Krooninen sairaus

tiivistelmä

resistenssin kehittyminen kemoterapiaan on suurin syy syöpään liittyvät kuolemat. Selvittämiseen mekanismit lääkeresistenssin pitäisi siis johtaa uusia terapeuttisia strategioita. Fibroblastikasvutekijä (FGF) -2 signalointi indusoi kokoonpanon monen proteiinin kompleksin, joka tarjoaa kasvainsolujen molekyyli koneet, joita tarvitaan lääkeresistenssin. Tämä monimutkainen, johon kuuluu proteiinikinaasi C (PKC) ε, v-raf hiiren sarkooman viruksen onkogeenin homologi B1 (B-RAF) ja p70 S6-kinaasi β (S6K2), parantaa selektiivinen kääntäminen anti-apoptoottiset proteiinit, kuten B-solu- leukemia /lymfooma-2 (BCL-2) ja inhibiittorit apoptoosin proteiinin (IAP) -perheen jäsenet, ja nämä voivat suojata useita syövän solutyypit kemoterapian aiheuttaman solukuoleman. Janus-kinaasien (Jaks) eniten todetaan niiden kriittisiä rooleja välittämisessä sytokiinisignaloinnin ja immuunivastetta. Tässä osoitamme, että Jaks olla uusia toimintoja, jotka tukevat heidän harkittaville uusia tavoitteita hoitoja, joilla pyritään vähentämään huumeiden vastarintaa. Esimerkiksi osoitamme, että Janus-kinaasi Tyk2 fosforyloituu alavirtaan FGF-2 signalointi ja tarvitaan koko fosforylaatiota solun ulkopuolisen signaalin säännelty kinaasi (ERK) 1/2. Lisäksi Tyk2 tarvitaan induktioon avaimen antiapoptoottisten proteiinien, kuten BCL-2 ja myeloidisolun leukemia sekvenssi (MCL) 1, ja edistämiseksi solujen selviytymistä upon FGF-2. Hiljentäminen JAK1, JAK2 tai Tyk2 käyttämällä RNA-interferenssi (RNAi) inhiboi FGF2-välitteisen proliferaation ja johtaa herkistymiseen kasvainsolujen kemoterapiaindusoitu tappamista. Nämä vaikutukset ovat riippumattomia aktivointi signaali anturin ja aktivaattori transkription (STAT) 1, STAT3 ja STAT5A /B, normaali tavoitteet JAK signalointi. Sen sijaan, Tyk2 kumppaniaan muiden kinaasien aiemmin sekaantunut FGF-2-välitteisen lääkeresistenssin. Vuonna Näiden havaintojen perusteella oletamme, että Tyk2 ja muut Jaks ovat tärkeitä modulaattoreiden FGF-2-ajettu solujen selviytymistä ja että inhibiittorit näiden kinaasien todennäköisesti tehostaa muiden syövän hoitomuotoja.

Citation: Carmo CR, Lyons-Lewis J, Seckl MJ, Costa-Pereira AP (2011) romaani Vaatimus Janus-kinaasien välittäjinä Drug Resistance indusoima fibroblastikasvutekijää-2 in ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (5): e19861. doi: 10,1371 /journal.pone.0019861

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 helmikuu 2011; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 20, 2011

Copyright: © 2011 Carmo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Syövän hoito ja Research Trust rahoittama tätä työtä. MJS ja JLL tukee myös Department of Health rahoitetaan Experimental Cancer Medicine Centre Grant, ja APC-P ja MJS Cancer Research UK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lääkeresistenssin kehittymisen mukaan kasvainsolut vastaa köyhien kokonaiselossaoloaikaa nähnyt useimpien syöpätyyppien [1]. Joukossa lukuisia lääkeresistenssimekanismien piilee fibroblastikasvutekijä (FGF) -2 signalointi. FGF-2 voi tarjota solujen pro-selviytymisen ja mitogeenisiä signaaleja, ja antaa laaja-alaista vastustuskykyä kemoterapeuttisten [2], [3], [4]. De-säännelty FGF-2 signalointi on liittynyt erilaisia ​​maligniteetteja ja kohonneet tämän molekyylin potilaan seerumi perustettiin itsenäisenä huono ennustetekijä lymfooma, keuhkosyöpä ja sarkooma [5], [6], [7 ]. Erityisesti, FGF-2: n osoitettiin edistää lääkeresistenssin pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) solut muodostamalla usean proteiinin kompleksi, joka käsittää proteiinikinaasi C (PKC) ε, v-raf hiiren sarkooman viruksen onkogeenin homologi B1 (B -RAF) ja p70 S6 kinaasin β (S6K2). Tämä riippui ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (ERK) 1/2 toiminta [3], [8], [9]. Muodostuminen tämän monimutkaisen johti translaatio- ylössäätöä keskeisten antiapoptoottisten proteiineja, jotka sitten resistenssin apoptoosia ja annettiin solujen hengissä kun altistettiin sytostaattien.

