Krooninen sairaus

tiivistelmä

Radioresistance on tärkein estettä tehokkaalle sädehoito ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Huolimatta useista kokeellisia ja kliinisiä tutkimuksia Säteilynsietotestin, tarkkaa mekanismia radioresistance in NSCLC soluissa ja kudoksissa edelleen epäselvä. Tämä tulos voidaan selittää rajoitus aikaisempien tutkimusten, kuten osittainen käsitys solujen radioresistance mekanismin yhden molekyylin tasolla. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään laaja säteilyn vasteita säteilyresistenteille NSCLC soluissa ja tunnistaa radioresistance-liittämällä tekijät. Ensimmäistä kertaa, käyttäen RNA-seq, massiivinen sekvensointi lähestymistapaa, tutkimme koko-transcriptome muutoksen säteilyresistenteille NSCLC A549 säteilyn, ja todentaa merkittävä säteilyn muuttunut geenejä ja niiden kromosomin leviäminen. Myös bioinformatiikan lähestymistapoja (GO analyysi ja IPA) suoritettiin kuvaamaan säteilyn vasteita säteilyresistenteille A549-soluja. Huomasimme, että epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), maahanmuutto ja tulehduksia voidaan mielekkäästi liittyvän sääntelyn säteilyn vasteita säteilyresistenteille A549-soluja. Tulosten perusteella on bioinformatiikan analyysi säteilyn aiheuttama transcriptome muutos, valitsimme seitsemän merkittäviä säteilyä muuttaa geenien (

SESN2, FN1, TRAF4, CDKN1A, COX-2, DDB2

ja

FDXR

) ja sitten verrataan säteilyn vaikutuksia kahdenlaisia ​​NSCLC-solujen eri radioherkkyyttä (säteilyresistenteille A549-soluja ja säteilylle NCI-H460-soluissa). Mielenkiintoista, säteilyn,

COX-2

osoittivat merkittävin ero mRNA ja proteiini ilmaisun välillä A549 ja NCI-H460-soluissa. IR-indusoitu lisäys COX-2-ekspressio esiintyi vain säteilyresistenteille A549-soluja. Yhdessä ehdotamme, että COX-2 (tunnetaan myös prostaglandiini-endoperoksidisyntaasi 2 (PTGS2)) voisi olla mahdollisuus otaksutuksi biomarkkeri radioresistance NSCLC soluissa.

Citation: Yang HJ, Kim N, Seong KM , Youn H, Youn B (2013) tutkiminen Säteily aiheuttaman transcriptome profiili säteilyresistenteille ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 Cells käyttäminen RNA-seq. PLoS ONE 8 (3): e59319. doi: 10,1371 /journal.pone.0059319

Editor: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan

vastaanotettu: 15 marraskuu 2012; Hyväksytty: 13 helmikuu 2013; Julkaistu: 22 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Nuclear Research Development Program (2012-0006383) ja Basic Science Research Program (2012-0003201) kautta National Research Foundation Korean rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: KMS on tällä hetkellä työntekijöitä Säteilyn Health Research Institute, Korea Hydro Nuclear Power Co., Ltd. Muut Kirjoittajat julistaa, ettei eturistiriitoja. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Sädehoito, yksin tai yhdessä leikkauksen tai kemoterapiaa, on ratkaiseva rooli hoidossa NSCLC. Kuitenkin hoitotulosten eivät ole täysin tyydyttäviä monissa tapauksissa. Odottamattomia säteily vasteita sädehoidon aikana, (luontainen /hankittu) radioresistance pidetään tärkein tekijä, joka rajoittaa tehoa sädehoitoa NSCLC [1].

säteilyherkkyyttä solujen ja kudosten on yhdistetty suoraan leviämisen hinnat ja säteilyn aiheuttama muutoksia geeni-ilmentymisen muodostuvat lähinnä solusyklin etenemisen, DNA: n korjaukseen ja apoptoosin [2]. Radioresistance NSCLC on liittynyt menetys p53-toiminto, muuttunut ilmentyminen selviytymisen proteiineja, kuten X-linked apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP) ja surviviinin, aktivointi fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) /Akt-signaloinnin [3], tai yliekspressio Pim-1 kinaasia [4]. Lisäksi kertynyt näyttöä siitä, että radioresistance usein korreloi epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja yliekspressio antioksidanttia, entsyymit, kuten Mn-superoksididismutaasi (Mn-SOD) [5], [6]. Vaikka nämä tutkimukset ovat edistäneet ymmärrystä mekanismeja solujen radioresistance, he voivat selittää vain osittain näkökohta säteilyresistenteille vastauksia, ja kattava toimintamekanismit ovat edelleen suurelta osin hämäräksi. Tämä tulos ei ole yllättävä, kun otetaan huomioon luonne radioresistance säätelee monimutkainen useita geenejä ja /tai proteiineja. Lisäksi on olemassa useita raportteja, jotka radioherkkyyttä ei liity ainoastaan ​​säteilyn indusoiman apoptoosin, ja ne saattavat riippua muita molekyylejä ja menetelmiä, joita ei vielä ole tunnistettu [7]. Tämän vuoksi on ollut vaikeaa selvittää tarkka mekanismi radioresistance ja ymmärtää koko muutoksen säteilyn vasteita NSCLC.

