Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Mahasyöpää edelleen yksi johtavista syistä syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Potilaat yleensä läsnä myöhään paikallisten invaasio tai etäpesäke, joille ei ole olemassa tehokkaita hoitoja saatavilla. Aiempien tutkimusten että tunnistaa adheesiomolekyyli kadheriinin-17 (CDH17) mahdollisena merkkiaine mahasyöpä suoritimme proof-of-periaatteen tutkimuksia kehittää järkeviä hoitomenetelmät kohdistaminen CDH17 tämän taudin hoitamiseksi.

Methods

Immunohistokemiaa käytettiin ekspression tutkimiseksi CDH17 156 mahakarsinoomat, ja suhde selviytymisen ja CDH17 ilmentymistä tutkittiin monimuuttuja-analyysin. Vaikutus RNA-häirintää-välitteisen knockdovvn CDH17 proliferaatioon mahalaukun sinoomasolulinjoja tutkittiin in vitro ja in vivo, sekä vaikutukset muuhun signalointiin immunoblottauksella.

Tulokset

CDH17 oli johdonmukaisesti säädellään ylöspäin ihmisen syöpien, ja kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla CDH17 säätelyä oli huonompi kuin niissä ilman tämän geenin ilmentyminen (5v yleinen eloonjäämisaste 29,0% vs. 45,0%, P 0,01). Funktionaaliset analyysit osoittivat, että CDH17 Knockdown inhiboi solujen lisääntymistä, tarttuvuus, muuttoliike, invaasio, kyky muodostaa klooneja ja aiheuttaa G0 /G1 pidätykseen. Hiirillä, shRNA-välitteisen CDH17 pudotus merkittävästi inhiboi kasvaimen kasvua; kasvaimensisäistä injektio CDH17 shRNAs johtaa merkittävään tuumorin vastaisen vaikutuksia siirrettyjen kasvainmuodoista. Antitumoorinen mekanismeista CDH17 esto liittyy inaktivaatio Wnt /β-kateniinin signalointi.

Johtopäätös

Tuloksemme tunnistaa CDH17 biomarkkerina mahalaukun syöpä ja houkutteleva terapeuttinen kohde tämä aggressiivinen maligniteetti.

Citation: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zl, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Targeting CDH17 Estää syövän etenemiseen mahasyövän by downregulating Wnt /β-kateniinin Signaling. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10,1371 /journal.pone.0056959

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2012 Hyväksytty: 16 tammikuu 2013; Julkaistu: 15 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Qiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation (30672408 on RHX). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syy syövän kuoleman maailmassa. Vaikka esiintyvyys mahasyövän on vähentynyt dramaattisesti joissakin kehittyneissä maissa viime vuosikymmenen aikana, yhteensä miljoona uutta tapausta arvioidaan diagnosoidaan vuosittain [1]. Potilaat, joilla tätä tautia yleisesti on huono ennuste, osuus 10% kaikista syöpäkuolemista [2]. Senkin jälkeen radikaaleja, yli puolet potilaista toistuisi. Imusolmuke osallistuminen, syvyys kasvaimen invaasio ja kasvaimen sijainti on tunnistettu merkittävimmät ennusteeseen viittaavia ennustetekijöiden [3], [4].

Paikalliset invaasiota ja etäpesäkkeiden esiintyy yleisesti kehittyneen mahakarsinoo-. Prosessin eteneminen ja metastaasit on monimutkainen ja vaatii dysregulaatio erilaisia ​​soluelementtien mukaan lukien kriittinen adheesiomolekyylien. Kadheriinin kuuluu yhteen adheesiomolekyyli perheiden ja on keskeinen rooli luotaessa solu-solu vuorovaikutus [5]. Kadheriinin-17 (CDH17), jota kutsutaan myös maksan-suoli (LI) kadheriinin tai ihmisen peptidi transporter-1 (HPT-1), on rakenteellisesti ainutlaatuinen jäsen kadheriinin superperheen [6], [7]. Kun taas niin sanottu klassinen kadheriinien, kuten E-, N- ja P-kadheriini, ovat viisi kadheriinin toistojen sisällä ekstrasellulaarisen domeenin, CDH17 koostuu seitsemästä kadheriinin toistuu. Lisäksi CDH17 on vain 20 aminohappoa sytoplasminen domeeni, kun taas klassinen kadheriineja on erittäin konservoitunut sytoplasminen domeeni, joka koostuu 150-160 aminohappoa. CDH17 ilmentyy hiirillä ja ihmisillä lähes yksinomaan epiteelisoluissa sekä alkion ja aikuisen ohutsuolessa ja paksusuolen, ilman havaittavaa ilme mahassa ja maksassa [8].

