Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

maksasolusyövän (HCC) on yleisin maksasyövän ja kolmanneksi yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Ainoa hyväksytty systeeminen hoito voida leikata HCC on suun estäjä, sorafenibi. Rekombinantti ihmisen hapan sfingomyelinaasi (rhASM), joka hydrolysoi sfmgomyeliini seramidiksi, on harvinaislääkekäyttöaihe kehitteillä hoitoon tyypin B Niemann-Pickin tauti (NPD). Johtuen hepatotrooppiset luonteen rhASM ja sen kyky tuottaa proapoptoottiseen seramidi, tässä tutkimuksessa arvioitiin käyttämällä rhASM adjuvanttina sorafenibihoidon kokeellisissa malleissa HCC.

Menetelmät /Principal Havainnot

In vitro

, rhASM /sorafenibihoidon vähensi kannattavuutta Huh7 maksasyövän solut yli sorafenibin.

In vivo

käyttäen ihonalainen Huh7 kasvain malli, hiiren eloonjäänti lisääntynyt ja leviämisen kasvainten laski samassa määrin sekä sorafenibin ja rhASM /sorafenibihoidon ryhmiä. Kuitenkin yhdistetty rhASM /sorafenibihoidon alensi huomattavasti kasvaimen tilavuus, lisääntynyt tuumorinekroosi, ja laski kasvaimen verisuonten tiheys verrattuna sorafenibille. Nämä tulokset saatiin huolimatta huonosta toimituksen rhASM että kasvaimia. Toinen (potilaalle tehdä) malli Huh7 kasvainten myös perustettiin, mutta vaatimaton ASM aktiivisuutta samalla havaittu näissä kasvaimissa verrattuna terveisiin hiiren maksa. Mikä tärkeintä, ei kroonisia maksatoksisuus tai laihtuminen havaittiin alkaen rhASM hoidon kummassakin mallissa.

Johtopäätökset /merkitys

rhASM /sorafenibille yhdistelmä osoitti synergistisen vaikutuksen vähentämiseen kasvaimen tilavuus ja verisuonten tiheys Huh7 ksenografteissa huolimatta vaatimaton aktiivisuus rhASM näissä kasvaimissa. Mitään merkittävää nousua eloonjäämisen havaittiin päässä rhASM /sorafenibihoidon. Huono toimitus rhASM jotta Huh7 kasvaimet voivat johtua, ainakin osittain alhainen ilmentyminen mannoosireseptoreihin. Turvallisuutta ja tehoa tämän lähestymistavan yhdessä uusi koskevat päätelmät entsyymin kohdistamista, ansaitsee lisätutkimuksia.

Citation: Savić R, hän X, Fiel I Schuchman EH (2013) Ihmisen rekombinantin Acid sfingomyelinaasi adjuvanttina sorafenibille hoito Kokeellinen Maksasyöpä. PLoS ONE 8 (5): e65620. doi: 10,1371 /journal.pone.0065620

Editor: Alexander Arlt, Christian-Albrechts-yliopistossa Kiel, Saksa

vastaanotettu: 03 helmikuu 2012; Hyväksytty: 02 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Savić et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NIH HD28607 . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viimeisimmän arvion mukaan American Cancer Society for 2013, että noin 30640 ihmistä olisi diagnosoitu primaarinen maksan ja sappiteiden syöpä Yhdysvalloissa, jossa noin 21670 (71%) syöpään liittyvät kuolemat. HCC on yleisin (~90%) muodossa maksasyövän, usein diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa taudin [1]. HCC on geneettisesti heterogeeninen maligniteetti, jossa lukuisissa purettu signalointireitteihin johtaa koholla leviämisen ja angiogeneesiä, kuten RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-kateniinin, IGF, ja HGF /c-MET [2]. Viime aikoihin asti, hoitovaihtoehtoja kokeneille /leikkaushoitoon HCC ovat olleet suhteellisen tehottomia ja hankaloittaa taustalla hepatiitti ja maksakirroosi. Vuonna 2007 FDA hyväksyi suullisen lääke voida leikata HCC – sorafenibia, pienimolekyylinen multikinaasi estäjä jossa

in vitro

tehoavan kymmeniä seriini /treoniini (esim RAF) ja tyrosiinikinaaseilla (esim VEGFR) vuonna kasvainsolut ja verisuoniston [3], [4]. Keskeisessä Kliinisissä tutkimuksissa sorafenibi saatiin 2,8 kuukautta paremmin selviytymisen hoitoryhmässä (10,7 kuukautta mediaani) lumelääkkeeseen verrattuna (7,9 kuukautta), jotka muodostavat perustan sen hyväksyntää FDA [3], [5]. Huolimatta osoittivat kliinistä tehoa, joillakin potilailla, joilla on edennyt sairaus eivät reagoi sorafenibille ja ne, jotka eivät ole rajallinen hyötyä [5]. Niinpä tutkimukset vaihtoehto /tukeva lääkehoidot ovat voimistumassa [6].