Useimmat sytokiinien ja monet kasvutekijät signaali

via

Janus-kinaasien (Jaks) ja signaalimuunta- ja aktivaattorien transkription (STAT) [10], [11]. Konstitutiivinen STAT fosforylaatio on ominaista laaja valikoima ihmisen syövän solulinjojen ja primaaristen kasvainten [12]. Yliaktivoituminen Jaks on myös tuumorigeneesiin [13]. Se, että Jaks ja STAT aktivoidaan useita mitogeenit on kannustanut tutkijoita kehittämään strategioita kohdistaa niitä syöpähoitojen. On vain vähän, hieman sekava, näyttöä JAK /STAT signalointi myötävirtaan FGF-2 ja sen merkitys on epäselvä [14], [15], [16]. Me ja muut [17] ovat havainneet de-säännelty JAK /STAT ilmentymistä erilaisissa keuhkosyöpä ja sarkooma solulinjat. Tämä ja se, että potilaat, joilla on kohonnut FGF-2 seerumissa huonompi tuloksia klinikalla johti meidät oletuksen, että Jaks ja /tai STAT ollut merkitystä FGF-2 signalointi-välitteisen lääkeresistenssin reittiin (s). Tässä osoitamme, että Janus-kinaasien JAK1, JAK2 ja Tyk2, mutta ei niiden pääasiallinen loppupään efektoreja STAT1, STST3 tai STAT5A /B, tarvitaan FGF-2-välitteisen chemoprotection in U2OS luusarkoomasoluissa. Tämä puolestaan ​​avaa uusia terapeuttisia mahdollisuuksia syöpiä, jotka ovat edelleen vaikea valvoa.

Tulokset

FGF-2 suojaa osteosarkoomaa U2OS soluja sisplatiinin välittämä solukuolema mekanismilla, johon PKCε , B-RAF ja S6K2 proteiini kompleksit

Koska FGF-2 osoitettiin suojaavan SCLC soluja sytotoksisen lääkkeen aiheuttama solukuolema [4], me aluksi pyrkivät laajentamaan tämän huomautuksen erillisten syöpäsolu tyyppi osteosarcoma U2OS solut. Nämä hoidettiin kliinisesti merkittävä lääkkeen sisplatiinin läsnä ollessa ja puuttuessa FGF-2 (Fig. 1). Pitoisuus kasvutekijä käytettyjen määritettiin käyttäen ERK1 /2 fosforylaation kuin lukeman (Fig. S1). Solukuolemaa arvioitiin käyttäen WST-1 solunelinkykyisyysmääritys, joka tuotti identtiset tulokset, jotka on saatu solujen laskenta trypaanisinisellä (tuloksia ei ole esitetty). Yön yli tapahtuneen käsittelyn 60 uM sisplatiinin tappoi 50% soluista, mutta esi-inkubaatio FGF-2: ssa 4 h esti tämän, mikä viittaa siihen, että FGF-2 suojattu U2OS soluja vastaan ​​sisplatiinin (Fig. 1A). WST-1 määritys ei erotella apoptoosin ja nekroosin. Lisäksi pelastus sisplatiinin voisi johtua proliferaatiota, joka indusoitui myös FGF-2, eikä pelkästään inhibition solukuoleman. Siksi valvotaan samanaikaisesti apoptoosin avulla katkaisun kaspaasi substraattien, kuten poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja lamiini B luku-out (Fig. 1 B, ja tietoja ei ole esitetty). Lisäksi, solusyklin analyysi virtaussytometrialla käytettiin määrittämään menetys DNA-pitoisuus, jota voidaan käyttää toisen lukeman apoptoosin (Fig. 1 C). Yön yli sisplatiinihoidolle indusoi apoptoosin U2OS soluissa, joka ilmenee ulkonäkö 85 kDa PARP pilkkomisfragmentin (Fig. 1 B) ja kasvua sub-G1 solupopulaation (Fig. 1 C). Nämä tapahtumat olivat estää esikäsittelemällä soluja FGF-2, joka myös vähentää tyvisolusyöpä kuoleman havaittu käsittelemättömien näytteiden. Kuvaajat edustavat keskiarvoja, saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. Kuten havaitaan SCLC-solujen [8], vähentää solukuolemaa FGF-2 voitaisiin estää estämällä mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinaasin (MEK) /ERK toimintaa selektiivinen estäjä (Fig. S2), kun taas inhibitiota fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) ja rapamysiinin kohde-kompleksia (TORC) 1 signalointi ei ollut vaikutusta (tuloksia ei ole esitetty). Siten FGF-2 kohdistuu anti-apoptoottinen vaikutus U2OS soluissa, jotka oli välittävät ERK1 /2, ja estää sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinia. Tärkeää on, kun vieroitusoireista, FGF-2-pelastettiin solut pysyivät kannattavaa viljelmässä useita viikkoja (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tukee edelleen käsitystä, että FGF-2 voi tehokkaasti edistää selviytymistä syöpäsoluja altistetaan sytotoksisille lääkkeille.

Soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa yli yön. 4 h jälkeen esikäsittely FGF-2 (10 ng /ml), soluja käsiteltiin sisplatiinin (60 uM) yön yli. A. Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä WST-1-määritystä. Arvot vastaavat tetratsoliumsuolaa WST-1 pilkotaan värillinen formatsaanin yhdisteistä mitokondrion dehydrogenaasit. Keskiarvo ± SEM kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena esitetään kertainen induktio suhteessa käsittelemättömiin kontrolleihin. B. Proteiinit erotettiin 7,5% SDS-PAGE geelillä ja Western blotting-analyysi suoritettiin kokosoluliuotteista (elossa ja kuolleet solut) käyttäen vasta-aineita PARP. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Edustava Western blot ja keskiarvo ± SEM densitometristä arvojen (pilkkoutuu PARP) kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. C. Solut tehtiin läpäiseviksi ja DNA värjättiin propidiumjodidilla (PI). Solusyklin profiilit arvioitiin virtaussytometrillä ja tiedot louhitaan FlowJo. Mean ± SEM sub-G1 tapahtumia kolmen erillisen kokeen ilmaistaan ​​kertamuutosta sub-G1 väestö yli käsittelemätön kontrolli.

SCLC soluissa, FGF-2-välitteisten lääkeresistenssin reittejä käsittää muodostumisen proteiinin, jossa on mukana PKCε, B-RAF ja S6K2 [4]. Me seuraavaksi kysyttiin FGF-2 voi aiheuttaa samanlaisia ​​proteiini vuorovaikutusten U2OS soluissa. Soluja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa FGF-2 kertaa osoitettu lyysattiin ja S6K2 immunosaostettiin ennen Western blotting varten PKCε, B-Raf: n tai S6K2 (Fig. 2A). B-RAF ja PKCε liittyvät S6K2 leposoluissa, vaikutus, joka kasvatti merkittävästi FGF-2 hoito 10 min (Fig. 2A). Vuorovaikutukset olivat ohimeneviä ja ei ole enää merkittävä 30 min jälkeisen FGF-2 hoitoa. Tukeakseen käsitystä, että kolmen proteiinin vuorovaikutuksessa, me seuraavaksi immunosaostettiin joko PKCε (Fig. 2B) tai B-RAF (Fig. 2C) solulysaateista. Sitten suoritettiin Western blotting koetin näiden proteiinien ja S6K2. Vaikka B-RAF ja PKCε pohjapinta vuorovaikutus lisääntyi 10 min kuluttua FGF-2 stimulaatiota ja sen jälkeen jatkunut, emme pystyneet havaitsemaan S6K2 näissä immunosaostumissa (Fig. 2B, 2C ja tuloksia ei esitetty). Tämä voi selittyä alhaisemmat ekspressiotasot S6K2 verrattuna PKCε ja B-RAF U2OS soluissa, vaihtelu stoikiometria yhdistysten tai muodostumisen useita, erillisiä, proteiini kompleksit. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että FGF-2 edistää molekyylien väliset vuorovaikutukset PKCε, B-RAF ja S6K2. Samanaikaisesti kaikki immunosaostukset, tasoilla kolmen proteiinit analysoitiin myös kokosoluekstraktien (Fig. S3). Mielenkiintoista on, että pieni (1,5-1,7-kertainen), mutta hyvin toistettavissa ja tilastollisesti merkittävää kasvua S6K2 havaittiin 10 min lisäämisen jälkeen FGF-2, kun taas tason PKCε, B-RAF, ERK1 /2 ja β-aktiini (jälkimmäinen kaksi käytettiin lastaus valvonta) eivät muutu (Fig. S3 ja myös S5). Olipa kasvu S6K2 signaali on puhtaasti johtuu kasvusta fosforylaation tai stabilointi proteiinin on vielä määrittämättä. Fosforylaatiota ERK1 /2: ta seurattiin myös varmistaa toimivuus FGF-2 (Fig. S3). Edelleen varmistamiseksi, että U2OS solut käyttäytyi kuin SCLC vastauksena FGF-2 pro-eloonjäämisen signalointi myös määrittää, jos nostettaisiin antiapoptoottisten proteiinit voitiin havaita [8]. Kuten ennustettiin, FGF-2 lisääntyi B-soluleukemia /lymfooma-2 (BCL-2), BCL-2-like-1-proteiinia (BCL-x

L) ja X-linked apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP) ekspressiotasot mutta lisäksi myös havaittu induktion toinen tärkeä anti-apoptoottisen proteiinin, eli myelooinen solu leukemia sekvenssi (MCL) 1, in U2OS solut (Fig. 2D ja tietoja ei näytetty).

soluja serum- nälässä kuten ennen ja jälkeen stimulaation FGF-2 (10 ng /ml), proteiinit uutettiin käyttäen samanaikainen immunosaostus lyysipuskuria. Solulysaatit altistettiin immunosaostukselle (A.) S6K2, (B.) PKCε tai (C) B-RAF-vasta-aineita ja proteiineja havaitaan western-blottauksella, kuten on ilmoitettu. D. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen kokosoluliuotteista ja vasta-aineita vastaan, MCL1 ja BCL-2. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Edustavia western blotit ja keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty kuvaajia. ”- Min.

