Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Proteiini glykosylaatio on tärkeä translaation jälkeisen modifikaation osoitettu voidaan muuttaa kaikissa kasvaintyypeissä tutkittu tähän mennessä. Musiiniglykoproteiinien on perustettu tärkeiksi kantajia

O-

liittyy glykaanien mutta muita glykoproteiineja näytteille muuttunut glykosylaatio kokoelmien ole vielä tunnistettu mutta tarjoavat potentiaalia biomarkkereita metastaattinen.

Menetelmät

tässä tutkimuksessa glycoproteomic lähestymistapaa käytettiin tunnistamaan glykoproteiinien esillä muutoksia glykosylaation kolorektaalisyövässä ja arvioida muutoksia

O-

kytketty glykosylaatio yhteydessä p53 ja KRAS (kodoni 12/13 ) mutaatio tila. Affinity puhdistus hiilihydraattia sitovan proteiinin

Helix pomatia

agglutiniini (HPA) kytkettiin 2-ulotteinen geelielektroforeesilla massaspektrometrialla tunnistamisen mahdollistamiseksi alhaisen runsaus

O-

glykoproteiinien ihmisen peräsuolen syövän yksilöitä.

tulokset

Aberrant

O-

sitoutunut glykosylaatio havaittiin olevan varhainen tapahtuma, joka tapahtui riippumatta p53 ja KRAS asema ja korreloi metastasoituneen kolorektaalisyövän . Affinity puhdistus käyttämällä lektiinin HPA seurasi proteomiikka-analyysi paljasti anneksiini 4, anneksiini 5 ja CLCA1 on lisääntynyt metastasoituneen kolorektaalisyövän yksilöitä. Tulokset validoitiin käyttäen edelleen riippumaton joukko yksilöitä ja tämä osoitti merkittävää yhdistyksen välillä värjäytyminen pisteet anneksiini 4 ja HPA ja aikaa etäpesäkkeiden; itsenäisesti (anneksiini A4: Chi square 11.45, P = 0,0007, HPA: Chi square 9,065, P = 0,0026) ja yhdistelmänä (anneksiini 4 ja HPA yhdistetty: Chi square 13,47; P = 0,0002).

Johtopäätös

glykoproteiineja joka osoittaa muutoksia

O-

kytketty glykosylaatio metastaattisessa kolorektaalisyövässä on tunnistettu. Glykosylaation muutokset olivat riippumattomia p53 ja KRAS tila. Nämä proteiinit tarjoavat potentiaalia lisäselvitysten biomarkkereina ja mahdollisina kohteina metastasoituneen kolorektaalisyövän.

Citation: Peiris D, Ossondo M, Fry S, Loizidou M, Smith-Ravin J, Dwek MV (2015) tunnistetiedot

O

-sidoksellinen glykoproteiineja Sitoutuminen Lectin

Helix pomatia

Agglutinin koska merkkiaineet metastaattisen kolorektaalisyövän. PLoS ONE 10 (10): e0138345. doi: 10,1371 /journal.pone.0138345

Editor: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 15 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 28 elokuu 2015; Julkaistu: 23 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Peiris et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat rintasyöpää vastaan, rekisteröity Charity Number 1121258 (rahoitetaan DP ja SF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Taustaa

Glykosylaatiota on tärkeä translaation jälkeinen muutos, joka on osoitettu muuttaa kaikissa syöpätyypeissä tutkittu tähän mennessä. Geenit, jotka koodaavat entsyymejä, jotka osallistuvat glykosylaatioreaktiot osuus on noin 1% ihmisen genomin selittää lukemattomia glykosylaation muutokset raportoitu syöpää. Etäpesäkkeiden levittämisen solujen primaarikasvaimen kaukaisiin elimiin, on merkittävä ongelma, joka vaikuttaa potilaiden diagnosoitu peräsuolen syöpä (CRC) [1]. Niinpä varhainen diagnosointi metastaattisen CRC on tärkeä tavoite ja uusia ennustetekijöitä merkkiaineita tarvitaan tunnistaa potilaat on suurin riski sairastua etäpesäkkeiden jotta onkologit räätälöidä hoitostrategioita riskiryhmiin of patients.Alterations glykosylaation on osoitettu liittyvän kanssa metastaattisen käyttäytymisen kasvainsolujen [2,3], ja voidaan tunnistaa käyttäen hiilihydraattia sitovia proteiineja, lektiinejä, jotka on eristetty monenlaisia ​​organismien, kuten bakteerien, kasvien, selkärangattomien ja selkärankaisten [4]. Lektiini

