Krooninen sairaus

tiivistelmä

Noin 50% potilaista, joilla lihas-invasiivisen virtsarakon syöpä (MIBC) kehittää metastaattisen sairaus, joka on lähes poikkeuksetta tappava. Kuitenkin käsityksemme polkuja, jotka ajavat aggressiivinen käyttäytyminen MIBC on epätäydellinen. Jäsenet FOXA alaryhmään transkriptiotekijöitä ovat sekaantuneet normaalissa urogenitaalimuutoksia kehittämiseen ja urologic syöpäsairauksia. FOXA proteiinit ovat osallisina normaalissa urothelial erilaistumiseen, mutta niiden rooli virtsarakon syöpä ei tunneta. Tutkimme FOXA ilmaisua käytetään yleisesti

in vitro

malleja virtsarakon syöpä ja ihmisen virtsarakkosyöpänäytteiden, ja käyttää uutta

in vivo

kudoksessa uudelleenyhdistelyjärjestelmässä määrittää toiminnallinen merkitys FOXA1 ilmaisun virtsarakon syöpä. Logistinen regressioanalyysi osoitti, väheni FOXA1 ilmentyminen liittyy kasvaimen lisääntyvän vaiheessa (p 0,001), ja menetys FOXA1 liittyy korkea histologinen (p 0,001). Lisäksi olemme havainneet, että virtsarakon uroteelin, joka on tehty keratinisoituvissa squamous metaplasia, edeltäjä kehittämiseen okasolusyöpä (SCC) oli menetys FOXA1 ilmaisun. Lisäksi 81%: ssa tapauksista SCC virtsarakon olivat negatiivisia FOXA1 värjäytyminen verrattuna vain 40%: urothelial solujen karsinoomat. Lisäksi osoitimme, että alapopulaatio FOXA1 negatiivisten urothelial kasvainsolut ovat erittäin proliferatiivisen. Knockdovvn FOXA1 vuonna RT4 virtsarakon syövän solujen lisännyt ilmentymä UPK1B, UPK2, UPK3A, ja UPK3B laski E-kadheriinin ilmentymisen ja huomattavasti solujen lisääntymistä, kun taas yli-ilmentyminen FOXA1 in T24-solujen määrä nousi E-kadheriinin ilmentymisen ja laski merkittävästi solujen kasvua ja hyökkäys.

In vivo

rekombinaation virtsarakon syövän solujen suunniteltu näytteille alentunut FOXA1 ilmaisu alkion rotan virtsarakon mesenchyme ja myöhemmät munuaisten kapseli siirteen johti tehostetun kasvaimen leviämisen. Nämä havainnot ovat ensimmäiset todisteet yhdistävät menetys FOXA1 ilmaisun histologisia alatyyppejä MIBC ja urothelial solujen lisääntymistä, ja ehdottaa tärkeä rooli FOXA1 että pahanlaatuinen fenotyyppi MIBC.

Citation: DeGraff DJ, Clark PE, Cates JM, Yamashita H, Robinson VL, Yu X, et al. (2012) menettäminen urothelial Differentiation Marker FOXA1 liittyy High Grade, myöhään Virtsarakon syövän ja Lisääntynyt kasvaimen leviämistä. PLoS ONE 7 (5): e36669. doi: 10,1371 /journal.pone.0036669

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 marraskuu 2011; Hyväksytty: 09 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 10, 2012

Copyright: © 2012 DeGraff et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: DJD oli tukema American Cancer Society Suurten järvien Division-Michigan Cancer Research Fund Postdoctoral Fellowship. PEC tukivat Yhdysvaltain National Institutes of Health (NIH) avustus K08-CA113452. Tutkimus myös tukee osittain NIH avustus CA143971 DT, Merit Review Award Veterans Administration XW, ja NIH avustus R01-DK55748 on RJM. Tämä tutkimus myös tukee osittain Vanderbilt CTSA avustus UL1RR024975-01 alkaen NCRR /NIH. Kirjoittajat haluavat tunnustaa teknistä asiantuntemusta ja neuvoja Doug Strand ja Simon Hayward suunnittelun aikana kudoksen -rekombinaatiokokeissa, ja tuen Michael Kidd, Tom asia ja Manik Paul, sekä virtsarakon syövän Research Network (BCRN), The virtsarakon syövän tukiverkoston (BCAN), ja Diane Zipursky Quale heidän tuestaan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: DJD, PEC, JMC, SFS, HFF, DT, ja RJM ovat jättänyt keksintöilmoitus Vanderbilt University käyttöön FOXA1 diagnostisena ja /tai prognostinen merkkiaine virtsarakon syöpään. Ei ole muita tuotteita kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

