Krooninen sairaus

tiivistelmä

Metioniini syntaasi (MTR), jolla on keskeinen rooli ylläpitää riittäviä solunsisäisiä folaatin, metioniini ja normaali homokysteiinin pitoisuuksien, ajateltiin olevan osallisena kehittämiseen peräsuolen syöpä (CRC) ja peräsuolen adenooman (CRA) vaikuttamalla DNA: n metylaatio. Kuitenkin tutkimukset yhdistyksen välillä MTR A2756G polymorfismin ja CRC /CRA pysyvät ristiriitaisia. Teimme meta-analyysi 27 tutkimukset, mukaan lukien 13465 tapaukset ja 20430 säätimet CRC, ja 4844 tapauksissa ja 11743 säätimet CRA. Mahdollisia lähteitä heterogeenisyys ja julkaisun bias myös systemaattisesti tutkittu. Kaiken yhteenveto riskisuhde G variantin CRC oli 1,03 (95% CI: 0,96-1,09) ja 1,05 (95% CI: 0,99-1,12) ja CRA. Mitään merkittäviä tuloksia havaittu heterotsygoottinen ja homotsygoottisia verrattuna villin genotyyppi näiden polymorfismien. Vuonna kerrostunut analyysit mukaan etnisyys, lähde hallintalaitteiden, otoskoko, sukupuoli, ja kasvainpaikkaa, Mitään näyttöä geeni-tauti yhdistyksen saatiin. Tulokset meta-analyysi neljästä tutkimuksia MTR ryhmiteltynä tupakointi ja alkoholin juominen tila todettiin olevan suurentunut CRC riski runsaasti tupakoivat (OR = 2,06, 95% CI: 1,32-3,20) ja raskas juovat (OR = 2,00, 95% CI: 1,28-3,09) G-alleelin kantajia. Tämä meta-analyysin mukaan MTR A2756G polymorfismi ei liity CRC /CRA alttius ja että geeni-ympäristö vuorovaikutus voi olla olemassa.

Citation: Ding W, Zhou Dl, Jiang X, Lu Ls (2013) Metioniini syntaasin A2756G polymorfismi ja suolen kasvainten ja syövän: Evidence Based 27. Studies. PLoS ONE 8 (4): e60508. doi: 10,1371 /journal.pone.0060508

Editor: Valli De Re, Centro di Riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italia

vastaanotettu: 30 joulukuu 2012; Hyväksytty: 26 helmikuu 2013; Julkaistu: 09 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Ding et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin maligniteetti ja neljänneksi yleisin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Yli miljoona uutta tapausta CRC diagnosoidaan vuosittain, ja lähes 530000 yksilöitä kuolee CRC vuosittain [1]. Etiologia CRC on monimutkainen ja monitekijäinen. Perinnöllinen oireyhtymät, kuten familiaalinen adenomatoottisen polypoosin ja perinnöllinen polypoottinen CRC, tili 10% kaikista tapauksista [2]. Suurin osa tapauksista ajatellaan johtua monesta tekijöitä, joita ovat ruokavalion ja elämäntapojen ja /tai lievä geneettinen taipumus [3]. Suolen kasvainten (CRA) on tunnustettu esiaste CRC perustuu epidemiologisiin, histologisia ja geneettiset osoittavia tutkimuksia jaettu geneettisiä muutoksia [4], [5].

Matala saanti ravinnosta tai plasman folaatin on todettu lisäävät paksusuolen syövän riskiä (CRC) useilla tapaus-verrokki ja kohorttitutkimukset [6] – [8]. Folaatti on välttämätöntä synteesi S-adenosyyli-metioniinin, joka on metyyli-luovuttajan tarvitaan eri metylaation reaktioita soluissa [9]. Metylaation CpG sivustojen estää DNA transkriptio ja säätelee geenien ilmentymistä ja epätasapainoinen DNA: n metylaatio havaitaan johdonmukaisesti paksusuolen neoplasia [10], [11]. Kertyvät todisteet osoittavat, että DNA: n metylaatio on tärkeä rooli peräsuolen syövän synnyn [12].

