Krooninen sairaus

tiivistelmä

fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) -mammalian rapamysiinin kohde (mTOR) signalointi-akselilla on tullut uutena kohteena syövän hoidossa. Aineita, jotka estävät PI3K, mTOR tai molemmat ovat parhaillaan kehitteillä. MTOR allosteeristen estäjä, RAD001, ja PI3K /mTOR dual estäjä, BEZ235, ovat esimerkkejä näistä aineista. Olimme kiinnostuneita kehittämään strategioita, joilla parannetaan mTOR kohdistetun Caner hoito. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että BEZ235 yksin tehokkaasti inhiboivat rapamysiinin-resistenttejä syöpäsoluja. Mielenkiintoista on, että yhdistelmä optimaalista pitoisuudet RAD001 ja BEZ235 kohdistetaan synergistisen kasvun eston ihmisen keuhkosyövän soluja yhdessä apoptoosin induktion ja G1 pidätys. Lisäksi yhdistelmä oli myös tehokkaampi kuin kumpikaan aine yksin kasvun estämiseksi keuhkosyövän hiirissä. Yhdistelmä osoitti parannettu vaikutuksia estämällä mTOR signalointia ja vähentää ilmentymistä c-Myc ja sykliini D1. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 on uusi strategia syövän hoidossa.

Citation: Xu C-X, Li Y, Yue P, Owonikoko TK, Ramalingam SS, Khuri FR, et al. (2011) Yhdistäminen RAD001 ja NVP-BEZ235 Kiinnostavuus Tehostemateriaalit Syövän Aktiivisuus ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e20899. doi: 10,1371 /journal.pone.0020899

Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 12 toukokuu 2011; Julkaistu: 14 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Georgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholar palkinto, NIH R01 CA118450 ja P01 CA116676 (Project 1), Department of Defense IMPACT (Imaging and Molecular tussit Potilaat, joilla Lung Cancer: lähestymisiä Molecular Targets, täydentäviä /uusien hoitomuotojen ja terapeuttinen yksityiskohtaiset) palkinto W81XWH-05-0027 (Project 5), BATTLE (biomerkkiaine lähestymistavat of Kohdennettu Therapy for Lung Cancer Elimination) palkinnon W81XWH-06-1-0303 (Project 4) ja BESCT (Biology, koulutus, seulonta, kemopreventioon ja Therapy) palkinto DAMD17-01-1-0689 (Project 2). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

K-Ras, LKB1 ja epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) usein mutatoitunut ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Nämä mutaatiot johtavat poikkeaviin aktivointi fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) /Akt /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) signalointireitin [1], [2], [3]. Siksi PI3K /Akt /mTOR-signalointireitin on tullut lupaava terapeuttinen kohde NSCLC.

RAD001 (Everolimuusi) on johdannainen rapamysiinin ja on toiminnallisesti samanlainen kuin rapamysiinin kuin allosteerinen estäjä mTOR. Potilailla, joilla on edennyt munuaissyövän aikaisemmin hoidettu VEGF kohdennettuja tekijöille, RAD001 parantaa ilman taudin etenemistä ja on siksi hyväksynyt Yhdysvaltain Food and Drug Administration tähän tarkoitukseen [4]. On myös havaittu parantavan ilman taudin etenemistä potilailla, joilla neuroendcorine syövät haima. Monissa muissa kiinteiden elinten pahanlaatuisten kasvainten, RAD001 ja muut rapamysiinianalogien (rapalogs) rapalogs aiheuttavat vaatimaton syöpälääkkeen vaikutuksia, että vaikka lupaavia, eivät riitä perusteeksi monoterapian näiden aineiden kanssa [5].

Viimeaikaiset pyrkimykset parantaa tehoa rapalogs ovat keskittyneet kehittämään uuden yhdistelmän strategioita. NVP-BEZ235 (BEZ235) on uusi ja suun kautta kaksi PI3K ja mTOR estäjä. Tämä yhdiste on tehokas reversiibeli estäjä sekä luokan I PI3K ja mTOR kinaasin katalyyttinen aktiivisuus kilpailemalla niiden ATP-sitoutumiskohtaan [6]. BEZ235 arvioidaan parhaillaan faasin I /II kliinisessä tutkimuksessa. Prekliinisissä tutkimuksissa, BEZ235 indusoi silmiinpistävää antiproliferatiivisia vaikutuksia sekä siirtogeenisiä hiiriä onkogeenisella K-Ras aiheuttama NSCLC ja NSCLC jotka ilmentävät kasvaimia synnyttävän K-Ras. Lisäksi se tehokkaasti sensitizes NSCLC solulinjat ilmentävät kasvaimia synnyttävän K-Ras pro-apoptoottisen ionisoivan säteilyn vaikutuksista sekä

in vitro

ja

in vivo

[7]. Kun BEZ235 yhdistettiin MEK estäjän, merkitty synergia saavutettiin kutistuu K-Ras mutantti hiiren keuhkosyövässä [8].