On arvioitu, että vuonna 2011 yli 69250 ihmistä Yhdysvalloissa diagnosoidaan karsinooma virtsarakon [1]. Enemmän kuin 90% virtsarakon syöpiä histopatologisesti luokitellaan urothelial solukarsinoomat (UCC), kun taas adenokarsinoomat, levyepiteelikarsinoomien (SCC) ja pienisoluista karsinoomat ovat harvinaisempia histologisia variantteja. Useimmat potilaat läsnä ei-invasiivisia sairauksia, mutta kehittyy usein toistuminen, joskus eteneminen stroomasoluihin hyökkäystä. Siten valppaana valvonta näistä potilaista ajoittain cystoscopy ja virtsan sytologian tarvitaan seuraavia kasvaimen hoitoon. Kliinisessä hoidossa potilailla, joilla on Ta tai Tis tauti on siis erittäin kallista [1]. Toisaalta, kliininen interventio jälkeen diagnoosi lihaksen invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC; kasvain stage≥T2) tyypillisesti edellyttää radikaalia cystectomy. Huolimatta aggressiivinen kirurgisia toimenpiteitä, noin 50%: lla potilaista, joille tehdään radikaaleja cystectomy kokevat tauti uusiutuu, yleensä muodossa etäpesäkkeitä. Kehittäminen etäpesäkkeitä on lähes poikkeuksetta tappava, ja on arvioitu vuonna 2011, että yli 14990 yksilöitä Yhdysvalloissa hukkuu metastaattinen virtsarakon syöpä Yhdysvalloissa [1].

Suhteessa muiden pahanlaatuisten kasvainten virtsarakon syöpä on vakavasti tutkittu ilmiö ja alirahoitettuja. Koska korkeat kustannukset valvonnan ja kuolleisuuteen potilailla, joilla on pitkälle edennyt sairaus, lisätoimia määritellä biologisia polkuja kriittinen tällaisia ​​painamalla kliinisiä ongelmia kasvaimen uusiutumisen sekä eteneminen lihasten invaasio, ja /tai kaukana etäpesäke tarvita. Yksi lähestymistapa on tunnistaa ne väyliä, jotka vaikuttavat normaalin erilaistumisen joita levoton aikana kasvaimen aloittamisen ja etenemiseen. Yksi ryhmä proteiineja, jotka näyttää olevan tärkeä rooli kehityksen ja valvonnan kudosspesifisiä ilmentymistä virtsarakon uroteeliin koostuu valitse jäsenistä Forkhead Box (FOX) perheen transkriptiotekijöiden. Useat viimeaikaiset raportit ovat sekaantuneet keskeinen rooli yksi tämän perheen jäsen, FOXA1, vuonna urothelial erilaistuminen [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Vaikka FOXA1 ilmentyy normaaleissa aikuisen hiiren ja ihmisen uroteelin, laajuus FOXA perheenjäsenen ilmentymistä virtsarakon syöpä on tuntematon. Koska muut FOX proteiinit ovat sekaantuneet kehittymistä ja etenemistä erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [8], me käynnistänyt tutkimuksen kuulustella FOXA perheenjäsenen ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa ja ihmisen kasvainten näytteissä, sekä määrittää toiminnalliset roolia FOXA1 kudoksessa rekombinaatio mallin urothelial kasvaimen solubiologian.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

De-tunnistettu ihmisen virtsarakon kudosnäytteitä saatiin Vanderbilt Tissue hankinta Core kautta patologian osaston mukaisesti Vanderbilt IRB protokollia. Kudossiruina luotiin aikaisemmin kuvatulla [9] peräisin de-tunnistettu ihmisen virtsarakkokudos saatu University of Virginia, ja käytettiin mukaisesti University of Virginia IRB protokollia. Kaikki potilaat allekirjoitti tietoisen suostumuksen hyväksymisestä käyttöä kudoksiin määrittelemättömistä tutkimustarkoituksiin. Kaikki kokeet, joissa käytetään eläimiä tehtiin määriteltyä Vanderbilt eläinten yhteyskäytäntönumero M-10-411, ja mukaan Animal Welfare Act ja hyväksynyt Vanderbilt Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Eläinten hoito /hyvinvointi ja eläimille valvonnasta saatiin Vanderbilt Divison Animal Care.

