Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jaeumganghwa-tang (JGT,

Zi Yan-Jiang -huo-tang

Kiinan ja

Jiin-koka-

in japani) on itämainen kasviperäisten kaava, joka on pitkään käytetty perinteisen lääketieteen hoitoon hengityselinten ja munuaisten sairaudet. Viimeaikaiset tutkimukset paljastivat, että JGT näytteillä voimakas estävä vaikutus allergioita, tulehdus, kipu, kouristukset, ja eturauhasen liikakasvu. Useita osatekijän yrtit JGT aiheuttaa apoptoottista syöpäsolun kuoleman. Kuitenkin syövän vastaista aktiivisuutta ja JGT ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet syövän vaikutukset JGT käyttämällä erittäin tuumorigeenisiä HT1080 ihmisen fibrosarkoomasoluissa ja selvitetty taustalla olevien mekanismien. Lisäksi olemme tutki,

Lactobacillus

käymisestä JGT parantanut syövän vastaista aktiivisuutta käyttämällä

in vivo

ksenograftimallia koska käyminen yrttiuutteet ajatellaan vahvistamaan terapeuttisia vaikutuksia. Tietojen mukaan JGT tukahdutti syöpäsolujen kasvua tehokkaammin stimuloimalla G1 solusyklin pysähtymiseen ja sitten indusoimalla apoptoottisen solukuoleman aiheuttamalla mitokondriovaurioita ja aktivoimalla kaspaaseiksi. Fosforylaatio p38 ja ERK myös rooli in JGT-solukuolema.

In vitro

kokeet osoittivat, että JGT fermentoitu

Lactobacillus acidophilus

, nimetty fJGT162, sai aikaan samankaltainen solukuoleman samoin kuin ei-fermentoitu JGT. Samaan aikaan päivittäinen suun kautta 120 mg /kg fJGT162 ja HT1080-laakeri BALB /c-nude-hiiriin tukahdutti kasvaimen kasvua huomattavasti (jopa 90%) verrattuna suolaliuoksella hoitoa, kun taas hallinto käymättömät JGT tukahdutti kasvaimen kasvua ~ 70 %. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että JGT ja fJGT162 ovat turvallisia ja hyödyllisiä täydentäviä ja vaihtoehtoisia syöpälääkkeen kasviperäisten hoitoja, ja että

Lactobacillus

käyminen parantaa

in vivo

syöpälääkkeen tehoa JGT merkittävästi.

Citation: Kim A, Im M, Hwang YH, Yang HJ, Ma JY (2015) Jaeumganghwa-Tang indusoi apoptoosia kautta Mitokondrioiden Pathway ja

Lactobacillus

Käyminen parantaa sen syövän vastaista aktiivisuutta in HT1080 ihmisen fibrosarkoomasoluissa. PLoS ONE 10 (5): e0127898. doi: 10,1371 /journal.pone.0127898

Academic Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 25 helmikuu 2015; Hyväksytty: 21 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 28, 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ on tuettu Grant K15280 myönnetty Korea Institute of Oriental Medicine (KIOM) alkaen tiede, ICT ja Future Planning (MSIP), Korean tasavallassa.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosina perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on saanut yhä enemmän huomiota voimavarana lääkekehityksen. Koska TCM-pohjainen yrttiuutteet ovat yleensä alhaiset kustannukset ja tapahtuu vähän myrkyllisyyttä tai sivuvaikutuksia kliinisessä käytännössä, niitä on sovellettu vaihtoehtoisia lääkkeitä hoitoon monenlaisia ​​ihmisen sairauksien, kuten syövän, Kiinassa, Japanissa, Koreassa ja muut Aasian maat [1-4]. TCM, yrttejä käytetään yhdistelmänä kaavoja, joiden uskotaan parantaa niiden terapeuttista tehokkuutta ja vähentää haitallisia vaikutuksia samanaikaisesti. Esimerkiksi Ka-mi-kae-kyuk-tang (KMKKT), kaavan 10 itämaisia ​​yrttejä, on anti-angiogeeninen, antimetastaattisia, ja anti-syöväntorjuntatoimista

in vivo

ilman selvää sivuvaikutuksia [5]. Lisäksi KMKKT stimuloi luuytimen kantasolujen hematopoieesia ja lievittää syövän huumeiden aiheuttama leukopenia sivuvaikutuksia hiirissä [6,7]. Lisäksi, Bojungbangdocktang (BJBDT), jota on käytetty ehkäisemään tai syöpien Koreassa, toimii estämällä VEGF /VEGFR inhiboida angiogeneesiä ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) [8]. Se myös estää sisplatiinin aiheuttamaa toksisuutta ja apoptoosin MCF-10A normaalin ihmisen rinnan epiteelisolujen, mutta ei rintasyöpäsoluissa [9]. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että kasviperäisten lääkkeiden on potentiaalisesti edullisia vaikutuksia syövän etenemiseen ja parantaa perinteisen kemoterapian tai sädehoidon aiheuttamaa komplikaatioita.