alassäätely JAK1, JAK2 tai Tyk2, mutta ei STAT1, STAT3 tai Stat5: n, inhiboi FGF-2-välitteisen lääkeresistenssin U2OS soluissa

Monet syöpäsolujen linjojen käytetty tutkimukseen on de-säännelty JAK /STAT signalointi. Tämä kuvastaa

in vivo

tilanteessa sama havaitaan ihmisen kasvainten yksilöitä. Huolimatta perinteiset roolit immuunivastetta Jaks ja STAT ollaan yhä useammin keskeisiksi molekyylien syövän biologian. Meidän edellisen tiedot osoittivat, että FGF-2 indusoi vuorovaikutukset B-RAF, PKCε ja S6K2, lisääntynyt ilmentyminen avaimen anti-apoptoottiset ja suojattu U2OS soluja sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Me seuraavaksi kysytään ekspressoituvat JAK perheenjäsenten ja /tai heidän alustaan ​​STAT olivat osa tätä signalointireitin. Käsitellä tätä kysymystä, RNA-interferenssi (RNAi) indusoitiin käyttämällä lyhyitä häiritseviä (si) oligonukleotidit vastaan ​​JAK1, JAK2, Tyk2, STAT1, STAT3 ja STAT5A /B. Kaikkialla tässä tutkimuksessa on käytetty siRNA-altaat, joista kukin käsittää neljä siRNA oligonukleotideja vastaan ​​suunnattu eri alueilla saman kohdemolekyylien. Kaikki siRNA altaat todensi dekonvoluutiolla ja western blottaus käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​tunnetaan kohde sekä läheistä sukua olevien molekyylien, kuten on aiemmin kuvattu laboratoriossamme [18]. Vaimentaminen tehokkuus ja spesifisyys yhdistettiin siRNA: iden on esitetty kuvassa S4. U2OS solut transfektoitiin siRNA käsiteltiin kanssa tai ilman FGF-2: ssa 4 tuntia ja sen jälkeen altistettiin sisplatiinin (Fig. 3 ja 4). Noin 50% U2OS soluja, jotka oli tukkinut JAK1 (siJAK), JAK2 (siJAK2) tai Tyk2 (siTYK2) sisplatiinia tehtiin apoptoosia ja tätä ei voida estää esikäsittelemällä näiden solujen FGF-2 (Fig. 3). Apoptoosi arvioitiin käyttämällä WST-1-määritystä (tuloksia ei ole esitetty), tai käyttämällä PARP katkaisun (Fig. 3A) ja DNA: n fragmentoituminen (Fig. 3B), kuten lukemien. Jyrkkänä vastakohtana, lisääntynyt PARP lohkominen ja sub-G1 solupopulaation aiheuttama sisplatiini esti FGF-2: n ohjaus transfektoiduissa soluissa ei-spesifisen siRNA (NS) ja transfektoimattomissa soluissa. Näin ollen, kukin analysoitu Jaks vaadittiin tehokkaan FGF-2-välitteisen chemoprotection sisplatiinin indusoiman apoptoosin.

Solut transfektoitiin 75 nM siRNA vastaan ​​JAK1, JAK2 tai Tyk2. Transfektoimattomia soluja ja soluja, jotka oli transfektoitu ei-spesifisiä siRNA (NS) käytettiin kontrolleina. 48 tunnin kuluttua solut uudelleen maljattiin (2 x 10

5 solua /kuoppa) ja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa yli yön. 4 h jälkeen esikäsittely FGF-2 (10 ng /ml), soluja käsiteltiin sisplatiinin (60 uM) yön yli. A. keskiarvona ± SEM densitometristä arvojen (pilkkoutuu PARP) kolmen kokeen näkyvät. B. Solusykli profiilit kolmen erillisen kokeen ovat graafisesti keskiarvona ± SEM sub-G1 populaatioissa. Yläpaneelien esimerkkinä tiedot ja vastaavat kontrollisoluihin.

Solut transfektoitiin 75 nM siRNA vastaan ​​STAT1, STAT3 tai STAT5A /B. Transfektoimattomia soluja ja soluja, jotka oli transfektoitu ei-spesifisiä siRNA (NS) käytettiin kontrolleina (vrt Fig. 3). Soluja käsiteltiin kuten kuviossa 3. A. keskiarvo ± SEM densitometrinen arvot (pilkotaan PARP) kolmesta kokeesta esitetään. B. Solusykli profiilit kolmen erillisen kokeen ovat graafisesti keskiarvona ± SEM sub-G1 populaatioissa.

seuraava tutki Jaks saattaa toimia välityksellä kanoninen loppupään tavoitteensa STAT1, STST3 tai Stat5: n. Kuitenkin hiljentäminen kukin näistä molekyyleistä erikseen ei ollut vaikutusta FGF-2-indusoitu lääkeresistenssin. Todellakin, PARP pilkkominen (Fig. 4A) ja osa-G1 tapahtumia (Fig. 4B) käynnistyvät sisplatiinin pysyi vähensi merkittävästi soluissa, esikäsitelty FGF-2 riippumatta tasojen STAT1, STAT3 tai STAT5A /B.