Helix pomatia

agglutiniini (HPA) tunnustetaan

O-

liittyy glykaanirakenteet [5,6] ja ensimmäisen osoitettu sitoutuvan valikoivasti rintasyövän potilaiden huonon ennusteen [2] [ ,,,0],7]. Hyödyllisyyttä HPA havaitsemiseksi metastaattinen on sittemmin esitetty erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia mukaan lukien ruoansulatuskanavassa, esimerkiksi peräsuolen, maha- ja ruokatorven kasvainten [8-11]. Glykoproteiinit tunnustettu HPA tutkittujen CRC solulinjat ja tämä osoitti, että hyödyllisyys HPA on sen kyky sitoutua samanaikaisesti monia glykoproteiineja mukana erilaisia ​​pro-metastaattisen toimintoja kuten solujen vaeltamiseen, anti-apoptoosin ja solusignalointia [12]. HPA: n on osoitettu sitoutuvan samaan glykoproteiinien rintasyövän kuin havaitaan HT29 rohkeita, että HPA tunnistaa muutokset glykosylaation, jotka ovat yhteisiä koko kiinteän kasvaimen tyyppejä. HPA tunnistaa glykoproteiineja modifioitu kiinnitys

O-

liittyy

N

-acetylgalactosamine (

O-

GalNAc) ja

N

-acetylglucosamine (

O-

GlcNAc) [13]. Syöpä liittyvät muutokset

O-

kytketty glykosylaatio on tunnustettu jo jonkin aikaa, mutta on ollut verrattain vähän tutkimuksia koskee kartoittamalla proteiineja, johon muuttunut glykaaneja attached.In olevassa tutkimuksessa, lektiini HPA käytettiin tunnistaa

O-

glykoproteiinien CRC kudosten, jotka olivat metastaattinen imusolmukkeisiin. Proteiinit ennalta rikastettiin lektiini affiniteettikromatografialla ja erotettiin kaksiulotteisella geelielektroforeesilla (2-DE) ja sen jälkeen tunnistaminen käyttämällä massaspektrometriaa (MS). Tarkastaminen glykoproteiinien tunnistettu suoritettiin immunohistokemiallisesti ja Western blottauksella. Korrelaatio HPA sitova; mutatoidun p53 KRAS ja CEA tilan kudosnäytteiden on arvioitu tarkoituksena ymmärryksen

O-

kytketty glykosylaatio yhteydessä muiden merkkiaineita CRC. Validointitutkimus jossa vielä kokoelma CRC näytteet riippumaton alkuperäisen näytteen kohortin osoitti, että muutokset

O-

kytketty glykosylaatio tunnustettu HPA pysyvät yhteydessä huonoon ennusteeseen CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit saatiin Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK, ellei toisin mainita.

Potilasnäytteet

proteomic Tutkimukseen osallistui 27 potilasta, joilla ensisijainen CRC, tiedetään olla vapaa maksametastaaseista, jotka kaikki tehtiin kirurginen resektio yliopistollisessa sairaalassa, Martinique (S1 taulukko). Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Medical School Martiniquen ja University Research eettisen komitean (UREC) yliopiston Westminsterin. Kaikki potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksensa näytteitä voidaan käyttää tutkimuksessa. Näytteet snap-jäädytettiin leikkauksen jälkeen ja vastaavat näytteet kiinnitettiin formaldehydillä ja upotettu parafiiniin histopatologista tutkimuksiin. Kunkin syövän kudosnäytteestä, normaali kudos kerättiin kasvaimen vapaat alueet viereisen limakalvon säteellä 4 cm kasvain. Potilaat luokiteltiin kahteen ryhmään perustuen asteeseen osallistumisen alueellisten imusolmukkeiden. Kaikki kudokset käytetään tutkimuksessa tutkittiin ja tarkasti läsnäolo kasvainsolujen avulla hematoksyliinillä ja eosiinilla-värjätään dioja. Validointi Teos käyttäen parafiiniin oli upotettu lohkojen CRC kudoksesta kerätään Lontoon yliopistollisessa sairaalassa (ennen 2006) ja käytetään mukaisesti Human Tissue laki (2008).

