Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aneuploidy kanssa kromosomi epävakaus on syöpä tunnusmerkki. Tutkimme kromosomissa 7 (CHR 7) kopiomäärä vaihtelu (CNV) glioomis- ja primaariviljelmissä niistä johdetut. Löysimme kasvain heterogeenisyys soluja, joilla on CHR 7-CNV esiintyy yleisesti glioomis-, joissa suurempi osuus solujen korkealaatuisesta gliooma joka kuljettaa yli 2 kappaletta CHR7, verrattuna matala-asteista gliooma. Mielenkiintoista, kaikki CHR 7-aneuploidi solutyyppejä vanhempien kulttuuriin perustettu glioomasolulinjoja ilmestyi uudelleen yksisoluiset johdettu alakulttuurit. Sitten tunnettu biologiaa kolmen syngeenisten gliooman kulttuureissa hallitsevat eri CHR 7-aneuploidi solutyyppejä. Löysimme fenotyyppinen eroavaisuudet soluille seuraavista CHR 7 mis-erottelu, joka hyötyi yleisen kasvaimen kasvu

in vitro

ja

in vivo

. Matemaattista mallintamista ehdotti osallistumista kromosomin epävakauden ja vuorovaikutuksen solualapopulaatioiden palauttamiseksi optimaalisen tasapainon kasvainsolutyypit. Sekä kokeelliset tiedot ja matemaattinen mallinnus osoitti, että monimutkaisuus kasvain heterogeenisuus voitaisiin parantaa olemassaolo kromosomeja, joissa rakenteelliset epämuodostumat, lisäksi niiden mis-Suotautumat. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot osoittavat ensimmäistä kertaa, osallistuminen kromosomin epävakauden ylläpitämisessä kasvain heterogeenisyys, taustalla tehostetun kasvun, pysyvyys ja hoito vastus syöpien.

Citation: Hu Y, Ru N, Xiao H , Chaturbedi A, Hoa NT, Tian XJ, et ai. (2013) Tumor-Specific Kromosomi Mis-segregaatio Controls Cancer Plasticity ylläpitämällä Kasvain heterogeenisuus. PLoS ONE 8 (11): e80898. doi: 10,1371 /journal.pone.0080898

Editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 30, 2013; Hyväksytty 17. lokakuuta 2013 Julkaistu 25 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain UC Irvine perustaa rahastoja ja antelias Stern perhe lahja (YHZ ja ML), avustukset tarjoamat UC Cancer Research koordinointikomitea, UC Irvine tutkimusta, Cancer Center Seed Grant (palkinto numero P30CA062203 National Cancer instituutti), Musella Foundation for aivosyövän Research Tiedotus ja Voice Against aivosyöpä (YHZ), National Science Foundation DMS-0969417 (JX), VA Merit Review Grant (MRJ). Zhenyu Jia on osittain tuettu Guizhou Normal College, Guiyang, Guizhou, Kiina, QKHJ [2013] 2238. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Liping Yu on työntekijä Ziren Research LLC, Irvine, CA, USA. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Mukaan Nowell n alkuperäisestä kloonista evoluutio hypoteesi [1], syövän kehittymisen on kehittyvä ja ekologinen prosessi, monin tavoin muistuttavat Darvinistinen evoluutio [2]. Tätä hypoteesia tukee ennustaminen syövän etenemisen kanssa geneettinen klonaalinen monimuotoisuutta ruokatorven adenokarsinooma [3], ja nyt on laajalti hyväksytty selitys kasvaimen heterogeenisyys havaittiin useimmat syövät aikaan kliininen diagnoosi, sekä alkuperäisen ja metastaattisen sivustoja [4], [5]. Käsite syövän Evoluutioprosessin kasvaimia, joilla geneettisesti ja fenotyypiltään erilaisia ​​solualapopulaatioiden on sopusoinnussa äskettäin syöpä kantasolujen malli, jossa korostetaan syövän joiden solutyypin pystyy tuottamaan muita solutyyppejä yksisuuntaisesti [6 ] – [9]. Kuitenkin havainto fenotyyppisten välisten muuntaminen osallistui kolme alaryhmien solujen rintasyövän solulinjoissa, mikä johtaa solupopulaation tasapainossa [10] paljasti kyky syövän toipua biologisen monimuotoisuuden yli vain varren kaltainen solu alaryhmässä. Tällainen kyky toipua tasapainotilassa häiriön jälkeen on ominaisuus ominaisuus perustettu, tasapainoinen ekosysteemi. Jäljelle jää kysymys siitä, miten, syöpäsolun fenotyyppisen siirtyminen ilmentyy perinnöllinen ominaisuus.