FGF-2 indusoi Tyk2 mutta ei STAT fosforylaatiota

STAT1, STAT3 ja STAT5A /B ovat luonnollisia substraatteja Jaks, mutta meidän edellisen data osoittaa, että niitä ei tarvita FGF-2 aiheuttama pro-eloonjääminen signalointia. Jos tämä olisi totta, niin voi odottaa FGF-2 on pysty aktivoimaan STAT, prosessi, johon tyrosiinifosforylaatiota erityisistä jäämiä, jolle fosfospesifiselle vasta-aineita on saatavilla [19]. Näin ollen tutkimme seuraavaksi STAT muutettiin myötävirtaan FGF-2 analysoimalla tyrosiinifosforylaatiota STAT1 (Tyr

701), STAT3 (Tyr

705) ja STAT5A /B (Tyr

694) western-blottauksella . Kanssa aikaisempien havaintojemme kanssa (Fig. 4), FGF-2 ei onnistunut indusoimaan aktivointi STAT1, STAT3 tai Stat5: n in U2OS soluissa (Fig. 5A). Kuitenkin, kuten odotettua, nämä proteiinit voidaan fosforyloida interferoni (IFN) – γ, interleukiini (IL) -6, tai onkostatiini M (OSM), joita käytettiin positiivisina kontrolleina (Fig. 5A).

A. FGF-2 ei indusoi STAT1, STAT3 tai Stat5: n fosforylaatio. U2OS soluja pidettiin seerumin puutteessa yön yli ja stimuloitiin sitten FGF-2 osoitetut ajat. Solut, joita käsiteltiin IFN-γ (500 IU /ml), IL-6 (200 ng /ml) /sIL-6R (250 ng /ml) ja OSM (50 ng /ml) käytettiin positiivisina kontrolleina aktivointi STAT1, STAT3 ja Stat5: n, vastaavasti. Proteiinit analysoitiin ennen vasta-aineita fosforyloidun STAT1 (Tyr

701), fosforyloitu STAT3 (Tyr

705), fosforyloitu Stat5: n (Tyr

694) ja vasta-aineita, jotka tunnistavat sekä fosforyloitu ja fosforyloitumaton proteiineja. B. FGF-2 indusoi fosforylaatiota Tyk2 in U2OS soluissa. Soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa ja sitten käsiteltiin FGF-2 (10 ng /ml) ja osoitettujen kertaa. Tyk2 immunosaostettiin ja western blotting-analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita fosforyloidun tyrosiinien ja yhteensä Tyk2. Tyk2 käytettiin latauskontrollina. C. Yhteensä solulysaatit käyttää immunosaostamaan Tyk2 ja transfektoitujen solujen siTYK2 erotettiin 7,5% SDS-PAGE-geelissä ja analysoitiin Western-blotilla. Kalvot tutkittiin koettimella varten Tyk2, pERK1 /2-Thr

202/185 /Tyr

204/187 ja yhteensä ERK1 /2. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. ”- Min.

Mahdollinen selitys näiden havaintojen sisältää mahdollisuuden, että FGF-2 yksinkertaisesti ei aktivoida Jaks, prosessi, joka liittyy myös tyrosiinifosforylaatio. Sen määrittämiseksi, ovatko Jaks voidaan aktivoida FGF-2, päätimme keskittää huomiomme Tyk2, yksi vähemmän tutkittu Jaks joka ilmentyy laajalti monissa solutyypeissä. U2OS soluja käsiteltiin FGF-2 eri aikoja ja Tyk2 immunosaostettiin. Tyk2 tyrosiinifosforylaatio määritettiin käyttäen vasta-aineita fosforyloidun tyrosiinien (4G10 ja PY20, 01:01 mix) ja Tyk2 proteiinin ekspression anti-Tyk2 vasta-aine. FGF-2 indusoi ohimenevä 2-kertainen nousu Tyk2 tyrosiinifosforylaation, joka oli korkeimmillaan 5 min ja palasi lähes perustason tasot 30 min (kuvio. 5B). Ei fosfo-Tyk2 tai Tyk2 nähtiin kontrollinäytteitä (immuunisaostuksissa helmiä vain, tai joiden merkitystä vasta-aine). Samanaikaisesti, kokosolulysaateista käytetään immunosaostuksella ja lysaatit siTYK2-transfektoiduissa soluissa (vasta-aine-ohjattu) analysoitiin (kuvio. 5C). Tiedot siis viittaavat siihen, että Tyk2 fosforyloituu, ja mahdollisesti aktivoitu, alavirtaan FGF-2. Nämä tulokset yhdessä niiden kanssa, esitetty kuvassa 3 ovat täysin sopusoinnussa rooli Tyk2 myötävirtaan FGF-2, joka ei riipu samanaikaisen fosforylaatio /aktivointi STAT1, STAT3 ja Stat5: n. Jää vakiintunut jos JAK1 ja JAK2 ovat myös fosforyloidun alavirtaan FGF-2.