Kuten rapamysiini, RAD001 aiheuttaa Akt aktivoitumista ihmisen syöpäsoluissa lukien NSCLC-solut samalla estämällä mTOR signalointi [9]. Me raportoi hiljattain parannettu teho yhdistelmän RAD001 kanssa PI3K estäjän kasvuun NSCLC-solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

[9]. Mielenkiintoista, BEZ235 voisi voittaa rapamysiinin vastus, koska se esti kasvua rapamycin- tai RAD001 kestävästä NSCLC soluissa. Siksi arvioimme vaikutuksia yhdistelmän RAD001 ja BEZ235 kasvuun NSCLC-solujen ja totesi, että yhdistelmä oli tehokkaampi kuin kumpikaan aine yksin kasvun estämiseksi NSCLC-solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tässä raportissa ensisijaisesti dokumentoimaan tutkimustuloksia tässä suhteessa.

Materiaalit ja menetelmät

Reagent

RAD001 ja BEZ235 toimitti Novartis Pharmaceuticals Corporation (East Hanover, NJ), liuotettiin DMSO: hon ja säilytetään -80 ° C: ssa. Kaniinin polyklonaalista anti-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Vasta-aineita Akt, p-Akt (S473), p-S6 (S235 /S236), S6, p-4EBP1 (S65) p-4EBP1 (Thr37 /46), 4EBP1, eIF4G, EIF4E, ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), vastaavasti, hankittiin Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Goat polyklonaalinen mTOR (FRAP, N-19) ja hiiren monoklonaalinen c-Myc (9E10) -vasta-aineita ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), tässä järjestyksessä. Kanin polyklonaaliset Rictor (BL2178) vasta-aine hankittiin Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX). Hiiren monoklonaalinen sykliini D1-vasta ostettiin Dako (Carpinteria, CA).

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen NSCLC solulinjat A549, H460 ja H157 kuvattiin aiemmin [10]. HCC827 hankittiin American Type Culture Collection ATCC (Manassas, VA). Rapamysiini kestävä A549-solulinja (A549-RR) perustettiin aiemmin [9]. Nämä solulinjat kasvatettiin yksikerrosviljelmään RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka koostuu 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

Growth Inhibition Assay

Soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla soluviljelylevyille ja käsitellään seuraavana päivänä aineiden kanssa ilmoitettu. Elinkelpoisten solujen määrä arvioitiin käyttäen sulforodamiini B (SRB) -määrityksellä, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Yhdistelmä-indeksi (CI) lääkeinteraktion (esim synergia) laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ).

pesäkemuodostusta

vaikutukset tietyn huumausaineiden pesäkkeiden muodostumista levyillä mitattiin, kuten aiemmin on kuvattu [11].

Detection of apoptosis

apoptoosi arvioitiin anneksiini V-värjäyksellä käyttämällä anneksiini V-PE apoptoosin detektioreagenssipakkaus hankittiin BD Biosciences ( San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blot -analyysi

valmistaminen koko solun proteiinin lysaatit ja Western blot-analyysi on kuvattu aiemmin [12], [13].

m

7GTP Avattava varten analyysi eIF4F Complex Formation

eIF4F monimutkainen soluekstrakteissa havaittiin käyttäen affiniteettikromatografiaa m

7GTP-Sepharose kuten aiemmin on kuvattu [14].

Detection of mTOR komplekseja (mTORCs) B

mTORCs lukien mTORC1 ja mTORC2 immunosaostettiin vuohen polyklonaalisen mTOR (FRAP, N-19) vasta-aine ja seurasi Western-blottaus havaita mTOR, raptor ja rictor vastaavasti kuten aiemmin on kuvattu [9].

