Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

muunnelmat histoni aminoterminaalisen hännät vaikuttavat pääsy sääntelyn tekijöiden ja kompleksit kromatiinin ja siten vaikuttaa biologisiin prosesseihin. Syöpäsolut ovat ominaista merkittävä epigeneettiset dysregulation, mukaan lukien histoni muutoksia. Kuitenkin toiminnalliset roolit histoni metyylitransferaasit (HMT) syövän edelleen epäselviä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tutkimme RNAi-pohjainen esto (Knockdown, KD) 2 eri H3K9 HMTs, SUV39H1 ja G9a. Knockdown n 2 HMTs PC3 tasyöpäsolulinja merkittävästi esti solun kasvua ja aiheutti syvällisiä morfologisia muutoksia menettäminen telomeraasiaktiivisuuden ja lyhentää telomeres. SUV39H1 KD solut osoittivat huomattavaa kasvua G2 /M jae. G9a KD solut osoittivat lisääntynyttä DNA-pitoisuus (1,7-kertainen 2 itsenäistä kloonia) verrattuna FACS-analyysit hallita. Karyotype analyysit osoittivat, että tämä johtui lisääntynyt määrä kromosomeja (61-102) in G9a KD soluissa verrattuna vanhempien PC3. Kiehtovan, löysimme epänormaali sentrosomimäärän morfologia ja numero noin 25% G9a KD soluja, kun taas sentrosomien olivat morfologisesti normaaleja hallinnassa soluissa. Microarray analyysit jälkeen KD SUV39H1 tai G9a osoitti hyvin harvat geenejä säädellään ylöspäin joukossa 39000 geenejä. Vaiennettu kasvaimen synnyssä

p16

ja

RASSF1A

ei aktivoituna KD soluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot viittaavat siihen, että 2 HMTs , SUV39H1 ja G9a tarvitaan yllä pahanlaatuiseen fenotyyppiin. Lisäksi G9a kriittinen rooli säätelyssä sentrosomimäärän päällekkäisyyksiä oletettavasti kautta kromatiinirakenteeseen sijaan vaikuttaa geenien ilmentyminen syöpäsoluissa. Kohdentamalla histoni metyylitransferaasit voi olla terapeuttista hyötyä syövissä.

Citation: Kondo Y, Shen L, Ahmed S, Boumber Y, SEKIDO Y, Haddad BR, et al. (2008) alassäätely histoni H3 lysiinin 9 metyylitransferaasi G9a indusoi sentrosomimäärän häiriintyminen ja kromosomi Epävakaus syöpäsoluissa. PLoS ONE 3 (4): E2037. doi: 10,1371 /journal.pone.0002037

Editor: Axel Imhof, University of Munich ja keskus Integrated Protein Science, Saksa

vastaanotettu: 26 joulukuu 2007; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2008; Julkaistu: 30 huhtikuu 2008

Copyright: © 2008 Kondo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat apurahoja CA098006 ja CA100632 NIH (JPJI) ja apurahan Japanin Society for Promotion of Science (YK).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Kromatiini kokoonpano on kriittinen liittyvä prosessi DNA: n replikaatioon, geenien ilmentyminen ja etenemistä solusyklin läpi. Erityisiä muutoksia liittyvät tiettyihin DNA-templaatin välittämää prosesseissa [1]. Metylointi histoni H3 lysiinin 9 (H3K9) on yksi hyvin tutkittu histonimodifikaation. Kun ensimmäinen tunnistamisen SUV39h1 lisäksi erittäin liittyvän SUV39h2 kuin H3K9 erityisiä histoni metyylitransferaasin (HMT) [2], ainakin kolme muuta HMTs, G9a, ESET /SETDB1 ja EuHMTase1, on kirjattu HMTs varten H3K9 nisäkkäillä [3] – [5]. Nämä entsyymit ovat eri affiniteetit epä-, mono- tai dimetyloitujen valtioiden ja tuottaa erilaisia ​​metylointi valtioissa. Tutkimukset knockout hiirille Suv39h1, 2 ja G9a paljasti, että G9a on pääasiassa vastuussa monomethylation (1Me) ja dimetyloimalla (2Me) ja H3K9, kun taas Suv39h1 ja Suv39h2 suora trimethylation (3Me) of H3K9. Lisäksi 1Me ja 2Me on H3K9 ensisijaisesti asuvat euchromatin, kun taas 2Me ja 3Me koskevat H3K9 tavataan erilaisia ​​heterochromatin, fakultatiivisten ja konstitutiivisen heterochromatin, vastaavasti. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 1Me, 2Me tai 3Me at K9H3 miehittää erillistä kromosomi aloilla ja kunkin kolmen valtioiden H3K9 metylaation on ainutlaatuinen rooli rakenne- ja funktionaalinen organisaatio kromosomien.