Hyödyntämällä integroiva genomista ja proteomiikka lähestymistavat, tutkijat ovat alkaneet tunnistaa uusia onkogeenien ja tuumorisuppressoreita mahasyövän. Aiemmat tutkimukset kliinisten kohortteja tunnistettu CDH17 mahdollisena sairauden merkkiaine mahakarsinoo- [9], [10]. Huolimatta näistä merkittävistä kliiniset havainnot, molekyyli toiminnot CDH17 ole tiedossa, ja sen tuumorigeenisia rooli mahakarsinoo- ei ole vielä vahvistettu. Tässä pyrittiin leikellä onkogeenisen signalointi mekanismeja CDH17 mahalaukun karsinooma yhteydessä ja arvioidaan vaikutukset kohdistuvat CDH17 mahdollisena terapeuttinen lähestymistapa mahasyövän.

Methods

Potilaat

tutkimus koostui 156 peräkkäisestä potilaasta (106 miestä ja 50 naista) suunniteltu leikkaus 1. tammikuuta 2002 ja 31. joulukuuta 2006 Sun Yat-Senin yliopistossa Cancer Center, Guangzhou, Kiina. Kaikki potilaat tähän tutkimukseen rekisteröidyt oli histologisesti diagnosoitu ensisijainen mahakarsinooman että analysoitiin edelleen patologisesti leikkauksen jälkeen. Leikkaus koostui subtotaalinen tai koko gastrektomia kaikilla potilailla; standardoitu tekniikka käytettiin kirurgisen resektion ja imusolmukkeiden, kuten muualla on kuvattu [3]. Potilaat, joille tehtiin ei-vastaavien haltijoiden leikkaus, ja ne, joilla Siewert tyypin I cardia adenokarsinoomaa suljettiin pois tutkimuksesta. Näytteen ja kasvainten koot tallentama patologit. Edustavalla kasvaimen valittiin ja snap-jäädytetty. pTNM luokitus seurasi kriteerit kuudes painos UICC [11] kantavassa mediaani-ikä potilaista oli 57,2 vuotta (vaihteluväli 27-78 v) ikä, sukupuoli, laji kirurgia, kasvaimen sijainti, TNM, kemoterapia, näyte pituus, kasvaimen koon, ja histologiset erilaistuminen, kirjattiin kullekin potilaalle tietokantaan. Kaikki potilaat, joille tehtiin tahansa kemoterapiaa olivat 5-FU, platinaa tai taksolin-pohjaiset hoidot. Kaikki potilaat, kun sairaalasta tuli jatkoa ohjelman mukaan standardin protokollan [12]. Seurannan suljettiin huhtikuussa 2010. Tutkimus hyväksynyt eettinen komitea Sun Yat-sen University Cancer Center, kaikki osallistujat jos niiden kirjallinen suostumus osallistua tähän tutkimukseen.

Solulinjat ja CDH17 vasta-

Mahalaukun sinoomasolulinjoja, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 ja SGC-7901 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), japani Cancer Research Resources Bank (Tokio, Japani) ja Peking Medical University (Peking, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Sigma), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine CDH17 (ab54511) oli peräisin Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) B

pLKO.1 puro (7 kb) lentiviraalinen konstruktio sisältää U6-promoottori ja HIV-1 RNA: n pakkaus signaali pruomycin- ja ampicillin- vastuselementtien kloonattu 3 ’ihmisen fosfoglyseraattikinaasi (hPGK) promoottori. CpptCTE lisättiin 5 ’hPGK promoottorin. Ihmisen CDH17 shRNA konstruktiot syntyy ligoimalla seuraavat hehkutettu oligomeerit osaksi ainutlaatuinen Agel ja EcoRI-kohtien pLKO.1 puro: CDH17 shRNA eteenpäin (5’- CCG GCC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG GTT TTT G -3 ’) ja reverse (5’AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCC GCT GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG AAA GTG G -3’). Lentiviruksen valmisteita tuotettiin kotransfektoimalla pLKO.1 puro tyhjän vektorin kanssa CDH17 shRNA, ja avustavan viruksen pakkaamista plasmidit pCMVΔR8.9 ja pMG.G (klo 10:10:01 suhde) 293T-soluihin. Transfektio suoritettiin käyttämällä lipofektamiinia ja PLUS-reagenssia (Invitrogen). Lentiviruksiin otettiin talteen 24, 36, 48 ja 60 tuntia transfektion jälkeen. Kaksi säätimet perustettiin, jossa mahalaukun syöpäsolut joko lainkaan hoitoa tai transfektoitiin salatun kohdentamattomaan RNAi vektorin (vale). Infektio suoritettiin, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä. Infektion jälkeen, AGS ja MKN-45-solut valittiin stabiilin ilmentymisen shRNAs käyttäen 2 ug /ml puromysiiniä. Solut lysoitiin western blot-analyysi 10 päivää infektion jälkeen.