Metioniini syntaasi (MTR), kromosomissa 1q43, koodaa yhtä useiden keskeisten osallistuvien entsyymien folaatti välittämää yksihiilisten aineenvaihduntaa. Se katalysoi metylaatio homokysteiinin metioniiniksi samanaikainen muuntaminen 5-metyyli-tetrahydrofolaatti (5-metyyli-THF) tetrahydrofolaatiksi (THF). MTR on välttämätöntä tarjota S-adenosyyli-metioniinin, universaali luovuttajan metyyli ryhmiä, samoin kuin tarjota THF: käytettäväksi nukleotidisynteesiä [13]. Yhteinen MTR variantti koostuu A-to-G siirtymän emäsparin 2756 ja johtaa muutosta asparagiinihapon glysiini kodonissa 919 (D919G) [14]. Vaikka välitön toiminnallinen vaikutus tämän polymorfismin ei ole osoitettu, on jonkin verran näyttöä siitä, että tämä voi olla aktivoiva polymorfismi; joissakin tutkimuksissa, yksilöiden GG-genotyyppi on korkeampi seerumin folaattipitoisuuksissa [15] ja alhaisempi homokysteiinipitoisuuksien [16], [17].

Yhdistyksen välillä MTR A2756G polymorfismin ja geneettinen alttius CRC ja CRA on laajalti dokumentoitu mutta ristiriitaisia ​​tuloksia. Yksittäinen tutkimus saattaa olla liian alimitoitettu havaita mahdollisen pieni vaikutus polymorfismin vaikutus CRC /CRA, varsinkin kun otoskoko on suhteellisen pieni. Lisäksi erilaisia ​​tutkimus väestön ja Tutkimuksessa voidaan myös edistää erilaisia ​​havaintoja. Auttaa selventämään epäjohdonmukainen havainnot teimme laajan meta-analyysin määrällisesti yleistä vaaraa MTR A2756G polymorfismin kehittämiseen CRC /CRA.

Materiaalit ja menetelmät

Literature Etsi Strategia

hyväksyttävät kirjallisuudessa julkaistu ennen loppua syyskuu 2012 tunnistettiin etsimään PubMed, EMBASE, Web of Science ja CNKI (China National Knowledge Infrastructure) tietokantoihin. Hakusana yhdistelmät olivat avainsanoja, jotka liittyvät metioniini syntaasi (esim ”metioniini syntaasi”, ”MTR”, ”yksi-hiili aineenvaihdunta”) yhdistettynä sanat liittyen CRC /CRA (esim ”peräsuolen syöpä”, ”peräsuolen kasvain” ”kolorektaalikarsinooma”, ”peräsuolen syöpä”, ”paksusuolen syöpä” ja ”suolen kasvainten”) ja ”polymorfismi” tai ”muutos”. Kaikki etsinyt tutkimuksia haettiin, ja niiden viitteet mukaan lukien asiaan arvioita myös käsin etsitään myös muihin asiaa koskevat tutkimukset. Jos useampi kuin yksi artikkeli julkaistiin käyttäen samaa tapauksessa sarja, ainoastaan ​​tutkimuksessa suurin näytekoko valittiin.

valintakriteerit ja Data Extraction

Tutkimukset mukana meta-analyysissä oli täytettävä kaikki seuraavat kriteerit: (1) alkuperäinen paperit sisältävien riippumatonta tietoa, (2) tunnistaminen CRC /CRA vahvistettiin patologisesti tai histologisesti, (3) riittävät tiedot laskemiseen kerroinsuhde (OR) ja sen 95%: n luottamusväli (CI) ja P-arvo, ja (4) tapausverrokkitutkimuksista tai kohorttitutkimuksessa ja (5) genotyyppi jakautuminen vertailupopulaatiossa on oltava Hardy-Weinberg tasapaino.