Laaja geenin ilmentymisen profilointi analyysi voidaan lisätä tulkinta molekyylimekanismiksi radioresistance moduloidaan monimutkainen geneettinen ja biokemiallinen verkoissa. Microarray on kattavin tapa mitata geeniekspressiota ja johtanut erinomaisen tietämyksen of radioresistance [8], [9]. Kuitenkin mikrosiru on useita rajoituksia kuten koettimen hybridisaation kinetiikka, koetin valinta (täytyy tietää genomista loci ja ominaisuudet), Taustahybridisaatiota ja cross-platform vertailukelpoisuuden [10]. Sekvensointi-pohjainen ekspressio analyysi on kehitetty voittamaan nämä rajoitukset hybridisaatioon perustuva määritys. Viimeisten 10 vuoden aikana käyttöön suuren suoritustehon seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on mullistanut transkriptomiikka tarjoamalla mahdollisuuksia moniulotteinen tutkimuksia huokoista transcriptomes. Se on mahdollista, koska laajamittainen ekspressiotietojen hankitaan yhdellä yksipohjaiseksi resoluutio. Koska tärkein määrällinen transcriptome profilointi alustan, RNA-seq on pidetty uuden kokeellisen menetelmän tilalle mikrosirun. RNA-seq, (yhteensä tai lähetti) RNA-populaation muunnetaan kirjaston cDNA-fragmenttien sovittimet on kiinnitetty toiseen tai molempiin päihin. Jokainen kirjasto, tai ilman vahvistusta, on sekvensoidaan sitten hankkia lyhyen järjestyksessä lukee toisesta päästä (single-end sekvensointi) tai molemmista päistä (pariksi-end sekvensointi). Luetut sekvenssit ovat tyypillisesti 30-400 bp pitkiä, riippuen sekvensointi alustat: Illumina, Roche 454 tai kiinteässä järjestelmässä. Sekvenssointia, tuloksena lukee joko linjassa viite genomiin tai transkriptien tai kootaan

de novo

ilman genomisen sekvenssin [11]. Koska korkea syvyys lukea kattavuuden, RNA-seq tuottaa tarkemman mittauksen tasojen selostukset ja niiden isoformeja kuin muita välineitä. Lisäksi sitä voidaan käyttää tutkimaan transkriptio rakenteita yhteydessä transkription aloituspaikkoja, vaihtoehtoisen silmukoinnin kuviot ja muut transkription jälkeisen muutoksia. RNA-seq on sovellettu tunnistaa pitkään kuin koodaavat RNA: t, joilla on tärkeä rooli transkription ja translaation jälkeisessä geenisäätelyn [11].

Tähän asti ei ole ollut tutkimuksia arvioi globaalin säteilyn vastauksia at koko transcriptome tasolla NSCLC soluissa. Keskityimme RNA-seq korjata puutteet aiempien tutkimusten osoittaa jonkin verran katkonainen todistusarvolla radioresponses, ja sitten ehdotti, että RNA-seq voisi olla ihanteellinen tapa perehtyä monimutkainen säteilyä vastausta. Tässä tutkimuksessa pyrittiin luonnehtimaan transcriptome of säteilyresistenteille NSCLC A549-solut ja tutkimaan toiminnallinen säätelyverkkojen geneettisellä tasolla. Näiden tavoitteiden saavuttamiseksi, me käyttänyt täysimääräisesti strateginen yhdistelmä RNA-seq johdetun geenin ilmentymisen tiedot ja tulokset bioinformatiikan ja biologisia määrityksiä. Se on ensimmäinen tutkimus soveltaa tätä uutta teknologiaa, RNA-seq profiloida säteilyn aiheuttamista geeniekspressiota säteilyresistenteille NSCLC soluissa. Ehdotamme, että tulokset voivat antaa hyödyllistä tietoa potentiaalisten biomarkereiden radioresponses kuten radioresistance, ja lopulta auttaa ymmärtämään säteilyn vaikutuksia NSCLC soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Soluviljelyväliaine (RPMI 1640), FBS ja antibiootteja (penisilliini ja streptomysiini) hankittiin Hyclone (Logan, UT). Vasta-aineita EGFR: ää, p53, Sestrin2, COX-2, TRAF4 ja β-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita varten fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfori-EGFR (Tyr845), fosfo-Akt (Ser473), fosfo-Akt (Tyr308), Akt, fosfo-p53 (Ser15), p21 ja fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-ainetta γ-H2A.X (Ser139) hankittiin Millipore (Billerica, MA). Vasta-aine FDXR ostettiin Abcam (Austin, TX).

