Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkokasvaimia ovat johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti ja paklitakseli on osoittautunut olevan käyttökelpoinen potilaille, joilla on keuhkosyöpä, kuitenkin, hankittu resistenssi on suuri ongelma. Tämän ongelman voittamiseksi, yksi lupaava vaihtoehto on käyttää Constitutive androstaani-reseptorin (CAR) ligandit, yhdessä kemoterapeuttisten aineiden syöpäsoluja vastaan. Siksi haluamme valaista vaikutuksia CAR ligandien antineoplastinen paklitakselin tehokkuutta keuhkojen syöpäsoluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

tulokset solujen elinkelpoisuuden määritykset altistaa CAR agonistin tai inverse- agonisti hiiren ja ihmisen keuhkosyövän soluja moduloitu antineoplastisen vaikutuksen paklitakseli. CAR agonistit lisäsivät vaikutus Paklitakselin 6 7 keuhkosyövän solulinjat, kun taas käänteinen agonisti ei ollut vaikutusta paklitakselin sytotoksisuuteen. Mielenkiintoista on, että mCAR agonisti TCPOBOP tehostettu ilmentyminen kaksi tuumorisuppressorigeeneille, eli WT1 ja MGMT, jotka additiivisesti parannettu käsitellyissä soluissa CAR-agonistia yhdessä paklitakselin kanssa. Myös

in silico

analyysi osoitti, että sekä paklitakseli ja CAR agonistin TCPOBOP telakoituna osaksi mCAR rakennetta, mutta ei käänteistä agonistia androstenol. Paklitakseli lisää itsessään ilmentymistä CAR syöpäsoluissa. Vihdoinkin olemme analysoineet ilmentymisen CAR kahdessa julkisen riippumattomissa tutkimuksissa Cancer Genome Atlas (TCGA) Non pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). CAR ilmaistaan ​​muuttujan tasoilla NSCLC näytteissä Ne eivät edusta kokonaiselossaolo todettiin.

Johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että CAR-agonistit moduloivat antineoplastinen teho paklitakselin hiiri ja ihmisen syövän solulinjoissa. Tämä vaikutus on todennäköisesti kertonut tehostettu ilmentyminen kaksi tuumorisuppressorigeeneille, so. WT1 ja MGMT. Useimmat NSCLC tapauksissa läsnä CAR geeniekspressiota kääntämällä sitä voidaan spekuloida auto modulaatiota ligandien ohella Paklitakselin NSCLC terapiassa.

Citation: Fukumasu H, Rochetti AL, Pires PRL, Silva ER, Mesquita LG, Strefezzi RF, et ai. (2014) perustamisasiakirjan androstaanidibro- reseptoriligandeja moduloivat antituumoritehoon Paklitakselin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (6): e99484. doi: 10,1371 /journal.pone.0099484

Editor: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Biotekniikan keskus, Intia

vastaanotettu: 06 elokuu 2013; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 24 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Fukumasu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos Fundação de Apoio Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) taloudellista tukea (prosessi. numerot: 2008 /56584-2; 2009 /11081-6; 2010 /00535-3; 2010 /05650-5; 2011 /05690- 0. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkokasvaimia ovat johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti, ja ne ovat vastuussa arviolta 1,2 miljoonaa kuolemaa vuodessa [1]. viimeisten 30 vuoden aikana useita edistysaskeleita keuhkosyövän hoidossa on syntynyt kanssa parantaminen immunoterapia, sädehoito ja kemoterapia, mutta vahvistusta elinaika keuhkosyöpäpotilaita edelleen vaatimaton [2]. Hoito keuhkosyöpä riippuu histologisen tyypin, läsnäolo etäpesäkkeiden ja potilaan suorituskyky. Yleisin hoito lähestymistapoja ovat yhdistelmä leikkaus (kun kasvaimet ovat resektoitavissa), sädehoito ja kemoterapia. Viimeksi mainitun osalta, käyttö yhden tai useamman sytotoksisten lääkkeiden samaan aikaan, kuten taksaanit, platina yhdisteitä, ja /tai nukleosidianalogeja on yleisin. Yleensä ensilinjan kemoterapiaa kehittyneen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) työllistää protokolla taksaanin kanssa (paklitakseli tai doketakseli) liittyy sisplatiinin tai gemsitabiinin [3].