asetus korkeamman asteen kromosomi rakenne vaikuttaa mitoosi uskollisuutta ja varmistetaan tasapainoinen kromosomi eriytymistä. Heterochromatin kokoonpano at sentromeerien helpottaa sekä Kinetokori muodostumista ja sisarkromatidin koheesiota [6]. Lisäksi muodostumista kromatiinin rakenteiden telomeerit toimii myös säilyttää pituus telomere toistojen [7]. Tutkimukset fissio hiiva osoitti, että vuorovaikutus 3MeH3K9 ja Swi6 /HP1 tarvitaan kromosomi eriytymistä mitoosin [8]. Nisäkkäillä, mitoosi kromosomit näyttää rikastettua 2MeH3K9 klo sentromeerisen alueiden ja lausutaan 3MeH3K9 klo pericentric heterochromatin. Knockout of Suv39h1 ja Suv39h2 hiiren johtaa laajaa genomin epästabiilisuuden ja lisääntyneen lymfoomien, viittaa siihen, että 3MeH3K9 on kriittinen muutos säilyttää kromosomi ympäristöihin [2]. 2MeH3K9 on myös liitetty DNA-metylaatio liittyy geenien [9] – [11], mutta entsyymi hallita tätä tapahtumaa ei ole määritelty.

Syöpäsolut ovat ominaista merkittävä epigeneettisiä dysregulation, mukaan lukien muuttuneet kromatiinin muutos. Aiemmin löysimme lisääntynyt taso G9a ihmisen syövissä [12], vaikka toiminnallinen rooli HMTs yli-ilmentymisen syöpä on edelleen epäselvä. Tässä osoitamme, että taintumisen (KD) on G9a ja SUV39H1 syöpäsoluissa estettiin merkittävästi solujen kasvua ja johti morfologisesti senescent solujen telomere poikkeavuuksia. Huomasimme, että G9a KD mutta ei SUV39H1 KD aiheuttaa laajoja kromosomi epävakautta ja sentrosomimäärän häiriöitä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että G9a sekä SUV39H1 tarvitaan pitämään pahanlaatuinen fenotyyppi ja voisi olla voimassa terapeuttisia kohteita ihmisen neoplasia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, viljelyolosuhteet ja lääkehoito

eturauhassyövän solulinja PC3, keuhkosyöpä solulinja H1299 ja rintasyövän solulinjassa MCF7 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ne kasvatettiin RPMI-alustassa (Invitrogen, Carlsbad CA), plus 10% FBS: ää muovista kudosviljelylevyille kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. Solut jaettiin 12-24 h ennen 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC, Sigma, St. Louis, MO) hoitoon. Sitten soluja käsiteltiin joko 1 uM DAC, tai PBS: ää (kontrolli) päivittäin 3 päivää.

RNA Interference

suunniteltu retrovirusvektoria (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector, BD Biosciences), joka koodaa pientä hiusneula-RNA (shRNA) vastaan ​​suunnattu G9a ja SUV39H1 PC3 (kohdesekvenssien 5′-AAGATTGAGCCTCCGCTGATT-3 ’ja 5′-AATCTCAAGTGTGTGCGTATC-3’ varten G9a ja SUV39H1, vastaavasti). Kontrollina käytimme shRNAs lusiferaasin (Luc) syntetisoitiin BD Biosciences tai shRNA vektori ilman hiusneula oligonukleotideja.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) B

ChIP määritykset suoritettiin perustuen muutos aiemmin julkaistuja menetelmiä [13]. Lyhyesti, solut käsiteltiin 1% formaldehydiä 8 min silloittamiseksi histonien ja DNA: ta. Solupelletit suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin ja sonikoitiin 8 sek seitsemän kertaa. Lysaatti inkuboidaan 10 ui anti-K4 dimetyloitu histoni H3, anti-K9 asetyloitu histoni H3, anti-K9 dimetyloitu histoni H3 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) ja anti-histoni H3-vasta-aine (sisäisenä kontrollina, Abcam, Cambridge, UK) 4 ° C: ssa yön yli. Kaksi% kaikista lysaattia käytetään lisäämisen valvonta. DNA uutetaan fenoli /kloroformilla menetelmä, etanoli-saostettiin ja suspendoitiin uudelleen veteen. ChIP tuotteita käytettiin kvantitatiivista PCR-oligonukleotidialukkeita, jotka on kuvattu taulukossa S1. Kvantitoimiseksi, TaqMan Q-PCR: t suoritettiin ABI Prism 7000 instrumentti (Applied Biosystems, Foster City, CA) kahtena varten kohdegeeneissä.

Immunoblottausmääritys

Immunoblottausmääritys suoritettiin primaaristen vasta-aineiden anti-G9a (Abcam), anti-SUV39H1, anti-K9 dimetyloitu histoni H3, anti-K9 trimetyloidaan histoni H3 (Upstate Biotechnology), histoni H3 (Abcam) ja ß-aktiini (Sigma).