Kertyvät näyttö tukee käsitystä, että mitoosi virheet aiheuttavat kromosomi epävakautta, joka ajaa syövän kehittymistä, luonnon valinta toimii joko syöpä ekologian tasolle välttää sytogeneettinen kaaos. Ilmeisesti ei-satunnaista jakautumista kromosomi voitot ja tappiot nähdä tietyn kasvaintyypeissä on yhdistetty vaikutus kromosomin epävakauden ja valinta tiettyjä fenotyyppejä joukosta massiivinen muutoksia transcriptome [11] – [15]. Gliooma ovat ensisijainen pahanlaatuisen aivokasvaimen ottaa astrocytic ja /tai oligodendrogliaalisiin piirteitä vaihtelevan maligniteetti. Korkealaatuisinta, valitettavasti yleisimmin nähty gliooma, on glioblastooma (GBM, luokka IV), morfologisesti, geneettisesti, ja sytogeneettisesti heterogeeninen, ja tasaisesti kohtalokas koska sen nopean solujen lisääntymisen ja voimakkaasti invasiivisen käyttäytymisen [16] – [19]. On tunnettua, että muutos kromosomissa 7 (CHR 7) kopiomäärä esiintyy niin korkean ja matala-asteinen gliooma ja että nämä muutokset näyttävät liittyvän invasiivisia ja proliferatiivinen solun fenotyyppejä [20] – [24]. Kirjoittajat raportoivat tutkimuksia CHR 7-aneuploidian liittyviä solujen monimuotoisuus ja rooli CHR 7 mis-erottelu (CHR 7-MS) ylläpitämään fenotyyppisen monimuotoisuuden gliooman solualapopulaatioiden, joka generoi synergistinen vaikutus yleiseen kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Pakastetut ja tuoreet gliooman näytteet tarjoamia kudospankkiyhdistys University of California, Irvine ja University of Arkansas for Medical Sciences, jossa Institutional Review Board hyväksyntä.

eläinten työ ja ihonalainen (sc) ja kallonsisäistä (sc) ksenografteissa

eläin työ hyväksyttiin animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja University of California, Irvine. Tutkimuksia käyttämällä kallonsisäistä (ic) ksenografteja, gliooma soluja (1 x 10

5/3 ui DMEM /F12) injektoitiin otsalohkon on 4-6 viikkoa vanhoja, naispuolinen, nude-hiiriin (tahra NCrNu-M, Taconic , Hudson, NY), seuraavat IACUC hyväksytty kirurgisia toimenpiteitä. Sen jälkeen i.c. istutusta, hiiriä tarkkailtiin päivittäin ja määräajoin punnita kuolemaisillaan merkkien (hunchback asento, merkitty laihtuminen ja kävelyn heikkeneminen). Hiiret lopetettiin, kun he kehittivät aivovaurioita oireita (ataksia, hemiparesia jne) ja /tai 20% painonmenetyksen, ja seuraavana päivänä oli äänittää selviytymistä päivästä hengissä analyysiä.

tutkimukset käyttäen ihon alle (sc) ksenografteja, soluja (1 x 10

6 solua /50 ui DMEM /F12) injektoitiin subkutaanisti nude-hiiriin, etummainen niiden oikea ja vasen reisi, molemmin puolin. Kasvainmittaukset otettiin joka 3-4 päivä istutuksen jälkeen, ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa V = (L * W

2) /2 (L, pituus, W, leveys). Hiiret lopetettiin ennalta määrättynä aikana kokeen tai kun tuumorin tilavuus ylitti 1,5 cm

3.

Gliooma primaariviljelmissä ja solulinjoissa

tuore ihmisen gliooman kudosten hajotettiin entsymaattisesti (0,05% trypsiini-EDTA: ta 30-45 minuutin ajan 37 ° C: ssa), hajotettiin mekaanisesti (kulkee lasipipetillä DMEM /F12, joka sisälsi 0,10 mg /ml DNaasia, ja 10% seerumia), ja viljeltiin sekä kollageenipäällysteisiin (3-4 ug /cm

2) viljelyastioihin DMEM /F12, johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia, joka on nimetty seerumin kiinni (SA) viljelyolosuhteet, ja agar (1%) – päällystetty viljelymaljoihin DMEM /F12, johon oli lisätty epidermaalisen kasvutekijän (EGF, 20 ng /ml), emäksinen fibroblastikasvutekijä (FGF, 10 ng /ml), ja 1-5% B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka on nimetty hermostoputken pallo (NS) viljelyolosuhteet. Monisoluisen gliooma palloja muodostettu NS viljelyolosuhteet johdettiin fibronektiiniä (1 ug /cm

2) päällystetty ruokia samassa viljelyalustassa ennen pakastusta tai alistamalla kalastaa analyysiin.

