Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA (miRNA tai miR) inhibitio onkogeenisten siihen liittyviä reittejä on osoitettu olevan lupaava terapeuttinen lähestymistapa syövän. Poikkeava rasva-ja kolesterolin aineenvaihduntaan osallistuu eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen loppuvaiheen tauti. Olemme viime aikoina osoittaneet, että keskeinen transkriptio tekijä lipogeneesiin, sterolin sääntely elementti sitova proteiini-1 (SREBP-1), aiheuttama rasvahappojen ja lipidien kertymistä ja androgeenireseptorin (AR) transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja myös edistänyt eturauhasen syöpäsolun kasvua ja kastraatio vastus . SREBP-1 yliekspressoitui ihmisen eturauhassyövän ja kastraatio kestävä potilasnäytteiden. Nämä kokeelliset ja kliiniset tulokset osoittavat, että SREBP-1 on mahdollinen onkogeenisen transkriptiotekijän eturauhassyövässä. Tässä tutkimuksessa olemme määritelleet kaksi miRNA, miR-185 ja 342, jotka ohjaavat lipogeneesiin ja cholesterogenesis eturauhasen syöpäsolujen estämällä SREBP-1 ja 2 ilmaisun ja alaspäin säätäminen kohdennetuissa geenit, kuten rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN) ja 3- hydroksi-3-metyyliglutaryyli-CoA-reduktaasin (HMGCR). Sekä miR-185 ja 342 estyy tuumorigeenisyyteen, solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio eturauhassyövässä soluviljelmässä ja ksenograftimalleja yhtyä niiden saartoon lipogeneesiin ja cholesterogenesis. Luonnostaan ​​miR-185 ja 342 ilmentyminen väheni merkittävästi eturauhasen syöpäsolujen verrattuna ei-syöpä epiteelisolujen. Palauttaminen miR-185 ja 342 johti kaspaasiriippuvaisen apoptoottista kuolemaa eturauhassyövän soluissa. Hiljattain tunnistettu miRNA, miR-185 ja 342, edustavat uutta kohdistaminen mekanismi eturauhasen syövän hoidossa.

Citation: Li X, Chen Y-T, Josson S, Mukhopadhyay NK, Kim J, Freeman MR, et ai. (2013) MicroRNA-185 ja 342 esto tuumorigeenisyyteen ja apoptoosia kautta salpaus SREBP metaboliareitissä eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (8): e70987. doi: 10,1371 /journal.pone.0070987

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 helmikuu 2013; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 09 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta puolustusministeriön (W81XWH-08-1- 0321) ja Cedars-Sinai Garber palkinnot Cancer Science (WCH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MicroRNA (miRNA tai miR) on lyhyt (keskiarvo 22 nt), yksisäikeisen ja endogeenisesti esiintyvä ei-koodaavan RNA, joka säätelee transkription jälkeinen geeniekspressiota täydentäviä emäspariutumisen 3 tulkitsemattoman alueet (UTR) ja kohde-mRNA: [1], [2]. MiRNA ohjaa ilmentymistä arviolta kolmasosa ihmisen proteiinia koodaavan geenien olennainen solun prosesseja, mukaan lukien metabolia, erilaistumisen, kasvun ja apoptoosin [2] – [5]. MiRNA on myös osoitettu avainasemassa taudin, erityisesti syövän [6] – [8]. Tietyt miRNA lajeja, kuten miR-20a, 23b, 34a, 126, 145, 146A, 221 ja 222, jotka poikkeavasti ilmaistaan ​​eturauhassyövän [9], [10]. Useita miRNA on osoitettu edistää kasvaimen aloittamista, kasvua ja tappava etenemistä [11] – [15]. Nämä löydöt antavat perusteet katsoa tehokkuuden miRNA-pohjainen hoitomuotoihin, jonka tavoitteena on estävä onkogeenien ja niihin liittyvät kulkuväylillä tai palauttaminen tuumorisuppressorigeeneille.