immunoblottauksella ja subsellulaarifraktiointikokeet

Protein lysaatit valmistettiin solulinjan yksisolukerroksiin käyttäen lyysipuskuria (1% NP-40,50 mM Tris HCl: lla, pH 8,0, 100 mM natriumfluoridi, 30 mM natriumpyrofosfaatti, 2 mM natriummolybdaattia, 5 mM EDTA, 2 mM natriumortovanadaatti), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (10 mg /ml aprotiniinia, 10 mg /ml leupeptiiniä, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Solulysaatit altistettiin natriumdodekyylisulfaatti sulfacte-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), ja erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti Immobilon-P -kalvoille (Millipore). Sen jälkeen tukkimaan rasvatonta maitoa, kalvoja inkuboitiin itsenäisesti ensisijainen vasta P53 (Cell Signaling # 9282), MDM2 (Zymed # 33-7100), P21 (Zymed # 33-7000), sykliini D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Cell Signaling # 9309), β-kateniinin (Zymed, 13-8400), GSK3p (Santa Cruz, sz-7291) ja p-GSK3p (Ser9) (Cell Signaling # 9336). Kalvo pestiin useita kertoja PBS: ssä 0,1% Tween® 20 ja skannataan LI-COR Odyssey infrapuna kaksivärinen tunnistus Imager järjestelmä (LI-COR Bioscience) mukaan valmistajan ohjeiden.

Subsellulaariset Fraktioinnit suoritettiin käyttäen erityiset solulyysiksen puskurit ja toistuva sentrifugointivaiheissa (Nuclear ote Kitin Aktiivinen Motive, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Cell fraktiot liuotettiin RIPA-puskuriin, ja proteiinikonsentraatio mitattiin käyttäen BCA-proteiinin määrän määritys. Proteiini uutteet (20 ug) lisättiin edelleen liuotettiin 1 x Laemmli-puskuria, suoritettiin elektroforeesi 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille, kuten edellä on kuvattu. Western blot-analyysi poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP, Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) ja superoksididismutaasi 2 (SOD2, mistä ABFrontier, Seoul, Korea) suoritettiin vahvistamaan asianmukainen erottaminen ydin- ja soluliman proteiineja.

Quantitative käänteistranskriptio-PCR: llä (qPT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista ja jäädytetty mahalaukun adenokarsinooman kudoksista TRIzol reagenssia (Invitrogen). Käänteistranskriptio kokonais-RNA (2 Ag) tehtiin käyttämällä Advantage RT-PCR -pakkausta (Clontech) ja cDNA altistettiin PCR-28 monistussykliä seuraavia alukkeita: CDH17 Fw, 5′-ACAATCGACCCACGTTTCTC ja CHD17 Rv, 5 ”-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-Actin käytettiin kontrollina.

immunohistokemia (IHC) B

yhteensä 156 formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotettujen mahalaukun syövän kudosnäytteiden valittiin IHC tutkimuksessa. IHC värjäys suoritettiin 5 um: kudosleikkeiden nesteytyksestä kautta arvostellaan alkoholeja. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 0,3% vetyperoksidia 15 minuuttia. Objektilasit mikroaaltouuni käsiteltiin 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 10 minuutin ajan. Epäspesifinen sitoutuminen blokattiin 10% normaalia kanin seerumia, 20 min. Kudos laseja inkuboitiin anti-CDH17 (1:50 laimennos) 60 min 37 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Levyjä inkuboitiin biotinyloidun kanin anti-hiiri-immunoglobuliini, jonka pitoisuus on 1:100 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa sitten reagoida streptavidiini-peroksidaasikonjugaatin 30 min ajan 37 ° C: ssa ja lopuksi inkuboitiin 3-3 ”diaminobentsidiiniä kromogeenin substraatti. Jos haluat sulkea pois väärä positiivinen signaali, negatiiviset kontrollit sisältyy jokaiseen testissä korvaamalla ensisijaisen vasta-aineen esto seerumin. Kaksi itsenäistä tarkkailijaa sokaissut ennusteeseen viittaavia tietoja teki dioja. Määritelmä värjäytyminen oli seuraava: negatiivinen, 0%: sta alle 5% tuumorisolujen osoittaa immunoreaktiivisuus; heikko, 5-40% syöpäsolujen osoittaa immunoreaktiivisuus; positiivinen, yli 40% tuumorisolujen osoittaa immunoreaktiivisuus. Positiiviset asiat enää joutuisi sub-luokiteltu CDH17 + (immunoreaktiivisuus: 40-60%), CDH17 2+ (immunoreaktiivisuus: 60-80%) ja CDH17 3+ (immunoreaktiivisuus: 80-100%).