Histochemistry

Euroopan immunohistokemia käytti piparjuuriperoksidaasi (HRP) havaitsemisjärjestelmä (EnVision kit plus Dual link järjestelmä-HRP monimutkainen, Anti-Mouse /Rabbit-HRP, Dako, Carpinteria, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 4 um: n paksuisia leikkeitä päässä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin vaha sulautettujen (FFPE) arkistointi paksusuolen kudoksiin (kasvaimia ja normaali kollegansa) poistui-paraffinized ksyleenissä ja rehydratoitiin läpi sarjan porrastettu alkoholien (70% – 100%). Antigeeni haku suoritettiin käyttäen Target Retrieval Solution tai sitraattipuskuria valmistajan ohjeita noudattaen. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin inkuboimalla Dual endogeeninen entsyymi lohkon (Dako, Carpinteria, CA, USA). Leikkeitä inkuboitiin vastaavan primaarisen vasta-aineen: monoklonaalinen anti-p53: n (klooni DO1; Immunotech, laimennus 01:50) tai kanin polyklonaalinen vasta-aine anneksiini 4 ja 5 (laimennus 01:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) . Olosuhteet, joita käytettiin kullekin vasta-aineelle olivat, kuten valmistaja on kuvannut. Värjäys ilman primaarista vasta-ainetta suoritettiin negatiivisena kontrollina. Envision järjestelmä, HRP, anti-hiiri- tai anti-kani käytettiin havaitsemiseen ensisijaisen vasta-aineita (Dako, Carpinteria, CA, USA) ja kudosvärjäyksellä visualisoitiin diaminobentsidiini (DAB) kromogeeniliuoksen (Dako, Carpinteria, CA, USA). Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä 5 min. Leikkeet dehydratoitiin läpi sarjan porrastettu alkoholien kirkastettiin ksyleenissä ja asentaa di-n-butyyli- ftalaatti ksyleenissä (DPX) kiinnitysväliaine. Histokemia havaita HPA sitovia käytetään 10 ug /ml biotinyloitua lektiinin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), 5% w /v naudan seerumialbumiinia (BSA), sovellettiin diat 1 h, pestiin kolmeen kertaan PBS: llä, jossa oli 0,01% v /Tween-20, ja inkuboitiin 5 ug /ml streptavidiini-HRP: tä 30 minuuttia. Leikkeitä pestiin jälleen PBS-vaihdolla 0,01% v /v Tween-20 ja lektiini sitoutuminen paljastettiin inkuboimalla 1% w /v DAB ja 0,3% v /v H

2O

2. Solut vastavärjättiin ja asennetaan edellä kuvatulla tavalla.

Objektilasit tutkittiin valomikroskoopilla ja pisteytettiin kahden riippumattoman yksilöiden pidennetyn tavalla. Tapauksissa, joissa oli aluksi ei päästy, yksimielisyys saatiin keskustelun jälkeen. P53 kirjattiin positiivinen, kun kasvainsolun tumat värjättiin, riippumatta siitä, positiivisten solujen prosenttiosuuden. Yleinen immunoreaktiivisia pisteet määritettiin (for P53) menetelmän mukaisesti käytetty aikaisemmin [6]. IRS on kumulatiivinen arvo intensiteetti Immunovärjäyksen (0 (-) ilman värjäystä, 1 (+) ja heikkoa värjäytymistä, 2 (++) kohtalainen värjäystä ja 3 (+++) vahvan värjäytyminen) ja prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja 5% = 0; 20% = 1; 20-50% = 2; 50-80% = 3 ja 80% = 4. HPA ja anneksiini 4, samoja perusteita on käytetty. Ensimmäinen prosenttiosuus syöpäsolujen värjäämällä arvioitiin ja tämä lisättiin sitten intensiteetti pisteet, jolloin saatiin lopullinen pistemäärä välillä 0 ja 8. Jotta voidaan määrittää optimaalisen cut-off, tulokset kaikista näytteistä analysoitiin kannalta niiden värjäys pisteet. Lukemat joka antoi suurimman syrjiä potilaista kehittyi etäpesäkkeitä ja ne, jotka pysyivät taudista vapaa (5 vuoden pysyvyys data) käytettiin raja-arvoa.

DNA: n eristämiseksi

näytteitä tuumori- kudoksen ja normaalin kudoksen kunkin potilaan käytettiin DNA: n eristämiseksi. Osat 1 mm

3 kudos leikattiin ja murskattiin välittömästi 200 ui: aan lysis-puskuria, pH 7,5, joka sisälsi 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% v /v SDS, 100 ug /ml proteinaasi K: Fenoli otot suoritettiin ja DNA saostettiin etanolilla -20 ° C: ssa. Saatu sakka kuivattiin huoneen lämpötilassa ja suspendoitiin uudelleen steriiliin Tris-EDTA (TE) konsentraatiossa noin 1 mg /ml. DNA: n konsentraatio määritettiin käyttämällä GeneQuant Pro spektrofotometrillä (GE Healthcare, Bucks, UK). Näytteitä säilytettiin + 4 ° C: ssa käyttöön asti.