Sterol sääntely elementti sitova proteiini (SREBP) on perus helix-loop-helix leusiinivetoketjun transkriptiotekijä tärkeitä aineenvaihdunnan rooleja rasvanmuodostukseen ja cholesterogenesis [16], [17]. Kolme suurta SREBP isoformia on identifioitu, SREBP-1a, SREBP-1 c ja SREBP-2 [18]. SREBP-1 säätelee geenien mukana rasvahappojen, lipidien ja kolesterolin biosynteesin [16], [17], kun taas SREBP-2 tarkemmin säätelee kolesterolin aineenvaihduntaan ja homeostaasin [19]. Dysregulaatio SREBPs ja niiden alavirran kohdennettuja liittyvien geenien lipogeneesiin ja cholesterogenesis on liitetty syöpään. Esimerkkejä ovat rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN), metabolisen onkogeenin [20], [21], ja 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-CoA-reduktaasin (HMGCR), nopeutta rajoittava vaihe kolesterolin biosynteesissä; molemmat proteiinit on raportoitu olevan mukana kehittämässä ja etenemisen eturauhassyöpä [20], [22] – [24]. Yli-ilmentymisen SREBP-1 havaittiin ihmisen eturauhassyövän yksilöitä verrattuna normaaliin /hyvänlaatuinen eturauhasen kudosten [22], ja tämä voitaisiin mekaanisesti liittyvät eteneminen androgen tulenkestävä /kastraatio-resistenttejä [22], [25]. Kohdistaminen poikkeava SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis reitti voi johtaa uusia lähestymistapoja eturauhassyövän hoitoon.

rooli miRNA in SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis eturauhasen syöpä on edelleen epäselvä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistaa ja kuvata kaksi ratkaisevaa miRNA, miR-185 ja 342, koska SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis sääntelyviranomaisten eturauhassyövän soluissa. Sekä miR-185 ja 342 inhiboivat ilmentymistä SREBP-1 ja SREBP-2 ja niiden alavirran geenien, FASN ja HMGCR, ja edelleen vähensi rasvahappoa ja kolesterolin eturauhassyöpäsoluissa. Lisäksi sekä miRNA vähentää ilmentymistä androgeenireseptorin (AR), joka on tunnettu kasvua ja selviytymistä tekijä. Lisäksi miR-185 ja 342 vaimennetaan tuumorigeenisyyteen ja solujen kasvua ja indusoi apoptoosia aktivoimalla kaspaasi /PARP-välitteisen apoptoottisen reitin eturauhassyöpäsoluissa ja hiirillä, joilla on ksenografti ihmisen eturauhasen kasvaimia. Alhaisempi miR-185 ja 342 havaittiin eturauhassyövän soluissa verrattuna normaaliin /ei-syöpä eturauhasen epiteelisolujen. Yhdessä osoitamme ensimmäistä kertaa, että miR-185 ja 342 toistaa tuumorisuppressorina rooli eston kautta keskeinen lipogeneesiin-cholesterogenesis mekanismi.

Materiaalit ja menetelmät

Eturauhassyöpä Cell Lines, Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP (androgeenistä riippuva) ja C4-2B, joka on LNCaP linjaa johdettu androgeeni-riippumaton alalinja [26], viljeltiin T-väliaineessa (Life Technologies, Grand Island, NY), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Ei-syöpä ihmisen eturauhasen epiteeli- solulinjan, RWPE-1 (ATCC, Manassas, VA), ylläpidettiin keratinosyyttien väliaineessa, joka sisälsi naudan aivolisäkeuutetta ja ihmisen rekombinanttia epidermaalista kasvutekijää (Life Technologies). Kaikki soluja ylläpidettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ihmisen miRNA esiasteet miRNA estäjät, TaqMan miRNA määritys, Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta ja Lipofectamine 2000 hankittiin Life Technologies. 3 ’UTR lusiferaasireportteri- DNA-konstruktit SREBP-1 (HmiT017704-MT05) ja SREBP-2 (HmiT017705-MT05) ostettiin GeneCopoeia (Rockville, MD). CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (mitokondrion MTS-määritys) ja kaspaasi-Glo® 3/7 Assay Systems saatiin Promegalta (Madison, WI).

miRNA transfektio

Transient transfektion miRNA esiasteita tai estäjien suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 mukaan valmistajan protokollaa. Ihmisen miR-185 (PM12486) ja 342 (PM13066) esiasteita, anti-miR-185 (AM12486) ja 342 (AM13066), ja negatiivinen kontrolli (miR-NC; AM17110) käytettiin kokeissa.