Syövät yleensä läsnä heterogeeninen populaatio pahanlaatuisten solujen, jossa jotkut ovat huumeiden herkkiä ja jotkut ovat lääkeresistenttiä. Solunsalpaajahoito tappaa huumeisiin herkkien solujen, mutta ei vaikuta lääkeresistenttiä soluja, jotka ovat yleensä lepotilassa [4]. Koska kasvain alkaa kasvaa jälleen, kemoterapia usein epäonnistuu, koska jäljellä olevat tuumorisolut ovat ensisijaisesti lääkeresistenttiä [5]. Paklitakseli, laajalti käytetty antineoplastinen lääke keuhkosyöpä, on tubuliinia sitovan aineen, joka estää myös mitoosin johtaen lopulta solukuolema [3]. Tämä taksaani on osoittautunut hyödylliseksi lääkettä potilaille, joilla on keuhkosyöpä; kuitenkin, kuten muiden kemoterapia huumeita, Hankitun resistenssin syöpäsolujen on yleisesti havaittu.

Siksi lisääminen paklitakselin tehokkuutta on erittäin toivottavaa. Chen

et al

. [6] pidetään yhtenä lupaava vaihtoehto, joihin liittyy CAR (Constitutive androstaani Receptor, NR1I3) ja PXR (pregnaania-X-reseptori, NR1I2) ligandien yhdessä kemoterapeuttisten aktivoivat PXR ja CAR voittaa tai ainakin lieventää monilääkeaineresistenssi (MDR) syöpäsoluissa. Mielenkiintoista on, että paklitakseli on tehokas PXR aktivaattori ja indusoija P-gp-välitteisen lääkeaineen puhdistuma [7]. Lisäksi useat kemoterapeuttiset lääkkeet moduloidaan tai metaboloituvat sytokromi P450-entsyymin CYP3A4 [8], joka on tunnettu transkription kohteena aktivoitua PXR ja CAR [9], [10].

CAR ja PXR ovat steroidi tumareseptoreista tunnettu master xenosensors [11], jotka kykenevät tunnistamaan rakenteellisesti erilaisia ​​yhdisteitä [12]. Molempien reseptorien, kun aktivoidaan ligandeja, siirtyvät tumaan ja aiheuttavat transkription useiden geenien lääkkeen metaboliaa ja erittymistä, glukoosi- ja rasva-aineenvaihduntaan ja hormonaalisen säätelyn [13], [14]. Äskettäin tärkeyttä PXR syövän synnyssä ja MDR tuumorien on ollut Kiistanalaista, mutta ole yksimielisyyttä sen erityinen rooli on saavutettu tähän mennessä [15], [16]. Samanlainen PXR, rooli CAR syövässä on myös kiistelty. On toisessa kädessä, CAR määritettiin olevan olennainen maksakasvain edistäneet Phenobarbital [17], [18], ja toisaalta CAR osoitettiin olevan uusi terapeuttinen kohde aivojen ja hematopoieettisten kasvaimia [19], [20 ]. Siksi tavoitteenamme oli valottaa tärkeyttä CAR modulaatiota valikoivasti ligandeja ja määrittää alavirran vaikutuksia antineoplastinen teho yksi yleisimmistä käytetty kemoterapeuttisten keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja solulinjat

Paklitakseli, CITCO, TCPOBOP, androstenol ja MTT saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Media ja reagenssit soluviljelmässä hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Trizol, oligodT- alukkeita, Superscript II entsyymi ja Power SYBR Green Mastermix olivat Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Muut reagenssit olivat analyysilaatua. Solulinjoja käytettiin tässä kokeessa olivat hiiren solulinja E9 [21] ja ihmisen solulinjoissa A549, H2023, H460, H2030, H1792 ja H23 [22]. Kaikki nämä solulinjat olivat lahja tri Lucy M. Anderson laboratoriosta vertailevan Karsinogeenisuus klo Frederick National Laboratory for Cancer Research (United States of America).

Solukokeet hiiren ja ihmisen keuhkojen syöpäsolu linjat

hiiri keuhkosyövän solulinjaa E9 oli peräisin spontaanista transformaatio ikuistettu epäneoplastisis- keuhkon epiteelisolujen eristettiin BALB /c hiiri [23]. Nämä solut viljeltiin CMRL 1066-alustassa (Invitrogen, New York, NY), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), 200 mM L-glutamiinia (Invitrogen) ja antibiootti cocktail (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä, Invitrogen) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 7% CO

2. Ihmisen keuhkosyövän solulinjat kasvatettiin RPMI 1640 (Invitrogen, New York, NY), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) plus 2% L-glutamiinia (Invitrogen) ja 1% Pen-strep (Invitrogen) kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

määritys mCAR ligandeja vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen.