Tyk2 sitoutuu PKCε ja B-RAF upon FGF-2 hoitoa ja vaaditaan täyttä fosforylaatiota ERK1 /2 ja MCL1 induktio

Edellistä data sai meidät onko Tyk2 vuorovaikutuksessa B-RAF, PKCε ja S6K2. Se ei ollut vähäpätöinen havaita Tyk2 vuonna S6K2, B-RAF ja PKCε proteiinikompleksi (es) oletettavasti alhaisten ekspressiotasoja tämän proteiinin U2OS soluissa. Tyk2 vuoksi immunosaostettiin käsittelyn jälkeen FGF-2 ja immunosaostumat analysoitiin Western blot -menetelmällä vasta-aineilla B-RAF, PKCε ja S6K2 sijaan. Kun FGF-2 stimulaatio Tyk2 lyhyesti liittyy B-RAF ja PKCε (Fig. 6A). Tilapäinen luonne näistä järjestöistä voi myös selittää, miksi se oli myös vaikea havaita S6K2 näissä immunokompleksit. Ohjaus lysaatit on esitetty kuvassa S5.

. FGF-2 indusoi vuorovaikutus Tyk2 kanssa PKCε ja B-RAF U2OS soluissa. Soluja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, ja proteiinit eristettiin käyttäen samanaikainen immunosaostus puskuria. Tyk2 immunosaostettiin kokosolulysaateista ja immunosaostumat analysoitiin western blotteja. Kalvot tutkittiin koettimella varten PKCε, B-RAF ja Tyk2, jälkimmäinen käytetään tässä latauskontrollina. B. ja C. Tyk2 hiljentäminen in U2OS soluissa vähensivät ERK1 /2 fosforylaation ja esti säätelyä MCL1 vastauksena FGF-2. Solut transfektoitiin siTYK2 kuin ennen. Transfektoimattomia soluja ja soluja, jotka oli transfektoitu ei-spesifistä siRNA (NS) käytettiin kontrolleina. 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin kuten aikaisemmin on kuvattu, ja stimuloitiin sitten FGF-2 (B) 10 min, ja (C) 4 tuntia. B. Proteiinit analysoitiin vasta-aineita p-ERK1 /2 (Thr

202/185 /Tyr

204/187) ja yhteensä ERK1 /2. Arvot vastaavat fosfo-ERK1 ja -ERK2 tasolla. C. Western blotting -analyysi suoritettiin käyttäen kokosoluliuotteista ja anti-MCL1 vasta-aine. β-aktiini käytettiin latauskontrollina ja normalisointi. Keskiarvo ± SEM densitometrisen arvojen kolmen erillisen kokeen on esitetty.

FGF-2-välitteisen chemoprotection tarvitaan ERK1 /2: n aktiivisuuden (kuvio. S2). Varmistaa, jos tämä on riippuvainen Tyk2, U2OS solut transfektoitiin siTYK2, joita käsitellään myöhemmin FGF-2 ja ERK1 /2-fosforylaation arvioitiin Western blot (kuvio. 6B). Verrattuna transfektoimattomiin soluihin, RNAi vastaan ​​Tyk2 vähensi ERK1 /2 fosforylaatio (40% for ERK1 ja 25% ERK2), ilmiö ei havaittu transfektoiduissa soluissa epäspesifinen siRNA. Tämä sai meidät tutkimaan seuraavaksi, onko säätely anti-apoptoottisten proteiinien FGF-2 oli heikentynyt upon Tyk2 hiljentäminen. RNAi suoritettiin kuten edellä, ja, kuten esimerkiksi ilmaus MCL1 seurattiin Western blot (kuvio. 6C). Transfektoimattomia soluja ja soluja, jotka oli transfektoitu joko ei-spesifisten siRNA tai siERK1 /2 käytettiin verrokkeina. Transfektoimattomissa soluissa, tai transfektoitujen solujen epäspesifinen kontrolli, FGF-2 johtaa merkittävään kasvuun MCL1 proteiinin tasoja. Ennustetusti siRNA vastaan ​​ERK1 /2 esti säätelyä MCL1 proteiinia. Tärkeää on, MCL1 ilmaisu ei kasvanut vastauksena FGF-2 soluissa, joissa on alentuneet Tyk2, mikä viittaa siihen, että tämä JAK tarvitaan säätelyä MCL1.