Soluviljely ja Säteilytys

Ihmisen NSCLC solulinjat (A549 ja NCI-H460) hankittiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Korean tasavalta). Molemmat soluja viljeltiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 U /ml) ja 10% FBS: ää. Solut altistetaan ionisoivalle säteilylle (IR) käyttäen

137Cs γ-säteilyttäjällä (IBL 437C, CIS Bio International) annoksena nopeudella 0,8 Gy /min. Säteilytettyjä soluja inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan.

RNA-seq kirjaston valmistus ja sekvensointi

Kokonais-RNA eristettiin säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen A549-soluihin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA laatu arvioitiin agaroosigeelielektroforeesilla (visuaalinen ilman merkittäviä 28S ja 18S rRNA hajoamista) ja spektrofotometrillä. Seuraavaksi kokonais-RNA eheys tarkistettiin käyttäen Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer kanssa RNA eheyden numero (RIN) arvo on suurempi kuin 8. mRNA puhdistettiin ja hajanainen kokonais-RNA (2 ug) käyttämällä poly-T oligo Sitoutumattomat magneettiset helmet kaksi kierrosta puhdistus. Lohkaistaan ​​RNA-fragmentit pohjustetaan satunnaisia ​​heksameerejä oli käänteiskopioida ensimmäisen juosteen cDNA käyttämällä käänteistranskriptaasia ja satunnaisia ​​alukkeita. RNA templaatti poistettiin ja syntetisoitiin korvaavan lohkon tuottaa kaksinkertaisen säikeen cDNA. End korjaus, A-pyrstön, adapteri ligaatio cDNA mallin puhdistus ja rikastaminen puhdistetun cDNA malleja käyttämällä PCR suoritettiin sitten. Rakennettu kirjastot olivat 100 ep pariksi-end sekvensoitiin jota Illumina GAIIx sekvensseri kaksi kaistaa virtauksen solun, valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Gene ontologia (GO) Analysis

GO analyysi on yleisesti sovellettu menetelmä toiminnan tutkimuksessa laajamittainen genomista tai transcriptomic data [12]. Gene ontologia rikastus Analysis Software Toolkit (GOEAST, https://omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/php/illumina.php) käytettiin tunnistamaan merkittävästi rikastettu GO termejä joukossa annetaan luettelo geenejä, jotka ilmentyvät eri vastauksena IR. Tilastollisesti yliedustettuina GO luokat p-arvo 0,01 pidettiin merkittävinä.

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) B

IPA ohjelmisto (Ingenuity System, Redwood City, CA) käytettiin analysoimaan meidän RNA -seq tietojen suhteen biologisia vasteita ja kanonisen polkuja. Sijoitus ja merkitys biofunctions ja kanonisen reittejä testattiin p-arvo. Lisäksi kanoninen reittejä tilattiin suhteella (lukumäärä geenejä syöttötietojen joukko, joka karttaa polkua jaettuna kokonaismäärä molekyylejä, joita esiintyy kanoninen reittiin). IPA myös syntyy matkaviestinjärjestelmien jossa säädellään eri tavalla geenit voivat liittyä mukaan aikaisemmin tunnettuja assosiaatioita geenejä tai proteiineja, mutta riippumatta vakiintuneiden kanoninen polkuja. Top verkot edusti verkon yhdistävien toiminnot perustuvat pisteet, joka huomioi -log (

p

-arvo), jossa esitetään kooste todennäköisyys geenien verkossa löydetään yhdessä johtuu sattumasta. Pisteet ≥2 katsottiin merkitseväksi.