Soluviljely

Aiemmin toimintansa ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa RT4 [10] ja T24 [11] säilyivät McCoyn modifioitu väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. J82 [12], 5637 [13] ja UMUC-3 [14] ihmisen urothelial syöpäsolulinjoja viljeltiin DMEM L-glutamiinia ja runsaasti glukoosia (4,5 g /l; Mediatech), jota oli täydennetty 10% FCS: ää (Atlanta Biologicals) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (BioWhittaker /Cambrex). 253J-P ja 253J-BV [15] soluja saatu materiaalin siirtosopimuksen laboratoriosta Dr. Colin Dinney (University of Texas MD Anderson Cancer Center) ja viljeltiin MEM (Mediatech) lisätty 10% FCS (Atlanta Biologicals ), 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (BioWhittaker /Cambrex), 10 mmol /L natriumpyruvaattia (Mediatech), 1x ei-välttämättömiä aminohappoja (Mediatech) ja 2x MEM-vitamiinin liuosta (Mediatech). SCaBER soluihin [16] saatiin ATCC ja ylläpidetään Minimum essential medium (Eagle) (Invitrogen), joka sisälsi 10% FCS: ää, 2 mM L-glutamiinia (Mediatech) ja Earlen tasapainotettua suolaliuosta (Invitrogen) säädettiin sisältämään 1,5 g /l natrium- natriumbikarbonaatti, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1,0 mM natriumpyruvaattia. Aikaisemmin luotu ihmisen eturauhasen adenokarsinooma solulinjoja LNCaP [17] ja PC3 [18] ja hepatosellulaarista karsinoomaa HepG2 [19] pidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2.

PCR

RNA uutettiin RNeasy sarjat (Qiagen) valmistajan protokollan kanssa Dnase ruuansulatusta. Sen jälkeen cDNA monistettiin standardimenetelmien mukaisesti. PCR suoritettiin alukesarjoista ihmisen FOXA1 (fwd-CGCTTCGCACAGGGCTGGAT, rev-TGCTGACCGGGACGGAGGAG), FOXA2 (fwd-TGCCATGCACTCGGCTTCCA, rev-CCCAGGCCGGCGTTCATGTT), FOXA3 (fwd-CTGGCCGAGTGGAGCTACTA, rev-GAGGATTCAGGGTCATGTAGGA). Alukesekvenssit käyttää standardeissa PCR uroplakin selostukset on aiemmin raportoitu [20]. Alukesarjat Q-RT-PCR-analyysi sisältää UPK1A FWD-GGTGTGGGTGCCGCACTCTG, rev-GGTCGGTGTCCGCGCTGTAG), UPK1B (fwd-GCCCTACCGTGTGCGCAGAAA, rev-AGCAGGCCCTGGAAGCAACG), UPK2 (fwd- CTCTGCTGTCCCCAGGGGCT, rev-GGCAACCAGCAGGCTCTCCG), UPK3A (fwd-TCACTGGCACCCACGAGGTCT, REV- CGTTGAGCCCAGTGGGGTGTT), ja UPK3B (fwd- CCCTGGCCCTGGACCCTATCG, rev-CCACAGGCTGGAGAAGCGCA). GAPDH (fwd-TGCACCACCAACTGCTTAGC, rev-GGCATGGACTGTGGTCATGAG) käytettiin raportoitu aiemmin [21] sisäisenä kontrollina PCR-reaktioissa.

Human kudosnäytteitä

Tämä tutkimus käsitti kaksi erillistä potilasaineistoihin alkaen Vanderbilt University Medical Center ja University of Virginia Medical Center (yhteenveto taulukossa 1). Kaikki tutkimukset suoritettiin hyväksymisen jälkeen sisäisen Review Boards kussakin osallistuvien laitosten. Koko kudosleikkeet valmistettiin transuretraalisen endoskooppinen tuumoriresektion näytteitä 18 potilasta, joilla huono laatu vaiheen Ta tautia hoidettiin Vanderbilt University Medical Center. Kudosnäytteitä primäärikasvain näytteistä peräisin University of Virginia potilaan kohortin olivat edustettuina aiemmin kuvattua kudos microarray (TMA) [9]. Neljänä kudoksen ytimet (0,6 mm) elinkelpoisten kasvain kerättiin arkistoitu sinkki-formaliinikiinnitetyt kudosblokeista 167 cystectomy yksilöitä. Alkuperäinen patologia liukuu tarkistettiin tallentaa histologisen alatyypin ja laatu sekä vahvistaa patologinen vaiheessa kasvaimia. Kasvaimet histologisesti arvostellaan asteikolla 1-4, arvosanalla 4 kuin korkein arvosana. 19 potilaasta, jotka saivat neoadjuvant terapiaa, 6 käsiteltiin sädehoidon, 8 kemoterapiaa ja loput yhdistelmähoitoa kemosädehoito. TMA ryhmä koostui 112 urothelial karsinoomat, 21 okasolukarsinoomia, 5 ensisijainen virtsarakon adenokarsinoomat, 3 pienisoluinen (high-grade neuroendokriini) karsinoomat, 1 sekoitettu urothelial ja suomuinen karsinooma, 1 adenokarsinooma jossa sarcomatoid pesäkkeitä ja 2 urothelial karsinoomien kanssa sarcomatoid pesäkkeitä (taulukko 1). Lisäksi TMA University of Virginia koostui neljän rinnakkaisen kudoksen ytimet (0,6 mm) imusolmukemetastaaseja leikattiin 28 potilasta edustettuina primaarikasvaimen TMA (taulukko 1).