RT -PCR Analyysit

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen), ja 2 ug, tehtiin käänteistranskriptio MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Alukesekvenssit käyttää, on kuvattu taulukossa S1. PCR-protokolla RT-PCR oli 95 ° C: ssa 4 minuutin ajan, jota seurasi 35 sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 30 sekuntia 55 ° C: ssa ja 30 s 72 ° C: ssa, ja sitten 5 min loppupidennys 72 ° C. TaqMan Q-PCR: t tehtiin kahtena varten kohdegeeneissä G9a, SUV39H1 ja GAPDH käyttäen koetin asetetaan Hs00198710_m1, Hs00162471_m1 ja Hs 00266705_gl, vastaavasti (Applied Biosystems).

bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi metylointianalyysi

suoritimme vetysulfiittikäsittelyä kuten raportoitu aiemmin [14]. Lyhyesti, 2 ug genomista DNA: ta denaturoitiin 2 M NaOH: lla 10 min ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 3 M natriumbisulfiitin (pH 5,0) 16 tuntia 50 ° C: ssa. Käsittelyn jälkeen DNA puhdistettiin käyttämällä Wizard Miniprep Column (Promega, Madison, WI), saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 30 ui laimennettua vettä. Käytimme erittäin kvantitatiivinen menetelmä, jolla arvioidaan DNA metylaatiotasoilla perustuu pyrosekvensointi teknologiaan [15] (pyrosekvensointi AB, Uppsala, Ruotsi). Alukesekvenssit on kuvattu taulukossa S1.

SA-ß-gal-analyysi

PC3-solut infektoitiin retroviruksella, joka koodaa G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA tai kontrolli-shRNA tutkittiin SA-p- gal aktiivisuus, kuten aiemmin on kuvattu [16].

RNA Microarray Analysis

Kokonais-RNA uutettiin soluista, jotka oli infektoitu jommallakummalla G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA tai kontrolli-shRNA kuten edellä on kuvattu. Tavoitteet microarray hybridisaatio tuotettu RNA mukaan valmistajan ohjeiden (Affymetrix, Santa Clara, CA). Ihmisen U133A geenilastuun (Affymetrix), joka sisältää ~33,000 selostukset käytettiin geeniekspressioprofilointi. Hybridisaatio, pesu, skannaus, ja analyysi geenilastut suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ekspressiotasoja analysoitiin tilastollisen algoritmin Microarray Analysis Suite (MAS) 5,0 ohjelmisto (Affymetrix) käyttäen oletusparametrit. Tiedot ohjaus-, shRNA hoito ja vanhempien PC3 käytettiin perustason lauseke vertailuun joko G9a-shRNA tai SUV39H1-shRNA käsitelty näyte.

Measurement telomeraasiaktiivisuuden

telomeraasiaktiivisuus analysoidaan muunnettua menetelmää standardin telomeraasin toista vahvistusta protokolla (TRAP), trapetsi telomerase Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Reaktio-tuotteet ajettiin 15% natiivi-polyakryyliamidigeelillä ja värjättiin etidiumbromidilla.

Immunofluoresenssi sytogeneettinen

G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA tai kontrolli-shRNA käsiteltyjen PC3-soluja kasvatettiin Falcon kulttuuriin dioja (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Anti-CENP-monoklonaalinen vasta-aine (Abcam), anti-K9 dimetyloitu histoni H3 ja anti-K9 trimetyloidaan histoni H3 polyklonaalisia vasta-aineita (Upstate Biotechnology) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita. Sentrosomien detektoitiin γ-tubuliinin polyklonaalista vasta-ainetta (Sigma) käyttäen standardia protokollaa [17]. Primaarisen vasta-aineen havaittiin Alexa Fluor 488-konjugaatti vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Invitrogen), Alexa Fluor 546-konjugaatti vuohen anti-kani-vasta-ainetta (Invitrogen) tai fluoreseiini-konjugoitu vuohen anti-kani-vasta-aineella (Sigma) ja solut vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI), ja upotettu anti-fade-liuosta (200 mM DABCO, 90% tilavuus /tilavuus glyserolia, 20 mM TRIS-HCl: ää, pH 8) vähentämään valovalkaisukykyä. Pisteytys solujen ja digitaalisen kuvan hankinta suoritettiin käyttäen 63 × tavoite asennettu Leica DMRBE mikroskooppi (Leica, Wetzlar, Saksa), joissa on optinen suodattimet DAPI ja FITC (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) ja jäähdytetyn (charge coupled device CCD) kamera (Photometrics, Tucson, AZ). IPLab ohjelmistopaketti (Scanalytics Inc, Fairfax, VA) käytettiin kuvan hankinta ja käsittely. Kunkin 3 soluvalmisteita (kontrolli, G9a-shRNA tai SUV39H1-shRNA käsitellyissä soluissa), 100 tumat tekee kaksi riippumatonta tarkkailijaa.