Ihmisen glioomasolulinjoja ( A172, LN229, LG11, T98G, U251, ja U87) saatiin Department of Neuro-Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center. Geneettinen profiilit (7-STR markkereita tarjoamia IDEXX Radil, Columbia, MO), jota tässä tutkimuksessa olivat samanlaisia ​​tai hyvin samankaltainen kuin geneettiset profiilit ilmoitettava kunkin solulinjan (taulukko S1). A172 raportoitu tässä oli alun perin nimetty D54, mutta kuljettaa geneettiset profiilit viittaa variantti A-172 raportoitu American Type Culture Collection (ATCC). U251 raportoitu tässä oli alun perin nimetty U251HF, joilla on geneettinen profiili viittaa muunnelma U251, verrattuna U251 NCI-60 Cancer Cell Line Panel. Vertailujen U251 variantteja (taulukko S2) toimitti Beth Bauer (IDEXX Radil).

Kaikki glioomasolulinjoja (vanhempien) viljeltiin SA olosuhteissa. Johdettujen SA ja NS kloonit perustettiin yksittäisistä pesäkkeistä muodostuu 0,3% pehmeä agar päälle kerros pohja agar (0,5%) vuonna DMDM ​​/F12 täydennetty 5% naudan seerumin tai EGF /bFGF /B27 kuin NS kulttuureissa, poimitaan lasipipetillä, ja laajennettu SA tai NS olosuhteissa. Sillä U251 sama homotsygoottisia mutaatioita PTENin [E242fs * 15 (723 724 insTT)] ja TP53 (R273H) vanhempien ja SA: n ja NS-alakulttuurien tunnistettiin Mariam Youssef, Nirvi Shah ja Anthony Wong (UC Irvine).

Fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) B

Metaphase levinnyt liukuu saatiin altistamalla 80% confluently kasvavat solut nacadozole liuokseen (100 ug /ml lopullinen, Sigma) 1 tunnin ajan. Sitten solut trypsinoitiin (0,25% trypsiini /EDTA: ta, Invitrogen) kerätä solupellettien, joita käsiteltiin hypotonisella liuoksella (fosfaattipuskuri) 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solupelletit kiinteä (metanoli: jääetikkaa = 03:01) vähintään 30 minuuttia. Lopuksi solususpensiot pudotetaan dioja saada metafaasissa kromosomilevitteisiin. Standardi B-ryhmittelyä tehtiin kalvot, sillä ne tehtiin niin (samanaikaisesti) käsittely trypsiinillä, ja värjättiin Giemsa tahra (Invitrogen). FISH suoritettiin metafaasissa leviää ja pakastetut tuumorisektioiden (7 um) käyttäen suora fluoresoiva DNA Probe Kit kanssa CEP X /CEPY, EGFR /CEP 7 ja PTEN /CEP10 (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL). Hybridisaatio, pesu, ja counterstaining suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 250-300 solua näytettä laskettiin fluoresenssimikroskoopilla, jossa on 100 x objektiivi.

Lentivirus infektion

Infectious lentivirus tuotettiin kotransfektoimalla lentivirusvektorin plasmidi pGIPZ-Tyhjä ja pTRIPZ -empty (Open Biosystems) pakkauksineen plasmidilla psPAX2 ja kirjekuori plasmidia pCMV-VSVG HEK-293T-soluissa, seuraten valmistajan protokollaa.

Immunofluoresenssikoe analyysit ic ksenografteissa

kryoleikkeet (7-8 um) hiiren aivot i.c. -ksenografteja asennettu suora havainnointi fluoresenssin ilmaisemat RFP ja GFP-leimatun tuumorisoluja käyttäen 2 × 20 × linssit on Keyence BZ8100 fluoresenssimikroskoopilla, kun tumavärjäystä DAPI. Vieressä kryoleikkeet alistettiin immunofluoresenssilla analyysejä käyttäen 15 ug /ml kanin BMI1 (ab38432, Abcam), 15 ug /ml hiiren CD133 (130-090-422, Miltenyi Biotec), 10 ug /ml hiiren CD31 (CBL1337, Chemicon), 15 ug /ml vuohen GFAP (sc-6170, Sana Cruz), 10 ug /ml kanin MELK (A01390, GenScript), ja 15 ug /ml hiiren SPARC (sc-73051, Sana Cruz) primaarisilla vasta-aineilla, jonka jälkeen sopivan sekundäärisen vasta-aineen, aasin anti-hiiri, kani, rotta tai vuohen Alexa Fluor 350 (sininen), Alexa Fluor 488 (vihreä), ja Texas Red (Invitrogen) seuraten immunofluoresenssi prosessia kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kudos leikkeet kiinnitettiin kanssa pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssia (Invitrogen) katsottuna, jossa on 40 x linssi fluoresenssimikroskoopilla ja kuvaamisen kanssa kulman kamera. Co-lokalisointi kuvat hankittiin ja analysoitiin käyttämällä Nikon kahden laser (HeNe ja Argon) PCM 2000 konfokaali System Eclipse E800 mikroskooppi 100 × tavoite (Melville, NY) _ENREF_20.