Käyminen lääkekasvien, hajoamisen prosessi välittämä mikrobien tai sientä, on ajatus käyttämään suotuisat vaikutukset imeytymiseen, hyötyosuuteen, ja farmakologinen aktiivisuus yrttiuutteet nopeuttamalla tuotantoa tai muuntaminen aktiivisten komponenttien niiden aineenvaihduntatuotteiden tai luomalla alhaisen molekyylipainon aineet kuten aglycone alkaen glykosidin [10,11]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että käyminen lääkkeiden kasviuutteita parantaa niiden terapeuttista vaikutusta. Esimerkiksi käymisestä

Anoectochilus formosanus

käyttämällä

Lactobacillus acidophilus

paransi hapettumisenestoaktiivisuutta lisäämällä määrää koko fenoli [12]. Äskettäin ryhmämme raportoitu myönteisiä vaikutuksia

Lactobacillus

käyminen, jossa hwangryunhaedoktang (HR) ja oyaksungisan (OY) osoittivat tehostetun tulehdusta vaikutuksia LPS-stimuloiduissa RAW 264.7 soluja käymisen jälkeen [13,14]. Lisäksi anto käynyttä HR ollut suurempi estävä vaikutus luukadon ovariektomisoiduissa (OVA) rottia tehostamalla luun mineraalitiheyteen ja luun mikrorakenne verrattuna käymättömät HR [15].

Jaeumgangwha-tang ( JGT,

Zi Yan-jiang-huo-tang

Kiinan,

Jiin-koka-

in japani) on itämainen perinteinen kasviperäisten kaava, ja on pitkään käytetty Kiinassa, Japanissa ja Korea ravita yin ja suoran tulen alaspäin puutteesta johtuvat munuaisten vettä. JGT on kuvattu Dongui Bogam, korealainen kirja noudattanut mukaan Heo kesäkuu (1539-1615), on farmakologisia vaikutuksia hoidettaessa hengityselinten ja munuaisten sairaudet, yöhikoilu, yskä, kuume iltapäivällä, runsas limaa, Veriyskä, ruokahaluttomuus, sylkeminen veren, ummetus, ja kasvojen punoitus. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että JGT inhiboivat allergisten reaktioiden, tulehdus, kipu, ja kouristuksia ja voimistaa immuunivastetta [16]. Lisäksi, JGT esti kehitystä testosteronipropionaattia (TP) aiheuttama eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) dramaattisesti rottamallissa [17]. JGT koostuu 12 lääkekasvien, kuten

Paeoniae Radix

,

Angelicae Gigantis Radix

,

Rehmanniae Radix Preparata

,

Atractylodis Rhizoma Alba

,

Liriopis Tuber

,

Rehmanniae Radix Crudus

,

Citri Unshius Pericarpium

,

Anemarrhenae Rhizoma

,

Phellodendri Cortex

,

Glycyrrhizae Radix et rhizoma

,

Zingiberis rhizoma Crudus

, ja

Zizyphi Fructus

. Useat yhden yrtit JGT, kuten

Angelicae Gigantis Radix

,

Asparagi Tuber

,

Anemarrhenae Rhizoma

, ja

Paeoniae Radix

, esiin syöpälääkkeen vaikutuksia indusoimalla apoptoosin [18]. Kuitenkin tutkimuksia ei vielä raportoitu syöpälääkkeen vaikutuksia JGT.

Tässä tutkimuksessa selvitimme syövän vastaisen vaikutuksen JGT kannalta asiakkuutta solukuoleman ja estämällä kasvaimen kasvua

in vivo

käyttämällä erittäin tuumorigeenisia HT1080 ihmisen fibrosarkoomasoluissa ja selvitetty yksityiskohtaisten vaikutusmekanismi jäljessä kemoterapeuttista aktiivisuutta. Lisäksi tutkimme, onko

Lactobacillus

käyminen paransi syöpälääkkeen vaikutuksia JGT käyttämällä

in vivo

-tuumoriksenografti malli.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjoja

ihmisen fibrosarkooma HT1080-solut (KCLB no. 10121), ihmisen eturauhasen adenokarsinooma PC-3-soluja (KCLB no. 21435), ja ihmisen mahasyöpä AGS-soluja (KCLB no. 21739) saatiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) ja niitä viljeltiin RPMI 1640 (Cellgro, Manassas, VA, USA), johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Cellgro), ja penisilliiniä (100 U /ml) /streptomysiiniä (100 ug /ml) (Cellgro) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Hiiren hepatosyyttien eristettiin käyttäen perfuusion järjestelmässä on joitakin muutoksia ja inkuboitiin kuten aiemmin on kuvattu [19].