In vitro määrityksiä arvioida kasvaimen fenotyypin

kokeelliset menettelyt solujen kasvua, pesäkkeitä muodostumista, pehmeä agar, solumigraatio, haavan paranemista ja solusyklin määritykset on kuvattu tukeminen Methods S1.

Rescue kokeet

pelastuminen CDH17 vuonna shCDH17 AGS ja MKN-45 solulinjat kuvataan tukeminen Methods S1.

in vivo hiiren malleissa mahasyövän

tutkimus toteutettiin out tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Sun Yat-sen University Cancer Center (Luvan numero: 09-0238). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Anestesian jälkeen Nude hiiret tapettiin katkaisemalla kaula.

kasvainten muodostumista nude-hiirissä.

In vivo kasvaimen kehittymisen tutkittiin -tuumoriksenografti kokeita. Noin 2 x 10

6 AGS soluissa tartunnan CDH17 shRNA, valvonta AGS infektoidut solut pilkata RNAi vektori ja vanhempien AGS solua injektoitiin s.c. oikeaan ja vasempaan takajalat 4 viikon ikäisten karvattomia hiiriä (30 hiiret, 10 per ehto). Kasvainten muodostumista nude-hiirissä seurattiin 8 viikon ajan. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla V = 0,5 × P × L

2. [13]

kasvaimia omaavilla hiirimallissa.

ihonalainen kasvaimia indusoitiin nude-hiirissä käyttämällä AGS soluja kuten edellä mainittiin. Yksi viikko ymppäyksen jälkeen, hiiret käsiteltiin anti-CDH17 shRNA. Kukin hiiri sai 100 ui kasvaimeen injectionscontaining 1 x 10

9 kappaletta CDH17 tai mock lentivirus, kahdesti viikossa 2 viikkoa. Viisi hiirtä käytettiin jokaiseen ryhmään. Kasvaimen kasvu tarkkailtiin päivittäin.

Tilastot

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 13.0. Eroja muuttujia arvioitiin χ2 analyysiä tai 2-tailed Studentin t testeissä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, ellei toisin mainita. Kokonaiselinaika (OS) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS) käyrät laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä, ja erot ryhmien välillä vertailtiin log-rank-testi. P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CDH17 ilmentyy voimakkaasti mahalaukun karsinooma solujen ja liittyy huono kliiniseen tulokseen

Ensinnäkin, tarkastelimme ekspressiotason CDH17 156 mahakarsinoo- näytteistä IHC: 69 (44,3%) ja 156 tapausta oli positiivinen, kun taas loput 87 tapausta (55,7%) olivat negatiivisia tai heikko CDH17 ilmentymisen (Fig. 1). Ilmentymisen taso oli +, 2+ ja 3+ 21 (13,5%), 20 (12,8%) ja 28 (17,9%) tapauksista vastaavasti. Nämä havainnot osoittavat, että CDH17 voi olla tärkeä rooli mahasyövässä kasvainten synnyssä. Sitten verrataan kliinisen ja patologisen ominaisuudet potilaiden kanssa ja ilman CDH17 ilme. Ei tilastollisia havaittu merkittäviä eroja näiden kahden ryhmän välillä osalta sukupuolen, iän, kasvaimen koko, kasvain sivusto, syvyys kasvaimen invaasio, imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke ja TNM-luokitus (taulukko 1).

IHC värjäystä mahalaukun karsinooma kudoksessa (alkuperäinen suurennos x 200). V: Negative, B: Heikko, C: Positiivinen (+), D: Positiivinen (2+), E: Positiivinen (3+).