Keuhkosyöpä ksenoqraftit ja hoidot

Eläinkokeet hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja Emory University. Protokolla numero on 222-2008. Viidestä 6 viikon ikäisiä naaras kateenkorvattomiin (nu /nu) hiirten tilattiin Taconic (Hudson, NY) ja sijoitettu alle patogeenivapaissa olosuhteissa mikroisolaattorihäkkeihin häkkejä laboratorio ruokaa ja vettä

halun

. A549-soluja 5 x 10

6 seerumivapaassa väliaineessa injektoitiin s.c. kylkeen alueelle nude-hiirten. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet kooltaan noin 100 mm

3, hiiret satunnaistettiin neljään ryhmään (n = 6 /ryhmä) mukainen kasvainten ja kehon painot seuraavista käsittelyistä: vehikkelikontrolli, BEZ235 (20 mg /kg /päivä, og), RAD001 (3 mg /kg /päivä, og), ja niiden yhdistelmä. Tuumoritilavuudet mitattiin mittaharppimittauksilla kerran kahden päivän välein ja lasketaan kaavalla

V

= π (pituus x leveys

2) /6.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen merkitys erot kahden ryhmiä tai joukossa useita ryhmiä analysoitiin kaksipuolinen parittomia Studentin

t

testit (samanarvoisesta varianssit) tai Welch korjattu

t

testi (epätasainen varianssit) tai yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käyttämällä Graphpad InStat 3-ohjelmisto. Tulokset katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä

P

0,05.

Tulokset

BEZ235 estää tehokkaasti kasvu Rapamysiini vastustuskykyisten NSCLC Cells

tutkimatta ensin, perustimme rapamysiini kestävä solulinja (eli A549-RR). Tämä solulinja on myös vastustuskykyinen RAD001 [9]. Odotimme, että tämä solulinja on, ainakin osittain, kestävät BEZ235, koska se on PI3K ja mTOR dual estäjä. Yllättäen BEZ235 oli voimakasta kasvun eston A549-RR-solut (Fig. 1A). Lisäksi BEZ235 myös indusoi apoptoosia A549-RR-solut (Fig. 1 B). Itse asiassa, apoptoosin ja kasvun inhibitio BEZ235 oli hieman tehokkaampi A549-RR solu kuin vanhemman A549-solut (Fig. 1). Näin ollen, rapamysiini-resistentit solut eivät näytä ristiresistenssiä BEZ235.

, Ilmoitettu solulinjoja istutettiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla BEZ235 kuten toisena päivänä. 3 päivän kuluttua, solujen lukumäärät arvioitiin käyttämällä SRB-määritystä. Points, tarkoittaa neljää rinnakkaista määrityksen; baareja, ± SD.

B

, Määritettyjä solulinjat maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin sitten seuraavana päivänä eri pitoisuuksilla BEZ235 kuten on osoitettu. Kun oli kulunut 24 ja 72 tuntia, solut kerättiin ja altistettiin havaitseminen apoptoosin käyttämällä anneksiini V värjäystä. Pylväät, keinot kaksoismääritysten; baareja, ± SD.

Yhdistäminen RAD001 ja BEZ235 synergistisesti estää niiden kasvun NSCLC solut yhdessä induktio Apoptosis ja G1 pidätys

aiemmin osoittaneet, että yhdistelmä rapamysiinin tai RAD001 kanssa PI3K estäjän LY294002 johti parannettu kasvua estäviä vaikutuksia vastaan ​​NSCLC-solut sekä

in vitro

ja

in vivo

[9], [15]. Olemme nyt tutkineet onko yhdistelmä BEZ235 ja RAD001 kykenee täydennettiin syövän vastaista aktiivisuutta in NSCLC soluissa. Yllättäen huomasimme, että yhdistelmä pieninä pitoisuuksina BEZ235 ja RAD001 oli paljon tehokkaampi kuin kunkin yksittäisen aineen kasvun estämisessä useiden NSCLC solulinjoja (esim., A549, H460, H157 ja HCC827). CIS useimpien yhdistelmien olivat 1 (Fig. 2A, oikea paneeli), mikä osoittaa synergiavaikutukset hillitsevät kasvua NSCLC-solujen. Yhteisymmärryksessä yhdistelmä BEZ235 ja RAD001 oli merkittävästi tehokkaampi kuin kunkin yksittäisen aineen apoptoosin (Fig. 2B) ja G1 pidätys (Fig. 2C) (

P

0,001). Näin ollen parannettu induktio sekä apoptoosin ja solusyklin pysähtymisen edistää lisätyn kasvua estäviä vaikutuksia, joka on indusoitu.

, ilmoitettu solulinjoja istutettiin 96-kuoppalevyille ja sitten käsitellään seuraavana päivänä eri pitoisuuksilla BEZ235 (BEZ), RAD001 (RAD), ja niiden yhdistelmät, kuten on ilmoitettu. 3 päivän kuluttua, solujen määrä arvioitiin käyttämällä SRB-määritys ja CI laskettiin CompuSyn ohjelmisto (oikea paneeli). Points, tarkoittaa neljää rinnakkaista määrityksen; baareja, ± SD.