telomeeripituuden Analyysi

G9a-shRNA, SUV39H1 -shRNA tai kontrolli-shRNA käsiteltyjen PC3-solut arvioitiin telomere lyhenemistä käyttäen Telo-FISH menetelmä, jolla kuvataan telomeres interfaasivaiheessa solupopulaatioiden, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, FISH-analyysi suoritettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla Cy3-konjugoitu peptidi (PNA) telomeerisiä koetin kohti valmistajan (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) ohjeiden mukaisesti. Riippumaton analyysi suoritettiin kaksi sokkoutettu tarkkailijaa käyttäen Leica DMRBE mikroskooppi on varustettu Cy3 ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) suodattimia. Yli 100 interphase tumat arvioitiin visuaalisesti, ja digitaalisia kuvia saatiin käyttäen jäähdytettyä CCD (charge coupled device) kameraa.

Tulokset

arvioimiseksi rooli SUV39H1 ja G9a syövissä, ensimmäinen loimme klooneja PC3, jossa jompikumpi näistä 2 HMTs oli vakaasti vaimentua mukaan shRNA. Käytimme PC3, koska endogeeninen SUV39H1 ja G9a olivat erittäin ilmaistaan ​​tässä solussa. Näiden pudotus (KD) klooneja, ilmentyminen 2 HMTs väheni 80-90% (kuviot. 1A ja 1B). KD solujen G9a (G9a-KD) osoitti kaiken kaikkiaan pienentää 2MeH3K9 ja 3MeH3K9. KD solujen SUV39H1 (SUV-KD) vähensi yleistä 3MeH3K9 mutta ei merkittävää muutosta 2MeH3K9 (Fig. 1 B). 2MeH3K9 pääpiirteittäin havaittiin tumien valvonnan soluihin, kuten eu- ja heterochromatic alue (Fig. 1 C). Kuitenkin G9a-KD solun tuma osoitti selektiivisesti alentunut laaja euchromatic värjäytyminen 2MeH3K9 ja sisälsi vain näön pilkkuja, jotka olivat päällekkäin pericentric alueen (tiheään värjättiin DAPI) ja sentromeerisen alue (värjätty CENP-A). 3MeH3K9 havaittiin on pericentric alueen ja sentromeerisen alue kontrollisoluissa. SUV-KD soluista osoitti vähentynyt 3MeH3K9, mutta ei kokonaan, on heterochromatic pesäkkeet ja ei merkittävästi muuta 2MeH3K9 valtioiden (Fig. 1 C). G9a-KD ei merkittävästi vaikuttanut 3MeH3K9 kuviot pericentric alueen ja sentromeerisen alue. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​edellisen G9a- puutteellinen ES-solujen tutkimuksissa [19], [20]. Mielenkiintoista on, että näytti siltä, ​​että G9a-KD vaikuttaa H3K9me3 tila euchromatic alueella.

Reaaliaikainen PCR (A) ja Western-blottauksella (B) osoittavat, että shRNA häiriöitä tehokkaasti downregulates G9a tai SUV39H1 ilmaisua. Virhepalkkien reaaliaikainen PCR osoittavat keskihajonnan ilmaisun yli 3 itsenäisesti eristettyjä klooneja. Mitä H3 muuttamiseksi, G9a-KD (2 itsenäistä kloonia) soluissa näkyy vähennetään yleisiä 2MeH3K9. Sen sijaan, SUV-KD vähensi yleistä 3MeH3K9 mutta ei merkittävää muutosta 2MeH3K9. C, H3-K9 metylaatio valtioiden analysoitiin immunofluoresenssilla 2MeH3K9 (punainen, vasen) tai 3MeH3K9 (punainen, oikea) spesifisten vasta-aineiden valvonta soluissa (Ctrl), G9a-KD soluja tai SUV-KD soluissa. 2MeH3K9 pääpiirteittäin tunnistettiin kontrolli ytimeksi. G9a-KD tuma paljasti heikko pilkut on 2MeH3K9 päällekkäin DAPI-tiheä (sininen) loci ja CENP-A värjäys (vihreä). jotka edustavat pericentric alue ja sentromeerisen alue, vastaavasti. SUV-KD vähensi 3MeH3K9 klo heterochromatic pesäkkeet ja ei merkittävästi muuta euchromatic värjäytyminen 2MeH3K9 toteaa. Solun koko on suhteessa 10 um bar. D, G9a-KD ja SUV-KD tuloksen voimakkaan kasvun estäminen. Solut maljattiin samaan tiheyteen ja laskettava päivittäin trypaanisiniekskluusiolla. Täytetyt ympyrät, täydet kolmiot ja täytetyt neliöt osoittavat kasvun ohjaus, SUV-KD ja G9a-KD-soluissa, vastaavasti. Virhejanat kaavion osoittavat keskihajonnan kolmena kappaleena kokeiluja. E, alassäätely kahden histoni metyylitransferaasit tuloksena merkittävä morfologista muutosta, joka värjäytyi positiivisesti SA-beta-gal, joka osoittaa induktio vanhenemista. Solukoko on suhteessa 50-pm bar.