Toisin HCC, NPD käsittää perheen ultra harvinainen yhden sairauksia, joiden tiedetään geneettiset ja biokemialliset poikkeavuudet. Esimerkiksi mutaatiot

SMPD1

geeni tuloksen puute ASM aktiivisuuden, mikä johtaa kertyminen Sfingomyeliinin lysosomeihin ja muihin soluosastoihin. Tyyppi A NPD on neurodegeneratiivinen, infantiili muoto ASM puutos, yleensä kuolemaan 2-3 ensimmäisen elinvuoden. Sen sijaan B-tyypin NPD puuttuu neurologisia osallistuminen ja selviytymistä saattavat olla osaksi myöhään lapsuudessa tai aikuisiässä, vaikka sairastavilla henkilöillä usein tavalla progressiivinen hepatosplenomegalia ja hengityselinten sairaus [7]. Entsyymin korvaushoitoon eksogeenisillä rhASM saanut harvinaislääkekäyttöaihe tila B-tyypin NPD vuonna 2000 [8], ja on onnistuneesti testattu vaiheen I kliinisen tutkimuksen aikuis- tyypin B NPD potilasta (clinicaltrials.gov tunniste NCT00410566). Faasi Ib toistuvia annoksia tutkimus on käynnissä. Hydrolyysi sfingomyeliinin jonka rhASM tuottaa erittäin bioaktiivinen ja sytosidaalisia lipidi, seramidi, joka pystyy indusoimaan kasvaimen suppression [9]. On tunnettua, että korkeus keramidin solun pinnalla uudelleen järjestää solukalvon signalointi alustoja, todennäköisesti indusoivat alavirtaan solumuutoksia, mutta tarkka mekanismeista näitä vaikutuksia edelleen aktiivinen alue tutkimuksen [9].

Due pro-kuolema vaikutuksia seramiditasot, syöpäsolut ovat kehittäneet useita puolustusmekanismit voittaa tämä lipidejä, mukaan lukien tuotannon vähenemiseen ja /tai parannettu tila, tai kohonnut tuotanto torjua pro-selviytymisen lipidejä, sfingosiini-1-fosfaatti (S1P). Nämä puolustusmekanismit voivat myös osaltaan sfingolipidikeramidi välittämää lääkeresistensseihin [10], [11]. Näin ollen, lääkehoitoja kohdistaminen sfingolipidi aineenvaihdunnan, mukaan lukien ylituotanto keramidin tappamaan kasvainsoluja tai vähentää angiogeneesiä, ovat houkuttelevia lähestymistapoja syövän hoitoon. Monet näistä uusista sfingolipidikeramidi lääkehoitoja on arvioitu soluviljelmässä ja /tai eläinmalleissa, ja keskittyvät suora jakelu ei-fysiologisten ceramides [12] kasvaimia, tai anto estäjiä ceramidases tai sfingosiinin kinaasien vastuussa synteesissä S1P [13]. Koska rhASM on a) selektiivisesti tarttunut maksan systeemisesti b) erittäin tehokas tuottavan keramidi-, ja c) saatavilla kliinistä laatua muotoilu, olemme keskittyneet tutkii mahdollisuuksia rhASM adjuvanttina sorafenibihoidon kokeellisissa maksassa syöpä.

Aikaisemmin osoitimme, että rhASM yhdistettynä säteilytys oli syvällinen vaikutus melanooman

in vivo.

Yhteenvetona tämä vaikutus

in vitro of the media piti olla happamaksi (pH 6,5), tila, joka jäljittelee microenvironment kasvain ja suosii ASM toimintaa [14]. Osoitimme myös, että rhASM yksinään (1 uM) ei ollut toistettavissa vaikutusta elinkelpoisuus 60 syöpäsolulinjoja käsittää leukemia, ei-pienisoluinen keuhko-, paksusuoli-, CNS, melanooma, munasarjasyöpä, munuaissyöpä, eturauhassyöpä ja rintasyöpä kasvaimia, mikä viittaa siihen, että

in vivo

mikroympäristössä kasvain oli tärkeä havaitut vaikutukset [15], [16].

Kun otetaan huomioon hepatotrooppiset luonne rhASM, me arveltu, että maksasyövän voi olla sopiva malli, jossa seuraavaan testata tehoa rhASM adjuvanttina standardihoitoa sorafenibihoidon. Tässä osoitamme, että yhdistelmän hoito suurella annoksella rhASM (25 mg /kg joka kolmas päivä (q.72 h), vatsakalvonsisäisesti (ip)) ja sorafenibille (30 mg /kg joka päivä (qd), letkuruokinnalla) vähentää kasvaimen Huh7 ihonalainen ksenografteja

in vivo

, vähentää verisuonten tiheyden, ja lisäksi lisääntynyt kuolio kasvaimia. Nämä vaikutukset saatiin huolimatta rajoitetun toimitus entsyymin ihonalaisen kasvaimia. Yhdistelmä hoito oli hyvin siedetty BALB /C-hiiriä ilman hoitoa liittyvät kuolemat, ilman painonlasku, ja joilla oli normaali maksan toiminta. Olemme myös perustaneet potilaalle tehdä mallin Huh7 kasvainten maksa SCID /beige hiiret, ja yllättäen havainneet samoin huono toimituksen rhASM näihin kasvaimiin suhteessa terve maksa. Lisätutkimuksissa ehdotti, että alhainen ilmentyminen mannoosireseptoreihin vuonna Huh7 kasvaimissa saattaa osittain selittää tätä vaikutusta.