Neural kantasolujen erilaistumista määritys

glioomasoluihin (5-10 x 10

3) ylläpidetään hermo alalla viljelyolosuhteet ympättiin 8-hyvin liukuu esipäällystetty fibronektiinin (10 ng /ml) yön yli kasvatettua alkuperäisessä väliaineessa ( undifferentiation), tai poly-L-lysiiniä (15 ug /ml) päällystettyihin kuoppiin DMEM /F12, joka sisälsi 1% FBS: ää 7-10 päivää viljelyn (erilaistumisen); puoli tilavuus tuoretta väliainetta lisättiin jokaiseen 3 päivää, ennen kiinnittämistä varten immunofluoresenssilla analyysejä. Solut kiinnitettiin 4% PFA ja blokattiin 10% aasi seerumia. Ensisijainen aineet (kani nestiinifenotyypin (1:1000) Millipore (AB5922), hiiri MAP2 (1:200) peräisin Abcam (ab11267), ja vuohi GFAP (1:300) alkaen Sana Cruz (sc-6170), hiiren beeta Tubuliinin III (1:200) peräisin Chemcon (MAB1637)), hiiri CD133 (1:50) Miltenyiltä Biotec (130-090-422), kanin MELK (1:200) peräisin GenScript USA (A01390), ja kanin BMI (1: 200) alkaen Abcam inkuboitiin soluja yön yli 4 ° C: ssa ja kehitettiin käyttämällä AlexaFluor toissijainen vasta-aineita (hiiren tai kanin Alexa Fluor 488 nm ja 594 nm (1:200) Invitrogen).

Reaaliaikainen vertaileva kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (CQ-PCR) ja kvantitatiivinen käänteistranskriptio (qRT-) PCR

DNA-näytteet jäädytetty gliooma näytteet eristettiin käyttäen DNeasy (QIAGEN, Valencia, CA). CQ-PCR standardin (tuote CQ101) ja PCR-alukkeita määrällisesti

EGFR

ja kolme viite geenien 2q34 (

SPAG16

), 3p14.3 (

ERC2

), ja 5q31.2 (

SPOCK1

) olivat Ziren Research LLC (Irvine, CA). Se on yhdistelmä-DNA, joka sisältää PCR-fragmentit

EGFR

ja viite geenien yhtenä kappaleena määrittää CNV kuten aiemmin on kuvattu [26]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen FAST-START SYBR-Green I Master Mix (Roche).

Kokonais-RNA (~ 1 ug) uuttamalla Ultraspec (Biotecx) peräisin SA ja NS-kiinnittynyt kulttuureissa, kun 24 tunnin viljelmä in peruselatusaineessa, muutettiin cDNA käyttäen 5 yksikköä Superscript II käänteistranskriptaasilla (Invitrogen). CDNA Näytteet laimennettiin ja kvantitoitiin varten geeniekspressioiden reaaliaikaisella qRT-PCR (SYBR Green I) yhdellä standardin markkeri ja viite geenit [27], normalisoitu

ACTB

. Kvantifiointi

GAPDH

suoritettiin myös verrata kiinnostavan geenin. Alukesekvenssejä varten geenien qRT-PCR ja CQ-PCR on saatavilla Ziren Research LLC (www.zirenresearch.com) pyynnöstä.