Reaaliaikainen Reverse Transcription (RT) -PCR

Yhteensä RNA alistettiin RT sattumanvaraisia ​​heksameerejä käyttäen SuperScript Ensimmäisen Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad , CA) saamiseksi cDNA. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kynnyssyklit (Ct) on lasketaan automaattisesti Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hampuri, Saksa). PCR ehto oli seuraava: polymeraasi aktivointi 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 1 min. Intensiteetti kunkin geenin normalisoitui vastaan ​​GAPDH ilme. Erilainen ekspressio laskettiin suhde ekspressiotasot kohdegeenien säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen solujen, mukaan ΔΔ C

t

menetelmä [13]. Kaikkien alukkeiden paria, spesifisen monistamisen PCR-tuotteiden varmistettiin sulamiskäyräanalyysillä ja agaroosigeelielektroforeesilla. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express 4,0 (Applied Biosystems, Foster, CA) ja sekvenssit esitetään taulukossa 1.

Western blot -analyysi

Kun 4 tuntia säteilytyksen kokosolu lysaatit (5 x 10

6 solua) valmistettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM Na

3Vo

4, 1 mM PMSF, 0,25% Na-deoksikolaattia ja 5 U /ml aprotiniini). Western blot -analyysiä varten, Denaturoitu proteiini lysaatit (40 ug) altistettiin SDS-PAGE: lla. Erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja tukittiin 5% rasvaton maito TBST: ssä (10 mM Tris, 100 mM NaCl, ja 0,1% Tween 20) 1 h huoneen lämpötilassa. Sitten membraanit tutkittiin tiettyjä primaaristen vasta-aineiden ja sen jälkeen peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, ja visualisoitiin ECL-detektiojärjestelmässä (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Englanti).

Tulokset

malli RNA-seq Study in säteilyresistenteille NSCLC Solut

Jokaisessa solulinja on peräisin NSCLCs on raportoitu niiden eri radioherkkyyttä. A549-soluja, hyvin tunnettu säteilyresistenteille NSCLC solulinja, osoittavat merkittävää toleranssia säteilylle ja vaatimaton menetys solujen elinkelpoisuuden altistumisen jälkeen IR [4], [14]. Tässä tutkimuksessa haluamme tutkia säteilyn aiheuttamien koko transcriptome muutoksen säteilyresistenteille NSCLC soluissa käyttäen RNA-seq, ja lisäksi tunnistaa radioresistance-liittämällä tekijät (mahdollisia biomarkkereita radioresistance). Sen tarkistamiseksi asianmukaiset koeolosuhteita RNA-seq analyysi, selvitimme ajasta riippuva useiden proteiinien ekspressio tunnetaan radioresponsive tekijät [15], [16], [17] säteilyresistenteille NSCLC A549 soluja säteilytys. Myös otetaan huomioon kumulatiiviset vaikutukset säteilyn, säteilytasoja asetettiin 2 Gy. Tämä oli annosalueella annetaan tyypillisesti säteilybiologiassa kokeista, joissa soluja [18]. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, ilmentymistasojen fosfo-EGFR (Tyr845), fosfo-Akt (Ser473) ja p21 osoitti lisätä enintään 4 tuntia säteilytyksen jälkeen. Lisäksi IR aiheuttama PTEN ilmentyminen vähitellen pieneni, kun taas fosforylaatio Akt at Ser473 suureni ajasta riippuva tavalla.

(A) määritys asianmukaisten säteilyttämistä ehto perustuu ilmaisemaan edustavia radioresponsive proteiineja. (B) Kaaviokuva suunnittelu ja tavoitteiden tutkimuksemme. Tophat tasaa RNA-seq lukee genomiin viite (hg19) ja etsii transkripti silmukointikohdissa. Kalvosinnapit kokoavat lukee syntyvät Tophat yhdenmukaistaminen osaksi selostukset. Cufflinks paketti koostuu seuraavista ohjelmisto – Kalvosinnapit, kokoaa transcrips; Cuffcompare, vertaa transkriptio kokoonpanot merkintä; Cuffdiff, etsii differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja selostukset.