Lisäksi kasvaimeen näytteet, joille demografiset tiedot olivat saatavilla, kuten on kuvattu taulukossa 1, arkistointiin kudos koostuu kasvain ja normaali viereinen kudos (NAT) 10 potilaalla kystektomia pitkälle virtsarakon syövän Vanderbilt University kerättiin analysointia varten FOXA1 ja uroplakin. Lisäksi arkistointiin kudos koostuu 21 potilasta, joilla ei keratinisoituvien levyepiteelikarsinooma metaplasiaa tunnistettiin. Näiden, 2 potilaalla oli alueilla keratinisoituvissa squamous metaplasiaa, ja 15 potilaalla oli NAT, joka toimi kontrollina.

Immunohistokemia ja kaksi immunofluoresenssilla

Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22], [23]. Lyhyesti, dioja poistettiin parafiini, vedettömät läpi sarjan porrastettu alkoholien ja pestään kaksinkertainen deionisoidussa vedessä 5 minuuttia. Kudokset asetettiin sitten antigeenin paljastumista liuokseen (Vector Labs, Burlingame, CA), ja antigeeni haku suoritettiin mikroaaltouunissa näytteitä 20 minuutin ajan 30% teholla on 900 watin mikroaaltouunissa. Objektilasit jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan, ja pestiin sitten 3 kertaa 10 minuutin ajan PBS: ssä (pH 7,4). Immunohistokemiaa varten kaikki inkuboinnit suoritettiin huoneenlämpötilassa, ellei toisin mainita. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä Peroxidase salpausreagenssissa (Dako Pohjois-Amerikassa, Carpinteria, CA) 20 minuutin ajan, minkä jälkeen leikkeitä pestiin jälleen PBS: llä 3 kertaa 10 minuutin ajan. Valmistetut objektilasit inkuboitiin vuohen seerumissa 30 minuuttia ja vähentää ei-spesifisen vasta-aineen sitoutumisen. Diat missä sitten inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa 1:1000 laimennoksilla joko vuohen polyklonaalisen FOXA1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA), vuohen polyklonaalinen FOXA2 (Santa Cruz Biotechnology) tai yleiseurooppalainen uroplakin vasta-AUM [ ,,,0],24] laimennettu 1:5000 PBS. Objektilasit pestiin sitten 3 kertaa 10 minuutin ajan PBS: llä ja biotinyloidun sekundaarisen vasta-ainetta laimennettuna PBS: ään lisättiin sitten. Ensisijainen vasta-aine visualisoitiin käyttäen Vectastain Elite ABC Peroxidase Kit (Vector Labs) mukaan valmistajan protokollan kanssa DAB substraattipuskurilla kuin kromogeenilla (Thermo Scientific, Fremont CA). Sillä FOXA1 ja FOXA2, diat pisteytettiin läsnä tai ei ole erityisiä tumavärjäystä. Positiivinen kontrolli varten FOXA1 olivat hiiren villityyppisen eturauhasessa, ja positiivisena kontrollina FOXA2 oli eturauhasen kudosta aiemmin kuvattu probasiini-T-antigeenin //Dominant aktiivista beta-kateniinin bigenic hiirissä [21]. Yleiseurooppalaiseen UPK, läsnäolo tai puuttuminen sytoplasman immunoreaktiivisuuden kasvainsoluissa on tallennettu. Immunovärjäystä ihmisen virtsarakon kudosten suoritettiin varten levyepiteeli markkeri sytokeratiini 10 (1:100; Dako, Carpinteria CA), ja tyvisolusyöpä markkeri sytokeratiini 14 (1:200; Dako). Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin ihmisen virtsarakon kudosten vasta-aineiden kanssa Ki67 (1:100; Dako, Carpinteria, CA, klooni MIB-1) ja FOXA1 (1:100: Santa Cruz).

Stable Cell Line Generation

transfektoinnin jälkeen Phoneix pakkaus solujen, retroviruspartikkeleihin suodatettiin ja puhdistettiin, ja viruspartikkelit käytettiin infektio RT4 ja T24 tavoite virtsarakon solulinjat. Seuraavat retrovirusinfektion, RT4 solut puromysiini valittu vakaasti ilmaista FOXA1 kohdennettu shRNA konstrukti mikä laski FOXA1 lausekkeen (RT4-FOXA1 KD) tai sekoitetun shRNA ilmentävät kontrollisolut (RT4-Scr) mukaisesti valmistajan ohjeiden (Origene, Rockville, MD) . Samoin T24 soluja puromysiini valittiin virusinfektio vakaasti ilmentämään pLPCX sisältävän plasmidin FOXA1 insertin (T24-FOXA1) tai tyhjän vektorin (T24-pLPCX). Tiedot mikrosiruanalyysi kuvattu tässä käsikirjoitus talletetaan julkisesti saatavilla olevassa tietokannassa mukaisesti MIAME ohjeita.