DNA: n monistuksen

monistusreaktio DNA uutettiin normaalista ja kasvainkudoksen suoritettiin käyttäen 1 ui DNA-näytettä reaktion kokonaistilavuus 50 ui, joka sisälsi Promega Master Mix (Ref. M7502) ja alukkeet syntyy Dr. E. Jullian Cochin sairaalassa. Monistusreaktio suoritettiin kahdessa vaiheessa, jossa kaksikymmentäneljä kutakin aluketta. Ensimmäisessä PCR-reaktiossa (KRAS1) suoritettiin seuraavilla alukkeilla: KRN5 ”(5′-TAAGGCCTGCTGAAAATGAC-3 ’) ja KRN3” (5′-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3′), jolla on seuraavat vahvistus sykli: 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 55 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, sitten 43 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 1 minuutin ajan, ja lopullinen laajennus 95 ° C: ssa 30 sekuntia , 55 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 10 min. Havainto heikko bändi matalan intensiteetin tai puuttumisesta kaistan, kun 1,5% w /v agaroosigeelielektroforeesilla johti toisen monistusreaktion. Tämä toinen PCR-reaktio (KRAS2) suoritettiin käyttäen 2-10 ui ensimmäinen reaktio KRAS1 ja seuraavia alukkeita: KRS5 ”(5’-AACTTGTGGTAGTTGGAG -3 ’) ja KRS3” (5’ – GTTGGATCATATTCGTCC -3 ’) kanssa monistuksen syklissä: 95 ° C: ssa 12 min, 52 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, sitten 43 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 52 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 1 min ja viimeinen sykli 95 ° C: ssa 30 sekuntia, 52 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 10 min. PCR tuotteet kasvainkudoksen sekvensoitiin varten ja mutaatiot kodoneissa 12 ja 13 KRAS-geeni tunnistettiin (Millegen, Ranska).

Näytteen valmistus proteiinien analyysiä

Ennen valintaa näytteitä Proteomiikan tutkimuksia, 7 jam: n jää- leikkeitä leikattiin ja läsnäolo syöpäsolujen varmistettiin värjäämällä hematoksyliinillä ja eosiinilla. Näytteet, jotka sisälsivät 60% syöpäsoluja ja hemolyysi vapaa valittiin. Neljä proteiinia, uima-altaat, valmistettiin: LN positiivinen (n = 6), CRC (LN +), viereinen terve kudos (AdLN +); LN negatiivinen (n = 5) CRC (LN-) ja vastaavat terveiden kudosten (AdLN-). Kliiniset patologiset näytteet on esitetty S1 taulukossa. Proteiinit uutettiin kustakin näytteestä pesemällä 50 mg kudosta kolmesti jäähdytetty PBS, homogenoimista in lektiini puskuri: 0,05 M TBS, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCI

2, pH 7,6 käyttäen kädessä pidettävää homogenisaattoria 5 min jäähdyttäen ajoittain jäiden päällä. Homogenaattia sentrifugoitiin 15000 x

g

kerätä supernatantti. Proteiini kvantifiointi suoritettiin käyttäen Qubit järjestelmä (Qiagen, UK). Proteiini saannot vaihtelivat välillä 5% ja 7%: n märkäpainon kudosta. Jokainen allas käsitti 100 ug kutakin syövän /normaali-proteiinin valmisteet asianmukaiset näytteet.

SDS-PAGE ja Western blotting

Proteiinit erotettiin 1-DE natriumdodesyylisulfaattipolyakryyliamidigeeleil- geelielektroforeesi (SDS-PAGE) käyttäen 12% geeliä 120 V: ssa 1,5 h [14], ja värjättiin kolloidisella Coomassie Blue G-250 [15]. Näytteet erotettiin SDS-PAGE siirrettiin nitroselluloosalle käyttäen märkä blotting järjestelmä 1,5 h 110 V siirtopuskurissa: 25 mM Tris, 192 mM glysiini, 20% v /v metanolia, blokattiin 2% w /v BSA: ta TBS -Tween 0,05% v /v yön yli ja inkuboitiin 5 ug /ml biotinyloitua HPA: ssa 2 tuntia ja sen jälkeen 1 h inkubointi 2 ug /ml streptavidiini-HRP: tä ja tutkittiin DAB /H

2O

2. Analyysiä varten CEA tasot hiiren anti-CEA monoklonaalista vasta-ainetta (sc-55547, Santa- Santa-Cruz, CA, USA) käytettiin 5 ug /ml anti-CEA-vasta-aineen 2 h, inkuboitiin 2 ug /ml peroksidaasia konjugoitua anti-hiiri-IgG: ssa 1 tunti ja visualisoitiin edellä kuvatulla tavalla. Tarkistaa tasoa anneksiini 4 ja 5 proteiinia näytteet erotettiin ja blotattiin kuten edellä ja tutkittiin hiiren monoklonaalinen anti-anneksiini 4/5 vasta-aineita (sc-46693 /sc-74438, Santa-Cruz, CA, USA) 5 ug /ml yli yön jälkeen inkuboitiin vuohen anti-hiiri-IgG: tä (1 ug /ml) ja kehitettiin tehostetun kemiluminesenssin (ECL) substraatti. Signaali oli kaapattu päälle röntgenfilmille käyttäen valotusaikaa 1 min.