Tulokset

vapauttaminen sfingolipidikeramidi signalointi ihmisen maksasyövän

Vertailu normaali maksa ja maksasolukarsinoomat, käyttäen neljää toisistaan ​​riippumatonta näytettä saatavilla Oncomine tietokantaan, paljastavat merkittävästi alentuneet ASM (

SMPD1

) ja S1 P fosfataasin (

SGPP1

) mRNA: n ekspressio (taulukko 1).

SMPD1

geeni rankattu 1, 9, 17 ja 11%: tukahdutettu geenien Mas [17], Chen [18], Wurmbach [19], ja Roessler maksa 2 aineistot [20]. Samoin

SGPP1

geeni sijoittuu alkuun 4, 5 ja 7% tukahdutettu geenejä 3 out of 4 aineistot [17], [18], [19]. S1P on erittäin bioaktiivinen sfingolipidi, joka edistää solun lisääntymistä [11], ja S1P fosfataasi on entsyymi, jota tarvitaan hydrolysoimaan fosfaattiryhmän S1 P (kuvio 1A). Tukahduttaminen näiden kahden geenin /entsyymejä, siis suosii alhainen keramidin ja korkea S1P tasolla, todennäköisesti johtaa solujen lisääntymisen ja /tai lääkeresistenssi.

(A) ASM ajaa tuotannon pro-apoptoottisten seramidi läpi hydrolyysin sfingomyeliini, joka muunnetaan sfingosiiniä jonka ceramidases, kuten happoa ceramidase (AC). Sfingosiinikinaasin 1 (SPHK1), sitten fosforyloi sfingosiini ja sfingosiini-1-fosfaatti (S1P), joka muunnetaan takaisin sfingosiiniä by S1P-fosfataasin (SGPP1) tai metaboloituvat S1P lyaasi 1 (SGPL1). (B) aktiivisuus ASM vuonna Hep3B soluissa oli merkittävästi suurempi (ANOVA, df (2,6), F = 48,49, p 0,001) kuin Huh7 (Tukeyn post hoc testi p 0,001, **) ja HepG2 solut (Tukeyn post hoc testi p 0,001). AC oli samanlainen kaikissa solulinjoissa, mutta HepG2-soluissa oli merkittävästi korkeammat SPHK1 aktiivisuus (ANOVA, df (2,6), F = 8,68, p = 0,017, *) kuin Huh7 (Tukeyn post hoc testi, p = 0,041) ja Hep3B (Tukeyn post hoc testi, p = 0,019). (C) Huh7-solut valittiin lisätutkimuksiin ja niiden elinkelpoisuus testattiin pH: ssa 6,5 ​​(katso menetelmät), kun läsnä on 500 ug /ml rhASM, 3 uM sorafenibia, tai yhdistelmä rhASM ja sorafenibin 48 tuntia. Sorafenibi (Dunnettin post hoc testi p 0,001, **) ja yhdistetty rhASM /sorafenibin (Dunnettin post hoc testi p 0,001, **) käsitellyt solut oli huomattavasti pienempi elinkelpoisuus kuin kontrolli soluja (ANOVA, df (3,38), F = 26,47, p 0,001). rhASM ei ollut merkittävästi erilainen kuin kontrolli (p = 0,118). RhASM ja sorafenibille yhdistelmä osoitti merkitsevästi pienempi elinkelpoisuus verrattuna sorafenibille yksin (t-testi, 1-puolinen, * p 0,05, ** p 0,001).