B

ja

C

, Määritettyjä solulinjat istutettiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin sitten 10 nM BEZ235 yksin, 2 nM RAD001 yksin, ja niiden yhdistelmä. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin havaitsemiseksi apoptoosin avulla anneksiini V värjäystä (

) ja solusyklin analyysi virtaussytometria (

C

). Pylväät, keinot kaksoismääritysten; Bars, ± SD. *,

P

0,05, **

P

0,01 ja ***,

P

0,001 verrattuna DMSO-kontrollin; ###,

P

0,001 verrattuna RAD001 tai BEZ235 yksin.

Yhdistäminen RAD001 ja BEZ235 estää tehokkaasti ja kasvua NSCLC Cell Colonies

lisäksi määrittää pitkän aikavälin vaikutuksia yhdistelmän RAD001 ja BEZ235 kasvuun NSCLC solujen pesäkemuodostusta. Tämä määritys antaa meille mahdollisuuden toistaa hoitoja pitkään (esim., 12 päivää). RAD001 annoksella 1 nM ja BEZ235 5 nM yksin oli vain vähäinen vaikutus tukahduttaminen pesäkkeen muodostumisen NSCLC-solujen; mutta yhdistelmä joko poistetaan pesäkkeen muodostumista (esim A549) tai rajusti yhdyskunnan numerot (esim H460 ja H157) (Fig. 3). Näin ollen on selvää, että yhdistelmä on paljon tehokkaampi kuin joko ainoana lääkkeenä estämään pesäkkeiden muodostuminen ja kasvu NSCLC-solujen (

P

0,001). Vertasimme myös vaikutusta sekvenssin antamisen kahden aineen kolonioiden muodostumista NSCLC soluja. Samoissa koeolosuhteissa edellä on kuvattu, peräkkäiset käsittelyt RAD001 ensin ja sen jälkeen BEZ235 käsittely (RAD001 → BEZ235) tai BEZ235 ensin ja sen jälkeen RAD001 käsittely (BEZ235 → RAD001) ilmeni vaikutuksia verrattavissa kunkin yksin minimaalinen vaimennus kasvun NSCLC solupesäkkeiden . Samanaikainen yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli paljon tehokkaampi kuin joko peräkkäinen hoidon muodostumisen estämiseksi ja kasvua NSCLC pesäkkeiden (

P

0,001) (Kuva. 2). Näin ollen, samanaikainen RAD001 ja BEZ235 on selvästi parempi kuin peräkkäisiä hoitoja kasvun estämiseksi NSCLC solupesäkkeiden.

ilmoitettu solulinjoja tiheyteen noin 200 solua /kuoppa siirrostettiin 24-kuoppalevyille. Toisena päivänä solut käsiteltiin 1 nM RAD001 (RAD), 5 nM BEZ235 (BEZ) tai niiden samanaikainen yhdistelmä (RAD + BEZ). Solut käsiteltiin myös 1 nM RAD001 ja 6 päivää ja sen jälkeen 5 nM BEZ235 vielä 6 päivää (RAD → BEZ) tai 5 nM BEZ varten 6 päivää ja sen jälkeen 1 nM RAD001 vielä 6 päivää (BEZ → RAD). 12 päivän jälkeen levyt värjättiin muodostumista solun pesäkkeet kristallivioletilla väriainetta. Kuva pesäkkeiden otettiin sitten digitaalikameralla (

) ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin (

B

). ***,

P

0,001 verrattuna DMSO-kontrollin; ###,

P

0,001 verrattuna kaikkiin muihin hoitoihin.

edelleen verrattiin yhdistelmän RAD001 ja LY294002 kanssa juokseva hoitoja pesäkkeiden muodostumisen NSCLC-solujen . Johdonmukaisesti, samanaikainen yhdistelmähoito, mutta ei peräkkäinen hoito joko RAD001 ensin ja sen jälkeen LY294002 tai LY294002 seurasi RAD001, tuotti täydennetty vaikutukset estämällä pesäkkeenmuodostusta NSCLC-solujen (kuvio. S1).