rikastaminen HPA sitovien glykoproteiinien

HPA affiniteettikromatografiaa käytettiin rikastuttaa ja puhdistaa HPA sitova glykoproteiineja kudoksesta otteet . Tämä mahdollisti laadullisia muutoksia glykosylaation ja määrällisiä muutoksia proteiinin tasoja voidaan arvioida. Lisäksi tämä vaihe poistaa runsaasti esiintyvät proteiinit. 5 ml: n HPA affiniteettikromatografiapylväs valmistettiin kytkemällä 10 mg HPA HiTrap NHS-aktivoituun Sepharose-pylvääseen (GE Healthcare, Bucks, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 2 mg yhdistettyä proteiinia näyte pylvääseen ja eluoitiin 0,25 M GlcNAc jotka valmistetaan lektiini puskuriin. Näytteitä dialysoitiin yön yli TBS ja kylmäkuivataan. Kylmäkuivattu näytteet liuotetaan 100 ul: aan urea-puskuria: 7 M ureaa, 2 M tioureaa, 2% v /v amfolyyttejä 4-7 (GE Healthcare, Bucks, UK), 4% paino /tilavuus CHAPS ja 1% w /v DTT. Proteiini kvantifiointi suoritettiin kuten edellä. Saanto affiniteettipuhdistettua proteiinia vaihtelivat 1%: sta 2% kokonaisproteiinista allas.

Kaksiulotteinen elektroforeesi (2-DE) B

Affiniteettipuhdistettua glykoproteiineja erotettiin 2-DE. 50 ug kutakin yhdistettyä proteiininäytettä sekoitettiin nesteytys puskuri: 6 M urea, 2 M tioureaa, 0,5% v /v CHAPS, 0,4% v /v DTT, 0,5% v /v amfolyyttejä pH 4-7, jolloin saatiin lopullinen tilavuus 120 ui. Seos ladattiin 11 cm Immobiline pH-gradientin nauhat, pH 4-7L (GE Healthcare, Bucks, UK) menetelmän mukaisesti kuvattu [16]. Isoelektrinen fokusointi suoritettiin käyttäen Multiphor II (GE Healthcare, Bucks, UK) 10000 Vh (GE Healthcare, 2004). Tarkennuksen jälkeen, IPG nauha säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes erottamalla SDS-PAGE, kuten edellä on kuvattu. Kolme rinnakkaista kunkin affiniteettipuhdistettuja glykoproteiini allasta erotettiin 2-DE ja visualisoitiin värjäämällä kolloidisella Coomassie Blue G-250 [15]. Gel kuvat otettiin käyttäen GS-800 densitometri (BioRad, UK).

Analyysi 2-DE erotukset

2-DE-erotukset analysoitiin tunnistaa glykoproteiineja läsnä eri tasoilla CRC näytteitä potilaista, joilla LN positiivinen sairaus. Skannatut kuvatiedostot analysoitiin käyttämällä Progenesis PG240 SameSpots ohjelmisto (Nonlinear Dynamics, U.K.), suhteellinen proteiini määrä tietyllä paikalla on johdettavissa pikselin intensiteettiä arvoa ja muunnetaan prosentteina voimakkuuden kaikkien proteiinin läiskät geelillä. Glykoproteiineja osoittaa muuttuneita tasoja luokiteltu p-arvo (yksisuuntainen ANOVA) ja kertamuutosta arvoja.

Matrix laserdesorptio ionisaatio massaspektrometrian (MS) analyysi

Protein tunnistaminen oli suorittamat kaupallisen järjestelyn tohtori Kevin Bailey, School of Biomedical Sciences, University of Nottingham. Proteiini täplät leikattiin irti 2-DE erotettiin geelit; suolat käyttäen käänteisfaasi C18ZipTips (Millipore, UK). 2 ui suolatonta peptidinäytettä huomattiin yhdelle tavoite hyvin ruostumattomasta teräksestä matriisi laserdesorptio ionisaatio (MALDI) levy 1 ui alfa syaani-4-hydroxycinnaminic happoa sisältävä sisäistä standardia (adeno- kortikotrofisissa hormoni, ACTH). Tavoitteena annettiin kuivua ja analysoitiin käyttäen on MALDI-MS (MicroMass M @ LDI, Waters Corp) toiminta resoluutio 10000 puoliarvoleveys) heijastusmoodissa. Spektrit saatiin 5 Hz käyttäen typpilaserilla (λ 337 nm) 10 laukausta summataan per spektrit. Data osti satunnaisesti näytteitä tavoitteesta levyn ja peptidi huippu Listatiedostojen syntyi sekä manuaalisesti että automaattisesti. Taustat huiput trypsiinin ja keratiinin suljettiin ja huippu luettelot ladattiin MASCOT PMF (https://www.matrixscience.com/) tietokannasta hakukoneen parametrit asetetaan seuraavasti: peptidi toleranssi 0,2 Da; muutoksia ruoansulatuksessa kuten hapettunut metioniini ja CAM otettiin huomioon ja jäi cleavages asetettiin 1.