Eläimet

Viisi viikkoa vanhoja naaraspuolisia BALB /c-nude-hiiriä hankittiin Nara Biotech ( Seoul, Korea) ja sijoitetaan erityisissä patogeenivapaissa laitokseen vakio-olosuhteissa (12 h valo-pimeä sykli 22 ± 1 ° C ja 55 ± 5% kosteus). Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eläinten hoidon ja käytön komitea Korea Institute of Oriental Medicine (KIOM, Daejeon, Korea), jossa viitenumero # 14-040 ja suoritettiin ohjeiden Eläinten hoidon ja käytön komitean KIOM.

Kemikaalit ja vasta-aineet

rodamiini 123, propidiumjodidi (PI), 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI), ja 3- (4,5-dimetyyli-2-tiatsolyyli ) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). SP600125, SB203580, ja PD98059 saatiin yhtiöstä Calbiochem (San Diego, CA). Vasta-aineet p21, P27, sykliini B, sykliini D, sykliini E, sykliini-riippuvaisen kinaasin (CDK) 2, CDK4, CDK6, Bcl-2, XIAP, Bad, p-Bad, Bax, Bim, Bok, kaspaasi-3, lohkaista kaspaasi-7, kaspaasi-8, kaspaasi-9, poly ADP riboosi-polymeraasi (PARP), p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), solunulkoisen säännelty kinaasin (ERK) 1/2, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) ja p-JNK (Thr183 /Tyr185) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-α-tubuliinin saatiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC), asetonitriili HPLC-luokan saatiin J. T. Bakers (Philipsburg, NJ, USA) ja trifluorietikkahappoa (TFA) ja 5-hydroksimetyyli furfuraalin (5-HMF) saatiin Sigma. Paeoniflorin ja glycyrrhitsiini ostettiin Tokyo Chemical Industry Co. (Tokio, Japani). Nodakenin, nodakenetin, berberiini, ja palmatine saatiin Faces Biochemical Co. (Wuhan, Kiina), ja hesperidiinimetyylikalkoni saatiin Korean Food and Drug Administration (KFDA, Osong, Korea).

valmistaminen JGT, aJGT ja fJGT162

Yrtit keittäminen JGT ostettiin Yeongcheon Oriental kasviperäisten Market (Yeongcheon, Korea) ja määrä kunkin yrtti oli lueteltu taulukossa 1. aitous kasvilajien validoitiin professori Ki Hwan Bae (Chungnam National University, Daejeon, Korea), ja kaikki voucher näytteet talletetaan kasviperäisten pankkiin KIOM. Yhteensä 1874,5 g silputtua JGT kaava upotettiin 18,745 L tislattua vettä, keitetään 3 tuntia käyttäen Herb Extractor (Cosmos-600 Linko, Gyungseo Co., Korea), ja sen jälkeen suodatetaan vakiotestausmenetelmillä seulojen (150 pm, Retsch, Haan , Saksa). Ennen käymistä, keittäminen JGT säädettiin pH-arvoon 7,0 käyttäen 1 M NaOH: lla ja sitten steriloitiin autoklavoimalla 15 minuutin ajan 121 ° C: ssa. Puhdas viljelmä

Lactobacillus acidophilus

(KFRI162) saatiin Korea Food Research Institute (KFRI) ja inkuboitiin MRS-elatusaineessa 24 tuntia 37 ° C: ssa, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Valmistella fJGT162, autoklavoitiin JGT (aJGT) lisättiin 1 x 10

8 CFU /ml

L

.

acidophilus

, ja fermentoitiin 37 ° C: ssa 48 tuntia. Lopullinen pH villityypin JGT, aJGT, ja fJGT162 oli 7,00 ± 0,00, 5,45 ± 0,01, ja 3,80 ± 0,01, vastaavasti. JGT, aJGT, ja fJGT162 vietiin läpi 60 um: n nailonverkko suodattimen (Millipore, Bedford, MA, USA), kylmäkuivattiin ja säilytettiin eksikkaattorissa 4 ° C: ssa. Sillä

in vitro

kokeissa, kylmäkuivattu jauhe liuotettiin 10% (v /v) DMSO: ta tislatussa vedessä (DW) lopulliseen konsentraatioon 50 mg /ml, ja sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 10 min ; supernatantti suodatetaan sitten (0,22 um, huokoskoko).