Keskustelu

On monia molekyyli mekanismeja, joiden solut voivat tulla vastustuskykyisiä sytotoksisten lääkkeiden ja siten erilaisia ​​lääkeresistenssin on puututtava väritystä syöpäsoluja. FGF-2 on tunnistettu haitallinen ennustetekijä monille syöpäpotilailla [5], [6], [7] ja Seckl ja Pardo ovat osoittaneet sen merkitystä lääkeresistenssin [3], [4], [8], [ ,,,0],9], [20].

ulostulo JAK /STAT signalointireitteihin vaikutuksia kaukana sytokiini valtakunnan. On yleisesti hyväksytty, että JAK /STAT signalointi on erittäin kontekstisidonnaisia ​​[18], [21], [22], [23], [24], että se on modulaarinen luonteeltaan ja että se liittyy sekä ylikuuluminen ja cross -recruitment muiden reittien [11], [25]. STAT ei yleensä ole mutatoitunut, mutta usein nähnyt konstitutiivisesti aktivoitua syöpäsoluissa [12], [19]. Sen sijaan Jaks usein mutatoitunut ja siten de-säännelty, erityisesti hematologiset maligniteetit [26], [27]. Tietääksemme Jaks ole koskaan suoraan osallisena lääkeresistenssin. On kuitenkin laajalti tunnustettu, että moniin syöpiin liittyy tulehdus, mikä välittyy sytokiinien ja näin ollen, JAK ja STAT [28]. De-säännelty tulehdus puolestaan ​​on ollut mukana monessa syövän kehittymisen ja etenemisen, kuten lääkeresistenssin [12]. Mielenkiintoista, Jaks voi olla ristiriitaisia ​​soluvasteita ja, kuten edellä mainittiin, tämä riippuu liipaisin ja matkapuhelinverkon yhteydessä [13], [29]. Proliferatiivisia vasteita voidaan suoraan välittyy STAT, tai muita molekyylejä, kuten ras viruksen onkogeenin homologi (RAS), ERK: t, v-src sarkooma viruksen onkogeenin homologi (SRC) ja PI3K [tarkistetaan [30]]. Sääntely sytokiinivasteita mukaan Jaks on STAT-riippuvainen mutta JAK-riippuvaisen STAT-riippumattoman soluvasteita on myös raportoitu. Todellakin, JAK1 ja JAK2 moduloivat ilmentymisen BCL-2 perheenjäseniä, molekyylejä ratkaiseva solun elämän ja kuoleman päätöksiä, riippumatta STAT [31], [32]. Tutkimukset käyttäen Tyk2 puutosta solulinjoja ehdotti, että Tyk2 oli kriittinen vastauksista IFN-α /β ja joidenkin sytokiinien. Sen sijaan hiirten, vaikka se alttiimpia virusinfektioiden, oli niiden sytokiinivasteita pitkälti ennallaan [33]. Tutkimukset potilaalle, jolla on luonnossa esiintyvä Tyk2 puute kuitenkin ehdotti, että Tyk2 vaadittiin koko sytokiinisignaloinnin [tarkistetaan [13]]. Tarkka roolit Tyk2, jopa sytokiinivasteita, siis edelleen täysin selvitetty.

Tässä olemme osoittaneet, että U2OS soluissa Tyk2 fosforyloituu nopeasti alavirtaan FGF-2 (Fig. 5B), on tarpeen täydelliseen aktivaatioon ERK1 /2 (Fig. 6B), ja induktio MCL1 (Fig. 6C). Lisäksi Tyk2, JAK1 ja JAK2 tarvitaan FGF-2-välitteisen suojan sisplatiinin (Fig. 1 ja 3). Tämä vaikutus näyttää olevan riippumaton tilastoja, koska vaiennettu STAT1, STAT3 tai STAT5A /B ei estänyt selviytymistä vaikutukset välittyvät FGF-2 (Fig. 1 ja 4). Kukin STAT hiljennettiin itsenäisesti ja on mahdollista, että samanaikainen knockdown kaikkien kolmen STAT, tai jopa muiden STAT perheenjäsenten, voi vaikuttaa FGF-2 lääkeresistenssin. Se, että ei ole fosforylaatio STAT voidaan havaita seuraavat FGF-2 hoidon ehdottaa kuitenkin, toisin (Fig. 5A). Sitä ei ole vielä tiedossa, miten Tyk2 fosforyloituu myötävirtaan FGF-2. Tyk2 voidaan suoraan rekrytoidaan FGF reseptoriin, tai se voi fosforyloitua edelleen myötävirtaan toisen kinaasin kuten SRC [30]. Puute STAT fosforylaation alavirtaan FGF-2 ja puute vaikutus FGF-2 lääkeresistenssin (Fig. 4 ja 5A) viittaa myös siihen, että sytokiinit eivät ole mukana lääkeresistenssin reitit käynnistyvät tämän kasvutekijän. Rooli Tyk2 in FGF-2-välitteinen lääkeresistenssi voi olla entsymaattista ja /tai rakenteellisia (Fig. 5B ja 6A). Itse rakenteellinen rooli Tyk2 syyksi on Tyk2 IFN-α /β vastauksia jossa sen läsnäolo ei ole tarpeellinen vain signalointi, mutta myös solun pinnalla ilmentymistä IFNAR1 ketjun [34]. Lisätyötä on siis tutkittava, Tyk2 kinaasiaktiivisuutta ja /tai rakenne vaaditaan välittävän FGF-2 aiheuttama pro-selviytymisen ja huumeiden resistenssifenotyyppi.