ennustaminen translaation jälkeisiä modifikaatioita (PTM) B

bioinformatiikka- analyysi tehtiin käyttäen NetNGlyc ; NetOGlyc; YinOYang; NetPhos työkalut https://www.cbs.dtu.dk/services tunnistamaan mahdolliset N-sidottu, O-GalNAc, O-GlcNAc ja O-fosfaatin muuttaminen sivustoja HPA sitovia proteiineja tunnistettiin yllä.

tilastollinen analyysi

vertailut 2 ryhmän välillä (imusolmuke positiivinen /negatiivinen CRC) tehtiin käyttämällä Studentin itsenäinen otosten t-testi jatkuvan datan ja ANOVA kategorisen muuttujia. Pearsonin kerrointa käytettiin myös määrittämään, onko tasot HPA tai anneksiini sitoutuminen liittyivät tautivapaan välein. Survival käyrät piirrettiin mukaan Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank-testi; kaikki tehdyistä testeistä, P-arvot 0,05 otettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS version 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA, IBM Company).

Tulokset ja keskustelu

proteomiikan analyysi

O-

glykoproteiinien CRC

yhdistetyt proteiinit CRC kudoksista fraktioitiin käyttäen HPA affiniteettikromatografiaa, erotettu 1 DE ja 2-DE ja tunnistettu MS, joka proteomic lähestymistapaa, jolla pyritään kuvaavat

O-

liittyy glykaanien koholla CRC metastaattinen imusolmukkeisiin (kuvio 1 ja S1 Kuva). Seitsemän glykoproteiineja tunnistettiin käyttämällä tätä lähestymistapaa (taulukko 1), joka sisältää solukalvon proteiineja anneksiini 4, anneksiini 5 ja kalsium- aktivoitu kloridikanavan proteiini 1 (CLCA1). Anneksiini 4 on aikaisemmin todettu, että HPA sitova glykoproteiini peräsuolen syövän solulinja HT29 [12]. Rinnalla kohonneita

O-

kytketty glykosylaatio, kohonneeseen CEA myös identifioitu (S1 kuvio) mukaan

N-

kytketty glykosylaatio lisäävät myös metastaattisessa CRC syöpää.

proteiinit poolattavissa LN + ve CRC kudosnäytteiden affiniteettipuhdistettiin HPA ja erottaa isoelektrisen fokusoinnin on pH 4-7 IPG nauhat ja sitten SDS-PAGE (12%) ja visualisoitiin kolloidista Coomassie Blue. Upotus: anneksiini 4/5 merkityllä LN + ve verrattuna LN-ve CRC kudosnäyte proteiinia altaat. Proteiinit tunnistettu MALDI-MS-analyysi on merkitty.

Proteiini tallennusnumero, kuvaus, MASCOT pisteet, sekvenssi kattavuus, nimellismassa ja ennustetut pl on merkitty. Kertainen muutos on suhde keskimääräinen normalisoitu tilavuus paikalla erotettu 2-DE päässä LN + ve ryhmän ja LN-ve ryhmä.

O-

kytketty glykosylaatio , p53 ja

KRAS

mutaatiostatus

histokemi- lähestymistapaa käytettiin HPA markkerina

O-

liitetty glykosylaatio tila. Suurin osa näytteistä oli reaktiivinen lektiinin (n = 24, koko n = 27 tapausta) ja näytteille voimakas solukalvon värjäyksen vähemmän tapauksia osoittavat rakeinen sytoplasminen värjäys, ehkä edustaa sitoutumisen lektiini glykokonjugaateille kauttakulkua Golgin laite (kuvio 2). Valomikroskoopilla ei tarjoa riittävää resoluutio sallimaan lähellä kuulusteluun solunsisäisen soluelimiin kudosten joka sitoo HPA. On mahdollista, että jotkut glykoproteiinien tunnistettu tässä tutkimuksessa, ovat näin ollen, proteiinien kautta eritysreitin läpi, mukaan lukien Golgin laitteeseen, mutta paljon HPA havaitun sitoutumisen käyttäen immunohistokemia solukalvon liittynyt. Ei ollut mitään suhdetta HPA värjäytymisen voimakkuuden ja potilaan ikä, sukupuoli, kasvaimen tai LN tila, mutta tämä saattaa heijastaa suhteellisen harvat näytteet tässä alustava analyysi (tuloksia ei esitetty). Anti-p53-vasta oli vahvasti reaktiivinen 13 29 tapauksessa ja heikosti reaktiivinen vielä 7 tapauksessa (kuvio 2) ja

O-

kytketty glykosylaatio tila ei korreloinut P53 värjäys. Kaikki P53 positiivisia tapauksia (n = 15) sitoutui HPA sekä joitakin P53 negatiivisten tapausten (n = 8).