Soluproliferaatiomääritys ja DAPI-värjäyksellä

Solut maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (5 x 10

3 /kuoppa) käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia, ja MTT-analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Sillä DAPI-värjäyksellä, soluja kasvatettiin ja käsiteltiin JGT 35-mm: n lasin pohja astiat kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 10 minuutin ajan, värjättiin DAPI (0,5 ug /ml) 10 min, ja sitä tarkasteltiin konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (FV10i-W; Olympus Optical Co. Ltd, Tokio, Japani).

Solusyklianalyysiä

Solut eksponentiaalista kasvua vaihe hoidettiin 1000 ug /ml JGT 12, 24, ja 48 h. Sadonkorjuun jälkeen solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolia -20 ° C: ssa vähintään 24 tunnin ajan. Kiinnitetyt solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, ja solunsisäinen DNA värjättiin käyttäen PI-liuosta (0,1% Triton X-100, 0,1 mM EDTA: ta, 50 ug /ml RNaasi A: ta, 50 ug /ml PI: n PBS: ssä) 4 ° C 30 minuuttia pimeässä. Solusyklin jakautumisen analysoitiin FACSCalibur virtaussytometrialla (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja WinMDI 2,8 ohjelmisto (J. Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).

Measuring mitokondrioiden kalvojännite (MMP, ΔΨ

m) B

käsittelyn jälkeen JGT (500 ja 1000 ug /ml) 24 ja 48 tuntia, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin sitten rodamiini 123 fluoresenssin väriaineen loppupitoisuuteen 5 uM 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Fluoresenssi rodamiini 123 analysoitiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus TH4-200; Olympus Optical Co. Ltd). JC-1 värjäystä, soluja kasvatettiin ja käsiteltiin JGT 35 mm lasipohja maljat värjättiin JC-1 (5 ug /ml) pimeässä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, pestään kasvatusväliaineita ja tarkasteltiin konfokaalisella laserskannaus mikroskoopilla.

Western blot-analyysi

Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kokosolulysaateista saatiin käyttämällä M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen bikinkoniini- happo-kittiä (Sigma). Yhtä suuri määrä proteiinia ajettiin elektroforeesilla, immunoblotattiin ja havaitaan raportoitu aiemmin [21].

In vivo

ksenograftimallissa

Naaraspuoliset BALB /c-nude-hiirissä 6 -week-ikä (n = 15) injektoitiin ihonalaisesti vatsan alueen HT1080-solujen (2 x 10

6 /hiiri). Päivänä 7 kasvaimen inokulaation jälkeen, kun kasvaimet saavuttivat tilavuuteen ~ 100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (n = 5 ryhmää kohti), ja vuorokaudessa suolaliuoksella (kontrolli), aJGT (120 mg /kg), tai fJGT162 (120 mg /kg), jonka tilavuus oli 100 ui ja 14 päivää. Annoksesta hiiriä laskettiin määrä käyttää ihmisten aikuisilla (37,49 g /60 painokilo /vrk) ja saanto ote jauheeksi (39.74% vuonna aJGT ja 39.53% vuonna fJGT162). Hiiriä tarkkailtiin brutto ulkonäkö ja käyttäytyminen, ja niiden painon mitattiin päivittäin. Päivänä 21 hiiret lopetettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti seosta, jossa oli Zoletil (Virbac, Magny-en-Vexin, Ranska) ja rompunin (Bayer, Seoul, Korea) (2: 1, 200 ui), ja sitten kasvaimet irrotettiin ja mittaus niiden painosta.

turvallisuusarviointi aJGT ja fJGT162

turvallisuuden arvioimiseksi aJGT ja fJGT162, 6 viikon ikäisiä naaras BALB /c-nude-hiiriin (n = 3 per ryhmä) ruokittiin ajoneuvo (suolaliuos), aJGT (120 mg /kg), tai fJGT162 (120 mg /kg) aikana päivittäin 14 päivän koejakson ajan. Gross ulkonäkö ja käyttäytyminen hiiriä päivittäin tarkastettu ja niiden ruumiinpaino mitattiin joka toinen päivä. Päivänä 14 hiiret tapettiin, ja painon tärkeimpien elinten mitattiin. Kerätyt veren ja seeruminäytteet analysoitiin hematologisten ja serologisia parametreja Advia 2120i hematologian järjestelmä (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) ja XL 200 (Erba Diagnostics Mannheim, Saksa), tässä järjestyksessä.