E9-solut ympättiin 2000 /kuoppa 96-kuoppaisille levyille (Corning, USA ), joka sisälsi 100 ui täydennettyä elatusainetta, kuten on kuvattu. 24 tunnin kuluttua väliaineesta poistetaan ja vaihdetaan uuteen median lisätty eri pitoisuuksia CAR-agonistin (TCPOBOP) tai CAR käänteisen agonistin (androstenol) 10

-4 uM 10 uM. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, 11 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT – 5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja formatsaanikiteet kiteet tuotettiin yli 2 h itämisaika. Väliaine poistettiin kustakin kuopasta ja 100 ui 0,4 N HCI: isopropilic alkoholia lisättiin liuottamiseksi kiteitä. Optinen tiheys 540 nm: ssä mitattiin Fluorstar Optima (BMG Labtech, Saksa).

määritys puolimaksimaalinen inhiboiva konsentraatio paklitakselia (IC50).

E9-soluja käytettiin samaa protokollaa edellä kuvattu pitoisuudet 1 nM 1600 nM paklitakselia.

vaikutusten arviointi on mCAR ligandien paklitakselin sytotoksisuuteen.

E9-soluja käytettiin samaa edellä kuvattua protokollaa, jossa ligandit olivat lisätä samanaikaisesti IC50 paklitakselin ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin kuvatulla.

määritys HCAR ligandien vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen, laskettaessa IC 50 paklitakselin ja samanaikainen altistuminen kokeiluja.

Kaikki nämä kokeissa, joissa käytettiin ihmisen syöpäsolulinjoissa suoritettiin, kuten on kuvattu hiiren E9 syöpäsoluja, joilla on erityisiä edellytyksiä soluviljelmässä, kuten on kuvattu.

geeniekspressioanalyysiä mCAR

E9-solut ympättiin 3,10

5 solua /malja T25-levyt (Corning, USA) samoissa edellä kuvatuissa olosuhteissa, paitsi että TCPOBOP (10 uM), androstenol (10 uM), TCPOBOP (10 uM) plus Paklitakseli (IC50), androstenol (10 uM) plus Paklitakseli (IC 50) tai DMSO-ainoastaan ​​valvontaa. Kokonais-RNA eristettiin viidestä rinnakkaista kunkin hoidon ja säätimet Trizol seuraten valmistajan ohjeita. RNA-näytteet kvantitoidaan sitten (Biophotometer, Eppendorf, Saksa) ja 260/280-suhde oli havaittu. Vain näytteet, jotka esitetään 1,7-2,0 ja osoitettiin hyvä laatu (ei hajonnut) jälkeen elektroforeesin analyysi agaroosigeelillä (1,5%, Tris-puskuroitu suolaliuos) käytettiin. Näin ollen, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio oligodT alukkeita ja yläindeksi II cDNA: ksi. Kaikki alukkeet suunniteltiin Primer-3 ohjelmisto [24] ja ajettiin BLAST [25] puuttumisen varmistaminen paikallisten linjaukset DNA ja muut hiiri RNA-transkripti sekvenssit. Teho SYBR Green käytettiin reaaliaikainen PCR-alukkeilla mCAR (NM_009803.5, F: 5′-GGGCCTCTTTGCTACAAGAT-3 ’; R: 5′-AGGTTTTTATGGAAGTGGAGGA-3′). Housekeeping-geeni käytettiin 18 s ribosomaalisen RNA: n (NR_003278.3, F: 5’-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3 ’; R: 5′-CTGTCAATCCTGTCCGTGTC-3’). Reaktiot suoritettiin ABI Prism 7500 lämpösyklilaitteessa (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) kanssa Power SYBR vihreä Master Mix reagenssin ja analyysi suhteellisen geeniekspression data suoritettiin Delta-Delta-CT menetelmä [26 ].

PCR joukko RT

2 Profiler analyysi

RT

2 Profiler hiiri Onkogeenit ja tuumorisuppressorigeeneille PCR array (PAMM-502Z, SABiosciences, USA), joka sisältää 84 geenejä, jotka edistävät syövän synnyn, plus siivous geenien ja valvontaa, käytettiin vaikutusten analysoimiseksi TCPOBOP plus paklitakselin liittyviä geeniekspression E9 soluissa. Solut ympättiin ja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, kokonais-RNA uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) ja kolme toistoa käsittelyä kohden, jossa yhdistettiin analyysiä varten (koe suoritettiin kahtena kappaleena). Yhdistetyssä RNA käänteistranskriboitiin kanssa First Strand kit (SABiosciences) yhdistettynä SYBR Green /ROX PCR master mix (SABiosciences), ja lisättiin kuhunkin kuoppaan RT2 Profiler PCR-levy, joka sisältää annosteltu geenispesifistä aluketta sarjaa. Reaktio ajettiin ABI Prism 7500 lämpösyklilaitteella. Tietojen analysointi perustui Ct menetelmä, jossa normalisointi neljään eri taloudenhoito geenejä. Kertamuutoksia 2X (ylös tai alas-asetus) katsottiin analyysiä varten.