Euroopan yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 kykenee Augmented Aktiivisuus kasvua NSCLC nude-hiirissä

Koska lupaava kasvua estävää vaikutukset RAD001 ja BEZ235 yhdistelmän NSCLC soluissa

in vitro

, me sitten validoitu teho yhdistelmän kasvua vastaan ​​NSCLC hiirissä. Sekä RAD001 ja BEZ235 osittain, mutta merkittävästi esti kasvua A549 ksenograftien (

P

0,01); kuitenkin yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli merkittävästi tehokkaampi kuin kunkin yksittäisen aineen kasvun estämisessä ja ksenograftien mitattuna sekä kasvainten koot ja painot (

P

0,01) (kuviot. 4A ja 4B). Nämä

in vivo

tiedot osoittavat lisäksi, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 näyttää lisätyn syövän vastaista aktiivisuutta. Havaitsimme suurempi painon menetys hiirillä, joita hoidettiin yhdistelmällä (jopa 19% hiirien), erityisesti alkupuolella hoitojakson aikana. Painoero lopussa kokeen parani vain 13% kontrolli (Fig. 4C), mikä viittaa mahdollinen mukauttaminen ja paremmin sietokyky yhdistelmähoidon,

A549 ksenografteja hoidettiin (kerran päivässä) ajoneuvon ohjaus, RAD001 (3 mg /kg, og), BEZ235 (20 mg /kg, og), ja niiden yhdistelmä (BEZ + RAD) alkaen samana päivänä ryhmittelyn jälkeen. Kasvaimen koot (

) ja kehon paino (

C

) mitattiin kerran kahden päivän välein. 14 päivän kuluttua hiiret tapettiin ja kasvaimet poistettiin ja punnittiin (

B

). Kukin mittaus on keskiarvo ± SD (n = 6). Numerot

C

edustavat kehon laihtuminen yhdistelmä ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. *

P

0,05 verrattuna ajoneuvon valvonta; **

P

0,01 verrattuna ajoneuvon valvonta; ***

P

0,001 verrattuna ajoneuvon valvonta;

##

P

0,01 verrattuna RAD001 tai BEZ235.

Yhdistäminen RAD001 ja BEZ235 kiinnostavuus Enhanced Vaikutukset tukahduttamista koskevan mTOR signalointi ja alassäätely c Myc ja sykliini D1

perehtyä mekanismit, joiden yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 kohdistavat parannettu syövän vastaista aktiivisuutta, olemme analysoineet vaikutuksia yhdistelmän mTOR signalointi ja ilmaus sen säänneltyjen proteiinien verrattuna joko annettaisiin erikseen. Testatuilla annoksilla, BEZ235 oli minimaalinen vaikutus vähentää p-S6 tasot, mutta ei ole vaikutusta tasot p-4EBP1 (sekä S65 ja T37 /46), c-Myc: llä ja sykliini D1. Itse asiassa havaitsimme kohonneita 4EBP1 (T37 /46) (sekä A549 ja H157) ja c-Myc (esim H157). RAD001 2 nm voimakkaasti esti S6 ja 4EBP1 (S65) fosforylaatio, mutta ei alentamispolitiikka p-4EBP1 (T37 /46), c-Myc ja sykliini D1. Samanlaisia ​​BEZ235, RAD001 myös nostivat p-4EBP1 (T37 /46) ja c-Myc sekä A549 ja H157-soluissa. Kuitenkin yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 joko kumottiin lisääntyminen p-4EBP1 (T37 /46) (esim A549-solut) indusoiman yksin tai kohdistuu parannetun pystytään vähentämään p-4EBP1 (T37 /46) tasojen (esim in H157-soluissa). Tärkeää on, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli täydennetty vaikutuksia vähentämällä tasoilla c-Myc ja sykliini D1 sekä A549 ja H157-soluja verrattuna kunkin yksittäisen aineen yksinään (Fig. 5).

, Määritettyjä solulinjat maljattiin 10 cm: n halkaisijan soluviljelymaljoille ja käsiteltiin seuraavana päivänä, jolla on annettu pitoisuudet BEZ-235 puuttuessa ja läsnä RAD001 24 tuntia. Solut kerättiin sitten valmistamiseksi kokosolu-proteiinin lysaatit ja sen jälkeen Western blot-analyysi havaitsemiseksi merkitty proteiineja.

B

, Ilmoitettu solulinjoja käsiteltiin 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 tai niiden yhdistelmä. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin valmistelua koko solun proteiini lysaatit ja myöhemmät m

7GTP alasvetovastukset määrityksessä seurasi Western blot-analyysi tunnistaa tietyn proteiineja.