Quantitative reaaliaikainen Reverse Transcription-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA valmistettiin soluista käyttämällä RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) ja suoritettiin käänteinen transkriptio SuperScript® III käänteistranskriptaasia ( Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aluke sekvenssejä käytettiin PCR-analyysi on esitetty taulukossa S1. Kuuma alku 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 s, pariutuminen alukkeiden 60 ° C: ssa 30 s ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s käyttäen ABI 7500 Fast Real -Aika PCR System (Life Technologies). Data normalisoitiin 18S rRNA tai GAPDH ja edustettuina keskiarvoa kertaiseksi kolmen itsenäisen kaksoiskappaleet. Määrittää luontainen miR-185 ja 342 ilmaisun, miRNA valmistettiin soluista käyttämällä Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta (Life Technologies). Aikuinen miRNA kvantifioitiin TaqMan miRNA määritys (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeita. Tiedot normalisoitiin RNU6B.

Western blot -analyysi

Solulysaatit valmistettiin miR-185, 342, NC (miR-negatiivinen kontrolli) -transfected tai ei-transfektoitujen eturauhasen syöpäsolujen käyttäen hajotuspuskuria [50 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 0,1% SDS, 1% NP-40 ja 0,5% natriumdeoksikolaattia], joka sisälsi 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteiinipitoisuus määritettiin Bradford-määrityksellä käyttäen Coomassie Plus Protein Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blot suoritettiin käyttäen Novex-järjestelmän (Life Technologies) kuten aiemmin on kuvattu [27], [28]. Ensisijainen vasta anti-SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR ja β2-mikroglobuliini (β2M) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja toisen vasta-aineita, jotka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (GE Healthcare, Piscataway, NJ) käytettiin. Havaitseminen proteiini bändit tehtiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi Western blotting tunnistus reagenssit (GE Healthcare).

Cell Proliferation, kyky muodostaa klooneja, Migration and Invasion Analyysit

LNCaP tai C4-2B solut (6000 solua /kuoppa ) maljattiin 96-kuoppalevyille ja transfektoitiin miR-185, 342 tai NC. Solujen proliferaatio mitattiin 3 d transfektion jälkeen MTS-määrityksellä (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä kyky muodostaa klooneja määritystä, LNCaP tai C4-2B transfektoitujen solujen miR-185, 342 tai NC ympättiin 6-kuoppalevyille (500 solua /kuoppa). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 14 d. Pesäkkeet kiinnitettiin formaliinilla ja värjättiin kristallivioletilla [27]. Lukumäärät kehitetty pesäkkeet laskettiin ja analysoitiin merkittäviä eroja.

In vitro

solumigraation tai invaasio määritettiin Boyden kammioissa ennalta päällystetty kollageeni I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, sillä migraatiokokeessa) tai kasvutekijä köyhdytetyn matrigeeliin matriisi (BD Bioscience, San Jose, CA, sillä invaasiomääritys). -Soluja (1,5 x 10

5 solua /kuoppa), jotka on transfektoitu miR-185, 342 tai NC ympättiin sisäpuolelle esipäällystetty yläkammiot. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2 48 h, numerot siirtynyt tai tunkeutumaan soluihin mitattiin kristalliviolettivärjäys- menetelmällä [27].

Fatty Acid ja Kolesteroli kvantifiointi

määrät pitkäketjuisten rasvahappojen ja kolesterolin määritettiin käyttämällä vapaiden rasvahappojen kvantitointi Kit ja kolesteroli /kolesteryyliesteri Detection Kit (Abcam, Cambridge, MA) transfektoiduissa soluissa miR-185, 342 tai NC. Määrät rasvahappojen ja kolesterolin normalisoitiin yhteensä solujen määrä. Suhteellinen rasvahappoa tai kolesteroli (%) nimitettiin 100% NC soluissa.

Apoptosis Analyysit

anneksiini V värjäys, joka on fluoresointiaktivoituneiden eturauhassyövän solulaji analyysi tehtiin 72 tuntia post-transfektio miRNA käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Bioscience), ja FACScan-virtaussytometrillä, jossa CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ). Sillä kaspaasiaktiivisuus määrityksessä, jotka on transfektoitu miRNA 24 tuntia mitattiin kaspaasi 3/7 entsymaattista toimintaa Caspase-Glo® 3/7 Assay Systems (Promega). Data normalisoitiin yhteensä proteiineja. Kaspaasi-Western blot-analyysi, kokosolulysaateille valmistettiin soluista, jotka on transfektoitu miRNA 72 tuntia ja niille suoritettiin Western blot. Anti-kaspaasi 9, 3 ja PARP ensisijaisen vasta-aineita (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) käytettiin.

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suositusten oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Cedars-Sinai Medical Center (IACUC Protocol # 004252) ja sitä seurasi hiiren tutkimuksiin.

In vivo

eläinkokeet

tarkastella antituumoritehoon Mir-185 ja 342

in vivo

, kuuden viikon ikäisiä urospuolisia kateenkorvattomia nude-hiirten (Harlan Laboratories, Placentia, CA) istutettiin subkutaanisesti 2 x 10

6 C4-2B solua hiirtä kohti. Tuumorikuormitusta seurattiin kasvaimen tilavuus (käyttäen kaavaa V = 4 /3π x (d /2)

2 x D /2, jossa d on vähäinen kasvain akselilla ja D on suuri kasvain-akseli). Kuuden viikon kuluttua siirrostuksen, 100 pmol miRNA kompleksoitu 3 ui Lipofetamine 2000 50 ui PBS: ää annettiin kasvaimensisäisesti joka 3 d 21-d hoitoon. Annos ja aikataulu miRNA injektion modifioitiin aiemman raportin [29]. Päättyessä eläimen tutkimus, kasvaimen kudokset kerättiin lopetettiin hiiriä ja kiinnitettiin 10% formaliinilla, vesi etanolissa, upotettiin parafiiniin ja leikattiin varten dioja. Aihio kudos dioja alistettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä (IHC) [30] käyttäen anti-SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR, PSA, Ki67 ja halkaistut PARP ensisijainen vasta-aineita. Määrän määrittämisestä Ki67 (soluproliferaation) ja pilkotun PARP (apoptoosin) lauseke, 100 kasvainsolut 5 satunnaisesti valittua alueet laskettiin ja positiivisesti värjäämällä solut kirjattiin. Lisäksi, osittain tuoreen tuumorikudokset kerättiin ekspression määrittämiseksi miR-185 tai 342, jonka qRT-PCR: llä. miRNA valmistettiin kasvainkudoksista käyttäen Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Opiskelijan

t

-testin ja kaksisuuntainen jakelu sovellettiin analysoitaessa tilastollista merkitystä.

Tulokset

MiR-185 ja 342 esto ilmentäminen SREBPs ja niiden Downstream Genes eturauhassyöpäsoluissa

sen tutkimiseksi, miRNA säännellä SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis metaboliareitti eturauhassyövän soluissa, ensin käytetty TargetScanHuman 6,2 online-ohjelmisto (https://www.targetscan.org/) ennustaa, yksi tai useampi miRNA kohdistaa sekä SREBP-1 ja SREBP-2, kaksi keskeistä transkriptiotekijät, jotka säätelevät rasvahappojen, lipidien ja kolesterolin biosynteesin ja homeostaasin. Kaksi miRNA, miR-185 ja 342, haettiin että mahdollisesti yhteistyössä kohdistettuja 3 ’UTR of SREBP-1 ja SREBP-2 mRNA: t (Kuva. S1A). Edelleen tarkistaa, onko miR-185 ja 342 suoraan sitoutua 3 ’UTR of SREBP-1 ja SREBP-2, suoritimme 3’ UTR lusiferaasireportterista määritys ja totesi, että suhteellinen 3 ’UTR lusiferaasiaktiivisuudet sekä SREBP-1 ja SREBP- 2 merkittävästi vähentynyt miR-185 ja 342 transfektoidut syöpäsolujen (Fig. S1B). Tulokset vahvistavat, että SREBP-1 ja SREBP-2 mRNA: t ovat kohdistu suoraa miR-185 ja 342. Validoida ovatko nämä kaksi miRNA ohjaavat SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis väylän eturauhassyövän soluissa, suoritimme qRT-PCR, Western blot, ja rasvahappojen ja kolesterolin kvantifioinnin analyysejä. Sekä miR-185 ja 342 inhiboivat ilmentymistä mRNA: iden (Fig. 1A) sekä esiasteena (125 kDa) ja kypsä (68 kDa) proteiinien (Fig. 1 B) on SREBP-1 ja SREBP-2 LNCaP ja C4-2B eturauhasen syöpäsoluja. Expression of FASN [32] ja HMGCR [33], [34], jotka ovat SREBP alavirran geenien, väheni miR-185 ja 342 (Fig. 1A ja 1B). MiR-185 ja 342 myös vähentää AR-mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä eturauhasen syöpäsolujen (Fig. 1A ja 1B). Koska FASN ja HMGCR ovat tärkeitä entsyymejä

de novo

synteesi rasvahapon ja kolesterolin erikseen, me tutki tämän jälkeen tasot rasvahapon ja kolesterolin soluissa. Kuten on esitetty taulukossa 1, määrät solunsisäisten rasvahapon ja kolesterolin merkittävästi vähentynyt miR-185 ja 342-transfektoiduissa LNCaP ja C4-2B soluja verrattuna kontrolliryhmiin. Edelleen testata spesifisyyden miR-185 ja 342 varten SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis, antisense-oligonukleotidit vastaan ​​miR-185 ja 342 käytettiin miR-185 ja 342 estäjiä. Estämällä endogeenisen miR-185 ja 342 eturauhassyöpäsoluissa, sekä miR-185 ja 342 estäjät kasvoi SREBP-1, SREBP-2 ja niiden alavirran geenien ilmentymistä (Fig. 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-185 ja 342 inhiboivat SREBP signalointi vähentämällä SREBP mRNA: ta ja proteiinia ja vähensi rasvahappoa ja kolesterolin eturauhassyöpäsoluissa.

A, molemmat miR-185 ja 342 inhiboivat mRNA: n ilmentymisen of SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR ja AR LNCaP ja C4-2B eturauhassyövän solut määritetään qRT-PCR. -: Ei-transfek-; NC: miR-negatiivinen kontrolli. Suhteellinen mRNA lauseke (fold) nimitettiin 1,0 ei-transfektoiduissa soluissa. Data normalisoitiin 18S rRNA ja edustavat keskiarvoa ± SD kolmen itsenäisen päällekkäisiä kokeita. **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC. B, MiR-185 ja 342 esti esiaste (125 kDa) ja kypsä (68 kDa) muotoja SREBP-1 ja SREBP-2, FASN, HMGCR ja AR ilmaisun LNCaP ja C4-2B solut analysoitiin Western blot. β2-mikroglobuliinin (β2M) käytettiin latauskontrollina. C, MiR-185 ja 342-estäjien (vastinjuosteoligonukleotidit vastaan ​​miR-185 ja 342) kasvoi SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR ja AR ilmaisun LNCaP ja C4-2B solut määritetään qRT-PCR. Suhteellinen mRNA lauseke (fold) nimitettiin 1,0 ei-transfektoiduissa soluissa. Data normalisoitiin 18S rRNA ja edustavat keskiarvoa ± SD kolmen itsenäisen päällekkäisiä kokeita. **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC. D, Expression luontaisten miR-185 ja 342 RWPE-1, LNCaP ja C4-2B soluja. qRT-PCR tulokset osoittivat, että suhteellinen ekspressio miR-185 ja 342 on merkittävästi vähentynyt eturauhassyöpäsoluissa verrattuna normaaliin /ei-syöpä RWPE-1. Alempi ilmentyminen molempien miRNA havaittiin aggressiivinen C4-2B verrattuna LNCaP. Suhteellinen miRNA lauseke (fold) nimitettiin 1,0 in RWPE-1-soluissa. **,

P

0,005 merkittäviä eroja RWPE-1. Data normalisoitiin RNU6B ohjaus ja edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, jotka suoritettiin neljänä rinnakkaisena.

Seuraavaksi määritetään ekspressiota luontainen miR-185 ja 342 eri solulinjoissa kliinistä merkitystä, mukaan lukien ihmisen normaali /ei-syöpä eturauhasen epiteelisolujen linja, RWPE-1, ja LNCaP (androgeenistä riippuva) ja C4-2B (androgeeni-riippumaton) eturauhasen syöpäsoluja. MiRNA valmistettiin näistä soluista. Suhteellinen ekspressio sekä miR-185 ja 342 on merkittävästi vähentynyt syöpäsoluissa verrattuna ei-syöpä RWPE-1 (Fig. 1 D), kuten määritettiin qRT-PCR: llä. Lisäksi alentaa miR-185 ja 342 ilmentymistä havaittiin aggressiivisempia C4-2B linja verrattuna LNCaP. Lisäksi olemme tutkineet ilmentymisen SREBPs, FASN ja HMGCR korreloivan luontainen miR-185 ja 342 näissä solulinjoissa. Suhteellinen ilmentyminen SREBP-1, SREBP-2, FASN ja HMGCR oli suurempi LNCaP ja C4-2B kuin RWPE-1-soluissa (kuvio. S2). Nämä tulokset osoittavat, että miR-185 ja 342 ovat negatiivisia säätöaineiden SREBP signalointi eturauhassyövän soluissa.

MiR-185 ja 342 Suppress Cell Proliferation, kyky muodostaa klooneja, Migration and Invasion eturauhassyöpäsoluissa

arvioida mahdolliset biologiseen seurauksista aikaansaama miR-185 ja 342, me uudelleen ilmaistaan ​​miR-185 ja 342 LNCaP ja C4-2B soluja ja suorittaa joukon funktionaalisia määrityksiä merkityksellisiä tuumorigeenisyyteen ja syövän etenemistä. Kun LNCaP ja C4-2B-solut transfektoitiin miR-185 ja 342, proliferaatiota sekä solutyyppien estyi verrattuna miR-NC ja ei-transfektoiduista soluista (kuvio. 2A). Sekä miR-185 ja 342 on myös vähentynyt kyky muodostaa klooneja verrattuna kontrolliryhmiin (Fig. 2B). Yksi tunnusmerkkejä progressiivinen ja metastaattisen solut on niiden kyky tunkeutua ympäröiviin kudoksiin ja siirtyä tehokkaasti [35]. MiR-185 ja 342 estivät merkitsevästi

in vitro

muuttoliike (Fig. 2C) ja invaasiota (Fig. 2D) LNCaP ja C4-2B soluja. Käänteisesti estämällä miR-185 ja 342 eturauhasen syöpäsolujen miR-185 ja 342-estäjien lisääntynyt solujen lisääntymistä, pesäkkeiden muodostumista, muuttoliikkeen ja invaasiota (Fig. S3). Nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä miR-185 ja 342 vähentävät tehokkaasti väyliä merkitystä tuumorigeenisyyteen ja syövän etenemistä.

, MiR-185 ja 342 esti solujen lisääntymisen LNCaP ja C4-2B soluja verrattuna ei-transfek- (-) ja miR-negatiivinen kontrolli (NC) transfektoitujen solujen 3 d seuraavat miRNA transfektion. Suhteellinen solujen lisääntymistä (%) nimitettiin 100% ei-transfektoiduissa (-) solut. **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kahden riippumattoman neljänä kokeissa. B, MiR-185 ja 342 tukahdutettiin pesäkkeenmuodostusta LNCaP ja C4-2B soluja verrattiin kontrolliryhmiin kuluttua 14 d miRNA transfektion. *,

P

0,05 ja **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kahden riippumattoman rinnakkaisessa kokeessa. C, solujen vaeltamiseen ja D, invaasio merkittävästi pieneni miR-185 ja 342 LNCaP ja C4-2B soluja verrattuna kontrolliryhmiin. **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kahden riippumattoman neljänä kokeita.

MiR-185 ja 342 Pakotettava kaspaasiriippuvaisen apoptoottista kuolemaa eturauhassyöpäsoluissa

Voit selvittää, miR-185 ja 342 indusoida apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa, anneksiini V-FITC /propidium- jodidia (PI) värjäys mittaus, kaspaasiaktiivisuus määritys ja Western blot kaspaasi ja PARP ilmaisun tehtiin. Tulokset anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen ja virtaussytometria-analyysi osoitti, että miR-185 ja 342 lisäsi apoptoottisten solujen fraktiot (sekä alussa ja lopussa apoptoottiset solufraktioista

P

0,005), LNCaP ja C4 2B-soluja verrattuna kontrolliryhmiin (Fig. 3A). Caspase 3/7 toiminta oli myös merkitsevästi aiheuttama miR-185 ja 342 LNCaP ja C4-2B soluja (Fig. 3B). Lisäksi Western blot tulokset osoittivat, että pro-kaspaasi 9 ja 3 pieneni miR-185 ja 342 (kuvio. 3C). Myös lohkaista kaspaasi-3 ja PARP, alavirran tekijä kaspaasien, havaittiin miR-185 ja 342 transfektoidut solut (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-185 ja 342 aiheuttaa eturauhasen syöpää solukuoleman kautta aktivointia kaspaasiriippuvaisen apoptoottisten mekanismi.

A, anneksiini V-FITC /PI värjäystä apoptoottisia määrityksessä ja virtaussytometria tehtiin LNCaP ja C4-2B-solut, jotka on transfektoitu miRNA. Sekä miR-185 ja 342 lisäsi apoptoottinen solu jakeet (sekä varhainen ja myöhäinen apoptoottiset solufraktioista;

P

0,005) verrattuna kontrolliryhmiin. B, Caspase 3/7 toiminta kasvatti merkittävästi miR-185 ja 342 LNCaP ja C4-2B soluja. Kaspaasi 3/7 toiminta (fold) on määrätty 1,0 ei-transfektoiduissa (-) solut. **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kahden riippumattoman rinnakkaisessa kokeessa. C, MiR-185 ja 342 laski pro-kaspaasi 9, 3 ja PARP, ja aktivoitu pilkotaan kaspaasi 3 ja PARP ilmaisun LNCaP analysoituna Western blot. β2M käytettiin latauskontrollina. C: hajonnut.

kasvaimensisäisenä Toimitus miR-185 ja 342 johtaa regressio Eturauhasen kasvaimia Hiiri ksenograftimallia

Koska

in vitro

tiedot osoittivat antituumorigeenistä ja apoptoottisten roolit miR-185 ja 342 eturauhassyöpäsoluissa, me tutki tämän jälkeen terapeuttista potentiaalia miR-185 ja 342 käyttää hiirtä ihonalainen eturauhasen ksenograftimallissa. Sen jälkeen, kun 21-d hoidon kasvaimensisäisiä toimitus joka 3 d, molemmat miR-185 ja 342 vähentää merkittävästi ihonalainen C4-2B kasvaintaakka verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 4A). Korreloida hoitovaste toimituksen miRNA miRNA eristettiin tuoreista C4-2B kasvaimia ja tasot miR-185 ja 342 arvioitiin qRT-PCR. Kasvaimet pistetään miR-185 tai 342 sisälsi noin 116 ± 30-kertaiseksi (miR-185,

P

0,05) tai 278 ± 59-kertaiseksi (miR-342,

P

0,05; **,

P

0,005 merkittäviä eroja NC-käsiteltyjen kasvainten (N = 5 kussakin ryhmässä). B, suhteellinen ilmentyminen miR-185 tai 342 C4-2B kasvaimia. qRT-PCR tulokset osoittivat, että suhteellisen miR-185 tai 342-tasot huomattavasti lisääntynyt ihonalainen C4-2B kasvaimia injektoitiin miR-185 tai 342 kontrolliin verrattuna kasvaimia. Suhteellinen miRNA lauseke (fold) nimitettiin 1,0 NC. *,

P

0.05 merkittäviä eroja NC. Data normalisoitiin RNU6B ja edustavat keskiarvoa ± SD. C, IHC tulokset osoittivat, että alas-säätely SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR ja PSA havaittiin miR-185 ja 342-käsitelty ihonalainen C4-2B kasvaimia verrattuna NC-käsitellyn kasvaimia. Mittaviivat = 25 pm.

kvantifiointi A Ki67 (soluproliferaation) ja B, halkaistut PARP (C-PARP, apoptoosin) positiivisten solujen ihonalainen C4-2B kasvain kerätyt näytteet luki- NC, 185 ja 342 käsitellyissä ryhmissä. Sata solujen 5 satunnaisesti valittua alueet laskettiin ja positiivisesti värjäämällä solut kirjattiin. **,

P

0,005 merkittäviä eroja valvontaa NC ryhmä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. Arrowheads ilmaisevat C-PARP positiivisia soluja. Mittaviivat = 100 pm.

Keskustelu

Aberrant lipidien ja kolesterolin anaboliaa on vahvasti sidoksissa eturauhassyöpä [36], [37]. Säätely ylöspäin lipogeneesiin ja cholesterogenesis syöpäsoluissa liittyy lisääntynyt tarve solukalvon osien ja aktivointi lipidilautan liittyvien Parakriiniset transduktion aikana hallitsematon solujen lisääntymisen ja jakautuminen sekä syövän kehittymisen ja etenemisen [24], [38] – [41]. Blockade epänormaali lipogeneesiin ja cholesterogenesis tarjoaa terapeuttisesti lupaava lähestymistapa ehkäisyyn tai hoitoon eturauhasen maligniteetti. MiRNA on raportoitu säätelemään useita tärkeitä biologisia prosesseja, mukaan lukien metabolia [3], [5], ja on mahdollista käyttöä syövän hoidossa [42] – [44]. Kuitenkin miten miRNA sovittelee poikkeava rasva-aineenvaihdunnan ja homeostaasin syöpäsolujen jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa tunnistamme kahden miRNA että on tärkeä rooli säätelyssä lipogeneesiin ja cholesterogenesis eturauhasen syöpäsoluja. MiR-185 ja 342 esti rasvahappojen ja kolesterolin biosynteesin kautta alas-säätely keskeisten lipogeeniset ja cholesterogenic transkriptiotekijöitä, SREBP-1 ja SREBP-2, ja niiden alavirran geenien myös FASN ja HMGCR. SREBP-1 ja FASN on osoitettu olevan potentiaalisesti onkogeenisten transkriptiotekijä [22] ja metabolisen onkogeenin [20], [21], vastaavasti. MiR-185 ja 342 pienentää solujen lisääntymistä, kyky muodostaa klooneja, muuttoliike ja invaasio, ja indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoosin eturauhassyövän soluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-185 ja 342 toistaa kasvaimeen tukahduttava rooli estämällä SREBP-1 ja SREBP-2 ilmaisun ja siten uudelleenohjelmointi lipogeneesiin ja cholesterogenesis.

Useat miRNA on tunnistettu olevan yhteydessä eturauhassyövän kehittymistä ja etenemistä tappavia tauti. MiR-20a ilmoitettiin säädellä solujen lisääntymisen ja etenemistä estämällä aukkoliitos proteiinin konneksiini 43 ilmentyminen eturauhassyövässä [45]. Vähentynyt ilmentyminen miR-143 ja 145 todettiin eturauhassyöpäpotilailla luumetastaasipotilailla [46]. Myös molemmat miR-143 ja 145 välittämän epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja tukahdutti metastaattista kykyä PC3 eturauhassyöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

[46]. MiR-203 alassäädetty kohortin etäpesäke liittyvien geenien ja esti luun etäpesäke eturauhassyövässä [47]. Estämällä CD44 ilmaisu, miR-34a esti muuttoliikettä ja hyökkäyksen eturauhassyövän kantasolujen [48]. MiR-let-7c laski AR ilmaisun ja aktiivisuutta syöpäsolujen kohdistamalla onkogeenisessä transkriptiotekijä, c-Myc [49]. Analysointi kliinisistä kasvaimen kerätyt luinen metastasoivaa kastraation kestävä eturauhassyöpä (CRPC) potilasta paljasti, että poikkeavaan miR-23b /27b ilmaisu voisi olla mukana etenemisessä kastraatio vastus [50]. Lisäksi, miR-221 ja 222 on osoitettu ohjaamaan kehitystä CRPC [12]. Tässä tutkimuksessa, huomasimme kaksi uutta lipidien ja kolesterolin anaboliaa säännelty miRNA, miR-185 ja 342, jotka esti SREBP-lipogeneesiä-cholesterogenesis, vähentynyt AR ilme, esti tuumorigeenisyyteen ja indusoi apoptoottista kuolemaa eturauhassyövän soluissa. Yhdistelmä miR-185 ja 342 eivät näytä merkittävästi additiivinen tai synergistinen vaikutus geenien ilmentyminen, kasvu, muuttoliike ja invaasio verrattuna kerta miRNA eturauhasen syöpäsolujen (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi ilmentyminen luontainen miR-185 tai 342 on huomattavan alhainen eturauhasen syöpäsolujen verrattuna normaaliin /ei-syöpä epiteelisolujen. Lisätutkimuksia ilmentymisen profiilit miR-185 ja 342 ihmisen eturauhasen kasvain näytteet on perusteltua.