In silico

analyysi telakointi mCAR ligandien ja paklitakselilla osaksi mCAR rakenne

Laskennallinen analyysi suoritettiin käyttäen kiderakenne CAR-reseptorin yhteistyössä kiteytettiin androstenol (pdb 1XNX) [27] ja TCPOBOP (pdb 1XLS) [28]. Reseptorin tavoite ja telakoinnin ligandit valmistettiin käyttämällä Chimera [29]. Molekyylipinnalla kohde syntyi perustuu algoritmiin kehittämiseen [30]. Sphere sukupolven suoritettiin käyttäen sphgen algoritmia; pallot jaettiin kanssa dock6 ja valitaan käyttämällä ”spheres_selector”. Grid sukupolven saavutettiin käyttämällä Grid, joka jaetaan lisävarusteena DOCK [31]. Joustava Dock käytettiin tarkistaa vuorovaikutukset kohde CAR reseptoria ja kemikaalien [32]. Tulokset saadaan telakointi tehtiin näkyviksi ja analysoitiin Chimera versio 1.4.1 (Build 30365).

cBioPortal analyysi Cancer Genome Atlas aineistoja

cBioPortal, työkalu kehittämä laskennat Biology Centerin Sloan Kettering, avattiin klo https://www.cbioportal.org/public-portal/[33], [34]. Kaksi aineistoja käytettiin tässä työssä: ”Lung adenokarsinooma (TCGA, painossa) ’230 tapausta ja” Lung Okasolusyöpä (TCGA, väliaikainen)’ 489 tapausta aikaan analyysin, maaliskuu 2014. Molemmat tutkimukset olivat arvioimiseen käytetyt läsnäolon geenimutaatioita ja kopioluvun muutokset (CNA) havainnollistetaan ”oncoprints”, muuttunut mRNA ilmaisun ja /tai DNA: n metylaation ja eloonjäämiseen käyrät näissä muutoksia. Voit selvittää, mikä näyte esitti muuttunutta geeniekspressiota Z-score oli asetettu 1,96.

Tilastollinen

Data esitetään keskiarvo ± keskihajonta, ellei toisin mainita. Graphpad Prism 5 for Windows (GraphPad Software, USA) käytettiin kaikkiin tilastolliset analyysit suoritettiin nonparametric testit Mann-Whitneyn ja Spearman. Kaksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaillessaan eri ligandien vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen. Kaiken elinajan TCGA tietoja arvioitiin Kaplan-Meier käyrät ja logrank p-arvot, joita cBioPortal syövän Genomics [33], [34]. Merkittäviä eroja pidettiin kun p 0,05.

Tulokset

CAR ligandit eivät ole sytotoksisia hiiren tai ihmisen keuhkosyövän soluja

Aluksi arvioimme sytotoksisia vaikutuksia mCAR ligandit, mukaan lukien agonisti TCPOBOP ja käänteisen agonistin androstenol, on E9 hiiren keuhkosyöpään soluja. Altistuminen TCPOBOP 48 tuntia ei ole ollut vaikutusta E9 solujen elinkelpoisuus jopa suuren pitoisuuden (kuvio 1). Toisaalta, käänteinen agonisti androstenol indusoi annoksesta riippuvaisen lisäys solujen proliferaatiota, joissa on enemmän kuin 60% soluja kuin verrokkiryhmässä korkean pitoisuuden (p 0,0001, Fig. 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että käyttö mCAR agonistien hiiren syöpäsoluja voivat aiheuttaa erilaisia ​​vaikutuksia solujen elinkykyä, jopa lisätä solujen proliferaatiota havaittiin androstenol.

(A) Solujen elinkelpoisuus 48 tunnin kuluttua eri pitoisuuksia mCAR agonisti TCPOBOP tai mCAR käänteisen agonistin androstenol. TCPOBOP ei ole vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen jopa korkein pitoisuus. Toisaalta, androstenol lisää määrä E9 syöpäsolujen annoksesta riippuen (* p 0,05 – Kaksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti hoitoon vaikutus). (B) vaikutukset mCAR ligandien antituumoritehoon paklitakselin (IC50). TCPOBOP lisää antituumoritehoon että paklitakselin merkittävä lasku solujen elinkelpoisuuden 1-10 uM verrattuna vain paklitakseli-käsiteltyjä soluja (p 0,05 – Kaksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti hoitoon vaikutus). Androstenol osittain poistetaan antituumoritehoon paklitakselin (p 0,05 – Kaksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti hoitoon vaikutus). (C), Gene ekspression mCAR käsitellyissä soluissa ligandeista, paklitakselilla yksinään tai yhdistelmänä. Ligandeja ei muuttanut mCAR geeniekspressiota. Huomaa, että kaikki paklitakselilla kohdellaan-ryhmät esitteli kasvoi mCAR geeniekspression vertailuryhmän ryhmään (* p 0,05 – Yksi tapa ANOVA).