Kuten SCLC-solujen [4], hoito of U2OS solujen FGF-2 indusoi muodostumista proteiinikomplekseille liittyy B-RAF, PKCε ja S6K2 (Fig. 2A-2C). Käsitteellisesti, FGF-2 voi johtaa muodostumista kolmen eri dimeerejä (B-RAF /PKCε, B-RAF /S6K2; S6K2 /PKCε) ja /tai muodostumista trimeeri (B-RAF /PKCε /S6K2). Tarkka stoikiometria proteiinin kompleksit aiheuttama FGF-2 on vielä määrittämättä. Näiden välinen vuorovaikutus kolmen proteiinin tapahtuu 10 min FGF-2 hoito ja on ohimeneviä, vähentämällä merkittävästi eli 30 min. Vaikka tarkkaa roolia monimutkainen on vielä purkaa, on houkuttelevaa spekuloida, että sen toiminta voi olla tarjota signalointi alustan, jossa näitä kinaaseja voidaan koota ja niitä erityisiä fosforylaatiotapahtumien tarvitaan jatkojalostustuotteisiin biologisia vasteita, jotka lopulta johtavat solujen selviytymiseen. Mielenkiintoista on, että S6K2 tasot nopeasti lisätä sen jälkeen, kun FGF-2: hoito osoittaa, että sen lisäksi, että indusoiva S6K2 fosforylaation, FGF-2 voi myös stabiloida S6K2 (Fig. S3 ja S5). Parhaan tietomme mukaan tämä on uusi havainto, joka edellyttää yksityiskohtaisempaa. Tyk2 immunosaostus seuraavat FGF-2 hoito co-immunopresipitaateista PKCε ja B-RAF, edelleen viittaa merkittävä rooli Tyk2 in FGF-2-välitteisen lääkeresistenssin (Fig. 6A). Niinpä vaientaminen joko Tyk2, JAK1 tai JAK2 käyttäen RNAi tukossa FGF-2 lääkeresistenssin vastaan ​​sisplatiinin (Fig. 3). Se on erityisen olennaista määrittää, onko muodostumisen proteiinin komplekseja, joissa PKCε, B-RAF ja S6K2 riippuu Tyk2 koska Tyk2 fosforylaatio on suhteellisen nopea, ja voidaan havaita 5 min post-FGF-2 hoitoa. Lisäksi olemme tunnistaneet MCL1 kuin Tyk2-säännelty molekyyli. Itse asiassa näissä koeolosuhteissa, lisääntyneen ilmentymisen MCL1 seuraavista FGF-2 riippui ehjänä Tyk2 (Fig. 6C). Tämä on todennäköisesti tärkeä havainto, koska, kuten BCL-2, MCL1 ei indusoi leviämisen vaan edistää syöpäsolujen elinkelpoisuus estämällä apoptoosin [35]. Lisäksi se on yksi geeneistä korostettu tutkimuksessa Meyerson ja työtoverit, joka on suunniteltu tunnistamaan genomista alueita usein muuttunut ihmisen syövissä [36].

Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen Tyk2, JAK1 ja JAK2 ovat uusia kohteita, jotka voivat osoittautua käyttökelpoisiksi kiertää lääkeresistenssin välittämien FGF-2, kasvutekijä usein erittävän syöpäsoluja, tai niitä tukevien kudosten ja kohonnut syöpäpotilailla. Tarkka molekyylitason mekanismeja on siis tällä hetkellä tutkittavana laboratoriossamme.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

U2OS soluja ATCC kasvatettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine ( DMEM), johon oli lisätty 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia (FCS) (FirstLink), 2 mM L-glutamiinia, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä (Biowhittaker) kostutetussa atmosfäärissä 10% CO

2 37 ° C: ssa, kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. FGF-2 oli peräisin Calbiochem.

Vasta-aineet

Anti-Tyk2 (C-20), STAT3 (N-terminaali), STAT5A (L-20), STAT5B (G-2), ERK1 (aliverkkotunnuksen XI), B-RAF (H145) ja BCL-2 (100) ostettiin Santa Cruz Biotechnology. STAT1 (N-terminaali) ja PY20 vasta saatiin BD Transduction Laboratories. Vasta-aineita fosforyloidun STAT1 (pSTAT1-Tyr

701), fosforyloitu STAT3 (pSTAT3-Tyr

705), fosforyloitu Stat5: n (pSTAT5-Tyr

694), fosforyloitu ERK1 /2 (pERK1 /2-Thr

202/185 /Tyr

204/187) ja PARP ostettiin Cell Signaling Technology. Anti-MCL1 oli BD Pharmingen. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.