Tissue rekombinaatiolait- ksenografti

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti institutionaalisten IACUC hyväksynnän. Eristäminen alkion virtsarakon mesenkyymin (eBLM), valmistamiseksi kudoksen rekombinantit, ja munuaiskapselin leikkauksia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [2]. Raskaana rotat (Harlan Laboratories, Tampa FL) tapettiin alkion päivänä 16 (E16) (plug päivä = 0). Rakot sitten microdissected yksittäisistä alkioiden ja alkion rakot erotettiin urogenitaalisinuksesta on virtsarakon kaulan ja liitteenä ureters huolellisesti hajoaviksi. Koko rakot pantiin sitten kalsium- ja magnesium-Hanks ’suolaliuosta (Gibco), joka sisälsi 25 mM EDTA: ta (Sigma, St. Louis MO), 90 min vapauttamiseksi virtsarakon uroteelin. Mesenkyymiä ja uroteeli erotettiin käsin alle mikroskooppinen tutkimus, jättäen mesenchyme takana kuin virtsarakon kuori. Viisikymmentä tuhatta RT4-Scr-solujen ja RT4-FOXA1 KD solut suspendoitiin uudelleen 50 mikrolitraa 3:01 suhde rotanhäntäkollageenin ja asetus liuosta, ja maljattiin 10 cm: n maljoihin. Sen jälkeen kun lisääminen 1 eBLM per näyte, kudoksen rekombinantteja sijoitettiin 37 ° C: ssa edistää jähmettymistä. McCoy modifioitu väliaine (Gibco), joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin sitten jähmettynyt siirteitä ja inkuboitiin yön yli. Seuraavana päivänä kaksi kudosta rekombinantit asetettiin munuainen kapseli vasen munuainen 5 SCID-hiiriin, mikä johtaa yhteensä 10 köynnöksen. Kolme viikkoa istutuksen jälkeen, hiiriin injektoitiin BrdU ja uhrataan. Dissektoitujen munuaiset sisältävä kudos rekombinantteja kiinnitettiin formaliiniin ja altistettiin standardin käsittely valmisteltaessa immunohistokemiaan. Eläinkokeet toistettiin kerran. Kasvaimen tilavuus mittaukset suoritettiin tavanomaisilla menetelmillä ja ne ovat edustettuina kertainen kasvaimen tilavuus.

Western blotting -analyysi

Western blotting -analyysi suoritettiin, kuten on raportoitu aiemmin [25]. Lyhyesti, solujen lysaatit valmistettiin Complete Lysis-M kit (Roche, Nutley NJ) kohti valmistus protokolla ja proteiinin pitoisuudet määritettiin tavallisella BCA-protokollaa (Pierce, Rockford, IL). Solulysaateista (30 ug) tehtiin elektroforeesi 10% Bis-Tris-geeliä 50 minuutin ajan 200 V: Sähköforeesisiirto nylon vahvistettu nitroselluloosakalvoille (Osmonics, Minnetonka, MN) suoritettiin yön yli 30 V, jonka jälkeen Ponceau- S värjäys (Sigma) varmistaakseen yhtäläiset Proteiinilisäyksen ja siirto. Kalvot blokattiin yön yli 5% rasvatonta kuivamaitoa (NFDM), 0,1% Tween 20 (Sigma) 1 x Tris puskuroidussa suolaliuoksessa. Seuraavana päivänä, nitroselluloosakalvot inkuboitiin vuohen anti-FOXA1 (Santa Cruz, 1/1000), anti E-kadheriinin (BD Biosciences, 1/1000) tai anti beeta-aktiini (Sigma; 1/1000) ja sen jälkeen tarkoituksenmukaista HRP- konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), laimennussuhteella 1/2000.

Kristalliviolettiliuos kasvun määrityksissä

Cells (5000 kuoppaa kohti) maljattiin 24-kuoppaisille viljelymaljoihin ( Falcon) ja annettiin kiinnittyä yön yli McCoyn elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 0,5 ug /ml puromysiiniä. Seuraavana päivänä viljelyalusta imettiin ja solut kiinnitettiin 11% glutaraldehydiä (Sigma) ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kiertoravistimella asetettu 500 sykliä /min. Sitten solut pestiin 3 kertaa upottamalla deionisoituun veteen ja sen annettiin kuivua ilmassa ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla liuotetaan 200 mM boorihappoa (Sigma), pH 8,0. Inkuboinnin jälkeen 20 minuuttia keinuravistelijalla, ylimäärä kristalliviolettia poistettiin sitten pesemällä deionisoituun veteen ja annettiin kuivua ilmassa. Kristalliviolettivärjäys liuotettiin sen jälkeen 10% etikkahappoa (Sigma), ja absorbanssi luettiin 590 nm: ssä seuraavan tausta vähennyslasku. Kristalliviolettia kasvun määritykset suoritettiin viisi päivää kolmena kappaleena ja toistettiin kahdesti.