valinta ihmisen hepatoomasolulinjassa ja

in vitro

vaikutus rhASM jakautumiseen

vieressä tutkittiin lähtötilanteessa toiminnan kolme keskeistä osallistuvien entsyymien sfingolipidikeramidi aineenvaihduntaan – ASM, happo ceramidase (AC), ja sfingosiinikinaasin 1 (SPHK1) – kolmella yleisesti käytetty ihmisen hepatoomasolulinjaa linjat: HepG2, Huh7 ja Hep3B. Hep3B solut oli korkein lähtötilanteessa ASM aktiivisuutta, kun taas SPHK1 aktiivisuus oli korkein HepG2-soluissa (kuvio 1 B). Kaikki kolme solua oli verrattavissa AC aktiivisuus. Näiden tulosten perusteella valitsimme Huh7 solut lisäkokeita varten, koska lähtötilanteessa toiminta oli maltillinen ja näiden HepG2 ja Hep3B. Lisäksi Huh7 ihonalainen hiiri ksenografteja ovat vakiintunut malli käytetään arvioimaan erilaisia ​​kokeellisia lääkehoitojen HCC [21], [22], [23]. Vaikutus rhASM tutkittiin Huh7-soluissa esikäsittely (2 tuntia) ja rhASM hapotetussa väliaineessa (6,5) – matkii kasvaimen mikroympäris- pH – minkä jälkeen inkuboitiin 46 tuntia pH: ssa 7,4. Mitään merkittävää vaikutusta rhASM hoito yksinään havaittiin elinkelpoisuudesta Huh7 solujen aikana 48 tunnin, kuten todettiin aikaisemmin melanoomasolujen [14]. Sen sijaan, sorafenibi johtaneet huomattavaan vähenemiseen leviäminen, joka oli merkittävästi parannettu soluissa altistuneet rhASM /sorafenibille yhdistelmä (kuvio 1 C). Nämä tiedot edelleen tukivat käsitystä, että rhASM yksin on vähän vaikutusta kasvainsoluihin, ja ne voivat olla käyttökelpoisia hoitona sorafenibille [14].

Alennettu kasvaimen tilavuus ja elonjäämisetua hoidetuilla hiirillä rhASM ja sorafenibilla

Seuraavaksi tutkimme vaikutuksia rhASM /sorafenibin yhdistelmähoito

in vivo

käyttäen Huh7 ihonalainen ksenograftikasvaimissa hiirillä. Eläimet jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään, käsiteltiin sorafenibilla (n = 10), rhASM (n = 13), rhASM /sorafenibi (n = 14), tai vehikkeliä (n = 9). Kuten

in vitro

kokeissa rhASM hoito yksinään ei ollut edullista vaikutusta

in vivo

(mediaanielinajassa 10 vrk kasvaimen tilavuus 925 ± 80 mm

3 päivänä 11) (data ei näytetty). Kuitenkin verrattuna ajoneuvon, huomattavasti pienempi kasvainten tilavuudet mitattiin rhASM /sorafenibia ryhmä päivinä 8 ja 11. Myös päivänä 11 vähentämiseen kasvaimen tilavuuden havaittiin yhdistelmänä ryhmässä oli merkitsevästi alempi kuin hiirillä, joille sorafenibilla yksinään ( kuvio 2A). Selviytymisen hiirillä oli merkitsevästi suurempi sekä sorafenibin (13 päivää), ja seos käsiteltiin hiiriä (19 päivää) verrattuna ajoneuvon (11 päivää) (kuvio 2B). Vaikka oli taipumus paranemiseen mitään merkittäviä selviytymisen eroja havaittiin näiden kahden hoitoryhmän. Huomionarvoista kuitenkin kaksi eläimet rhASM /sorafenibia yhdistelmä ryhmässä oli kasvaimia 1,000 mm

3 ja selviytyi yli 5 viikkoa. Nämä hiiret uhrattiin päivänä 43 kuin niiden kasvainten pysyivät suhteellisen vakaana (132 mm

3 (hiiri ID # 452) ja 267 mm

3 (hiiri ID # 443) ajankohtana uhrauksen.

(A) keskimääräinen tuumorin tilavuus käsiteltyjen hiirien rhASM ja sorafenibilla oli merkittävästi pienempi kuin kontrollihiirten päivänä 8 (Dunnettin post-hoc-testi, p = 0,035; ANOVA df (2,30), F = 3,24, p = 0,053). päivänä 11 sekä sorafenibin (Dunnettin post hoc testi p = 0,034) ja yhdistetty rhASM ja sorafenibin (Dunnettin post hoc testi p 0,001) hoidettujen hiirten oli pienempi kasvaimia kuin ohjaus hiirillä (ANOVA, df (2,27), F = 12,22, p 0,001). rhASM /sorafenibille yhdistelmä ryhmä oli myös merkittävästi pienemmät kasvaimia kuin sorafenibia ryhmä vuorokautena 11 (t = 2,32, df (20), p = 0,031). (B) merkitsevästi pidempi eloonjäämismediaani ( 13 päivää) sorafenibia käsiteltyjen hiirten (chi-neliö 5,02, df (1), p = 0,025) ja yhdistetty rhASM /sorafenibille käsiteltyihin hiiriin (19 päivää) (chi-neliö 14.57, df (1), p 0,001) havaittiin kontrolliin verrattuna (11 päivää). Kaksi hiiret rhASM /sorafenibia ryhmä eläneet yli 5 viikon tutkimusjakson aikana, ja lopulta tapettiin päivänä 43 (kasvaimen tilavuuden 132 mm

3, 267 mm

3). *, # P 0,05, ** p 0,001.