Kaksi tutkijat kopioi tietoa itsenäisesti. Kun se tuli ristiriitaisia ​​arviointeja päästyä keskustelun jälkeen kaikkien tekijöille. Tiedot kerättiin ensimmäisen tekijän sukunimi, julkaisuvuosi, etnisen Tutkittujen väestöstä (luokiteltiin ” ryhmä), otoskoko, kasvainpaikkaa (peräsuolen syöpä vs. paksusuolen syöpä), keski-ikä tapauksista ja valvonta, sukupuolijakauma tapauksissa ja valvonta, genotyypitysmenetelmää, tupakointi asema, alkoholin kulutus, vahvistus diagnoosi, Hardy-Weinberg tasapaino (HWE) asema, ja genotyypin esiintymistiheys tapauksissa ja valvontaa. Jos olennaisia ​​tietoja ei esitetty esineissä, joka pyritty ottamaan yhteyttä tekijöille.

tilastolliset menetelmät

MTR geeni, arvioimme riskit G-alleelin A2756G CRC /CAR verrattuna A-alleelin. Sitten arvioimme riskit Heterotsygoottisten ja homozygoottisia genotyyppien CRC /CAR, verrattuna villityypin AA homotsygootti. Vahvuus välisen assosiaation MTR-geenin ja CRC /CRA riski mitattiin syrjäisimpien alueiden 95% CI. Cochranin Khin neliö Q testiä käytettiin laskemiseen heterogeenisuus yksittäisissä tutkimuksissa. Random-tehosteet ja kiinteän vaikutus yhteenveto toimenpiteitä laskettiin käänteinen-varianssi painotettu keskiarvo tukin OR [18]. Tulokset random-vaikutusten yhteenveto raportoitu tekstissä, jossa otetaan huomioon vaihtelusta tutkimuksissa. Merkitys koko OR määritettiin Z-testi. Tutkimus koko (≥500, ja 500 tapausta), lähde valvonta (väestö vs. sairaaloiden), kansallisuus (Itä-Aasian, Kaukasian ja muut), sukupuoli, kasvaimen sivustoja (paksusuolen syöpä vs. peräsuolen syöpä) ja tyypit loppupisteet ( CRC vs. CRA) on ennalta määritellyissä kuin ominaisuuksien arvioimiseksi heterogeenisyys. Etninen ryhmä määriteltiin Aasian (esim, Kiina, Japani, Korea), valkoihoinen (so ihmiset eurooppalaista alkuperää), ym etninen väestö (sekoitettu tai tuntematon populaatiot). Myöhemmin meta-regressio suoritettiin lisätutkimuksia potentiaalisia heterogeenisyys-etnisyyden, otoksen koko, ikä ja sukupuoli, joilla määritellään arvioimiseksi Tutkimusten välisten eriäviä rajoitettu suurimman uskottavuuden. Arvioimme julkaisu bias käyttämällä liitännäinen menettelyä johtuvan Egger ym. [19], joka käyttää lineaarista regressio lähestymistapa mitata suppiloon juoni epäsymmetria. Mitata herkkyysanalyysi, kunkin tutkimuksen poistettiin puolestaan ​​kokonaismäärästä ja loput analysoitiin uudelleen. Tätä menetelmää käytettiin, jotta mikään yksittäinen tutkimus oli kokonaan vastuussa yhdistetyn tuloksia. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin kanssa Stata ohjelmistoversio 10.0 (Stata Corporation, College Station, TX). Kaikki P-arvot ovat kaksipuolisia on P = 0,05 tasolla.

Tulokset

Ominaisuudet Studies

Kuva S1 esittää tutkimuksen valintaprosessia. Kaikkiaan 27 tutkimuksia haettiin perustuu hakuehtoja CRC /CRA alttius liittyy MTR A2756G polymorfismi [20] – [46]. Päätutkimus ominaisuudet olivat yhteenveto taulukossa 1. On 22 tutkimuksia 13465 potilasta ja 20430 valvontaa koskevia CRC ja 6 tutkimuksissa 4844 potilasta ja 11743 valvontaa koskevia CRA. Genotyyppi jakaumat kontrolleissa kaikkien tutkimukset olivat yhdenmukaisia ​​HWE. Ominaisuudet tutkimusten sisälly nykyiseen meta-analyysi on esitetty taulukossa 1.

Meta-analyysin tulokset

Kuten kuviosta 1 ja taulukosta 2, ei merkittäviä assosiaatioita A2756G polymorfismi MTR ja CRC tai CRA alttius löytynyt.