KRAS

mutaatiostatus arvioitiin käyttämällä PCR lähestymistapaa ja 8 25 arvioitavissa näytteet osoittivat mutatoitunut

KRAS

joko kodonissa 12 tai 13 (26% tapauksista), tämä verrattuna suotuisasti kanssa raportoitu esiintyvyys CRC välillä 30-40% [17]. 8 näytteitä mutatoitunut

KRAS

, neljä oli samanaikaisesti positiivisia HPA värjäystä ja kaikki nämä olivat P53 positiivisia. Yhdessä nämä tulokset viittaavat, että

O-

kytketty glykosylaatio tapahtuu muutoksia aikaisin etiologiassa CRC.

Vasen: valomikroskoopilla kuvia paksusuolen kudosleikkeiden (5 pm) inkuboitiin HPA (10 ug /ml) ja streptavidiini-HRP: tä (5 ug /ml) tai inkuboitiin anti-P53-vasta-ainetta (1: 200) ja hevosen biotinyloidun kanin anti-hiiri-IgG: tä (1: 1000), kuten on ilmoitettu. Ruskea väri osoittaa Peroksidaasireaktio DAB /H

2O

2, tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä (sininen). Suurennus X400. Oikea: Taulukko osoittaa tulokset HPA, P53 ja

KRAS

analyysi.

validointi tulokset proteomiikka analyysin

anneksiini 4 ja anneksiini 5 tasoa tutkittiin käyttämällä Western blotting, kuvio 3. Kun normalisointi on β-aktiini tasot, merkittävän kasvun tasoa anneksiini 4 (mutta ei anneksiini 5) havaittiin CRC kudosnäytteistä, joka oli metastasoitunut imusolmukkeisiin aikaan diagnoosi (opiskelija t-testi, P = 0.05). Vastaavasti, Western-blotit, jossa HPA ja kasvu HPA sitova glykoproteiinien havaittiin näytteissä imusolmukkeesta positiivisilla potilailla (dataa ei esitetty). Tämä on sopusoinnussa havaintojen muiden tutkimusten raportoinnin lisääntymiseen

O-

kytketty glykosylaatio huonoon ennusteeseen metastaattisen CRC syöpä. Voit selvittää, anneksiini 4 ja HPA sitoutuminen korreloi huonon ennusteen CRC ylimääräinen sarja 35 CRC yksilöiden kanssa potilaan seurannan tiedot arvioitiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Kun solujen prosenttiosuus värjäämällä (0-100%) ja yhteenlasketusta värjäytyminen pisteet (asteikko 0-7) katsottiin, molemmat olivat merkittävästi korreloi käänteisesti elossaololuku, kuvio 4. Kun esimerkiksi yhteenlaskettu värjäytyminen pisteet HPA otettiin kuten ≥5 mediaani elinaika oli 13 kuukautta verrattuna 68 kuukautta varten katkaista ≤5 (Chi square testi 9,065; P-arvo = 0,0026); anneksiini 4: kun katkaista yhteenlaskettujen värjäystä pistemäärä ≥5 otettiin mediaani elinaika oli 17 kuukautta; toisin pisteet ≤5 liittyi mediaanielossaolosta 59,6 kuukautta (Chi square testi 11,45; P-arvo = 0,0007). Kun tulokset sekä anneksiini 4 ja HPA yhdistettiin pysyivät merkitsevästi käänteisesti yhteydessä selviytymisen jälkeen CRC, kuvio 4. anneksiini 4: ottaen leikattu pois ≥60% soluista värjäämällä, mediaani elinaika oli 11 kuukautta verrattuna 58 kuukautta for ≤60% soluista värjäämällä (Chi square testi 7,466; P-arvo = 0,0063) ;. HPA: ≥50% solujen värjäytymisen johti eloonjäämismediaani 11,5 kuukautta mutta kun ≤50% solujen värjäytymisen otettiin Keskimääräinen elinaika oli 60 kk (Chi square testi 11,74; P-arvo = 0,0006), tietoja ei ole esitetty. Nämä havainnot osoittavat, että sitovat HPA ja anti-anneksiini 4 vasta kudosleikkeiden CRC ovat indikaattoreita huonoon ennusteeseen. Sekä