Vähentynyt lisääntymistä ja verisuonten tiheyden ja lisääntynyt solukuolema kasvaimissa yhdistetyistä rhASM /sorafenibille hoidetut hiiret

molekyylitasolla taso, solujen määrä positiivisia Ki67 leviämisen markkeri pieneni merkitsevästi sekä sorafenibin ja rhASM /sorafenibihoidon ryhmiä samassa määrin (kuvio 3A). Kuitenkin kuolion lisääntyi merkitsevästi yhdistetyn rhASM /sorafenibille käsiteltyihin hiiriin (kuvio 3B). Tutkimaan Tämän havainnon lisäksi, tutkimme seuraavaksi verisuonittumisen kasvaimia. Määrä verisuonten värjätään anti-αSMA oli merkitsevästi pienempi kasvaimissa sekä sorafenibin (6,9 ± 0,5) ja rhASM /sorafenibin (5,5 ± 0,4) käsitellyissä hiirissä kontrolliin verrattuna (9 ± 0,6). Tärkeää on, että määrä anti-αSMA positiivisia verisuonia oli merkitsevästi pienempi rhASM /sorafenibin kuin sorafenibin käsitellyissä hiirissä (p 0,001). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin anti-CD34-värjäys, jossa rhASM /sorafenibille (5,3 ± 0,4), oli merkittävästi alhaisempi kuin sorafenibille yksinään (7,5 ± 0,4), ja molemmat olivat pienempiä kuin kontrolli (11,6 ± 0,9). Sekä anti-αSMA ja anti-CD34 annettiin valikoivaa värjäyksen verisuonten parafiiniin kasvaimen osaan, kuten on esitetty kuvioissa 3 E, F. RhASM /sorafenibille pitkän elossa hiiriä (ID # 452 ja ID # 443) olivat samaa luokkaa mittausten yhdistelmälle ryhmän jommallakummalla määritysten edellä.

(A) keskimääräinen lukumäärä Ki67-positiivisten solujen kasvaimia hiirille on sorafenibilla (Dunnettin post-hoc p 0,005) ja rhASM /sorafenibilla yhdistelmä (Dunnettin post-hoc p 0,001) oli merkittävästi alhaisempi kuin ajoneuvo (ANOVA df (2,30), F = 14,63, p 0,001). Mitään merkittävää eroa ei havaittu Ki67 värjäytymistä kasvaimia sorafenibin ja rhASM /sorafenibille käsiteltyihin hiiriin (t = 1,19, df 22, p = 0,249). (B) Nekroosi lisääntyi merkittävästi (ANOVA, df (2,30), F = 3,66, p = 0,038) in rhASM /sorafenibin käsiteltyihin hiiriin (Dunnettin post hoc ohjaus, p = 0,043) verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin, kun taas sorafenibi käsitellyissä hiirissä eivät poikkea ohjaus (Dunnettin post hoc ohjaus, p = 0,760). Nekroosi rhASM /sorafenibin käsitellyistä hiiristä oli merkittävästi suurempi kuin hiirillä, joille sorafenibilla yksinään (t = -2,39, df (22), p = 0,26). (C) Anti-αSMA verisuonen värjäys paljasti huomattavasti pienempi määrä aluksia (ANOVA df (2,30), F = 12,57, p 0,005) in sorafenibin (Dunnettin post hoc testi p = 0,020) ja rhASM /sorafenibi käsiteltyihin hiiriin (Dunnettin post hoc testi p 0,001). RhASM /sorafenibille ryhmä oli myös merkitsevästi vähemmän αSMA verisuonia kuin sorafenibia ryhmä (t = 2,25, df (22), p = 0,031). (D) anti-CD34 verisuoni värjäys vahvisti αSMA tuloksia, osoittaa huomattavasti pienempi määrä aluksia (ANOVA df (2,30), F = 32,07, p 0,001) sorafenibin (Dunnettin post hoc testi p 0,001) ja rhASM /sorafenibi käsiteltyihin hiiriin (Dunnettin post hoc testi p 0,001). Yhdistetty rhASM /sorafenibille ryhmässä oli merkittävästi vähemmän CD-34 positiivista verisuonten kuin sorafenibia ryhmä (t = 3,56, df (22), p = 0,002). Selektiivinen värjäys verisuonten parafiiniin kasvaimen osat värjättiin on esitetty anti- αSMA (E) ja anti-CD34 markkereita (F). * P 0,05, ** p 0,001.

analyysi seramiditasoja kasvaimissa, mikä ei osoittanut mitään eroa ryhmien välillä (tuloksia ei ole esitetty), tehtiin päätepisteenä mittaus loppuun tutkimuksen (jopa 48 tuntia viimeisen injektion jälkeen). Koska korkeus keramidin soluissa vasteena ASM on nopeaa, ja se voi palata lähtötasolle minuuttia, tarkastelimme tuumorinekroositekijää ja verisuonten tiheys (yllä), kuten sijaismarkkereita biologisten vaikutusten hoitoon. Koska havaitsimme lasku kasvaimen tilavuus, lisätä kuolioon, ja vähentää verisuonten tiheyden rhASM /sorafenibia ryhmä, emme mitata tasoa muiden sfingolipidikeramidi aineenvaihduntatuotteiden kuten S1P. Yleensä kuitenkin ilmenee tietomme että hallitseva vaikutus rhASM yhdistelmähoidon oli solukuoleman, ja siten mikä tahansa alavirran S1P, jotka ovat saattaneet aiheuttaa, eivät ole estää näitä rhASM /sorafenibille aiheuttamien muutosten.