Seuraavaksi tutkimme mahdollisia vaikutuksia of CDH17 ilmentymistilanne pitkän aikavälin selviytymisen potilaiden yhden ja usean analyysi. Seuranta-ajan mediaani oli 24,3 kuukautta, lopussa seurannan, 68 potilasta oli vielä elossa, 87 potilasta oli kuollut kasvain, ja 1 potilas oli kuollut muusta syystä; syöpä liittyvät 5 vuoden pysyvyys koko sarjassa oli 37,8%. Univariate analyysit osoittivat yhdistyksen välillä eloonjäämiseen ja kasvainpaikkaa, histologiset erilaistuminen, TNM ja CDH17 ilmaisun (taulukko S1). Monimuuttuja analyysit, kasvainpaikkaa (p = 0,02) histologinen eroavuus (p = 0,02), TNM (p 0,001) ja CDH17 lauseke (p 0,01) olivat riippumattomia ennustavat tekijät kokonaiselossaolo. Kuva. 2A esittää eloonjäämisaste eroa potilaiden ja ilman CDH17 ilme. Mediaani kokonaiselossaoloaika oli 15,9 kuukautta potilailla, joilla CDH17 ilme verrattuna 26,6 kuukautta näissä CDH17 negatiivinen tai heikko ilmentyminen (P 0,01), mikä vastaa 16%: n vähennys kuolleisuuden. Lisäksi Tautivapaa elinaika (DFS) analyysi suoritettiin 131 potilaalla, joille tehtiin R0 resektio. Lopussa seurannan, 69 (52,7%) potilaista oli edelleen elossa ja 62 (47,3%) potilaista oli kuollut kasvaimen uusiutumisen tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä, monimuuttuja analyysit osoittivat samanlaisia ​​tuloksia, histologinen eroavuus, tuumoripaikkaan, syvyys kasvaimen invaasio (pT vaihe), imusolmukkeiden etäpesäke (pN vaihe) olivat riippumattomia ennustavat tekijät tautivapaan elinajan (tuloksia ei ole esitetty). Olemme myös havainneet, että potilailla, joilla ei CDH17 ilme on parempi ennuste kuin ne, jotka kanssa CDH17 ilmentymistä kasvainkudoksessa (Fig. 2B) (p 0,01). Kaiken eloonjääminen pienentää potilailla, joilla on korkea ilmentymisen CDH17 (IHC 2+, 3+) kuin potilailla, joilla CDH17 + ilme (Fig. 2C). Keskimääräinen eloonjäämisaika potilaiden, joiden kasvaimet olivat korkeammat CDH17 ilme oli 10,9 kuukautta CDH17 3+ 21,1 kuukautta CDH17 2+, ja 25,7 kuukautta näissä osoitettu olevan CDH17 + lauseke (p 0,01).

Kaplan -Meier selviytyminen analyysi eri CDH17 ilme. A. Kaiken hengissä 156 potilaalla on mahasyöpä (p 0,01) B. Taudista vapaa elinaika in 131 mahakarsinoo- potilailla, joille tehtiin R0 resektio (p 0,01). C. Kaiken hengissä 156 potilaalla on mahasyöpä mukaan CDH17 tila (IHC 1+, 2+ ja 3 +) (p 0,01).

CDH17 ilmaistu ihmisen mahalaukun solulinjoissa

arvioitiin, onko ihmisen mahalaukun sinoomasolulinjoja ilmaista CDH17 ja näin voitaisiin käyttää edelleen arvioitava mahdollisuudet toiminto tätä proteiinia. Valitsimme paneeli 6 mahalaukun sinoomasolulinjoja eri metastaattinen potentiaali: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 ja SGC-7901. CDH17 mRNA taso mitattiin qRT-PCR-analyysillä. Voimakas ilmentyminen nähtiin ensisijaisen ja mahalaukun metastasoivaa masolulinjassa (AGS ja MKN-45) (Fig. S1A). Western blotit analyysi vahvisti korkea CDH17 proteiinin ilmentymistä AGS (perustettu ensisijaisesta kasvain) ja MKN-45 (metastaattinen) (Fig. S1B).

Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että CDH17 on tärkeää aloittamisen ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpä; ainakin osajoukko hyvin credentialed mahalaukun sinoomasolulinjoja säilyttää ilmaus CDH17 mahdollistaa edelleen toiminnallisen kuvauksen.

CDH17 Knockdown indusoi antituumorivaikutuksia in vitro

Seuraavaksi pudotti CDH17 vuonna mahalaukun sinoomasolulinjoja-AGS ja MKN-45 käyttäen CDH17-erityisiä shRNAs. Knockdown tuotti 75%: n vähennys sekä mRNA ja proteiini tasoilla (Fig. 3A). Sitten arvioitiin kasvaimia ja metastaattinen ominaisuudet (leviäminen, pesäkemuodostusta, tarttuvuus, invaasio ja solusyklin) on CDH17 puutteellinen mahasyövän soluja (shCDH17 solut) verrattuna mock vektori-tartunnan ohjaus soluissa.