Kun yleinen analyysissä 2756G ei merkittävästi kohonnut CRC riski. Käyttäen satunnainen vaikutus mallissa per-alleelin yleistä OR G variantin CRC oli 1,03 (95% CI: 0,96-1,09, p = 0,42), sekä vastaavat tulokset heterotsygoottinen ja homotsygoottinen 1,04 (95% CI: 0,96-1,12 P = 0,36) ja 0,99 (95% CI: 0,85-1,16, p = 0,91), vastaavasti. Tämä analyysi perustuu yhdistämällä tietoja useista eri etnisten väestöryhmien. Kun ositettiin etnisyys, OR = 0,99 (95% CI: 0,92-1,05, p = 0,66) ja 1,17 (95% CI: 1,00-1,36, p = 0,06) johti G-alleelin, valkoihoisilla ja Itäaasialaiset, vastaavasti. Tarkastelemalla ohjauslähde alaryhmiä, OR oli 1,01 (95% CI: 0,94-1,08, p = 0,81) väestön perustuvia tarkastuksia verrattuna 1,14 (95% CI: 0,97-1,33, p = 0,12) sairaaloiden valvontaa. Vuonna ositettu analyysi otoskoko, mitään merkittäviä yhdistysten havaittiin laajassa tutkimuksessa tai pieniä tutkimuksia. Vuonna alaryhmäanalyyseissa kasvainpaikkaa mitään merkittäviä yhdistyksiä havaittiin paksusuolen syövän ja peräsuolen syövän kaikissa geneettinen tiloissa. Tytäryhtiö analyysit sukupuolen saatiin per-alleeli OR miespotilaille 0,92 (95% CI: 0,82-1,02, p = 0,12) ja naispotilaille 1,02 (95% CI: 0,86-1,22, p = 0,81). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös heterotsygoottisten ja homotsygoottinen. Meta-regressioanalyysi kumpikaan etnisyys, otoskoko, eikä iän, sukupuolen korreloi suuruuteen geneettinen vaikutus (P 0,05 kaikille).

Tiedot genotyypit MTR A2756G polymorfismi joukossa tapauksia ja valvonta ositettu tupakointi ja alkoholin kulutus oli saatavilla neljässä tutkimuksessa. Joukossa runsaasti tupakoivat (≥40 paketti /vuosi) kaikissa neljässä tutkimuksessa, G-alleelin kantajia oli merkittävästi lisääntynyt CRC riski verrattuna villin AA genotyyppi kanssa OR = 2,06 (95% CI: 1,32-3,20; p = 0,001, P

heterogeenisyys = 0,29). Käyttäen hallitseva geneettinen malli, runsas alkoholin juovat (≥50 g etanolia /D ≥5 päivä /viikko) ja G-alleelin A2756G variantti oli huomattavasti CRC riskiä OR = 2,00 (95% CI: 1,28-3,09; P = 0,002, P

heterogeenisyys = 0,38).

Kaiken ei ollut näyttöä yhdistyksen välillä MTR A2756G ja CRA riski (G-alleelin: OR = 1,05, 95% CI: 0,99-1,12; heterotsygoottista : OR = 1,03, 95% CI: 0,94-1,12; homotsygoottinen: OR = 1,16, 95% CI: 0,94-1,43). Mitään merkittävää heterogeenisyyttä ei löytynyt sisältyi tutkimuksia (P 0,05). Analyysi rajoittuu 4 tutkimuksia vähintään 500 tapauksissa tuotti OR = 1,05 (95% CI: 0,99-1,12) G-alleelin.

herkkyysanalyysi ja julkaiseminen Bias

Yksi tutkimus mukana meta-analyysi poistetaan joka kerta heijastaa in fl uence yksittäisten tietojen asetettu yhdistettiin OR, ja vastaavien yhdistettyjen OR ei olennaisesti muuttunut, mikä viittaa siihen, että tulokset meta-analyysissä, ovat stabiileja (tuloksia ei ole esitetty ). Kuten kuvassa S2, muoto suppilon juoni tuntui symmetrinen, mikä viittaa siihen ole julkaistu bias keskuudessa tutkimuksiin osallistui. Egger testi osoitti myös mitään näyttöä julkaisemisesta bias suhteessa alleeli tai genotyypin vertailu (P 0,05, kaikille).