Comparative genomin hybridisaatio (CGH) B

DNA (1,5 ug) näytteet glioomasoluihin ja ohjaus (poolin kuusi normaalia ihmisen veren DNA-näytteet) on differentiaalisesti leimattu Cy5 ja Cy3-dUTP vastaavasti puhdistettu ja sitten hybridisoidaan Agilent Human Genome CGH 244 k Microarray. Aineisto analysoitiin tilastollisesti ja visualisoitiin kaksi riippumatonta menetelmiä, kuten Agilent Genomic Workbench 6,5 (Agilent), jossa Z-score algoritmia ja ohjelma kirjoitettu R (https://www.r-project.org/), joka havaittiin samana kromosomimuutoksia. Kynnys Z-score käytetty Agilent menetelmää asetettiin 4.

gelatiinitsymografialla, entsyymi immunometriset määritykset, Western blotting ja immunocytofluorescence

proteiinit 24 tunnin ilmastoiduissa soluviljelyalustoissa saostettiin 4 tilavuudella kylmää asetonia, kehrätty heti 14000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen radioimmunosaostuskokeella puskurissa (RIPA), joka sisälsi proteaasi-inhibiittori Cocktail (Roche). Sama määrä väliainetta proteiinia käytettiin suorittaa gelatiinitsymografialla. Elatusaine tehtiin entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) VEGFA (VEGF-165) ja SPP1 (Osteopontin) käyttäen sarjat Assay Designs (Ann Arbor, MI), ja PTN R 0,01 käytettiin merkitys arvoa määrittämään useita vertailuja ilman overinflating tyypin II virhe.

Matemaattiset mallit

Matemaattinen malli Rakentaminen.

Ilmi x1, x2, x3, x4, x5 koska runsaus solujen 1-5 kopioita CHR 7. Me laiminlyöty solut 6 kopiota, olettaen, että ne olivat Anaphase vaiheissa 3-kopio CHR7 soluissa. Emme odottaneet, että tulokset alla vaarantaisi merkittävästi tästä oletuksesta, koska prosenttiosuus 6-kopio soluissa on alhainen kaikissa mittauksissa. Yksinkertaisuuden vuoksi oletetaan myös, että mis-erottelu hinnat normaalin ja epänormaalin CHR7 ovat samat. For Stics (2Chr7: 1 n, 1 d), oletamme solut voivat joko jakaa symmetrisesti tai yksi CHR 7 mis-erottelu, voidaan tiivistää seuraavasti

Vastaavasti TMCS (3Chr7: 2n, 1 d), meillä on

parametrit

r

i on kasvuvauhti jatkuva lajeja

i

, p

2 ja p

3 viittaavat todennäköisyyksiä epäsymmetrinen (väärin) erottelua yhdet CHR 7 on Stics ja TMCS kohti solunjakautumisen, vastaavasti. Yleensä nämä todennäköisyydet ovat riippuvaisia ​​x, mutta yksinkertaisuuden emme välitä tällaista mahdollista riippuvuutta. Huomaa, että varten TMCS, kaksinkertainen mis-erottelua kaksi paria CHR 7 voi johtaa joko 1 + 5 tai 3 + 3, jolle oletetaan yhtä suuri todennäköisyys. Soluille muiden CHR7 kopioida numeroita, koska niiden prosenttiosuudet ovat hyvin alhaiset, olemme laiminlyöty jopa pienempi osuus mahdollisista kromosomin mis-erottelua tapahtumia. Sääntelevä korko yhtälöitä

Yksinkertaisuuden keskustelua myös Merkitään prosenttiosuus kustakin alaryhmästä α tiettynä ajankohtana i niin. Nämä määrät olivat mitä mitataan kokeellisesti FISH.

Katsomme kolmessa tapauksessa

Ei mis-erottelu, eli p

2 = p

3 = 0 lyhytsanomapalvelukeskukset ja MC ole suora keskinäinen vaikutus

Mis-eriytyminen, Stics ja TMCS ole suoraa keskinäistä vaikutteita

Missegragation olemassa, Stics osittain estää kasvun TMCS, joka mallinnetaan Hill toimivat, ja MC aktivoi kasvua SCS, joka mallinnetaan, missä ja ovat kasvuvauhti vakio TMC kun STIC prosenttiyksikköä ja vastaavasti ja ja ovat kasvuvauhti vakio STIC kun TMC prosenttiyksikköä ja vastaavasti. Me itse asiassa myös tarkastella tapausta, jossa Hillin kerroin 4 sijasta 2, mutta tulos osoittaa mitään merkittävää muutosta

numeerinen menetelmä

Edellä differentiaaliyhtälöitä ratkaistiin Matlab. Alussa kussakin kanavassa, me rescale niin. Kokeellisesti. Meidän matemaattinen mallintaminen tarkka lukumäärä N

0 ei vaikuta tuloksiin. Kulkua varten 1, käytimme arvot ρ käytetty kokeellisesti alkuarvoina. Myöhempinä kohtia, käytimme arvot ρ lasketaan lopussa edellisen passage kuin alkuperäiseen arvoon.