Ilmaus ja CDH17 tukahdutettiin lentiviruksen-välitteisen CDH17 shRNA (shCDH17); solut infektoitu ei-kohdennettu vektori (Mock) ja vanhempien AGS tai MKN-45-soluja käytettiin kontrolleina. (A) qRT-PCR (vasen) ja western blot (lähi) osoittavat mRNA ja proteiini taso CDH17 eri koeryhmään jälkeen puromysiiniselektion. p-Actin käytettiin aloading ohjaus. (A) (oikea) kasvukäyrät shCDH17 soluja verrattiin Mock, AGS solut XTT-määrityksellä. (Points, keskiarvo vähintään kolmen itsenäisen kokeen, baareja, SD). (B) edustaja esto pesäkkeitä muodostumisen yksikerrosviljelmässä (vasen) ja pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa kulttuuri (oikea) by CDH17 knockdown. Pylväskaavio esittää määrällisiä analyysejä pesäkkeitä tai pesäkkeiden numerot (sarakkeet, keskiarvo vähintään kolmen itsenäisen kokeen, baareja, SD). (C) (vasen) haava luotiin on subkonfluenteista kulttuurin vanhempien AGS, Mock solut ja shCDH17 soluja, ja haavan sulkemisen tarkkailtiin 0, 24 ja 48 tuntia. Edustava valokuva kolmesta itsenäisestä kokeesta. Alkuperäinen suurennos, × 200. (C) (oikea) edustaja kuvat osoittavat shCDH17, Mock ja AGS solut, jotka tunkeutuneet läpi matrigeeliä. Lukumäärä hyökkääviä kasvainsolujen kvantifioitiin. Pylväät, keskiarvoa kolmesta kokeet; baareja, SD. Alkuperäinen suurennos, × 200. (D) Solusyklianalyysiä Poiketen virtaussytometrialla. Knockdown CDH17 merkittävästi heikentynyt kasvaimia ja invasiivisia ominaisuuksia AGS solujen, kun taas indusoimiseksi solusyklin G0 /G1 pidätykseen. (* P 0,05; ** p 0,01; ***, P 0,001).

CDH17 shRNA välittämää knockdovvn johti merkittävästi vähentää solujen kasvua maha- sinoomasolulinjoja (P 0,001 ) (Fig. 3A, oikea). Pesäkkeitä muodostuminen oli myös inhiboi merkittävästi (P ​​ 0,001) shCDH17 soluissa verrattuna Mock-solut (Fig. 3B, vasen), samanlainen tulos saatiin pehmeällä agarilla, jossa pesäkkeiden muodostuminen väheni merkittävästi shCDH17 soluissa (P 0,001 ; Fig. 3B, oikea). Rooli CDH17 vuonna etäpesäkkeiden tutkittiin haavan paranemista ja transwell määrityksissä. CDH17 Knockdown pystyi alentamaan solujen liikkuvuuden (Fig. 3C, vasen), määritettynä haavan määrityksessä. TranswellTM määritys paljasti, että alentunut ilmentyminen CDH17 vähentää merkittävästi soluadheesiota (P 0,001) (Kuva. 3C, oikea). Tutkia mekanismia taustalla kasvun inhibitiota CDH17 Knockdown, solusyklin jakaumia solujen CDH17 shRNA hiusneula ja Mock määritettiin virtaussytometrialla: shCDH17 solut pidätettiin G0 /G1 vaiheeseen, jossa on vähemmän soluja G2 /M-vaiheen (kuvio . 3D). Antituumorivaikutuksen vaikutus CDH17 Knockdown nähtiin myös etäpesäkkeisessä mahakarsinoo- solulinjaa MKN-45 (Fig. S2A-E). Mukaan hyväksyttyjen standardien joka vakuuttaa laatua ja tarkkuutta RNAi kokeiluja [14], suoritimme pelastuskokeiden uudelleen ilmentävien CDH17 in AGS ja MKN-45 shCDH17 soluja (Kuva. S3A-B). Palauttaminen CDH17 ilmaisun AGS ja MKN-45-solut palautetaan solut vanhempien fenotyypin, jossa vahvistetaan, että anti-kasvain vaikutuksia CDH17 Knockdown eivät johtuneet armottoman vaikutuksia. Pelastus kokeissa kävi ilmi, että palautumisen jälkeen CDH17 ilmentymisen näissä kahdessa solulinjassa, tuumorigeenisyyden ja metastaattista potentiaalia nostetaan samalla tasolla vanhempien AGS ja MKN-45-soluissa (kuvio. S3C-F). Nämä tulokset antavat vahvaa näyttöä kasvaimia synnyttävän roolit CDH17 mahalaukun syöpä soluissa.