RAD001 lisääntynyt Akt fosforylaatio sekä A549- ja H157-solulinjoja kuten olemme aiemmin raportoitu [9]. Mielenkiintoista, pienillä annoksilla, BEZ235 myös lisääntynyt p-Akt tasolle. Läsnäolo BEZ235 on testattu annos vaihtelee joko heikosti vähensivät p-Akt indusoiman RAD001 (esim A549-solut) tai jotka eivät vaikuta RAD001 aiheuttama lisäys p-Akt (esim in H157-soluissa) (Fig. 5). Näyttää siis siltä, ​​että RAD001 ja BEZ235 yhdistelmä voi näyttää tehostettu vaikutus vaimennetaan mTOR signalointi ja ilmaus sen säännellyn proteiinien vähän tai ei lainkaan estäviä vaikutuksia Akt fosforylaatiossa.

Yhdistäminen RAD001 ja BEZ235 Kiinnostavuus Enhanced vaikutukset estäminen eIF4F Assembly

Koska mTOR signalointi tiedetään positiivisesti säädellä cap-riippuvaisten translaation aloituksen, me edelleen analysoineet vaikutuksia RAD001 ja BEZ235 yhdistelmä korkkia sitoutumiseen EIF4E ja eIF4G (esim eIF4F kokoonpano) kanssa m

7GTP-Sepharose vetää alas määrityksessä. Kuten esitetty kuvassa. 5B, RAD0001 ja BEZ235 yksinään alentanut eIF4G jotka vuorovaikutuksessa EIF4E. Kuitenkin yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli paljon tehokkaampi kuin kummallakaan aineella yksin vähentää määriä eIF4G sitoutumisen EIF4E. Opinnäytteet tulokset osoittavat selvästi, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 kiinnostavuus parannettu vaikutuksia tukahduttaa korkki sitoutuminen EIF4E ja eIF4G tai eIF4F kokoonpano.

Yhdistäminen RAD001 ja BEZ235 Ei osoita suurentunutta Vaikutukset inhiboimalla mTORCs

on tunnettua, että kokoonpano assosiaatiosta tai mTOR kumppaneidensa kanssa (esim raptor ja rictor) on välttämätön erillisen entsyymin toimintaa ja biologisia toimintoja. RAD001, kuten rapamysiini, estää mTOR signalointi estämällä kokoonpanoon mTORCs [16]. Niinpä edelleen määrätietoisesti onko yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 aiheutti tehostetun estäviä vaikutuksia kokoonpanoon mTORCs lukien mTORC1 (mTOR /Raptor) ja mTORC2 (mTOR /rictor). Tämän vuoksi teimme immunosaostuksella (IP) anti-mTOR-vasta kaatamaan sekä mTORC1 ja mTORC2 ja sitten seurasi Western-blottaus havaita raptor ja rictor että immunopresipitaatit. Kuten esitetty kuvassa. 6, BEZ235 oli vähäinen vaikutus pitoisuuksien vähentämistä raptor ja rictor Immunosaostumien, kun taas RAD001 vähensi olennaisesti tasot sekä raptor ja rictor vedettävä alas mTOR vasta-aineella. Yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli samanlainen teho kuin RAD001 yksin vähentäminen tasojen raptor ja rictor Immunosaostumien, mikä osoittaa, että yhdistelmä ei osoittaa parantunutta vaikutusta inhiboimalla mTORC1 ja mTORC2.

A549 -soluja käsiteltiin 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 tai niiden yhdistelmän. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin valmistelua koko solun proteiini lysaatit ja myöhempien IP-Western blottauksella.

Keskustelu

Kehittäminen rapamysiinin vastus on kriittinen kysymys hoidossa syövän kanssa rapamysiiniä ja sen analogit [17]. BEZ235 on PI3K ja mTOR dual estäjä [6]. Tutkimuksemme osoittaa, että BEZ235 inhiboivat rapamysiinin-resistenttien solujen ja indusoi apoptoosia yhtä tehokkaasti kuin se teki sovitetussa kantasoluja. Itse asiassa, rapamysiini-resistentit solut olivat hieman herkempiä kuin vanhempien solut BEZ235 (Fig. 1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että rapamysiini-resistentit solut eivät ole ristiresistenttejä BEZ235. Koska tämä solulinja oli osoitettu olevan täysin vastustuskykyisiä RAD001, havaintomme viittaavat siihen, että BEZ235 estää syöpäsolujen kasvua erilaisilla mekanismeilla, jotka välittävät toimia rapalogs. On mielenkiintoista tietää, jos BEZ235 hallussaan lisämekanismia yli kaksi esto PI3K ja BEZ235. Rinnalla, meidän tiedot myös sitä, että BEZ235 voidaan voittaa rapamysiinin vastus.