In vitro invaasio määrityksissä

In vitro

invaasio-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [26]. Falcon soluviljelmässä insertit (8 um huokosia) pestiin kahdesti McCoyn elatusainetta ja sen jälkeen päällystetään 20 ui vähentää kasvutekijän Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ) laimennettiin 1:06 ja niiden annettiin kiinteytyä 30 minuuttia. RT4-Scr, RT4-FOXA1 KD, T24-pLPCX, ja T24-FOXA1 (1 x 10

5 /kuoppa) lisättiin yksittäisiin kaivoihin 200 ul: ssa, jos McCoyn elatusaineessa (10% FBS: ää, 0,5 ug /ml puromysiiniä) , ja 300 ui identtisiä väliainetta lisättiin alaosaan. Sen jälkeen, kun 24 ja 48 tunnin inkuboinnin väliaine imettiin alempaan kammioon, ja tunkeutuu solut kiinnitettiin 5% glutaraldehydiä liuotettiin 1 x PBS: ssä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja solut pestiin sen jälkeen deionisoituun veteen kolme kertaa. Tunkeutuneet solut värjättiin lisäämällä 0,5% toluidiinisinisellä (Sigma) 2% natriumkarbonaattia ja inkuboimalla 20 min, jonka jälkeen toluidiini väriainetta ja imettiin pois ylemmän ja alemman kammion, vastaavasti. Alaosaan pestiin sitten kolme kertaa deionisoidulla vedellä, ja ei-hyökkäsi solut poistettiin pyyhkimällä sisällä ylemmän kammion varovasti vanupuikolla, ja tunkeutuu solut laskettiin 20x tavoitteen. Invasion määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kahdesti.

Tilastollinen

Associations välillä ydin- FOXA1 ja FOXA2 värjäys ja ennusteeseen viittaavia parametreja arvioitiin käyttäen standardia yhden muuttujan menetelmiä. FOXA1 ja FOXA2 ilmentymistilanne tiivistäen kasvain vaiheessa imusolmukestatuksesta, histologisen tyypin ja laadun. χ2 testit yhdistymis- tehtiin välillä kahtia ilmaisun arvojen ja kunkin patologisen parametrin. Sillä FOXA1 ilme, logistinen regressio käytettiin testaamaan ennustaja ”kasvain vaiheessa”, kuten järjestysluku muuttuja viiteen luokkaan (Ta, T1, T2, T3 ja T4). Testit yhdistymis- tehtiin sekä koko datasarja ja osajoukon TCC näytteitä vain. Tilastollinen analyysi suoritettiin SAS 9.2. Kaikki testit arvioitiin α = 0.05. Tilastollinen arviointi eroja kasvaimen tilavuuden välillä RT4-Scrambled ja RT4-FOXA1 KD suoritettiin standardin yhden muuttujan menetelmiä, joissa p 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

FOXA1 ja FOXA2 ilmentyminen rajoittuu erityinen virtsarakon syövän solulinjoissa:

tutkimuksissa virtsarakon kehityksen, ydin- FOXA1 ilmentyminen havaittiin rajoituttava urothelial osastoon ja pidettiin aikuisten uroteeliin [27]. Sen sijaan

in situ

-hybridisaatio analyysit ovat osoittaneet ilmentymistä FOXA2 aikana alkion varhaiskehityksen [28], kun taas ilmentymistä ei ollut selvää myöhemmissä vaiheissa urothelial kehityksen tai uroteelin aikuisten rakkoja [27]. Ensimmäisenä askeleena kuvaavat ilmaus FOXA perheenjäsenten virtsarakon syövän, suoritimme RT-PCR: ää käytetään yleisesti ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa RT4, T24, J82, 5637, 253J, 253J-BV, UMUC3 ja SCaBER. Mielenkiintoista, vain RT4 solulinjaa, joka oli alun perin kasvatetaan hyvin eriytettyä kasvain [10], joissa esiintyi voimakasta FOXA1 ilme. Lisäksi, ekspressio FOXA1 liittyi läsnä UPK transkriptien (kuvio 1A), joka UPK2 käytetään urothelial differentiaatiomarkkeri. 5637-solut myös koekspressoi alhainen FOXA1 ja UPK mRNA. T24 solut ilmensivät hyvin alhainen FOXA1 ja UPK2, mutta osoitti myös todisteita FOXA2 ilmentymisen (Fig. 1A). Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi SCaBER solujen perustettu ensisijaisesta SCC kasvain osoitti FOXA1 ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi näissä verrattuna RT4 (Fig. 1 B). Yksikään solulinjoista tutkittujen ilmaistuna FOXA3, kolmasosa liittyvien jäsen FOXA perhe (tuloksia ei ole esitetty). Kuten FOXA1 ilmentyminen liittyi UPK in RT4 ja 5637 solut, tutkimme ilmaus näiden merkkiaineiden ihmisen virtsarakkosyöpänäytteiden. 10 näytteiden FOXA1 positiivinen NAT, ja FOXA1 negatiivinen liittyvä kasvain, 4 kasvaimia esiintyi negatiivisia AUM värjäystä, kun taas 6 kasvaimet säilytti AUM värjäytymistä (Fig. 1 C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että menetys FOXA1 ilmentyminen liittyy vähentynyt tai puuttuu UPK ilmentymistä käytetään laajalti ihmisen virtsarakon syövän solulinjat ja osajoukko ihmisen virtsarakon kasvainkudosta.