Kun tarkoitus kokeen, sekvensointi alustoja, lukea pituudet ja sekvensointi tyyppejä tulee määrittää kunnolla. Nämä koeolosuhteet ovat läheistä sukua tehokkuuden RNA-seq analyysi. Illumina sekvensointialustamme näyttää olevan erittäin replikoituvaan suhteellisen vähän teknistä vaihtelua kuten transkriptio-pituus bias [19]. Se osoittaa suurempaa transcriptome kattavuus ja sekvensointi syvyys [10]. Lisäksi pariksi-end sekvensointi on johtamiseen soveltuvat laadullista analyysiä kuten transkription aloituskohdasta kartoitus, havaitseminen geenin fuusio selostukset ja vaihtoehtoisen silmukoinnin ja kartoitus genomisen rakennevariaatiot lukien deleetiot, insertiot ja uudelleenjärjestelyt [20]. Perustuen näihin tutkimustuloksiin, 4 tunnin jälkeen säteilytyksen, kokonais-RNA eristettiin säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen säteilyresistenteille A549-solut, joita käytetään luomaan Illumina RNA-seq kirjasto, ja altistettiin sitten 100 ep: n pariksi lopussa sekvensointi käyttäen Illumina GAIIx alustalla. Kaaviokuva suunnittelusta ja tavoitteet Tutkimuksemme on esitetty kuvassa. 1B.

tunnistaminen Radioresponsive geenien säteilyresistenteille NSCLC Solut kautta transcriptome Analysis

kokonaismäärät RNA-seq lukee (tulos formaatti: FASTQ) hankittu säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen säteilyresistenteille NSCLC A549-soluja, oli 32315026 (6527635252 bp) ja 31084922 (6279154244 bp), tässä järjestyksessä. Me kohdistettu sekvenssi lukee ihmisen genomin viite (hg19) käyttäen Tophat versiota 1.2.0. Pujontaliitosten poimittiin RefSeq linjaus (ladattavissa University of California, Santa Cruz (UCSC) Genome Browser). Yhteensä vähintään yksi päissä 28372827 (87,8%) ja 27514052 (88,5%) lukee varten säteilytettyjen ja ei-säteilytettyjen A549-solut, vastaavasti, saatiin onnistuneesti suhteutettu hg19. Seuraavaksi tuloksena luku- linjaukset (tiedostomuoto: BAM) koottiin kautta kalvosinnapit versio 1.0.3, ja se loi uutta transkriptio käyttäen Cufflinks viite merkintä-pohjainen transkripti (RABT) algoritmia. Transkriptit yhdistetään Cuffcompare käytettiin laskettaessa suhteellinen runsaus kunkin transkriptin kautta Cuffdiff. Geeniekspression tasot määritettiin mittaamalla summa fragmenttien kohden kiloemästä eksonin mallin per miljoona kartoitettu lukee (FPKM) arvot sen eksonien. Hankitaan tarkempia tuloksia, me suodatettu pois kunkin data, jos arvioitu FPKM arvot sekä säteilytettyä ja ei säteilytetty näytteessä oli alle 1,0 (vrt FPKM arvo 0,05 alaraja ekspressiotason on yleisesti asetettu). Loppujen lopuksi tunnistimme, että 727-geenit merkittäviä differentiaalisesti ilmaistut säteilyresistenteille A549-solut säteilytyksen jälkeen. Näistä geeneistä, 367 geenejä säädellään ylöspäin, ja 360 geeniä alassäädetty. Mukaan solujen toiminnallista luokittelua, huomattavasti ylöspäin geenien luokiteltiin seuraavasti: solukierron (

CDKN1A, MLL5, NEK11, TP53INP1

), korjaus (

DDB2, REV3L, SESN1, SESN2, XPC

), solukuoleman (

ACER2, BTG2, MDM2, MEF2A, OPA1, PLTP, TRIAP1

), rasva-aineenvaihduntaa (

COL4A3, COX-2

), solujen kasvun ja lisääntymisen (

DOK1, EIF2AK2, FDXR, DFRK, GDF15, GSTM1, PDK1, PGF, PIK3IP1, PPM1D, RHOBTB2, SH3BP2, SHBG, SLC22A1

) ja immuunijärjestelmän vasteet (

FOXP3, TNFSF9

). Myös merkittävästi alas geenien luokiteltiin seuraavasti: solukierron (

Cdc42, MT2A, SPC25, STAT5A

), korjaus (

H2AFX, PDE11A, XRCC3

), solujen kehitystä (

GPER, ICAM2, OPHN1

), solukuoleman (

CARD8, CEACAM1, PTPRG, ST6GAL1

), solujen kasvun ja lisääntymisen (

BAI1, F3, KLF11, MNT, MORF4L1, MYC, ROMO1 , SMAD1, ST7L, TBXA2R

) ja immuunijärjestelmän vasteet (

IL12A

). Yksityiskohtaiset tulokset esitetään Dataset S1, taulukko S1 ja Taulukko S2.