Vaikka BEZ235 estää sekä PI3K ja mTOR, yhdessä RAD001, se kohdistaa synergistiset vaikutukset kasvun estämisessä paneelin NSCLC-solujen osoitettiin 3 päivän yksikerrosviljelmään (jossa SRB-määritys) ja pitkän aikavälin 12 päivää pesäkemuodostusta (kuviot. 2 ja 3). Tämä synergia johtuu todennäköisesti tehostaa vaikutuksia solusyklin G1 pysähtymisen ja apoptoosin (Fig. 2). Yhteisymmärryksessä, yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli merkittävästi tehokkaampi kuin kumpikaan aine inhiboi kasvun ei-pienisoluisen keuhkosyövän nude-hiirissä (Fig. 4). Vuonna eläin tutkimuksessa olemme huomanneet, että yhdistelmä johtaneet merkittävää painonlaskua (jopa 19% kontrollista); kuitenkin, lopussa kokeen, hiiret, jotka saivat yhdistelmähoitoa näytti takaisin osan laihtuminen (13% kontrollista). Tämä viittaa siihen, että hiiret voivat sopeutua ja lopulta sietää hoidon yhdistelmällä RAD001 ja BEZ235. Tästä huolimatta meidän pitäisi tietää mahdollisia tehostettu aiheuttamien haittavaikutusten yhdistelmän taas yhdistelmä näyttää lupaavalta synergistinen syövän vastaista aktiivisuutta.

Hoito aikatauluja voi vaikuttaa lopputulokseen tietyn monimuotoiset hoito. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että peräkkäiset hoidot RAD001 seurasi BEZ235 tai BEZ235 seurasi RAD001 minimaalisesti esti kasvua NSCLC pesäkkeitä; sen sijaan, samanaikainen hoito RAD001 ja BEZ235 inhiboi oleellisesti kasvua NSCLC pesäkkeiden tai eliminoida pesäkkeen muodostumista (Fig. 3). Tämä pätee myös yhdistelmä rapamysiinin ja LY294002 (Fig. S1). Tuloksemme viittaavat siihen, että samanaikainen yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 voi olla optimaalinen jatkokehityksen yhdistelmän.

IC

50s (pitoisuudet estää 50% solukasvua) on BEZ235 ihmisen NSCLC soluissa vaihtelevat 10 100 nM (meidän julkaisematon data). Meidän yhdistelmä kokeita, me yleensä käytetään pieniannoksista valikoimat BEZ235 (esim 1-10 nM). Näillä annoksilla, BEZ235 oli heikko inhiboiva vaikutus p-S6 fosforylaation, mutta ei moduloi p-4EBP1 fosforylaation tai tasot c-Myc ja sykliini D1. Annoksella 2 nM, RAD001 esti fosforylaation S6 ja 4EBP1 (S65), mutta ei tukahduttaa 4EBP1 fosforylaatiota (T37 /46) ja c-Myc ja sykliini D1 ilme. Kuitenkin yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 esti tehokkaasti p-4EBP1 fosforylaatiota (at T37 /46) ja vähensivät c-Myc ja sykliini D1 (Fig. 5A). Lisäksi osoitimme, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 oli paljon tehokkaampi kuin joko ainoana lääkkeenä estämään korkki sitoutumisen EIF4E ja EIF4E tai eIF4F kokoonpano (kuvio. 5B), mikä tarkoittaa, että yhdistelmä saa aikaan parannetun estävä vaikutus cap-riippuvaisten aloittamista . Koska c-Myc ja sykliini D1 tiedetään säänneltävä mTOR signalointi cap-riippuvaisten proteiini käännös [18], meidän tiedot osoittavat, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 kiinnostavuus tehostetun vaikutuksen estämällä mTOR signalointi ja ilmaus sen säännelty onkogeenisten proteiineja (esim, c-Myc ja sykliini D1). Tämä vaikutus voi edistää synergististä aktiivisuutta kasvua vastaan ​​NSCLC-solujen

in vitro

ja

in vivo

yhdistelmällä RAD001 ja BEZ235.