Seuraavaksi suoritimme samanlaisia ​​kokeita kuudessa ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Testasimme jos erityinen ihmisen CAR-agonisti, CITCO, ja käänteinen agonisti androstenol, esittäneet sytotoksisten vaikutusten näissä solulinjoissa. Mitään vaikutusta ei huomattu CITCO tai androstenol jopa korkein testattu pitoisuus (p 0,05 kaikissa solulinjoissa, Fig. S1).

CAR-agonistit TCPOBOP ja CITCO parantaa antineoplastinen paklitakselin tehokkuutta hiiren ja ihmisen keuhkosyövän solut

hypoteesi oli, että CAR modulaatio sen ligandien voisi muuttaa antituumoritehoon paklitakselin, antineoplastinen aine, jota käytetään yleisesti keuhkojen syövän kemoterapiassa ihmisillä. Ensin määritettiin Paklitakselin pitoisuus, joka esti 50% solujen elinkelpoisuuden kunkin solulinjan (IC50, taulukko 1). Käyttämällä tätä pitoisuus, seuraavan kerran arvioitiin vaikutuksia CAR agonistien kasvaimen vastainen vaikutus paklitakselin altistamalla syöpäsolujen paklitakselin plus eri pitoisuuksilla CAR agonistin tai käänteisen agonistin kanssa.

Kun co -exposed hiiren keuhkosyöpään solujen eri pitoisuuksilla TCPOBOP ja paklitakseli on estävä pitoisuus (IC50), CAR agonisti parantunut paklitakseli antituumoriteholla annosriippuvaisesti, joka vähentää solujen elinkelpoisuus lähes 40% verrattuna, että soluissa, joita käsiteltiin paklitakseli yksin (p 0,05, Fig. 1). Toisaalta, käänteinen agonisti androstenol vähennetään sytotoksisia vaikutuksia paklitakselin E9-solut (p 0,05, Fig. 1). Nämä tulokset osoittavat, että erityisiä modulaatio CAR agonistin TCPOBOP parantaa antituumoritehoon paklitakselin E9 syöpäsoluja.

Suoritimme Tämän kokeen kuudessa ihmisen keuhkosyövän solulinjat jossa samanaikainen altistuminen ihmisen CAR ligandeja arvioitiin sen vaikutus citotoxicity paklitakselia. CAR agonisti CITCO tehostaa merkittävästi paklitakselin tehoa viidessä kuudesta ihmisen keuhkosyöpä solut testattiin (p 0,05; Fig. 2). Toisaalta, CAR käänteinen agonisti androstenol ei johtanut merkittäviä eroja missään solulinjoissa (p 0,05, Fig. 2). Nämä tulokset osoittavat, että CAR-agonistit parantavat antineoplastisen vaikutuksen paklitakselin useimmissa keuhkosyövän solulinjoja (hiiri ja ihminen), mikä tekee niistä kiinnostavia painopiste lisäkarakterisointia.

Solujen elinkelpoisuus jälkeen 48-agonistin androstenol yhdistelmänä paklitakselinanopartikkeleil-. CITCO parantaa paklitakselin sytotoksisuutta merkittävästi viidessä kuudesta solulinjojen (* p 0,05 – Kaksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutesti hoitoon vaikutus). Toisaalta, androstenol yhdessä paklitakselin kanssa ei ole vaikutusta verrattuna paklitakseli-käsitellyissä soluissa.

Paklitakseli parantaa mCAR ilmaisu

seuraavan arvioitiin wheter paklitakselin muuttunut mCAR geenin ilmentymistä. Tätä varten me alttiina E9-solut seuraaviin käsittelyihin: 10 uM TCPOBOP, 10 uM androstenol, IC50 paklitakselin, tai näiden yhdistelmä. Tulokset osoittavat, että yhden käsittely TCPOBOP tai androstenol ei ollut vaikutusta mCAR mRNA: n ilmentymisen (Fig. 1). Kuitenkin, kun solut käsiteltiin paklitakselia yksinään tai yhdessä TCPOBOP tai androstenol, lisääntyminen mCAR ilmentymisen nähtiin riippumaton ligandin (p = 0,0102; kuvio. 1).