Sekä SUV-KD ja G9a-KD osoitti merkittävästi esti solun kasvua ja syvällisiä morfologisia muutoksia, laajentunut ja litistetty muotoja. (Kuviot. 1D ja 1E). Vanheneminen liittyy p- galaktosidaasi (SA-ß-gal analyysi) osoittivat, että tämä elimellisen muutoksen vastasi induktion solujen vanhenemista.

induktio solun vanhenemisen vastauksena ärsykkeisiin riippuu ensisijaisesti p53 tai p16-pRB reittejä [21]. Koska p16 on vaiennetaan DNA: n metylaation PC3 ja sen p53 tila on nolla, tutkimme seuraavaksi p16 uudelleenaktivointi on G9a-KD ja SUV-KD soluissa. Toisin hoitoon DNA metyylitransferaasi inhibiittori 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC), löysimme p16 aktivaation kumpikaan G9a-KD eikä SUV-KD soluja, sopusoinnussa mitään vaikutusta epigeneettiset tilasta promoottorialue ( kuva 2). Tutkimme myös toisen tuumorisuppressorigeeniä,

RASSF1A

, joka on kohde-DNA: n metylaation PC3, ja totesi, että ei ollut vaikutusta geenien uudelleen aktivoituminen joko G9a-KD tai SUV-KD soluissa. Koska DNA: n metylaatio, ratkaiseva epigeneettiset mekanismi hiljentäminen tuumorisuppressorigeeneille ihmisen neoplasia on mekaanisesti yhdistetty histoni 2MeH3K9 metylaatio [9] – [11], nämä tiedot voidaan selittää korvausta muiden HMTs.

A-RNA-ekspressio kunkin geenin tutkittiin RT-PCR: llä. Toisin kuin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC) käsittely, ei G9a-KD eikä SUV-KD aktivoi p16 ja RASSF1A ilme. p21 ja GAPDH käytetään aktiivisen geenin valvontaa. B, DNA: n metylaatio muutoksia p16 ja RASSF1A promoottorit analysoitiin pyrosekvensointi kvantitatiivinen menetelmä. Yhdenmukainen ilmentymistilanne molempien geenien, DNA: n metylaatio on vähentynyt DAC hoito, kun taas mitään muutoksia havaitaan joko G9a-KD tai SUV-KD soluissa. Virhejanat kaavion osoittavat keskihajonnan kolmena kappaleena kokeiluja. C, histonimodifikaation tutkineet Chip esitetään alla sarakkeita. K4Me, K9Ac, K9Me ja Ab (-) osoittaa, K4 dimetylaatio, K9 asetylaatio, K9 dimetylaatio eikä vasta-aineen ohjaus, vastaavasti. Y-akseli edustaa suhdetta kunkin IP ydin histoni H3 immunosaostus. Mustat palkit, valkoiset pylväät ja harmaat palkit osoittavat pelimerkki mock hallinnassa, G9a-KD ja SUV-KD-soluissa, vastaavasti. p21 käytettiin aktiivisen geenin valvonta, jossa aktiivinen histonimerkkien, K4Me ja K9Ac, ovat korkeat. Virhejanat kaavion osoittavat keskihajonnan rinnakkaisessa kokeessa.

tarkastella kohdegeenien H3K9 metylaation riippuvainen hiljentäminen joko G9a tai SUV39H1, analysoimme geenejä säädellään ylöspäin jälkeen eston G9a tai SUV39H1 käyttämällä oligonukleotidigeenisirumenetelmää. Analysoinnissa array data, ensimmäinen valitsimme geenit signaalin voimakkuudet 50 tai vähemmän joko vanhempien tai valvontaa shRNA saaneilla PC3 (ts vaiennetaan geenejä). Sitten etsittiin geenien kanssa signaalin intensiteettiä kasvoi yli 2 kertaa jälkeen KD joko G9a tai SUV39H1. Poistamisen jälkeen itsensä ristiriidassa antureista joukossa samaa geeniä, voisimme tunnistaa vain 4 ja 6 geenit (3 geenit ovat yleisiä) on G9a-KD ja SUV-KD-soluissa, vastaavasti. Tutkimme näitä 7 geenien RT-PCR ja havaitsi, että vain 2 geenit,

Klotho

ja

kasvuerilaistumistekijä 8

(

GDF8

), olivat todella vaiennettu kontrolliryhmässä solut ja ajan säännelty kummassakin G9a-KD ja SUV-KD soluja (tuloksia ei ole esitetty). Siten hyvin harvat geenejä säädellään ylöspäin jälkeen inhibition 2 HMTs PC3. Vaikka G9a ja SUV39H1 ovat yleensä mukana geenien, huomasimme, että 12 ja 2-geenien (2 geenit olivat yleisiä) on alas-säännelty G9a-KD ja SUV-KD-soluissa, vastaavasti (taulukko S2). Down-regulation niitä harvoja geenejä voisi johtua sivuvaikutusten G9a-KD ja SUV-KD.