vaatimaton jakelu rhASM subkutaaniseen kasvaimissa verrattuna terve maksa

edellä esitetyt tiedot osoittivat positiivista, vaikka vaatimaton, vaikutus yhdistetyn rhASM /sorafenibihoidon tässä ihonalaisen Huh7 HCC malli. Tutkia biologisen jakautumisen entsyymin kasvaimia, mittasimme ASM aktiivisuutta lopussa tutkimuksen. Kukin eläin sai viimeisen rhASM injektio 1, 24 tai 48 tuntia ennen tappamista mukaan yksittäisen eläimen annostusvaihtoehto. Mitään selvää eroa ASM aktiivisuuden havaittiin suhteessa aikaan odotti kuluttua viimeisestä rhASM injektion. Kuten odotettua, ASM aktiivisuus oli huomattavasti korkeampi kasvaimen otteet rhASM /sorafenibille käsitellyissä hiirissä verrattuna sorafenibille yksinään (kuvio 4A). Kuitenkin, ASM aktiivisuus terveiden maksa näillä hiirillä oli 12 kertaa, että ihonalainen kasvain (kuvio 4B). Niinpä vaatimaton biologinen jakautuminen on rhASM ihonalaisen kasvaimet voivat selittää vaatimaton tehoa yhdistelmähoidon tässä mallissa.

(A) ASM aktiivisuutta kasvaimen otteita rhASM /sorafenibin käsitellyistä hiiristä oli merkitsevästi korkeampi (ANOVA, df (2,30), F = 22,58, p 0,001; Dunnettin post hoc testi p 0,001) kuin kontrolli, kun taas sorafenibi ei ollut vaikutusta perustason ASM toimintaa. (B) ASM aktiivisuus maksassa otteita rhASM /sorafenibin käsitellyillä hiirillä oli myös korkeampi kuin ajoneuvon käsitellyissä hiirissä (ANOVA, df (2,30), F = 11,17, p 0,001; Dunnettin post hoc testi p 0,001), ja sorafenibi ei ollut vaikutusta perustason ASM toimintaa. Huomattavaa on, että eläimet yhdistelmä hoitoryhmän 12 kertaa suurempi ASM aktiivisuus maksa kuin kasvaimissa, mikä osoittaa hepatotrooppiset luonne rhASM pitkäaikaisessa käytössä ja suhteellisen vaatimaton jakelu ihonalaisen kasvaimia. ** P 0,001. Huomautus: Y-akselit aktiivisuus (10

-6 mol /l /h) mitattiin yhtä suureen osaan 20% paino /tilavuus kudosuutenäytteitä kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

turvallisuus rhASM /sorafenibi yhdistelmähoito

vaiheen I turvallisuuden tutkimuksessa rhASM tyypin B NPD potilaita, korkein turvallinen aloitusannos määritettiin olevan 0,6 mg /kg [24]. Johtuen erittäin suuria annoksia rhASM käytetty nykyisessä tutkimuksessa (25 mg /kg q.72 h), tutkimme toksisuusrajat yhdistelmähoidon seuraamalla ruumiinpainon koko tutkimuksen ja tutkimalla maksan toiminta hiirten lopussa hoidon. Painot alussa ja lopussa hoidossa eivät olleet merkittävästi erilaiset (kuva S1A). Lisäksi mitään merkittävää eroa alaniinitransaminaasiarvo (ALT) havaittiin joko sorafenibin tai rhASM /sorafenibille käsitellyissä hiirissä kontrolliin verrattuna (kuvio S1B). Kaksi eläintä korkea harha-arvot ALT oli taskuja tulehdussolujen (kuvio S1B) muuten terve maksa, ilman merkkejä pysyviä vammoja (kuvio S1C). On huomioitava, että pitkäikäisiä rhASM /sorafenibille hiiret ID # 452 (ALAT 52 U /L) ja ID # 443 (ALAT 53 U /L) eivät olleet poikkeavia havaintoja. Aspartaattitransaminaasi- (ASAT, kuva S1D) ja kokonaisbilirubiini (kuvio S1E) myös eivät muuttuneet merkitsevästi yhdistelmällä hoitoa. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmä rhASM (25 mg /kg q.72 h) ja sorafenibin (30 mg /kg kerran päivässä) on hyvin siedetty.

arviointi rhASM /sorafenibihoidon käytettäessä potilaalle tehdä mallin Huh7 kasvaimet

edellä myönteiset tulokset rhASM /sorafenibihoidon saatiin huolimatta huono biologinen jakautuminen on rhASM ihonalaisen kasvaimia. Siksi perusteltu, että tulokset voidaan parantaa käytettäessä potilaalle tehdä mallin HCC. Perustaa tällainen malli, Huh7 solut jotka ilmentävät pysyvästi lusiferaasireportterigeenillä injisoitiin maksaparenkyymi SCID /beige hiiret. Eläimet oli kuvattu 24 tuntia ja 1 viikko leikkauksen jälkeen, ja seurataan joka 4-5 päivä, kunnes jatkuva kasvu luminesenssi havaittiin (kuvio 5A). Tämä tehtiin, jotta solut selviytyi implantointia menettely ja alkoi kasvaa ja tuottaa kasvaimia. Kaikki hiiret olivat havaittavissa luminoivan alueita maksan alueella alussa hoidon, ja voimakkaasti suurennettu luminesenssi alueiden lopussa tutkimuksen – vastaa tuumorit, jotka kasvoivat maksassa (kuvio 5B).