Lisäksi tarkistaa ominaisuus sijainnit kromosomissa säätelevien geenien säteilyn vastauksia, selvitimme ilmaisu maiseman poikki kokonaisia ​​kromosomeja tutkimalla muuttamalla geeniekspressiota säteilytetty säteilyresistenteille A549-soluja. 400 kb liukuikkuna määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien A549-solujen vastauksena IR, on piirretty yhdessä koko kromosomien muokattuja-kirjaa UCSC Genome Browser (Fig. 2). Huomasimme, että kromosomi leviämismallit vaihteli suuresti suhteessa geenin tiheyteen, ja erityisesti kromosomin 19 oli suurinta geeni tiheys kartoitettu geenejä. Vuonna säteilyresistenteille NSCLC A549-soluja, useita geenejä osoittaa IR-muuttunut ilmentyminen sijaitsee kromosomissa 1, 2, 3 ja 19. Kuitenkin, emme voi saada mielekästä tietoa suoraan suhdetta säteilyn vastauksista ja nämä kromosomi leviäminen.

(x-akseli: kromosomi koordinoida, y-akseli: määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien A549 solujen säteilyn 400 kb liukuva ikkuna).

Investigation of Radiation aiheuttaman transcriptome Alteration in säteilyresistenteille NSCLC Solut läpi GO Analysis

Minkään tietyn geenin sarjaa (mikrosiru tai NGS kokeelliset tiedot sarjat), GO-pohjainen toiminnallinen analyysi antaa tilastollisesti rikastettua GO termejä, jotka kuvaavat geenituotteiden ja osoittaa niiden suhteita mukaan kolme ontologian luokat: biologinen prosessi, molekyyli- toiminta ja solukomponenttiin [12]. Analysoivat RNA-seq tiedot perustuvat ryhmiä toiminnallisesti liittyvien geenien sijaan yksittäisiä geenejä, käytimme GOEAST web-pohjainen suurikapasiteettisten toiminnallinen genomisen analyysin avulla. Sitten tunnistettiin merkittävästi rikastettu GO termejä ja ominaista säteilyn vasteet säteilyresistenteille NSCLC A549-solut. Kaikkiaan rikastettu GO termejä löytyivät 77 alaluokkaa biologisissa prosessi, 17 alaluokkia alla solukomponenttiin, ja 50 alaluokat alle molekyyli toiminto. Biologisessa prosessissa ontologian, tulokset osoittivat, että ydinvoiman lokalisointi, TGF-β-reseptorin signalointireitistä, solusyklin pysähtymisen, solujen vaeltamiseen, seriini /treoniini-kinaasi-signalointireitin, angiogeneesi, BMP-signalointireitin ja säätely solujen morphogenesis ovat liittyneet lähinnä radioresponses vuonna säteilyresistenteille A549-soluja. Focal tarttuvuus oli yksi tärkeimmistä solukomponenttien muutettu IR. Merkittävät GO rikastamiseen profiileja biologisen prosessin ja solukomponenttiin luokat (vain p-arvo alle 0,01) on koottu taulukkoon 2. Olemme myös määrittäneet yliedustettuna GO termejä graafisessa muodossa niiden suhteita hierarkkisessa puussa molekyyli toiminto ontologian (Fig. 3). Rikastettu GO molekyyli toiminto termejä säteilyresistenteille A549-soluja säteilyn olivat β-galaktosidaasi-α-2,6-sialyylitransferaasitoimintaa, pyruvaattidehydrogenaasikinaasi aktiivisuutta, TGF-β-reseptorin aktiivisuutta, GTP: n sitoutumista, proteiini transmembraani- kuljettaja aktiivisuutta, filamiini sitova ja activin reseptoreihin. Kautta GO analyysi, huomasimme, että yliedustettuna GO termejä meidän radioresponsive geenin sarjaa, liittyvät läheisesti EMT, muuttoliikkeen ja edelleen angiogeneesiä. Jossa osallistuminen fokaalisen adheesion komponenttien, TGFli /BMP signalointi, filamiini sitova ja activin reseptorin aktiivisuus on raportoitu säätelemään muuttamiseen solumorfologian aikana EMT tai solujen vaeltamiseen. Yhdessä ehdotamme, että EMT ja EMT liittyviä tapahtumia voi olla kriittinen säätelyssä säteilyn vasteita säteilyresistenteille A549-solut säteilytyksen alaisena.

Jokainen laatikko on GO ehdot merkitty sen GO ID, termi määritelmä ja yksityiskohtaisia ​​tietoja, jotka edustavat ” q /m