Huolimatta vähäinen vaikutus geenien ilmentymisen, merkittävästi esti solun kasvua havaittiin sekä G9a-KD ja SUV-KD soluissa. Tutkimme näitä soluja FACS analysoi määrittää mekanismista. Huomasimme, että G9a-KD solut osoittivat lisääntynyttä DNA-pitoisuus (1,7-kertainen 2 itsenäistä kloonia) ja SUV-KD solujen osoituksena huomattava kasvu G2 /M jae (29%: sta 40%) kontrolliin verrattuna (kuvio. 3A). Yhdenmukainen Näiden tietojen karyotyyppi analyysit (Fig. 3B) paljasti määrä on lisääntynyt kromosomien G9a-KD solujen verrattuna SUV-KD soluihin ja vanhempien PC3-solulinjassa (kuvio. 3B). Numerot kromosomin laskettiin yli 8 ytimen kunkin KD solun (Fig. 3B). G9a-KD solut osoittivat huomattavasti kromosomissa numeroita (keskimäärin 119 kromosomeja,

P

0,01) kuin SUV-KD soluja (63 kromosomia) ja ohjaus soluja (65 kromosomit). Tämä oli totta riippumatta solulinjan tyyppejä käytetään. Sekä vakaa G9a-KD klooneja rintasyövän MCF7 ja keuhkosyövän solulinjassa H1299 osoitti myös lisääntynyt määrä kromosomien verrattuna ohjata soluihin (MCF7-ohjaus vs MCF7-G9a-KD, 60 kromosomeja vs 98 kromosomia; H1299- vertailuryhmä vs. H1299-G9a-KD, 72 kromosomeja vs 104 kromosomien; Kuva S1).

, FACS-analyysit osoittavat DNA pitoisuus kasvaa 1,5-2 kertaa G9a-KD solujen verrattuna mock valvonnan kohteena kahdessa itsenäisesti eristetty kloonit (G9a-C1 ja C2). SUV-KD solut näyttävät suuri määrä G2M solujen verrattuna mock valvontaa. B, karyotyyppi analyysit osoittivat 61, 102 ja 61 kromosomia valvonnassa PC3 The G9a-KD ja SUV-KD solulinjoissa, vastaavasti. Kromosomiluku on huomattavasti lisääntynyt G9a-KD soluissa. Numerot kromosomin laskettiin yli 8 tuma kunkin KD solun. G9a-KD-solut osoittivat huomattavasti kromosomissa numerot kuin SUV-KD-soluja ja kontrollisoluja. Y-akseli osoittaa määrän kromosomi. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan. *,

P

0,01. C, Nuclei värjättiin DAPI. Sentrosomien havaittiin käyttämällä vasta-ainetta γ-tubuliinia. Kontrollisoluissa ja SUV-KD-solut, 1-2 sentrosomien joka esiintyy pistemäisiä rakenteita nähdään jokaisessa solussa. Vuonna G9a-KD solujen epänormaalia sentrosomimäärän morfologia ja lukumäärä, viittaavia sentrosomimäärän vahvistus havaittiin noin 25%: lla soluista. Poikkeuksellisen monistettu sentrosomien suurennetaan laatikoihin.

sentrosomien ovat välttämättömiä asianmukaisen solun napaisuus ja tasapuolinen jakelu kromosomien [22]. Käytimme vasta-aine vastaan ​​γ-tubuliinin arvioida sentrosomien vuonna KD soluissa. Vaikka suurin osa soluista sekä ohjaus- ja G9a-KD oli normaalia (1-2) sentrosomin numerot, Havaitsimme sentrosomin vahvistus noin 25% soluista on G9a-KD-soluja. Tämä ei havaittu kontrolliryhmässä solujen ja SUV-KD-solut (Fig. 3C). Sentrosomimäärän poikkeavuus havaittiin myös sekä MCF7-G9a-KD solujen ja H1299-G9a-KD soluja noin 20% soluista (kuva S1). Siten G9a saattaa kriittinen rooli säätelyssä sentrosomimäärän päällekkäisyyksiä, oletettavasti kautta kromatiinirakenteeseen sijaan vaikuttamalla geenien ilmentyminen syöpäsoluissa.

kromatiinirakenteeseen at telomeres on myös tärkeää säilyttää pituutta telomere toistoja [7 ]. Tutkimme telomere toiminto G9a-KD ja SUV-KD soluissa. Ensinnäkin, käytimme telo-FISH määrityksessä arvioimaan telomeeripituuden. Merkittävä väheneminen telomere signaalin voimakkuuden havaittiin G9a-KD ja SUV-KD käsiteltyjen PC3-soluissa, verrattuna kontrolliin soluihin viittaa siihen, että sääntely telomeeripituuden häiriintyi näissä KD soluissa. Tyypillinen esimerkki väheneminen telomere signaali näkyy kuvassa 4A. Me seuraavaksi määrällisesti telomeraasiaktiivisuus näissä soluissa TRAP määrityksen ja löysi vähentäminen telomeraasiaktiivisuuden G9a-KD-solulinjassa (kuvio. 4B). Näin ollen lyhentää telomeeripituuden on G9a-KD-soluja voisi johtua muuttunut telomeraasiaktiivisuuden. Vähentynyt taso hTERT ilmaisun G9a-KD solujen antaa tukea näihin havaintoihin (Fig. 4C). Sen sijaan SUV-KD solut osoittivat samalla tasolla telomeraasiaktiivisuuden kontrolliin soluihin, mikä osoittaa, että telomere toimintahäiriö SUV-KD soluja voi riippua muiden mekanismien kuin hTERT ilme, johtunee korjauksilla H3K9 metylaation tilan telomeerisesti heterochromatin.

, Interphase tumat hybridisoitiin Cy3-konjugoidun peptidin (PNA) telomeerisesti koetin ja vastavärjättiin DAPI. Vähentynyt selvästi telomere signaali havaitaan interfaasivaiheessa ytimiä KD soluista verrattuna ytimiä ohjauslinjan. Näkyy sisäkkeet ovat laajentuneen kuvia merkityillä alueilla. B, Telomeraasiaktiivisuus arvioidaan TRAP määrityksessä. Näytteet, joissa telomeraasiaktiivisuutta tuottaa 6-base inkrementaalinen tikkaat TRAP tuotteiden geelejä. Sisäisen valvonnan juovia alareunassa geelin. Alennettu signaalin intensiteettiä telomeraasiaktiivisuuden havaitaan G9a-KD solulinjat. Signaali ei ole havaittu, kun uutteet esikäsitellään lämmön poistamiseksi proteiinin osien telomeraasi viittaa telomeraasin spesifisyys mittaaman signaalin tässä määrityksessä. C, Expression taso hTERT mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. hTERT ilmentyminen väheni G9a-KD solujen verrattuna kontrolliryhmän PC3 ja SUV-KD soluissa. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan 3 riippumatonta määrityksissä.

Dsicussion

Nykyinen tutkimus osoittaa, että ilmaus SUV39H1 ja G9a on tärkeää tukea kasvua pahanlaatuisia soluja, vaikka niillä erilliset tehtävät syöpäsoluissa. Yllättäen hyvin vähän geenejä säädellään ylöspäin jälkeen inhibition 2 HMTs, mikä viittaa siihen, että H3K9 metylaatio liittyy hiljentäminen, joka on mekaanisesti yhdistetty DNA: n metylaatio [9] – [11], on stabiili, kun on todettu syöpäsoluissa, mahdollisesti toiminnan kautta useiden HMTs.

Sentromeeri välittää useita erottelu toimintoja, kuten Kinetokori muodostuminen, kara välittämä liikkeitä, sisko koheesio ja mitoottisen tarkastuspiste [6]. Pericentric heterochromatin arkkitehtuuri on ratkaiseva rooli kromosomi eriytymistä sekä perustamalla transkription tukahduttaminen. Menetys Suv39h1 ja Suv39h2 HMTases hiirimallissa lakkautetaan H3-K9 metylaation pericentric heterochromatin ja aiheuttama kromosomi epävakautta. Kuitenkin, yhden geenin häiriöt joko Suv39h1 tai Suv39h2 ei näyttänyt vaikuttavan elinkelpoisuus ja hedelmällisyyden mutanttihiirillä, mikä viittaa siihen, nämä kaksi entsyymiä ovat tarpeettomia [2]. Study in G9a hiiressä osoitti G9a oli välttämätöntä alkion kehittymiseen tai erilaistumiseen ja alkion kasvun vika G9a puutosta ES-solut saattavat johtua apoptoottisen solukuoleman mutta ei solusyklin pysähtymiseen. Tässä mallissa, kromosomi epävakaus ei koettu tyrmäys soluissa [19]. Olemme täällä että syöpäsoluissa, mikä usein satama poikkeavaa kromosomeja, G9a KD aiheuttama sentrosomimäärän häiriöitä ja laajempi kromosomi epävakautta, mikä johti solujen kasvun esto ja solujen vanhenemista. Vaikutti siltä, ​​että 3MeH3K9 myös vähentynyt klo euchromatic alue G9a KD soluja. Tämä saattaa johtua siitä, että jyrkkä supistuvat 2MeH3K9, mikä on edellytys muuttaminen tri-metylaation on loci. Nämä tiedot osoittivat, että rooli G9a syöpäsoluissa on kriittinen ja näyttää suojelemaan edelleen kromosomi häiriöitä. Sen sijaan yksi Suv39H1 KD osittain luovuttu 3MeH3K9 at pericentric alueella, mutta ei kromosomeja epävakautta, mikä todennäköisesti johtuu irtisanotuille rooleja SUV39H HMTases [2].