O-

kytketty glykosylaatio-mitattuna HPA värjäys-ja tasot anneksiini 4 ovat markkereita huonoon ennusteeseen CRC. Monimutkaisuus proteomiin tekee tuumorimarkkeri löytö työtä haastava; kuitenkin on tarpeen tunnistamiseksi biomarkkereita ja uudet tavoitteet hoitoon CRC. Niistä monet muutokset translaation jälkeen esiintyvän proteiineihin, glykosylaatio on yleisin ja monipuolinen [18] ja poikkeamat proteiinien glykosylaatio raportoitu syöpää [19] on potentiaalia ja tunnistamista syöpää erityisiä muutoksia. Hiilihydraattia sitovan proteiineja, lektiinit, on aiemmin kuvattu etupainotteisesti kaapata syöpään liittyvien glykoproteiineja [20, 21]. On ollut huomattavaa kiinnostusta glykoproteiinien tunnustettu lektiinin HPA kuin osallistuminen HPA sitoutumisepitoopit Metastasoituneessa prosessi on osoitettava käyttäen syöpäsolulinjoja peräisin ihmisen tuumorikudoksista [22]. Integriinin α5 ja α6 ja anneksiini 2 ja 4 on aiemmin tunnistettu tärkeimmät HPA sitova kumppanien metastaattisen CRC solulinjassa HT29 [12]. Tässä tutkimuksessa proteiineja CRC kudosnäytteet ennalta fraktioitiin käyttäen HPA affiniteettikromatografiaa jolloin alhainen runsaasti proteiineja voidaan eristää ja tunnistaa. Erot HPA sitova glykoproteiinien yksilöt oli metastasoitunut imusolmukkeisiin aikaan diagnoosi oli ilmeinen, kun glykoproteiinit erotettiin 1-DE ja blotattiin nitroselluloosalle tunnistamiseen lisääntymiseen

O-

sidoksissa glykosylaation; todennäköisesti liittyy Tn ja sialyyliryhmiä-Tn-antigeenin ilmentyminen syövässä [23]. Kun HPA on käytetty Western-blottien syövän proteiinin valmisteet, kaistojen määrä ja intensiteetti vaihteli verrattuna, kun proteiinit oli ennalta fraktioitiin lektiiniblottianalyysillä affiniteettikromatografialla (S1 kuvio). Tämä saattaa heijastaa hienoisia eroja sitoutumisessa, kun HPA on kovalenttisesti immobilisoitu affiniteettimatriisina verrattuna siihen, kun lektiinin oli vapaassa liuoksessa. Tunnistaminen HPA sitoutumisen glykoproteiineja CRC oli merkittävä Tämän työn, nämä verrattiin tasot CEA samasta kudosnäytteistä ja vahvistettu olevan riippumaton CEA tasojen (S1 Kuva). Vaikka tutkimus musiineja oli kuulu tämän nykyisen työn, selvästi tasot MUC1 ja MUC2 ja niiden HPA sitovat ominaisuudet on kysymys jonkin verran kiinnostusta. Samoin solunsisäinen lokalisaatio HPA sitovien proteiinien on kiinnostava. Se ei ole teknisesti mahdollista fraktioida soluorganellit, kun jäädytetyt syövän kudosnäytteet käytetään lähtöaineena ja niin emme pystyneet määrittämään, onko glykoproteiinien Golgin laitteeseen puhdistettiin käyttämällä affiniteettikromatografiaa vaiheessa. Ensisijaisena tavoitteena oli tunnistaa proteiinit, jotka sitovat lektiinin HPA ja muutellaan metastasoituneen että ei-metastasoituneen CRC. Koska kudos-värjäys käyttäen HPA osoitti sekä solunsisäinen ja voimakas kalvon värjäytyminen, me hypoteesin, että HPA sitova glykoproteiinien tunnistettu tässä tutkimuksessa ovat todennäköisesti peräisin solukalvon, sytosolissa ja mahdollisesti Golgin laitteeseen. Proteomiikan analyysi affiniteettipuhdistettua HPA sitovia proteiineja paljasti seitsemän glykoproteiinien kuten anneksiini 4 ja 5 ja CLCA1 että korotettiin valmisteluissa alkaen metastaattinen kudoksiin. Anneksiini 4 on jo osoitettu erillisessä tutkimuksessa on tunnustettava HPA CRC solulinjassa HT29 [12]. Kaikki kolme näistä proteiineista on kuvattu aikaisemmin suhteessa CRC mutta proteiineja ei ole aikaisemmin tunnistettu esirikastusta kautta

O-

liittyy glykaanin moeities. Annexins ovat perheen kalsium-säänneltyjen fosfolipidin ja hiilihydraattia sitovia proteiineja monipuolisia sisäisissä ja ulkoisissa rooleja eri solun prosesseja, mukaan lukien merkinanto, ioninkuljetusmeka-, solunjakautumisen ja apoptoosin [24].