Keskustelu

Geenit yhden hiili aineenvaihduntatie voi mukauttaa riskiä CRC ja CRA vaikuttamalla metyyliryhmällä saatavuuden DNA: n metylaatio reaktioita tai nukleotidisynteesiä [11], [28], [34], [47], [48]. Se on tällä hetkellä uskotaan, että ehkä jopa 30% paksusuolen syövän syöpien on ominaista tässä CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP), jossa lukuisia CpG-saarekkeiden ovat metyloidut ja tuumorisuppressorigeenit, kuten solu- syklin säädin, p16, ovat inaktivoitu [ ,,,0],49], [50]. Tuore tutkimus osoitti, että 60% peräsuolen adenoomien ovat poikkeuksellisen metyloituja ainakin yhteen lokukseen. Lisäksi CpG-saarekkeen metylaation fenotyypin on osoitettu suurten peräsuolen adenoomien ja adenoomia kanssa putkimainen tai villous histologian [51], [52]. Tämä on laajin meta-analyysi tutki A2756G polymorfismin MTR ja suhde alttiuteen CRC ja CRA. Sen vahvuus perustuu kertyminen Julkaistujen tietojen annetaan enemmän tietoa havaita merkittäviä eroja. Kaikkiaan meta-analyysissä mukana 26 tutkimusten joka tarjosi 18309 tapauksia ja 32034 valvontaa.

Tässä laajamittaista meta-analyysissä, yhdistetty näyttö viittasi siihen, MTR A2756G polymorfismi ei edistänyt kehitystä CRC tai CRA. Sillä alaryhmäanalyysissä etnisin perustein, otoskoko, lähde hallintalaitteiden, kasvain sivusto, ja sukupuoli emme voineet havaita mitään vaikutusta muutos, joka on linjassa yhdistetyssä analyysissa. Tiedot tutkimuksista ei ilmennyt tilastollisesti merkitsevä heterogeenisyys useimmissa kontrasteja. On joitakin mahdollisia syitä ristiriitaisia ​​tuloksia alussa raporteissa. Ensinnäkin, etniset erot voivat jakaa näihin erilaisiin tuloksiin, koska jakaumat A2756G polymorfismin olivat erilaiset eri etnisten väestöryhmien. Itse asiassa, jakelun harvinaisempia G alleelin vaihtelee laajasti eri rotuja, joiden esiintyvyys ~ 14% keskuudessa Itäaasialaiset, -20% valkoihoisilla. Toisaalta, tutkimuksen suunnittelu tai pieni otoskoko tai jotkin ympäristötekijät voivat vaikuttaa tuloksiin. Useimmat näistä tutkimuksista ei pitänyt useimmissa tärkeissä ympäristötekijät. On mahdollista, että vaihtelu tässä lokuksessa on vähäinen vaikutus CRC /CRA, mutta ympäristötekijät voivat vallita edistymistä CRC /CRA, ja naamio vaikutukset tämän vaihtelun. Erityiset ympäristötekijät, kuten elämäntapojen ja tupakointi on jo hyvin tutkittu viime vuosikymmeninä [53], [54]. Harkitsematon tekijät sekoitukset voi kattaa aseman MTR polymorfismin. Näin ollen, vaikka vaihtelu on syy vaikutus CRC, se voi kestää kauan noudatettava. CRC /CRA on monimutkainen sairaus, sekä ympäristö- ja geneettiset tekijät ovat mukana sairauden kehittymiseen. Siten vaikutus yksittäisen geneettisen tekijän riskiä CRC /CRA voi olla voimakkaampia on muita yhteisiä geneettisiä tai ympäristöön riskitekijöitä, kuten tupakointi, punaisen lihan kulutusta, ja alkoholin väärinkäyttö.