TCPOBOP ja paklitakselin muuttaa tuumorisuppressorigeenin ja onkogeenin ekspressiotasot

Lisäksi kokeet tehtiin vain hiirellä keuhkosyövän solulinjaa E9. Arvioimme vaikutukset TCPOBOP ja paklitakselilla on geeniekspressioprofiili 84 onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Aluksi viisi geeniä katkaisun analyysistä koska he esittivät CT-arvot ovat yli 35 ja /tai läsnä on useampi kuin yksi PCR-tuote havaittiin. Vuodesta 79 jäljellä geenit, paklitakselihoidolla muuttunut ilmentyminen 10 geenien, jossa kertainen muutokset enemmän kuin 2 (taulukko 2). Mukaan funktionaalinen geeni ryhmittymien päässä RT2 Profiler PCR array, useimmat geenit säädellään ylöspäin paklitakselia olivat tuumorisuppressorigeeneille, liittyvien geenien apoptoosin, onkogeenien tai geenit, jotka esillä ominaisuudet onkogeenien ja tuumorisuppressorigeenit (taulukko 2).

altistuminen E9 solujen hiiren CAR ligandin TCPOBOP lisääntynyt ilmentyminen kaksi kasvaimen synnyssä: MGMT ja WT1 (taulukko 2). Mielenkiintoista on, että kun arvioimme geeniekspression käsiteltyjen solujen TCPOBOP ja paklitakseli (sama konsentraatio, joka lisää paklitakselin sytotoksisuus), ilmentymistä näiden kahden geenin on parannettu pidemmälle kuin silloin, kun vain paklitakselia tai TCPOBOP annettiin, mikä viittaa additiivinen vaikutus geenin näiden geenien ilmentymistä. Lisäksi, yhdistelmä TCPOBOP ja paklitakseli johti downregulation kahden onkogeenien, ZHX2 ja ESR1 (taulukko 2). Lisäksi näyttää siltä, ​​että yhdistetty altistuminen E9 solujen TCPOBOP ja paklitakselilla parannettu paklitakseli aiheuttama geenien ilmentymisen allekirjoitus (taulukko 2). Yhdessä nämä tulokset ovat sopusoinnussa edellä kuvatun ja selittää moduloivan ominaisuudet mCAR agonistin TCPOBOP on kasvaimen vastainen vaikutus paklitakselin hiiren keuhkosyöpään soluja.

In silico analyysi osoittaa, että paklitakseli ja TCPOBOP sovi mCAR rakenne

rinnastus 1XLS ja 1XNX rakenne osoitti, että asemointi agonistin TCPOBOP ja käänteisen agonistin androstenol osaksi mCAR rakenne ovat erillisiä (Fig. 3). Telakointi TCPOBOP suoritettiin kontrollina, ja se osoitti hyvää superpositio TCPOBOP on kiderakenteen 1XLS (Fig. 3). Telakka käyttäen 1XLS rakenne osoitti, että käänteinen agonisti androstenol ei voi sitoa tällä asemaa agonistin TCPOBOP; androstenol osoitti positiivisen energiaverkko (51,82), joka on epäedullinen sitoa sisällä reseptoriin. Energia verkkoon TCPOBOP ja paklitakselin ovat vastaavasti -49,34 ja -125,53. Toisaalta, telakointi käyttäen 1XNX rakenne ohjata parhaiten energiaa reseptori-ligandi-vuorovaikutuksen osoitti mahdolliset toisen sivuston CAR reseptori TCPOBOP sitoutumisen (Fig. 3), jossa on suotuisa energian verkkoon (-32,01), samankaltaisia sille, jotka on saatu androstenol (-40,44). Paklitakseli osoitti myös edullisinta energiaa ja suljettu sitoutumisen arvot sitoutuvat sekä rakenteissa, joissa TCPOBOP tai androstenol käytettiin telakka opas ligandin (taulukko 3), mikä osoittaa, että paklitakseli voi olla mCAR ligandi.

, D-androstenol; B, E-paklitakseli; C, F-TCPOBOP; G ja H * androstenol ja TCPOBOP päällekkäisyys: G- pinta katsella ja H- lanka näkymä ligandien. Huomaa, että paklitakseli telakoituna molemmissa mCAR rakenteissa.

Ihmisen CAR luonnehdinta ei-pienisoluinen keuhkosyöpä näytteitä kaksi riippumatonta tutkimusta

ominaista tilan HCAR vuonna NLSLC kahden tutkimuksen kanssa julkisesti saatavilla kautta TCGA. Vuonna adenokarsinooma tutkimuksessa, 230 näytettä, 17,8%: ssa tapauksista (41/230) esitetään geneettiset muutokset ja HCAR, mukaan lukien kopiomäärän muutostyöt (CNA), mutaatioita tai muuttunut geeni-ilmentymisen (Fig. 4). Nämä muutokset eivät liittyneet yleiseen eloonjäämiseen (OS, p = 0,40, Fig. S2). Suurin osa näytteistä tämän tutkimuksen esitetään lisääntynyt HCAR metylaatio mukaan HM450 analyysi (Fig. 4). Vahvistavia näitä tietoja, ainoastaan ​​8%: ssa tapauksista (19/230) esitetään säätelyä HCAR mRNA.

(A) geneettiset muutokset ja taajuus HCAR Lung Adenokarsinooma tutkimus saatavilla TCGA. (B) Sama tietoja Lung Okasolusyöpä tutkimus saatavilla TCGA. (C) DNA: n metylaatio vs geenin ilmentymistä HCAR peräisin Lung Adenokarsinooma näytteitä TCGA. (D) DNA: n metylaatio vs geenin ilmentymistä HCAR peräisin Lung Okasolusyöpä näytteitä TCGA. Molemmat aineistot esitetään erittäin DNA: n metylaation ja vaihteleva mRNA ilmentymisen NR1I3.

Seuraavaksi käytimme tietoja toiselta tutkimuksessa TCGA keuhkojen okasolusyöpä (LSCC, TCGA, alustavat tiedot – 04/26 /2014). Taajuus HCAR muutoksia, mukaan lukien mutaatiot, CNAs tai muuttunut geeni-ilmentymisen (Fig. 4), oli 8,2% (40/489), joka ei liittynyt OS (p = 0,81, kuvio. S1). Samanlainen adenokarsinooma tutkimuksessa suurin näytteistä esitetään kasvanut DNA: n metylaatio on HCAR (Fig. 4). Tämä voi selittää, miksi vain 7,4% kaikista tapauksista esitetään säätelyä HCAR mRNA (36/489).

tulosten perusteella sekä tutkimuksissa, on mahdollista, että suurin osa näytteistä keuhkoadenokarsinooma ja LSCC potilaat aiheuta muutoksia HCAR ilmaisun suhteessa pariksi, ei-syöpäkudoksen, joka voisi selittää korkeita metylaation löytyy molemmissa tutkimuksissa.

keskustelu

Keuhkosyöpä edelleen suuri ongelma terveydenhuollon järjestelmiin koko maailmassa, koska useimmissa tapauksissa liittyy potilaalla on käsitti keuhkojen toimintaa, etäpesäke, monilääkeaineresistenssi ja huono tuloksia. Selviytymisen keuhkosyöpäpotilaita jälkeen kasvain havaitseminen on tyypillisesti vähemmän kuin 5% viiden vuoden ajan [35]. Viime aikoina todisteita on alkanut osoittaa, että CAR voisi olla rooli syövän hoidossa [19], [20]. Tässä me osoitamme, että erityiset CAR modulaatio agonistien, mutta ei käänteinen-agonistit, lisäsi kasvaimen vastainen paklitakselin tehokkuutta sekä hiiren ja ihmisen keuhkosyövän soluja. Tämä vaikutus mukana voimistaa paklitakselikonsentraatio aiheuttaman geenien ilmentyminen allekirjoitusta käytettäessä yhdistelmää paklitakselin ja TCPOBOP. Lisäksi, yksi altistuminen syöpäsolujen TCPOBOP lisääntynyt ilmentyminen kaksi kasvaimen synnyssä (WT1 ja MGMT), joka voisi vahvistavan parantunut tehokkuus paklitakselin syöpäsolulinjoissa. Paklitakselihoidolla lisääntynyt CAR geenien ilmentyminen ja telakoitiin molekyylirakenteen CAR

in silico

. Lopuksi analysoidaan profiilia HCAR kahdessa TCGA tutkimuksiin ja totesi, että CAR voisi olla kiinnostava kohde NSCLC saavilla potilailla paklitakselihoidolla koska HCAR ilmaistaan ​​Tuumorinäytteissä ja ole yhteydessä OS.

Chen

et ai.

äskettäin pitää CAR ligandien olevan lupaava vaihtoehto yhdistettynä kemoterapia, jonka tarkoituksena on voittaa MDR syöpäsoluissa [6]. Tuloksemme tukevat tätä ehdotusta, koska CAR ligandit eivät aiheuta sytotoksisia vaikutuksia sinänsä syöpäsoluissa; kuitenkin, kun CAR agonisteja käytettiin yhdessä paklitakselin, mielenkiintoinen modulatorinen vaikutus ilmennyt. Tämä parannettu sytotoksinen vaikutus nähtiin myös viisi kuuden eri ihmisen syöpäsolulinjoissa, koska CITCO, The HCAR agonisti, oli samanlainen vaikutus paklitakselin tehokkuutta. Tuemme siksi hypoteesi Chen

et al.

Että CAR modulaatio voisi todellakin olla tärkeitä syövän kemoterapiaa [6].

tarkka rooli CAR syövän synnyssä ja syövän hoito on edelleen Kiistanalaista. Toisella puolella, auto on välttämätön maksakasvain edistäneet fenobarbitaali hiirissä [18] ja se säätelee tuumorigeneesiä vastauksena ksenobioottisille stressiin [36]. Toisaalta, Wang et ai. kuvattu CAR uutena terapeuttisena kohteena, joka helpottaa syklofosfamidi (CPA) -pohjainen hoito hematopoieettisia maligniteetteja [20], ja jos he päättelivät, että CAR aktivointi mahdollistaa CPA kemoterapian selektiivisesti edistämällä sen bioaktivaatiosta. Toisessa tutkimuksessa, CITCO osoitettiin kohdistaa aivokasvain kantasoluja, estämällä niiden kasvun ja leviämisen [19]. Molemmat paperit ehdoteta käytettäväksi CAR-agonisteina veren maligniteettien ja aivojen syövät, vastaavasti.

Kuten edellä todettiin, paklitakseli indusoi apoptoosia jakautuvat solut. Täällä, paklitakseli indusoi solukuoleman kaikki hiiren ja ihmisen syövän solulinjoissa, ainutlaatuinen IC50 arvot kullekin yksi niistä. Senkin jälkeen, kun otetaan huomioon, että nämä solut läsnä eroja niiden vastustuskyky Paklitakseli (≈3600x), CAR agonistit paransi paklitakselin tehokkuutta lähes kaikissa syöpäsolulinjoissa (6/7). Toisaalta, käänteinen agonisti androstenol ei aiheuta mitään vaikutusta sytotoksisuuteen paklitakselin useimpien solujen, ja se vaimennetaan sytotoksisen paklitakselin yhdessä solulinjassa. Nämä tulokset päätellä, että ainoa CAR agonistit tulisi harkita parantaa NSCLC syöpähoidon.

Vaikutukset CAR agonistien antituumoritehoon Paklitakselin olivat samanlaiset sekä hiiren ja ihmisen soluja. Näin fokusoimme kokeita hiirimallissa kahdesta syystä: meillä on enemmän kokemusta tämän mallin [37], [38] ja kaikki käytetyt tekniikat hiirimallissa olivat rutiinia meidän lab. Lisäksi se, että hiiren keuhkon epiteelin syöpä solulinjoja on perustettu yli 30 vuotta ja on esittänyt samanlaisia ​​tuloksia kuin saatiin ihmissolulinjoilla [23]. Niinpä myös osoitettu tässä

in vitro

hiirimallissa että paklitakseli kasvaa CAR geenin ilmentymistä on IC50, riippumatta sen yhdessä CAR ligandien. Voisi olettaa, että mCAR ligandit pitäisi moduloida mCAR geeniekspressiota, mutta tuloksemme eivät näytä tätä vaikutusta. CAR aktivaatio ligandit eivät aina muuttanut CAR geeniekspressiota tai proteiinien tasoja, mutta se voi silti johtaa lisääntymiseen sen transkriptionaalista aktiivisuutta.

CAR ilmentymisen analyysi hiiren syöpäsoluja käsitelty CAR-ligandeista, paklitakselilla yksinään tai molempia, paljasti, että paklitakseli lisäsi geeniekspressiota CAR riippumaton sen yhdessä TCPOBOP tai androstenol. Niinpä Sopiminen tähän tulokseen,

in silico

telakointi analyysi TCPOBOP, androstenol ja paklitakselin osaksi CAR proteiinien rakenteeseen osoitti, että paklitakseli sopii ligandia sitova taskussa mCAR reseptorin, mikä voi lisätä CAR ilmentymisen positiivista palautetta. Ei vaikutusta CAR geenien ilmentymisen todettiin jälkeen CAR ligandeja altistuksen, tosiasia, että vahvistavat puuttumisen kanssa sytotoksisuuden näiden ligandien.

Mielenkiintoinen tulos tukee moduloivia vaikutuksia CAR agonistien paklitakselia tehoa niiden voimistaa paklitakselin geenin ilmentymisen allekirjoitus, lisäämällä kuvaamaan joitakin kasvaimen synnyssä ja vähentää ilmentymistä kaksi onkogeenien. Mielenkiintoista, hoito TCPOBOP yksin myös indusoi ilmaus kaksi tuumorisuppressorigeeneissä MGMT ja WT1. MGMT promoottori metylaatio on vahvempi ennustetekijä kuin ikä, vaihe, ja kasvaimen varten gliooma [39].