Tässä tutkimuksessa RAD001 lisääntynyt Akt fosforylaatio sekä A549 ja H157-solut; tämä on yhtä mieltä meidän aikaisempien raporttien [9]. Testatuissa konsentraatioissa (esim, 1-10 nM), BEZ235 lisääntynyt p-Akt tasoja. Tämä havainto on sopusoinnussa aiemman raportin, jossa BEZ235 havaittiin lisäävän Akt fosforylaation pienillä annoksilla (esimerkiksi 10 nM) [19]. Se oli aiemmin osoittaneet, että korkeammat pitoisuudet BEZ235 tarvitaan (esim., 100 nM) estää Akt verrattuna (esim., 10 nM), joka tarvitaan inhiboimaan S6 fosforylaation [19]. Näin ollen näyttää siltä, ​​että BEZ235 ensisijaisesti hallussaan mTOR-inhiboiva aktiivisuus pieninä pitoisuuksina alueilla. Näin ollen on ymmärrettävää, että BEZ235 pieninä pitoisuuksina alueilla kasvaa Akt-fosforylaation, kuten voisi odottaa, joka rapalog [9], [15]. Mielenkiintoista on, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 ei vähentää p-Akt tasot, jotka olivat yhtä suuret kuin käsitellyissä soluissa RAD001 tai BEZ235 yksinään (Fig. 5). Ottaen huomioon, että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 tehokkaasti estää niiden kasvun NSCLC-solujen, kuten edellä on kuvattu, näyttää siltä, ​​että yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 voidaan käyttää parannetun syövän vastaista aktiivisuutta, joilla on kohonneet tasot p-Akt.

mTOR kykenee sen kriittiset roolit edistää solusyklin etenemisen ja soluproliferaation pääasiassa vuorovaikutusta muiden proteiinien kanssa, kuten raptor (muodostavan mTORC1) ja rictor (muodostaen mTORC2) [18], [20]. mTORC2 on yleensä ajateltu olevan epäherkkä rapalogs [18]. Kuitenkin pitkäaikainen hoito näillä mTOR inhibiittorit häiritsee kokoonpanoon mTORC2 osoituksena meille [9] ja muut [21]. Tässä tutkimuksessa, kun 24 h hoito, RAD001, mutta ei BEZ235, estävät tehokkaasti kokoamista tai aktiivisuutta sekä mTORC1 ja mTORC2. Yhdistelmä RAD001 ja BEZ235 eivät entisestään alentamispolitiikka raptor ja rictor Immunosaostumien (Fig. 6), jotka osoittavat, että yhdistelmä ei näy parannettu vaikutuksia estämällä kokoonpanoon mTORCs. Näiden havaintojen perusteella, me spekuloida, että tehostettu vaikutukset tukahduttaminen mTOR signaloinnin yhdistelmällä johtuu todennäköisesti niiden erottavat vaikutukset estämällä mTORC kokoonpano ja mTOR-kinaasiaktiivisuuden. On yleisesti sitä mieltä, että synergia saavutetaan yhtiö kahden lääkkeen toimivaa kautta erillisten mekanismien. Koska BEZ235 estää tehokkaasti kasvun rapamysiini-resistentit solut, on myös mahdollista, että synergiaa RAD001 ja BEZ235 kasvua vastaan ​​keuhkosyövän cells kautta tuntemattoman mekanismin BEZ235, joka tarvitsee lisätutkimuksia.

Yhteenvetona, nykyinen tutkimus on osoittanut, että yhdistelmä RAD001 ja PI3K /mTOR-estäjä BEZ235 synergistinen inhibitio kasvuun NSCLC-solujen

in vitro

ja

in vivo

ja muodostavat näin novel strategia tehostavat mTOR-kohdennettuja syövän hoitoon. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy perustelut arvioida tämän yhdistelmän kliinisissä tutkimuksissa potilailla, joilla rapalog herkkien ja tulenkestävät syöpäsairauksia.

tukeminen Information

Kuva S1.

samanaikainen yhdistelmä rapamysiinin ja LY294002 on tehokkaampi kuin peräkkäisiä hoitoja muodostumisen estämiseksi ja kasvun NSCLC pesäkkeitä. Ilmoitettu solulinjoja tiheyteen noin 200 solua /kuoppa siirrostettiin 24-kuoppalevyille. Toisena päivänä, solut käsiteltiin 1 nM rapamysiiniä (Rap) yksinään, 5 nM LY294002 (LY) yksinään, samanaikainen yhdistelmä rapamysiinin ja LY294002 (Rap + LY), rapamysiini ja 3 päivää, ja sitten kytketään LY294002 hoitoon (Rap → LY), LY294002 3 päivää ja sitten kytketään rapamysiinin hoitoon (LY → Rap). Sama sykliä hoitoja toistettiin joka 3 päivä. 12 päivän jälkeen levyt värjättiin muodostumista solun pesäkkeet kristallivioletilla väriainetta. Kuva pesäkkeiden otettiin sitten digitaalisella kameralla (A) ja pesäkkeet laskettiin (

B

).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020899.s001

(PDF)

Kiitokset

TKO, SSR, FRK ja S-Y.S.