Alkoholinkäyttö on vaarallinen vaikutus foolihappometaboliaan, joka on läheistä sukua DNA: n metylaation kautta. Valitettavasti lähes kaikki tutkimukset eivät tutkia vuorovaikutusta MTR genotyypin ja alkoholin juominen tottumukset. Tämä oli luultavasti vähäisen tilastollinen voima yksittäisistä tutkimuksista havaita vuorovaikutusta. Tuloksemme osoittavat merkittävää yhdistys keskuudessa runsaasti juovien alaryhmään välillä MTR A2756G polymorfismin ja CRC riski. Alkoholin juominen estää folaatin imeytymistä suolesta, keskeyttää folaatti vapautumista maksassa, ja edistää erittyminen virtsaan folaatti kehosta [55], jotka kaikki johtavat vähensi seerumin folaatin [56], joista 5-metyyli-tetrahydrofolaatista on hallitseva komponentti. Säännös 5-methyltetrahydrofolate on ratkaisevan tärkeää metioniini syntaasia katalysoimaan homokysteiinin remetylaatiossa metioniinia. Lisäksi, alkoholin nauttiminen voi suoraan vaikuttaa entsymaattisen aktiivisuuden metioniinin syntaasin [57]. Edelleen alkoholin vaikutuksen saanti voi vaihdella yksilöiden välillä eri geneettinen alttius. Havaintomme välistä vuorovaikutusta MTR A2756G ja alkoholin kulutus viittaa siihen, että DNA: n metylaation reitti on osallisena kehittämiseen peräsuolen syöpä. Tupakoinnin on vakiintunut riskitekijä moniin syöpiin. Yhdistämällä kerätyt tiedot tupakoinnista ja MTR genotyyppejä, havaittiin tilastollisesti merkitsevä 2,00-kertaisesti lisääntynyt riski CRC ilmestyi yksilöille liittyy riski G-alleelin verrattuna yksilöiden villi AA genotyyppi. Tämä tulos viittaa siihen, että läsnä sekä kaksi riskitekijöiden huomattava määrä CRC tapauksia tapahtuisi.

Joitakin rajoituksia tulisi ottaa huomioon tulkittaessa tuloksemme, niiden lisäksi, jotka periytyvät meta-analyysi . Ensinnäkin alaryhmä meta-analyysit huomioon vuorovaikutukset MTR genotyypin ja tupakointi sekä alkoholin juominen, tehtiin perusteella murto-osa kaikista mahdollisista tiedot jaettavan, joten valinta bias saattanut tapahtua, ja meidän tulokset voivat olla ohi fl ated. Toiseksi, meidän tulokset perustuvat oikaisemattomaan arvioihin, kun taas tarkempaa analyysiä voitaisiin tehdä, jos kaikki yksittäiset raaka tietojen puuttuessa, mikä mahdollistaisi säädön muiden co-muuttujien kuten ikä, sukupuoli, juominen tila, savukkeiden kulutusta, ja muut elintapoihin liittyvien tekijöiden. Ihannetapauksessa haluaisimme yhdistää yksilötason tietoja. Tämä ei kuitenkaan ole mahdollista, esillä olevassa tutkimuksessa. Lisäksi suuri ja hyvin suunniteltu tutkimuksia tarvitse tehdä edelleen vahvistamaan tuloksemme. Kolmanneksi, koska vain julkaistuja tutkimuksia haettiin meta-analyysissä, julkaisu bias voisi olla mahdollista, vaikka tilastollinen testi ei näytä sitä.

Johtopäätöksenä meidän meta-analyysi osoittaa, että ei ole yhdistyksen välillä MTR A2756G polymorfismi ja CRC /CRA. Kuitenkin A2756G polymorfismi MTR voivat mukauttaa tupakkaan liittyviin sekä alkoholiin liittyviä synnyssä CRC. Tuleville yhdistys tutkimukset, tiukka valinta potilaiden ja suurempien otoskoko eri etnisten väestöryhmien tarvitaan. Lisäksi geeni-geeni ja geeni-ympäristön vuorovaikutukset olisi myös harkittava.

tukeminen Information

Kuva S1.

Study valintaprosessi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060508.s001

(TIF) B Kuva S2.

Funnel juoni yhdistyksen välillä MTR A2756G polymorfismin ja CRC /CRA yleistä yksilöitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060508.s002

(TIF)

tarkistuslista S1.

PRISMA tarkistuslista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060508.s003

(DOC) B