(A ) jälkeen kirurgisen injektion lusiferaasi-leimatun Huh7 soluihin, luminesenssi tarkkailtiin ajan kuluessa. Lisäys luminenssi ≥6 kertaiseksi lähtötasoon (päivä 1) käytettiin todisteena onnistunut istuttaminen solujen aloittamisesta kasvaimen kasvua ja pisteen satunnaistamisen hiirien hoitoryhmiin. (B) Kuvat ovat hiirten alussa lääkehoidon osoittaa hyvin havaittavissa luminesenssi maksasta (aseta), suuri luminoiva vastaava alue maksaan Huh7 kasvain aikaan uhri (inserttien b, c). Maksan ja kasvaimen leikattiin irti ja erotettiin (d) jatkokäsittelyä varten. Asteikkoviiva insertti d on 1 cm. (C) merkitsevästi pidempi mediaanielossaolosta sorafenibin käsiteltyjen hiirten (n = 5, 42 päivää, chi-neliö 4,88, df (1), p = 0,027) ja yhdistetty rhASM /sorafenibille käsiteltyihin hiiriin (n = 5, 44 päivää, Chi neliö 4,43, df (1), p = 0,035) havaittiin kontrolliin verrattuna (n = 4, 14 päivää). Mitään merkittävää eroa ei havaittu rhASM yksinään (n = 4, 19 päivää) ja ohjaus tai välillä sorafenibia ja rhASM /sorafenibin. (D) rhASM aktiivisuus potilaalle tehdä HCC ajoneuvojen ja sorafenibin hoidetut hiiret (joilla rhASM hoitoon; lähtötilanteessa rhASM) oli merkitsevästi, 6,4 ± 1,4 kertaiseksi, alempi kuin rhASM aktiivisuutta kasvaimia rhASM ja rhASM /sorafenibille käsiteltyihin hiiriin (t = -3,99 , df (15), p = 0,001). Vastaavasti lähtötilanteen rhASM maksassa oli merkittävästi pienempi, 13,6 ± 1,6 kertainen, kuin aktiivisuus rhASM maksanvärisillä hiirien vastaanottamisesta rhASM tai rhASM /sorafenibin (t = -9,07, df (14), p = 3,1 · 10

– 7). Tärkeää on, että ero aktiivisuus rhASM käsitellyissä hiirissä (rhASM ja rhASM /sorafenibille) välillä ortotooppisille HCC ja maksassa oli paljon korkeampi maksassa, 20,8 ± 2,4-kertaisesti (t = -8,7, df (13), p = 8,8 · 10

-7, **). Huomautus: Y-akselit aktiivisuus (10

-6 mol /l /h) mitattiin yhtä suureen osaan 20% paino /tilavuus kudosuutenäytteitä kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

satunnaistaminen ja hoidon aloittamisen suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Hiiret vastaanottaa rhASM /sorafenibia yhdistelmä aloitettiin samalla annoksella ja hoitoaikataulu kuten ihonalaisen mallissa – 30 mg /kg sorafenibia q.d. letkulla ja 25 mg /kg rhASM q.72 tuntia i.p. Vaikka emme pystyneet tarkasti määrittämään kasvaimen kokoa luminesenssi ajan (todennäköisesti johtuen pieni määrä eläimiä ja kinetiikan lusiferiini aktivointia kasvaimet), ei havaittu selvää tasanteella luminesenssi käsitellyissä hiirissä. Siksi taajuus rhASM annon lisättiin (2-päivää-on, 1-päivä-off) 2 viikkoa tutkimuksen yritetään lieventää mahdollisia osa-annostelun rhASM.

selviytyminen profiilit hoidetut hiiret olivat samanlaisia ​​kuin havaittiin ihonalaisen mallissa, eli mitään merkittävää eroa sorafenibia yksin ja rhASM /sorafenibille yhdistelmä ryhmiä (kuvio 5C). Yllättäen kuitenkin, ASM aktiivisuus terveiden maksa käsiteltyjen hiirten oli moninkertaisesti suurempi kuin potilaalle tehdä Huh7 kasvaimia samasta eläimestä. Tämä on samanlainen kuin tulokset ihonalaisen kasvaimia (kuvio 4B), joka ilmaisee, että huono biologinen jakautuminen on rhASM on Huh7 kasvaimia oli riippumaton ksenograftin sijainti.