Kunkin tapauksessa paras parametrijoukko saatiin minimoimalla missä ja viittaavat lasketaan ja mitataan prosenttiosuudet subpopulaatio α lopussa passage i, vastaavasti. Käytimme alamäkiauto simplex lähestymistapa [28] suorittamaan minimointiin. Jokaisen paras joukko parametreja, ennustimme kahdentumisajoista.

Tulokset

Kasvain heterogeenisyys määrittämän CHR 7-CNV esiintyy yleisesti korkea ja huono laatu gliooma

Määritä CHR7 kopioluvun vaihtelu (CNV) solun alaryhmästä tasolla, suoritimme loisteputki

in situ

-hybridisaatio (FISH), jossa kaksi koettimia

EGFR

geeni ja sentromeerisen alue kromosomissa 7 (CEP7 ). Tutkimme GBM ja oligodendrogliaalisiin kasvain (OT), toiseksi yleisimmäksi ryhmä gliooma, tunnettu oligodendrogliaalisiin ominaisuuksia. OT sisältää oligodendrogliooman (OG, luokka II), oligoastrosytooma (OA, luokka II); ja anaplastinen oligodendrogliooman (AO, luokka III), joka perustuu kriteereihin Maailman terveysjärjestön. Lukumäärä CHR 7 sentromeerien per ydin, havaitsema FISH CEP7 koetin, määritettiin laskemalla yli 250 solua kasvain, ja nämä tiedot käytettiin luomaan tason kasvain heterogeenisyys osalta CHR 7-CNV. Sitten suoritetaan vertailun eroja tasapainotilaan kasvainten heterogeenisyys perustuu CHR 7-CNV tietoja 14 GBM ja 12 OGS. Oli huomattavasti suurempi prosenttimäärä solujen kuljettavat yli 2 kappaletta CHR 7 (vahvistus) GBM verrattuna OG (

P

0,0005) (kuvio 1A). Toisin OG The CHR 7-CNV OA ja AO oli lähes sama kuin GBM, joissa edustavat tiedot kuvassa 1B.

, kolmen komponentin juoni väestön mittasuhteet 1 kappale (poistetaan), 2 kappaletta (normaali), ja 3 tai enemmän (vahvistus) jäljennökset CHR7 perusteella CEP7 signaalit Ffuorescent

in situ

-hybridisaatio (FISH) 14 glioblastooma multiformes (GBM,

punainen kolmio

) ja 12 oligodendrogliaalisiin kasvain (OGS,

musta neliö

),

P

= 0,0012 päässä MANOVA analyysiin. B, vertailu kasvaimen heterogeenisyys osalta kromosomiin 7 (CHR 7) aneuploidiaan alkuperäisestä kasvaimesta (T) ja vastaavat 3-4 viikkoa vanha primääriviljelmissä alle seerumin kiinni (SA) tai hermo pallo (NS) viljelyolosuhteet. C-D, kuviot solujen CHR 7-CNV peräkkäisessä ja korkea-EGFR monistetaan GBM. Edustavia FISH kuvia omaavien solujen 1-4 kappaletta CHR 7 kanssa polttoväli EGFR vahvistus.

Voit selvittää, CHR 7 CNV-ominaista kasvainsolupopulaatioissa ovat elinkelpoisia ja edistää klonaalisen monimuotoisuuteen kunkin kasvain, tutkimme lyhytaikainen (4-6 viikkoa 1-2 kohdat) primääriviljelmissä alle seerumin kiinni (SA) ja /tai hermo alalla (NS) viljelyolosuhteet. Löysimme alapopulaatio solujen CHR 7-CNV kaikissa tutki gliooman primääriviljelmissä (kuvio 1 B). Oli suurempi osuus solujen CHR 7-vahvistus in kulttuureissa GBM kuin niillä, OG. Molemmissa tapauksissa, prosenttiosuus solujen CHR 7-ampliciation oli suurempi primaariviljelmissä kuin vastaavalla kasvain. AO, joka on enemmän progressiivinen tyyppi OT, myös havaittu samanlainen CHR 7-vahvistus kasvaimen ja sen johdetut primaariviljelmän. Mielenkiintoista on, että oligo-Astro sekoitettu OT, nimeltään ”OA”, tasapainoa solujen koostumuksessa CHR 7-heterogeenisuus alkuperäisessä kasvaimissa oli samanlainen kuin GBM. Kuitenkin OA johdettu primääriviljelmiä, havaitsimme heterogeenisuus silmiinpistävän muistuttavia OG, ja suurin osa soluista on kaksi CHR 7 kappaletta ja vähemmän kuin 40% soluista kuljettaa kolmea tai useamman kappaleen CHR 7 (kuvio 1 B).