CDH17 in vivo Kohde mahasyövän Therapy

tutki CDH17 tarvitaan kasvaimen muodostumisen ja invasiivisuus vuonna mahakarsinoo- solut nude-hiirissä malli. Me ihon alle injektoidaan shCDH17, Mock ja vanhempien AGS soluja nude-hiiriin. Kasvaimet ovat yleensä nähtävissä paljain selkäpuoli sivuaa sisällä 6-8 viikon ajan solujen injektion. 1 hiiri sekä vanhempien AGS ja Mock ryhmien kuolivat kolmannella viikolla injektion jälkeen (inhimillinen päätepisteet käytettiin). Hiiret tapettiin 8 viikkoa sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. Ryhmässä injektoitujen hiirten kanssa shCDH17 soluihin, 2 hiirtä ei osoittanut kasvain kyhmy, ja 8 hiiret osoittivat merkittävää vähenemistä kasvainmuodostusta verrattuna hiiriin ruiskutettiin mock soluihin. Kasvaimen koon ja painon vähensi merkittävästi hiirillä ruiskutetaan shCDH17 solujen verrattuna hiiriin ruiskutettiin mock-soluissa (kuvio. 4A). Nämä tulokset osoittavat, että vähentäminen CDH17 ilmaisun voi merkittävästi estää kasvainten muodostumiseen in vivo.

. Edustavia esimerkkejä kasvaimista muodostetun nude-hiirissä injektion jälkeen shCDH17 solujen vasemman selkä kyljissä. AGS ja Mock solut ruiskutetaan oikealle. Viivakaavio havainnollistaa, että volyymin muutoksiin ihonalaisen kasvainten shRNA vs. Mock, * p 0,05. B. Vaikutus CDH17 shRNA suppression kasvuun ihonalaisen kasvaimia nude-hiirissä. Ihonalainen kasvaimia indusoitiin nude-hiirissä injektoimalla AGS solujen hoito liittyi kasvaimeen injektion Mock reagenssit (ei-kohdennetut RNAi-vektori) tai shCDH17 hoito annoksella 10

9 viruspartikkelin /injektio tuumoripaikkaan eläinten (n = 3). Valokuvia kuvaavat ihonalainen kasvain tuottama Mock ja shCDH17 nude-hiirissä. Kasvaimen tilavuus indusoitiin karvattomilla hiirillä mitattiin välillä tutkittavissa ryhmissä sen jälkeen, kun 35 päivää. IHC kuvat osoittavat, että CDH17 ilmaisu vähenivät shRNA käsitellyissä hiirissä. Alkuperäinen suurennos, × 400. Viivakaavio havainnollistaa, että volyymin muutoksiin ihonalaisen kasvaimia. shRNA vs. Mock, *** p 0,001.

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi CDH17 Knockdown Ensisijaiseen kasvaimen kasvuun, me olivatko in vivo toimituksen CDH17 shRNA voisivat haitata lisääntymiseen perustettu -tuumoriksenografti vanhempien AGS soluista nude-hiirissä. Viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen, kun kasvain saavutti noin 100 mm

3, teimme kasvaimeen injektion CDH17 shRNA tai mock vektori annoksella 10

9 viruspartikkelin /injektio tuumorikohtaan. Injektio annettiin kahdesti viikossa, ja 2 viikkoa. Eläimillä, joihin oli injektoitu Mock vektori, kasvaimet kasvoivat progressiivisesti aikana kokeen. Päinvastoin, tuumorinsisäinen injektio CDH17 shRNA johti huomattavasti pienempiä kasvaimia joka ajankohtana, mukaan lukien lopullinen tilavuuden mittauksen (Fig. 4B). Tutkiminen kasvainsolujen CDH17 IHC huomattavan hyvin alas-säätely tarkoitettu CDH17 kohteensa shCDH17 käsitellyissä soluissa (P 0,05; Fig. 4B). Nämä tulokset osoittavat, että in vivo downregulation of CDH17 mahalaukun karsinooma soluissa vähentää kasvaimen muodostumista hiirillä, mikä merkitsee, että CDH17 on terapeuttinen tavoite mahasyövän.