kromatografinen analyysi, JGT , aJGT, ja fJGT162

verrata phytochemical profiilit JGT, aJGT, ja fJGT162, HPLC suoritettiin käyttämällä HPLC-DAD kone (Lachrom Elite, Hitach High-Technologies Co., Tokio, Japani), kuten on kuvattu aiemmin joillakin muutoksilla [22]. Kromatografinen erotus saavutettiin käyttäen Phenomenex Luca C

18-kolonnia (4,6 mm x 250 mm, 5 um). Gradienttieluutio käyttäen 0,1% TFA: ta deionisoitua vettä (A) ja asetonitriili (B) suoritettiin seuraavasti: 0-5 min 5% B, 5-15 min, 5-12% B, 15-25 min 12% B, 25-65 min 12-50% B, ja 65-70 minuutin ajan 50-50% B virtausnopeus ja injektiotilavuus olivat 1 ml /min ja 10 ui, vastaavasti, ja HPLC-kromatogrammit saatiin käyttäen UV 190-400 nm. Standard (5-125 ug /ml) ja näyteliuokset (20 mg /ml) liuotettiin ja laimennettiin metanolilla.

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD) . Erot ryhmien analysoitiin Studentin

t

-testissä kanssa SigmaPlot 8.0 ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

p

-arvo 0,05 pidettiin osoittamaan merkittävää eroa.

Tulokset

JGT vähenee elinkelpoisuutta ja indusoi G

1 solusyklin pysähtymisen HT1080 soluissa

tutkimiseksi syövän vaikutus JGT ja valaista yksityiskohtaisia ​​mekanismeja sen kemoterapeuttista aktiivisuutta, käytimme erittäin tuumorigeenisia HT1080 ihmisen fibrosarkoomasolulinjoilla. Ensin tutkittiin vaikutuksia JGT solujen kasvuun käyttämällä MTT-määrityksiä hoidon jälkeen 25-1000 ug /ml JGT 48 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa 1A, käsittely 500 ja 1000 ug /ml JGT laski HT1080 solujen elinkelpoisuuden merkittävästi ja indusoi useimpien solujen kutistumisen ja pyöristää, joka on tyypillistä apoptoosin. Lisäksi, JGT vähensi elinkelpoisuutta ihmisen mahakarsinooman AGS ja ihmisen eturauhasen karsinooma PC-3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas vastaavan pitoisuuden DMSO: ta jopa 0,2%: lla oli vähän vaikutusta soluproliferaatioon (S1 kuvio). Sen sijaan normaalit maksasolut eivät vaikuta JGT hoitoa, vaikka sen jälkeen, kun 48 tunnin 1000 ug /ml, mitattuna solujen lisääntymisen tai morfologinen ulkonäkö viittaa siihen, että JGT ei maksatoksinen (kuvio 1B). Analyysi solusyklin etenemistä käyttämällä PI värjäys osoitti, että JGT hoitoa 12 ja 24 h kasvattanut solujen G

1 vaiheen 38.49 ja 44.71%: lla verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja (33,22%). Lukumäärä apoptoottisten solujen subG

0 /G

1 faasi merkittävästi kasvanut JGT 4,99 ja 9,49% hoidon jälkeen 24 ja 48 tuntia, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solujen (1,13%), mikä viittaa siihen, että JGT välittämä G

1 solukierron pysähtymisen jälkeenjäänyt solujen lisääntymisen ja näin ollen indusoi solukuolemaa (kuvio 2A) kuin itämisaika oli pitkittynyt. Tämän mukaisesti, Western blottaus osoitti, että JGT nostivat CDK-inhibiittorit p21 ja p27 ja alentuneesta sykliini B, sykliini D, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6 vuonna HT1080 soluissa merkittävästi verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluissa (kuvio 2B ).

Ihmisen fibrosarkooma HT1080-solut (A) ja hiiren hepatosyyttien (B) käsiteltiin osoitetulla annoksella JGT 48 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määrityksissä. JGT käsiteltyjä soluja havaittiin alle käännettyä mikroskooppia (40-kertainen suurennus). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja ne ilmaistaan ​​keskiarvoja ± SD. *

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli.