vertasi malleja CHR 7-heterogeenisyys OG tai GBM joilla on uusiutuva ja

de novo

tila, eikä löytänyt korrelaatiota. Oli kuitenkin vähitellen kasvaa prosenttiosuus solujen CHR 7-vahvistus peräkkäisessä GBM (eli kasvaimet näytteitä ajan suhteen uusiutuvan tai etenevän) potilaalta, jolla neurofibromatosis (kuvio 1 C). Tämä on sopusoinnussa edellä olevan tarkastelun osoittaa nopeamman kasvun valmiudet solujen CHR 7-amplificaiton.

suora molekyyli- seuraus CHR7 vahvistus on monistuminen onkogeenin EGFR asuvat sen sisällä, joka antaa kasvuetua. Focal vahvistus EGFR on yleisesti nähtävissä klassisen alatyypin GBM [29]. Meillä on siis verrattuna CHR 7-CNV EGFR-CNV, määritetään reaaliaikaisen vertaileva kvantitatiivinen PCR. Löysimme tasapainoinen

EGFR

suhteessa viite geenejä (suhde 0,7-1,3, annetaan 20-30% vaihtelua määrällisesti) kaikissa oligodendrogliaalisiin kasvain (n = 17) ja 53%: n GBM (n = 51), ja alhaista

EGFR

vahvistusta (suhde 1,4-2) 23,5%: GBM: ien, kaikki hyvin korreloi lasketaan

EGFR

tasoa, joka perustuu solujen prosenttiosuus ja niiden CHR 7 numeron. Muissa 23,5% GBM, löysimme korkeatasoinen

EGFR

vahvistusta (suhde 5-48), joka varmistettiin EGFR /CEP7 FISH olevan polttoväli EGFR vahvistusta (kuvio 1 D). EGFR (polttoväli) monistettu GBM, rakenteessa CHR 7-kasvain heterogeenisuus havaittiin olevan samanlainen kuin GBM: issä ilman EGFR (polttoväli) vahvistusta.

Yhteenvetona havaitsimme merkittävällä tasolla kasvaimen heterogeenisyys, jossa solut näytetään CHR 7-CNV yleisesti esiintyvien sekä matalan ja korkean asteen gliooma. Monosomia kromosomin 10 on myös kromosomiin epävakautta toiminnallisesti liittyvät kasvaimen pahanlaatuisuuden [30], ja sitä esiintyy noin 80% GBM kasvaimia. Kun läsnä, monosomia 10 on esitetty homogeenisesti, toisin kuin heterogeenisuus nähty CHR7. Tämä ero osoittaa, että on oltava aktiivinen prosessi ylläpitää CHR 7 heterogeenisyys kasvaimia, jotka olemme tunnistaneet on CHR 7-MS. Lisätutkimuksia tämän prosessin tutkimme CHR 7-MS ja CHR7-CNV vakiintuneilla glioomasolulinjoja.

CHR 7-MS on mukana ylläpitää solussa heterogeenisyys perustettu glioomasolulinjoja

Me tehdään B- ryhmittelyä käyttämällä Giemsa tahra kromosomilevitteisiin kuuden ihmisen pahanlaatuisen glioomasolulinjoja ja määritetään välillä koko kromosomin numeroita (WCN) ryhmitellään tila perustuu yli 7 solua. EGFR /CEP7 FISH suoritettiin ja laskee CEP7 signaalien yli 250 interphase soluja käytettiin määrittämään solujen prosenttiosuus, jotka kantavat eri numerot CHR 7 (kuvio 2A). Kaikki glioomasolulinjoja osoitti rinnakkaiselo monipuolinen solualapopulaatioiden perustuu CHR 7-CNV, joilla on merkittävä osuus kantavien solujen 2-, 3-, ja 4-kopiota CHR7 kanssa lähes diploidi karyotyyppi (U251, U87 ja LG11) , 4-, 5- ja 6-kopioita CHR7 lähes-triploidien /tetraploideja (A172 ja LN229), ja 6-, 7-, ja 8-kopioita CHR7 in lähes pentaploid karyotyyppejä (T98G).

A-B, prosentuaalinen solujen CHR 7-CNV in glioomasolulinjoja, ja niiden SA ja NS alakulttuurien yksinkertaisesta (esim 1, 2) tai sekoittaa (mix) pehmeässä agarissa pesäkkeiden, vastaavasti. Koko kromosomin numerot (WCN) vaihdellen lähellä tila löytyivät 50% soluista kussakin glioomasolulinjaa. D, FISH kuvia siitä normaalia (n) ja johdannaisen (d) CHR 7, ja tuntematon (?) Kromosomi kuljettaa siirtämisellä EGFR edustavasta metafaasissa solu kunkin solulinjan. Kromosomi näkyy DAPI (sininen), sentromeerin ja EGFR esitetään FISH koettimia CEP7 (vihreä) ja EGFR (punainen).