Viimeaikaiset raportit osoittivat, että sentromeerisen chromatin erityistä yhdistelmiä histonimodifikaation ja kolmiulotteinen järjestäminen kromosomien voisi myös olla tärkeä rekrytointia koheesion komplekseja heterochromatin lähellä sisko Kinetokori [23] [24]. 2MeH3K9 kromatiinin, joka on läsnä sisemmässä Kinetokori väli mitoosi sisaren kromatidien ja alueilla, jotka reunustavat sentromeerisen kromatiinin, voisi johtua asemaa CENP-A kohti napasuuntaisen kasvot mitoosi kromosomi [25]. Vähentynyt taso 2MeH3K9 on reunustavan alueen sentromeeriantigeenin kromatiinin mukaan G9a KD saattavat vaikuttaa kolmiulotteinen järjestäminen sentromeeriantigeenin kromosomeja, jolloin kromosomi epävakaus löysimme täältä.

sentrosomien alkaa monistaa klo myöhään G1 /varhainen S-vaihe solusyklin, ja kaksi funktionaalista sentrosomien aikana muodostuu G2 [22]. Jos solut eivät läpi sytokineesiin jälkeen DNA-synteesin ja seuraava solusyklin jatkuu, ne saattavat olla kaksi kertaa normaalia DNA-pitoisuutta ja sentrosomimäärän. Siten nykyinen tiedot osoittivat, että epäonnistuminen sytokineesiin saattaa olla selitys poikkeavuuksia kromosomi numero ja sentrosomien että G9a-KD soluissa.

G9a näyttää vaaditaan hTERT ilmaisun ja telomeerivasta huolto. SUV39H1 tarvitaan myös valvontaa telomere sääntelyä. Hiirimallissa, alkion fibroblasti hiiristä null sekä Suv39h1 ja Suv39h2 osoittivat epänormaalia telomere pidentymisen [26]. Kumoaminen kahden HMTs johti menetykseen heterochromatic toimintoja telomeres alkion kantasoluja ja hiiren alkion fibroblasteissa. Meidän tiedot osoittivat, että SUV39H1 KD syöpäsoluissa on lyhyemmät telomeerit. Syyt siihen, miksi löysimme lyhentäminen telomeres SUV39KD soluissa toisin kuin aiemmin tulokset voivat johtua solutyyppejä tutkittu (eli normaalit solut versus syöpäsolujen), koska telomere toiminta yleisesti poikkeuksellisesti säännelty syöpäsoluissa [27]. Lisätutkimukset puututtava mekanistisen yhteyksiä G9a, SUV39H1 ja kromosomi /telomeerivasta rakenteita sekä hTERT ilmentymistä syöpäsoluissa. Lisäksi se voisi olla mielenkiintoista nähdä, onko yksittäisiä vaikutuksia G9a ja SUV39H1 ovat osuuskunta, kun ne molemmat vähenevät ja onko uudelleen kahden HMTs palaa fenotyypin. Kuitenkin kohdentamalla histoni metyylitransferaasit voisi olla terapeuttista hyötyä syövän hoitoihin.

tukeminen Information

Kuva S1.

alassäätely G9a metyylitransferaasin MCF7 ja H1299 solulinjoissa. A, Reaaliaikainen PCR osoittaa shRNA häiriöitä tehokkaasti downregulates G9a MCF7 ja H1299. Virhepalkkien reaaliaikainen PCR osoittavat keskihajonnan ilmaisun 3 erillistä eristettyä klooneja. B, FACS-analyysit osoittavat DNA pitoisuus kasvaa 1,5-2 kertaa G9a-KD solujen verrattuna mock valvonnan yksittäinen klooni. Lisääntynyt DNA-pitoisuuden havaittiin kaksi itsenäisesti eristetty kloonia (dataa ei esitetty). C, karyotyyppi analyysit osoittivat pieniä ja kasvoivat kromosomeja sekä MCF7-G9a-KD ja H11299-G9a-KD solulinjoissa. D, sentrosomien havaittiin käyttämällä vasta-ainetta γ-tubuliinia. Kontrollisoluissa, 1-2 sentrosomien joka esiintyy pistemäisiä rakenteita nähdään.