Down-Wnt /β-kateniinin opastinjärjestelmillä CDH17 knockdown

kuulusteltiin useita väyliä, jotta löytää molekyylitason mekanismi CDH17 knockdown estoa mahalaukun syövän kasvua, lisääntymistä ja etäpesäkkeiden. Löysimme useita jäseniä Wnt /β-kateniinin väylän ekspressoitua eri välillä shCDH17 ja vanhempien soluja. β-kateniinin ilme, GSK-3β fosforylaation, ja sykliini D1 ilmentyminen väheni; ja Rb ilmaisun lisääntyi sekä AGS ja MKN-45 shCDH17 soluissa. Lisäksi ilmaus P53, MDM2 ja avain solusyklin säädin p21 kasvoi CDH17-pudotus soluissa. (Fig. 5A). Vuonna TOPFlash /FOPFlash toimittaja lusiferaasianalyysissä (Fig. 5B), palauttaminen CDH17 sekä AGS ja MNK-45 soluissa lisäsi merkittävästi lujuutta TCF /LEF signaaleja verrattuna shCDH17 valvontaa. Lisäksi, kuten on esitetty tapa immunoblottausanalyysillä, havaitsimme kasvua sekä koko ja ydinvoiman β-kateniinin proteiinia palautumisen jälkeen CDH17 vuonna AGS ja MKN-45, verrattuna shCDH17 (Fig. 5C) .Together nämä tulokset osoittavat, että CDH17 pudotus johtaa downregulation Wnt /β-kateniinin reitin mahalaukun syöpäsoluja. Tämä puolestaan ​​viittaa siihen, että CDH17 ylläpitää proliferaatiopotentiaali kautta Wnt /β-kateniinin reitin signalointi.

. Expression of β-kateniinin, GSK-3β, p- GSK-3β, Rb, sykliini D1were verrataan shCDH17 ja Mock sekä AGS ja MKN-45-solujen Western blot -analyysillä. MDM2, p53 ja p21 myös arvioitiin. p-Actin käytettiin latauskontrollina. B. TOPflash /FOPflash toimittaja määritys osoittaa, että Wnt signalointia uudelleenaktivoitu jälkeen CDH17 ennallistamisen AGS ja MKN-45. (* P 0,05). C. lisäys sekä kokonais- ja ydinvoiman β-kateniinin proteiinia palautumisen jälkeen CDH17 vuonna AGS ja MKN-45, verrattuna shCDH17.

Keskustelu

CDH17 on uudenlainen kadheriinin, sen rakenne on erilainen kuin klassisen kadheriinien, että N-terminaalinen domeeni ja sytoplasminen osa näytössä ei ole merkittävää homologiaa klassisen kadheriineja [6]. Biologinen funktio CDH17 on vielä tuntematon. Lukuisat tutkimukset ovat raportoineet kohonneita CDH17 eri ihmisen syövissä, joka yhdistää tämän proteiinin ilmentymisen ja ennusteeseen ja riskien arviointi [10], [15]. CDH17 yli-ilmentyminen on raportoitu mahalaukun adenokarsinooman [9], maksasyövän [16] ja peräsuolen syöpä [17]. Tämä osoittaa, että CDH17 voi olla ratkaiseva merkitys kasvainten synnyssä maha- ja maksasyövän.

Ihmisillä CDH17 tavallisesti ilmaistaan ​​yksinomaan basolateraalisessa hepatosyyttien pinnalla ja enterosyyttien. Kun ensimmäinen raportti CDH17 kuten suoliston metapasia markkerin Grotzinger et al [9], useat tutkimukset ovat arvioineet CDH17 ilmentymistä mahasyövässä. CDH17 ilmaistiin 50-78% mahasyövän kudosten suoliston-tyyppinen valta [18], [19]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että CDH17 on onkogeeni ja houkutteleva terapeuttinen kohde mahasyövän: CDH17 ilmentyy voimakkaasti tuumorikudoksissa, jossa lähes puolet syöpien on CDH17 positiivinen IHC. Park ja kollegat arvioivat CDH17 ilmaisun yli 200 mahasyöpä kudosnäytteitä, ja ilmoitti, että se oli erittäin ilmaistu aiemmissa TNM vaiheessa [20], Lisäksi he havaitsivat, että alentunut ilmentyminen CDH17 on osoitettu olla tiiviisti mukana kasvaimen aggressiivisuus ja imusolmuke etäpesäke ihmisen mahakarsinooman [20]. Toiset kuitenkin ilmoitti, että sen ilmentyminen oli huomattavasti suurempi kehittyneiden imusolmuke etäpesäke [18], [21]. Tutkimuksessamme ei ollut suhdetta CDH17 ilmaisun ja muiden kliinis.

Koska ennustetekijä, CDH17 ilme osoitti taipumusta indikaattorina epäsuotuisa hengissä useita potilasaineistoihin, jopa sen jälkeen ohjataan kasvaimen vaiheessa. Tässä yhteydessä mediaani kokonaiselinaika 15,9 kuukautta ryhmässä positiivisia CDH17 ilme, vs. 26,6 kuukautta potilailla, joilla IHC syöpäkasvain edustaa kliinisesti merkittävää yhteyttä. Lisäksi valmisteleva analyysi osoitti huono kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla on korkea ilmentymisen CDH17 proteiinin (IHC 2+ ja 3+) verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen ilmentyminen CDH17 proteiinin (IHC +). Nämä havainnot ovat huomionarvoisia ottaen huomioon huonon ennusteen tässä potilasryhmässä.