Under SA-viljelyolosuhteisiin, joita on käytetty kulttuuriin nämä glioomasolulinjoja, loimme alakulttuurien välillä yksisoluiset pinnoitus tai yksi pehmeä-agar pesäkkeitä glioomasolulinjoja, jonka nimesimme SA klooneja (SA1, SA2, jne). FISH osoitti uudelleen ulkonäkö CHR7-solun heterogeenisuus kussakin SA klooneista (kuvio 2B), säilyttäen ominaispiirteet CHR 7 ja

EGFR

monistuminen ja /tai alueelta toiselle siirtämistä, jotka todettiin niiden vanhempien kulttuureissa (kuvio 2D) . Mielenkiintoista, prosenttiosuus niitä soluja, jotka olivat olleet enemmistönä vanhempien kulttuuriin laski klonaalisia SA alakulttuurit. Poikkeuksena oli LN229, joka oli alun perin koostuu kahdesta alaryhmien soluja lähes yhtä prosentteina. Ilmeisesti kasvain heterogeenisuus säilytettiin perustettu glioomasolulinjaa by CHR 7-MS. Se osoittaa myös, että vakiintuneesta solulinjasta on viljelty ekosysteemin solualapopulaatioiden saavuttaa tietty tasapaino ajan mittaan. Sitten mietti muuttamalla viljelyolosuhteet voisimme muuttaa heterogeenisyys tasapainoa, kuten sallimaan aiemmin vähemmistö solun subpopulaatio tulla hallitseva uusissa viljelyolosuhteissa. Jos tämä osoittautui tapauksessa me voisi vaihdella viljelyolosuhteet saada riittävä määrä eri vähemmistön solujen jatkotutkimuksiin heidän fenotyyppien ja maksuja kokonaiskasvua.

alttiina glioomasolulinjoja NS viljelyolosuhteet, jotka on alun perin kehitetty viljelemällä hermo kantasoluja ja sitten muunnettu rikastamiseksi gliooma soluja, jotka ilmentävät hermo varsi-tyyppisten solujen ominaisuuksia [31], [32]. Olemme havainneet, että kun kuukauden kulttuurin NS olosuhteissa, jonka aikana oli massiivinen kuolevien solujen (kuolleiden solujen toistuvasti poistettiin viemällä solut edestakaisin tarttumattomia ja fibronektiini välittämä tarttuu olosuhteissa NS väliaineessa), joka on vähemmistö solu alaryhmän emolinjan tuli hallitsevat NS alakulttuurit. Olemme edelleen perustettu klonaalisia NS alakulttuurien yksittäisistä muodostuneiden pesäkkeiden pehmeässä agarissa valmistettu käyttäen NS keski- ja nimesi nämä ”NS klooneja” (NS1, NS2, jne). Kuvio 2C esittää edustavia FISH tiedot NS alakulttuureineen glioomasolulinjojen. Nämä tiedot osoittavat uudelleen esiintymisiä CHR7-solun heterogeenisuus päässä klonaalinen NS alakulttuurit.

Kesti 4 viikkoa pesäkkeitä muodostamaan pehmeässä agarissa, ennen niiden siirtämistä SA tai NS viljelyolosuhteet lisäkasvun. Siirron jälkeen kesti noin 2 viikkoa saada tarpeeksi soluja (2 x 10

5) FISH-analyysillä. Tarvittava aika perustaa uudelleen kulttuurin heterogeenisuus yhdestä ainoasta solusta oli alle 18 solua jakautuminen, joka kesti noin 6-7 viikkoa. Uudelleen saamassa heterogeenisen soluviljelmiä CHR 7-CNV in klonaalisia SA ja NS alakulttuurien kaikista tutkittu glioomasolulinjoja osoittivat, että CHR 7-MS voisi tapahtua missä tahansa alaryhmästä solu ajaa kasvain väestön monimuotoisuuden kannalta, kun taas viljelyolosuhteet määritetty heterogeenisyys tasapainon kasvainsolutyypit.

dramaattisia muutoksia tasapainoon solualapopulaatioiden välillä SA ja NS viljelmiä havaittiin kahden glioomasolulinjoja kanssa lähellä diploidinen karyotyyppejä, U251 ja U87.