(A) HT1080-soluja inkuboitiin 1000 ug /ml JGT 12, 24, ja 48 h, ja solusyklin jakautuminen analysoitiin sen jälkeen, kun PI-värjäyksellä. (B) tasot solusyklin liittyvien proteiinien JGT-käsitellyissä soluissa määritettiin Western-blottauksella. Bändi intensiteettejä suhteessa kuin käsittelemättömien solujen laskettiin ImageJ ohjelmiston normalisoinnin jälkeen tubuliiniin ilmentymisen. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

JGT aiheuttaa kaspaasiriippuvaisen apoptoottisen solukuoleman HT1080 soluissa indusoimalla mitokondriovaurioita

Täsmennetään apoptoottisen solukuoleman aiheuttama JGT, ensin arvioidaan tasot apoptoosiin liittyvien proteiinien avulla Western blotting. Kuten on esitetty kuviossa 3A, JGT vähensi ekspressiota anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2, ja XIAP merkittävästi, nostivat pro-apoptoottisen Bad, Bax, Bim, ja Bok, ja indusoitiin lohkaisu kaspaasi-3, -7, -8, -9, ja PARP. Samanlaisia ​​havaintoja HT1080 soluissa, JGT säänneltyjen solusyklin liittyviä, anti-apoptoottiset, ja pro-apoptoottisten proteiinien ja lisääntynyt PARP pilkkominen PC-3-solut (S2 Kuva). DAPI värjäys vahvisti, että JGT lisäsi apoptoottisten tumien osoittaa kromatiinin tiivistyminen ja DNA: n fragmentoituminen (kuvio 3B). Vuonna luontainen apoptoosireitin, Mitokondrioiden kalvon potentiaali (MMP,

m) on peruuttamaton piste kuolemaan Cascade, ja säätelee pro- ja anti-apoptoottisen jäseniä Bcl-2-perheen. Erityisesti proapoptootti- Bax suosii vuoto apoptoottisten tekijöiden mitokondriot, kun taas anti-apoptoottisten Bcl-2 estää tämä vuoto [23-25]. Mittaus MMP (ΔΨ

m) käyttäen rodamiini 123 fluoresenssiväriä paljasti, että JGT indusoi menetyksen MMP (ΔΨ

m) merkittävästi annoksesta ja ajasta riippuva käytöstapoja. Käsittely 500 ja 1000 ug /ml JGT 48 h vähensi solujen prosenttiosuus, joilla on korkea MMP (ΔΨ

m) ja 82,15% ja 58,20%, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja (94,38%) (kuvio 4A) . Fluoresenssimikroskopia vahvisti tämän MMP (ΔΨ

m; Kuva 4B). Lisäksi menetys MMP (ΔΨ

m) indusoima JGT varmistettiin käyttäen fluoresoivaa väriainetta JC-1, jolla on mahdollisesti riippuvainen kertyminen mitokondrioissa. Suurella MMP (ΔΨ

m), JC-1 pysyy koostetussa muodossa havaitaan punaisena pistemäinen värjäystä, kun se näkyy vihreänä diffuusia monomeeriset värjäys alhaisella MMP. Kuten on esitetty kuviossa 4C, JGT indusoi merkittävän annoksesta riippuvan menetys MMP (ΔΨ

m) 48 h käsittelyn jälkeen.

(A) HT1080-soluja käsiteltiin 500 ja 1000 ug /ml JGT 24 ja 48 h, ja tasot solukuoleman-sukuiset proteiinit tutkittiin Western-blottauksella. Bändi intensiteetit suhteessa käsittelemättömiin soluihin laskettiin ImageJ ohjelmistoa jälkeen normalisoinnin tubuliinia ilme. (B): n havaitsemiseksi apoptoottisten tumien, solut käsiteltiin 500 ja 1000 ug /ml JGT 48 h värjättiin DAPI ja tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen, ja ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD 5 satunnaista kenttää per näyte. *

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli.

(A) depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaali (MMP, ΔΨ

m) tutkittiin ohjaus ja JGT käsiteltyjen HT1080-solujen värjäyksen jälkeen rodamiini 123. solujen prosenttiosuus, joilla on korkea MMP (ΔΨ

m) verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solut laskettiin käyttäen WinMDI 2,8. (B) rodamiini 123-värjättyjen solujen havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (40 x ja 200-kertainen suurennus). (C) häviäminen MMP (ΔΨ

m) tutkittiin käyttäen JC-1 värjäystä hoidon jälkeen JGT 48 tuntia (200 x ja 600-kertainen suurennus). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