Koska samanlaisia ​​ASM aktiivisuuden profiili kaksi erilaista seuraavan kerran tutki ilmaus kahden reseptorin tärkeää solun sisäistämisen rhASM – insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori 2 (IGF2R) ja mannoosireseptorin 1 (MRC1) – HCC. Analyysi Oncomine tietokannan osoitti, että ilmaus

IGF2R

ei johdonmukaisesti purettu välillä 4 eri ihmisen HCC aineistoja, kun taas ilmaus

MRC1

oli säädellä vähentävästi 3/4 aineistoja (geeni joukkoon: top 11, 2, ja 5%) (taulukko 2).

siksi tutkittiin ilmaus

MRC1 /Mrc1

maksanvärisillä ja potilaalle tehdä Huh7 kasvaimia. Kaksi erilaista PCR-alukkeet suunniteltiin arvioimaan ekspressiota ihmisen ja hiiren

MRC1

ja

Mrc1

, vastaavasti. Tulokset (taulukko 3) ei paljastanut mitään havaittavaa ilmentymistä

MRC1

ihmisen Huh7 soluissa tai potilaalle tehdä Huh7 kasvaimia. Ekspressiota havaittiin terveen ihmisen maksan positiivisena kontrollina. Ilmentyminen hiiren

Mrc1

oli havaittavissa ei-kasvain maksassa ja Huh7 kasvaimia. Jälkimmäinen vastaa isäntä-siirre ”saastuminen”, joka on dokumentoitu ennen [25]. Koska C

T arvot ~21 havaittiin sekä

Mrc1

ja

Srsf4

taloudenhoito geeni hiiren maksassa, ja z25 varten

Mrc1

ja

Srsf4

vuonna Huh7 maksan kasvaimia, ilmaus

Mrc1

kasvaimissa näyttää olevan -10 kertaa pienempi.

Srsf4

käytettiin housekeeping-geeni, joka perustuu stabiilin ekspression eri vaiheissa HCC kehityksen [26]. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset paljastavat hyvin alhainen

MRC1

ilmentymistä Huh7 solua /kasvaimet olivat yhdenmukaisia ​​alhainen ASM aktiivisuuden havaitaan ksenograftikasvaimissa hoidon jälkeen.

Keskustelu

muutokset membraanilipidejä syöpäsoluja, kuten glykosfingolipidit, on tunnustettu jo yli 40 vuotta [27]. Sittemmin rakenteelliset roolit sfingolipideihin on laajennettu sisältämään monimutkaisen verkoston bioaktiivisten lipidien kanssa erilaisia ​​rooleja monissa solun prosesseissa, kuten solukuoleman ja selviytymistä. Nykyään tärkeät roolit kaksi näistä lipidien, keramidia ja S1P, on vakiintunut syövässä. Keskittyminen seramideja ja S1 P syöpähoitoa on hyvät koska säilymään keramidi- /S1P tasapaino on kriittinen määritettäessä solun kohtalon, ja muuttunut sfingolipidikeramidi aineenvaihdunta on yhteinen piirre monissa syövissä, mikä vähenemiseen seramidiksi ja /tai nousua S1P [10]. Siten sfingolipidikeramidi huumeet kehitteillä pyritään palauttamaan tämä aineenvaihdunnan tasapainon ja /tai parantamiseen keramidiin välittämää kuoleman syöpäsolujen tai kasvaimen mikrovaskulaarisessa [10], [11]. Useita hoitoja perustuu joko ylentävä pro-kuolema keramidi tai vähentämällä pro-eloonjääminen S1P ovat aktiivisesti tutkitaan, mukaan lukien käyttö seramidianalogit ja inhibiittorit ceramidases tai sfingosiini kinaasien [28]. Kuluneen vuosikymmenen aikana lukuisia papereita ovat selvitetty roolit keramidin, ja ASM erityisesti solujen signalointi ja mahdollisuuksia moduloivan tämän reitin syövän hoidossa [14], [29], [30]. Kolesnick ja kollegat oli ensimmäinen viittaa siihen, että lysosomaalisen entsyymin, ASM, voi olla rooli näissä prosesseissa, ja osoittaneet, että on tärkeää ASM syntyvän keramidiin radioherkkyyttä kasvainsolujen ja kasvaimen hiussuonten [31].

Tässä tuomme huomiota mahdolliseen soveltamiseen sfingolipidikeramidi mukauttamisen kokeellisen HCC käyttämällä rhASM, joka on tuotettu ihmisille ja arvioitiin entsyymikorvaushoidon tyypin B NPD potilailla. HCC on erityisen tappava kiinteä maligniteetti kasvava maailmanlaajuinen ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta [32]. Osittain, vaikeasta tulosten HCC potilailla johtuvat sairauden patogeneesiin, joka sisältää poikkeavan aktivaation suurten signalointireittien, kuten RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-kateniinin, IGF, HGF /c-MET ja angiogeneesissä [2].