A: paneelin yleisesti käytetty urothelial solulinjoja seulottiin perinteisissä RT-PCR: n läsnäolo FOXA1, FOXA2, ja FOXA3 selostukset, sekä jäsenten uroplakin (UPK) perhe. HepG2-solut, jotka ilmentävät jokaisen jäsenen FOXA alaperheen, käytettiin positiivisina kontrolleina (dataa ei esitetty). RT4 solut osoittivat vahvaa ilmaisua FOXA1 ja kuten aiemmin raportoitu, UPK perheenjäsenet [20]. FOXA2 ekspressiota havaittiin T24-soluissa, mutta ei korreloi UPK perheenjäsenen ilme. FOXA3 ei havaittu missään testattu solulinja (tietoja ei esitetty). B: Q-RT-PCR-analyysi osoittaa FOXA1 ilmentymistä SCaBER solulinjassa peräisin ensisijainen SCC ja T24 on huomattavasti alhaisempi kuin RT4. C:Decreased FOXA1 ilmentyminen liittyy vähentynyt UPK ilmentymistä ihmisen kudosta. Arkistointi normaali viereinen kudos (yläpaneeli) ja lihasten invasiivisia virtsarakon kasvain immunovärjättiin yleiseurooppalaisella UPK vasta-omaisuudesta [24] sekä vastaan ​​kohdistettu vasta FOXA1. 10 näytteiden FOXA1 positiivinen NAT, ja FOXA1 negatiivinen liittyvä kasvain, 4 kasvaimia esiintyi negatiivisia AUM värjäystä.

FOXA1 Knockdown vuonna RT4 soluissa lisääntyy uroplakin ilmaisu

uroplakin (UPK) geeniperheellä ihmisillä koostuu UPK1A, UPK1B, UPK2, UPK3A ja UPK3B [29]. Vaikka vähentynyt FOXA1 ilmaus näyttäisi korreloivan vähentynyt UPK ilmaisua käytetään yleisesti virtsarakon syövän solulinjoissa, ja pienessä osassa ihmisen cystectomy näytteistä (kuvio 1), AUM vasta-Näissä tutkimuksissa käytettyjä tunnistaa kaikki jäsenet uroplakin perheen [30] . Lisäksi se oli aiemmin raportoitu, että knockdovvn FOXA1 johti sekä laskua että nousua ilmaisemisessa UPK perheenjäsenten [5]. Sen vuoksi oli epäselvää, jos muuttunut FOXA1 ilmentyminen johti muutoksiin yksittäisten uroplakin perheenjäseniä. Kuten RT4 ilmentävät FOXA1 ja kunkin jäsenen UPK perhe (kuvio 1), käytimme shRNA lähestymistapa insinööri vakaa RT4 solujen vähentynyt FOXA1 ilmaisun vaikutusten arvioimiseksi FOXA1 hiljentäminen on UPK lauseke (kuva 2). Mielenkiintoista, microarray tutkimuksia suoritetaan RT4-Scr ja RT4-FOXA1 KD osoitti FOXA1 KD liittyy lisääntynyt UPK perheenjäsenen ilme. Kvantitatiivinen RT-PCR tutkimukset RT4-Scr ja RT4-FOXA1 KD solujen validoitu tämän havainnon, joka osoittaa, että FOXA1 KD johti merkittävään kasvuun ilmaus UPK1B, UPK2, UPK3A, ja UPK3B (kuvio 2C-F). Näin ollen vaikka FOXA1 ja UPK menetetään useimmissa solulinjoissa perustettu korkealaatuisesta, MI kasvaimet ja osajoukko ihmisen cystectomy näytteiden FOXA1 KD RT4 soluissa johtaa huomattavasti UPK perheenjäsen ilmaisun

in vitro

.

V: Vakaa knockdovvn FOXA1 ihmisen RT4 virtsarakon syövän solut (kuva 6 FOXA1 proteiinin tasot seuraavat knockdown in RT4). B: Ei merkittäviä muutoksia UPK1A havaittu seuraavia FOXA1 KD. (CF): mRNA tasoilla UPK1B, UPK2, UPK3A, ja UPK3B olivat nousseet merkittävästi FOXA1 pudotus.

Loss of FOXA1 ilmentyminen liittyy pitkälle kasvaimen vaiheen ja korkea histologinen

määrittämiseksi, missä määrin FOXA1 ja FOXA2 ilmentymisen eri vaiheissa virtsarakon syöpä, teimme immunohistokemiallinen analyysi ihmisen kasvainnäytteissä (Fig. 3). Esiintyvyys FOXA1 ilmaisun, laskivat kasvaimen vaiheessa (taulukko 2). FOXA1 oli tasaisesti ilmaistu vaiheessa Ta rakkokasvaimista, verrattuna vain 67% vaiheessa T1 kasvaimia, 59% vaiheen T2 syöpiä, 42% vaiheen T3 kasvaimia, ja 34% vaiheessa T4 kasvaimet. Logistinen regressioanalyysi osoitti, että menetys FOXA1 ilmentyminen oli merkitsevästi lisääntymiseen liittyvien kasvain vaiheessa (p 0,001). Menetys FOXA1 ilmaisun tapahtunut myös kasvaimissa korkeamman histologinen (p 0,001; taulukko 2). FOXA1 oli myös negatiivinen useammin kasvaimia naispotilaiden. Kuitenkin tämä yhdistys ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä seuraavat normalisoinnin kasvaimen vaiheessa ja arvosana (p = 0,096). FOXA2 ei havaittu Ta vaiheeseen kasvaimia ja esiintyi vain 12% korkeampi vaiheen syöpiä. Ei ollut merkittäviä assosiaatioita FOXA2 ilmaisun ja kasvaimen vaiheesta tai histologinen.

AJCC vaiheessa Ta, T1, T2, T3 ja T4 rakkokasvaimista immunovärjättiin FOXA1 ja FOXA2. Edustavia tapauksia on havainnollistettu ylälevyissä. Tis alue on kuvattu potilaalla diagnosoitu AJCC T1 vaiheessa virtsarakon kasvain. Association välillä menetys FOXA1 ilmaisun ja kasvava vaihe vahvistettiin logistinen regressio (alapaneeli, p 0,001). Pieni alijoukko invasiivisen kasvaimet näytteillä ydin- ilmentymä FOXA2.

FOXA1 ilmentyminen vähenee merkittävästi keratinisoituvissa squamous metaplasiaa ja okasolusyöpää virtsarakon

Suurin osa virtsarakon syöpiä histologisesti todettu UCC. SCC on seuraavaksi yleisin histologista variantti virtsarakon syöpä. Tunnustettu esiaste SCC on kehittää keratinisoituvissa squamous metaplasiaa (KSM). KSM on erillinen ei-KSM, joka on suhteellisen yleinen ja hyvänlaatuinen. Koska ennuste potilailla, joilla on nonbilharzial SCC virtsarakon on erityisen vakava [31], vertasimme FOXA1 ilmentymistä KSM, ei-KSM ja SCC. Histologinen analyysi osoitti, että vaikka FOXA1 ilmaistiin ei-KSM (Fig. 4A, keskiösyvyys, vasen paneeli), ja päällekkäinen ilmaus CK14 positiivisia tyvisoluihin, FOXA1 ei ollut esitetty KSM (Fig. 4A) tai suurimman SCC (kuvio . 4B). FOXA1 ekspressio hävisi 81% SCC näytteistä (Fig. 4B) verrattuna 40%: UCC virtsarakon (Fisherin tarkka testi, p 0,001) (taulukko 3). Vaikka suurin osa SCC on diagnosoitu suhteellisen kehittynyt kasvain vaiheessa yhdistyksen välillä SCC ja FOXA1 tappio edelleen merkittäviä (p = 0,0043) jopa oikaisun jälkeen kasvaimen vaiheessa. Lisäksi FOXA1 värjäyksen TMA koostuu etäpesäkekasvainten talletusten Positiivisten imusolmukkeiden leikattiin 28 potilasta edustettuina primaarikasvaimen TMA (Fig. 4C) paljasti lisäksi yhdistyksen välillä FOXA1 menetys ja SCC. Pois alkuperäisestä 28 tapauksissa riittävä kudosta analyysia jäi vain 22 näytettä. Viisi tapausta imusolmukemetastaaseja (23%) olivat negatiivisia FOXA1 ilmaisua. Kolme 5 FOXA1-negatiivinen imusolmukkeiden (60%) leikeltiin joilla potilailla on diagnosoitu primaarinen SCC. Näistä 2 (yksi vaihe T4 ja yksi vaihe T2) on sovitettu FOXA1-negatiivinen ensisijainen kasvaimia, yksi oli sovitettu vaiheessa T3 primaarikasvaimen menetys FOXA1 ilmaisua. Loput 2 FOXA1-negatiivinen imusolmukemetastaaseja leikeltiin joilla potilailla on diagnosoitu vaiheen T3 TCC ja pienisoluinen karsinooma, jotka molemmat olivat negatiivisia FOXA1 ilmentymisen.

(A) H & E-ja immunovärjäys ei-keratinisoituvien al.