JGT indusoi solukuolemaa aktivoimalla p38 ja ERK

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että MAPK signalointipolkujen voivat aiheuttaa joko solujen lisääntymisen tai solukuoleman riippuen solutyyppi ja ärsyke [26,27]. Käsittely 1000 ug /ml JGT kohonneet tasot fosforyloitua p38 ja ERK merkittävästi, mutta oli vähän vaikutusta JNK fosforylaation HT1080 soluissa (kuvio 5A) ja PC-3-solut (S3 kuvassa). Valaista rooli p38 ja ERK-aktivaation JGT-välitteisen solukuoleman, farmakologinen p38 (SB203580), ERK (PD98059) ja JNK (SP600125) käytettiin. Pre-inkubointi SB203580 ja PD98059 suojattu JGT käsiteltyjä soluja kuolemasta tehokkaasti, kun taas SP600125 oli vain vähän vaikutusta. Lisäksi esi-inkubaatio yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-FMK esti JGT välittämä solukuolema lähes täydellisesti (kuvio 5B ja 5C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että JGT-välitteistä solukuolemaa kohdistetaan kautta p38 ja ERK aktivaatio, jota seuraa kaspaasi aktivaation.

(A) Soluja käsiteltiin 1000 ug /ml JGT 1, 6, 12, ja 24 h, ja veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun MAPK mitattiin Western blottauksella. Bändi intensiteetit suhteessa käsittelemättömiin soluihin laskettiin jälkeen normalisoinnin tubuliinia ilme. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) Esikäsittelyn jälkeen tai ilman spesifisiä inhibiittoreita (10 uM), soluja käsiteltiin 500 ja 1000 ug /ml JGT 48 tuntia, ja tarkasteltiin käännettyä mikroskooppia. (C) Solujen elinkelpoisuus (B) määritettiin käyttäen MTT-määrityksissä. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja ne ilmaistaan ​​keskiarvoja ± SD. *

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli, #

p

0,05 vs. ei inhibiittoria.

käyminen JGT parantaa sen estävä vaikutus

in vitro

solujen lisääntymisen ja

in vivo

kasvaimen kasvua ilman haitallisia vaikutuksia

vaikutuksen tutkimiseksi bakteerien käymisestä JGT vertasimme antiproliferatiivisia ja solujen death- indusoivan villityypin JGT, autoklavoidaan /käymättömät JGT (aJGT), ja autoklavoitiin /käynyt JGT (fJGT162) in HT1080 soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 6A, aJGT ja fJGT162 vähensi elinkykyisten solujen annoksesta riippuvalla tavalla, joka on samanlainen havaitut vaikutukset JGT kuviossa 1A. Kuitenkin fJGT162 osoitti suurempi estävä vaikutus solujen lisääntymistä kuin teki käymättömät JGT ja aJGT, ja apoptoottisen morfologisia muutoksia fJGT162 käsiteltyjä soluja olivat vaikeampia kuin aJGT käsiteltyjä soluja. PC-3-solut ja AGS soluja, fJGT162 oli parantunut aktiivisuus on soluproliferaation inhibointi ja solukuoleman induktio verrattuna JGT ja aJGT (S4 kuvassa). Lisäksi Western blotting paljasti, että molemmat aJGT ja fJGT162 nostivat p21, p27, Bax ja PARP pilkkominen, ja vähensi tasot sykliini B, sykliini D, sykliini E, CDK2, CDK4, CDK6, ja XIAP merkittävästi verrattuna käsittelemättömän verrokin solut (kuvio 6B). Lisäksi sekä aJGT ja fJGT162 aktivoida p38 ja ERK merkittävästi, mutta oli vähän vaikutusta JNK aktivointia (kuvio 6C), sopusoinnussa vaikutuksia JGT hoidon. Sen arvioimiseksi, onko syöpälääkkeen vaikutuksia JGT tehostettiin käyminen,

in vivo

kasvaimen kasvua estäviä vaikutuksia aJGT- ja fJGT162 verrattiin. HT1080-soluja inokuloitiin subkutaanisesti osaksi vatsan alueella BALB /c-nude-hiirissä, ja 7 päivää myöhemmin hiiret (n = 5), tuntuvaa kasvain (~ 100 mm

3) on päivittäin käsiteltiin suolaliuoksella, aJGT tai fJGT162 ja 14 päivää. Kuten on esitetty kuviossa 7A, hoito 120 mg /kg aJGT tukahdutti kasvaimen kasvun onnistuneesti verrattuna suolaliuoksella käsiteltyihin kontrollihiiriin, kun taas fJGT162 osoitti voimakkaampi inhiboiva vaikutus

in vivo

kasvaimen kasvua kuin teki aJGT. Kontrollihiiret oli kasvaimen keskimääräinen paino 3,95 ± 0,50 g, kun taas hiiret, joita käsiteltiin aJGT ja fJGT162 oli kasvain painot 1,26 ± 0,56 g ja 0,54 ± 0,38 g, mikä laskee 68,1% ja 86,3%, vastaavasti (kuvio 7B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että JGT on voimakas syövänvastainen formulaatio, ja että käyminen parantaa

in vivo

syövän vaikutukset JGT huomattavasti. Lisäksi merkittävää painonpudotusta aJGT- ja fJGT162 annostellun hiirillä ei havaittu koko hoidon, mikä osoittaa aJGT ja fJGT162 ei aiheuttanut vakavia myrkyllisiä vaikutuksia (kuvio 7C). Sen arvioimiseksi, onko päivittäinen anto aJGT ja fJGT162 aiheuttaa vakavia myrkyllisyys, vertasimme kehon paino, elinten painossa, ja hematologiset /serologiset parametrit hiirissä, joita käsiteltiin vehikkelillä (suolaliuos), aJGT tai fJGT162. Antaminen aJGT ja fJGT162 annoksella 120 mg /kg 14 päivän ajan ei vaikuttanut kehon ja elinten painot (S1 ja S2 taulukot). Lisäksi arvot GOT, GPT, BUN, CRE, ja hematologiset parametrit eivät eronneet merkittävästi välillä aJGT-, fJGT162- ja suolaliuoksella käsitellyillä hiirillä (S3 ja S4 taulukot). Nämä tiedot osoittavat, että toistuva anto aJGT ja fJGT162 annoksena 120 mg /kg ei ole haitallisia vaikutuksia.

(A) HT1080-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla aJGT tai fJGT162 48 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määrityksiä ja solujen morfologia havaittiin alle käännettyä mikroskooppia. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja ne ilmaistaan ​​keskiarvoja ± SD. *

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli, #

p

0,05 vs. JGT tai aJGT. (B) tasot solun cycle- ja solukuolemaan liittyviä proteiineja aJGT- tai fJGT162 käsiteltyjen HT1080-solut tutkittiin Western-blottauksella 48 h käsittelyn jälkeen. (C) aktivointi MAPK analysoitiin Western-blottauksella jälkeen aJGT tai fJGT162 käsittely 1, 6 ja 18 h. Bändi intensiteettejä suhteessa kuin käsittelemättömien solujen laskettiin normalisoinnin jälkeen tubuliiniin ilmentymisen.

(A) HT1080-solut (2 x 10

6 /hiiri 200 ul PBS: ssa) inokuloitiin subkutaanisesti BALB /c-nude-hiirissä. 7 päivän jälkeen hiiriä käsiteltiin päivittäin suolaliuoksella (kontrolli), 120 mg /kg aJGT, tai 120 mg /kg fJGT162 varten 14 päivää. Päivänä 21 tuumorin istuttamisen jälkeen, kasvaimet poistettiin ja valokuvattiin. (B) lopullinen kasvaimen painon kokeen lopussa mitattiin. (C) Kehon paino mitattiin kokeen aikana. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD.

tunnistaminen pääkomponenttien JGT, aJGT, ja fJGT162 käyttäen HPLC-DAD

analysoimiseksi tehoaineet JGT, aJGT, ja fJGT162, valitsimme 8 merkki yhdisteet: 5-HMF (

Rehmanniae Radix Preparata

), paeoniflorin (

Paeoniae Radix) B, glycyrrhitsiini (

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

), nodakenin ja nodakenetin (

Angelicae Gigantis Radix

), berberiini ja palmatine (

Phellodendri Cortex

), ja hesperidiinimetyylikalkoni (

Citri Unshius Pericarpium

). Gradienttieluutio veden ja asetonitriilin levitettiin hankkia optimaalisen erottamisen, ja TFA: ta käytetään parantamaan piikin muoto ja estää piikin pyrstön. UV-aallonpituudet kahdeksan yhdisteitä säätyvät suurimman UV-absorption kunkin komponentin. Kukin yhdiste Näytteissä tunnistettiin vertaamalla retentioajat (

t

R

) ja UV-spektrit kemiallisesti määritellyt standardin yhdisteitä. Kuten kuviossa 8 ja S5 kuvassa, 5-HMF (1,

t

R

: 9,3 min), paeoniflorin (2,

t

R

: 32,6 min), nodakenin (3,

t

R

: 40,7 min), hesperidiinimetyylikalkoni (4,

t

R

: 43,3 min), nodakenetin (5,

t

R

: 48,2 min), berberiini (6,

t

R

: 51,2 min), palmatine (7,

t

R

: 51,7 min), ja glycyrrhitsiini (8,

p

Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD.