Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori 2 (VEGFR2) ovat nousseet kaksi tehokasta kliinistä tavoitteita ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että delfiniidi, joka on anthocyanidin, läsnä pigmentoitunut hedelmiä ja vihanneksia, on voimakas estäjä sekä EGFR ja VEGFR2 NSCLC soluihin, jotka yli-ilmentävät EGFR /VEGFR2. Käyttämällä näitä soluja, me seuraavaksi määritellään vaikutuksia delfiniidi solujen kasvuun ja apoptoosin

in vitro

ja kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä

in vivo

. Delfiniidi (5-60 uM) hoitoon NSCLC-solujen esti aktivoinnin PI3K, ja fosforylaatiota AKT ja MAPK. Lisäksi hoito NSCLC-solujen delfiniidi johti solujen kasvun esto ilman merkittäviä myrkyllisiä vaikutuksia ihmisen normaaleista keuhkoputken epiteelisolujen. Erityisesti, hoito NCI-H441 ja SK-MES-1-soluja, joissa delphindin (5-60 uM) johti (i) lohkaisu PARP-proteiinin, (ii) kaspaasi-3 ja -9, (iii) downregulation anti -apoptotic proteiineja (Bcl2, Bcl-x L ja Mcl-1), (iv) ylössäätely pro-apoptoottisten proteiinien (Bax ja Bak), ja (v) vähentynyt ilmentyminen PCNA ja sykliini D1. Lisäksi kateenkorvattomissa nude-hiirissä ihon alle istutettu ihmisen NSCLC-solujen, delfiniidi hoito aiheutti (i) merkittävä tuumorin kasvun estäminen, (ii) pienentää ilmentymisen merkkiaineiden solujen lisääntymisen (Ki67 ja PCNA) ja angiogeneesiä (CD31 ja VEGF) ja (iii) apoptoosin induktion verrattuna kontrollihiiriin. Näiden havaintojen perusteella ehdotamme, että delfiniidi, yksin tai liitännäisaineena nykyisiin hoitomuotoihin, voitaisiin käyttää hallintaan NSCLC, erityisesti ne, jotka yli-ilmentävät EGFR ja VEGFR2.

Citation: Pal HC, Sharma S, Strickland LR, Agarwal J, Athar M, Elmets CA, et al. (2013) delfiniidi Vähentää Cell proliferaatiota ja indusoi apoptoosia Non-Small-Cell Lung Cancer Cells by Targeting EGFR /VEGFR2 signalointireittejä. PLoS ONE 8 (10): e77270. doi: 10,1371 /journal.pone.0077270

Editor: Xianglin Shi, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 elokuu 2013; Hyväksytty: 09 syyskuu 2013; Julkaistu: 04 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Pal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH Grant AT004966 ja National Cancer Institute CA13148-39 UAB Kattava Cancer Center Junior Lionkouluttajien apurahaohjelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on merkittävä terveysongelma Yhdysvalloissa osuus on noin 28% kaikista syöpään liittyvien kuolemien. Lisäksi yhteensä 228190 uutta syöpätapausta ja 159480 kuolemantapauksia keuhkosyöpä on ennustettu esiintyvän Yhdysvalloissa vuonna 2013 [1]. Kaksi suurta keuhkosyöpään on pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jotka käsittävät noin 15 ja 85% kaikista tapauksista vastaavasti. Keuhkosyöpä on osoittautunut vaikeaksi ohjata hoitomuodon ja kirurgiset lähestymistavat johtavat huonoon ennusteeseen. Suuntaa tämän huono ennuste, yleinen 5 vuoden pysyvyys on vain 15% NSCLC [2,3]. On selvää, tutkimus vaihtoehtoisen hoitovaihtoehdot NSCLC on tarpeen, ja toivottavasti johtaa lievittämiseen tämän suuren taakan kuolleisuuden.

kasvutekijän reseptorin (EGFR /HER1 /erbb1) on tyypin 1 transmembraanireseptoriproteiinia tyrosiinikinaasin (RTK) ErbB- perheen. Se koostuu solunulkoisen sitovan domeenin ja solunsisäisen alueen, joka sisältää tyrosiinikinaasiaktiivisuutta [4]. Se on vakiintunut, että EGFR yli-ilmennetään noin 95% kaikista kiinteä kasvain [5,6]. Lisäksi tiedetään olevan kriittinen kasvaimia synnyttävän kuljettaja, joka syntyy yli 60% NSCLC tapauksista [7] ja noin 30% rintasyövistä [8]. Lisäksi verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori 2 (VEGFR2) on raportoitu olevan yli-ilmentynyt useissa kasvaimissa, mukaan lukien keuhkosyöpä, [9]. Lisäksi yliekspressio sekä EGFR ja VEGFR2 liittyy chemoresistance ja korreloi huonoon ennusteeseen [10,11]. Poikkeava aktivaatio EGFR ja VEGFR2 laukaisee fosforylaatiota lukuisia proteiineja, mukaan lukien PI3K /AKT ja MAPK reittejä, jotka ovat mukana solujen eloonjäämistä, apoptoosin ja angiogeneesin [12,13]. Johtuen mahdollisesta ylikuulumisen ja vakiintunut asema kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä, esto sekä EGFR ja VEGFR2 signalointi voi parantaa kliininen tulos kehittyneiden NSCLC potilaiden. Erilaisia ​​lähestymistapoja on otettu käyttöön samanaikaisesti estää EGFR ja VEGFR2 signalointi. Yhdistelmiä kahdesta spesifisiä inhibiittoreita, ja yksittäisillä aineilla, jotka kohdistuvat näitä reseptoreita on käytetty; mutta niiden käyttöä potilailla tapasi hyväksyttävää toksisuutta.

On kiireellisesti kehitettävä multi kohdistetut terapeuttinen luonnollinen aine, joka estää RTK toimintaa ja alavirran signalointia sekä EGFR ja VEGFR2 parantaa terapeuttisen tehon ja minimoivat myrkyllisyys normaaleille isäntäsoluja. Yksi tällainen aine on delfiniidi, ravinnon anthocyanidin tiedetään olevan täysin läsnä monissa pigmentoitunut hedelmiä (granaattiomenia, marjat ja tumma viinirypäleet) ja vihannekset (munakoisoa, tomaattia, porkkanaa ja punasipulia) [14]. Sillä on antioksidantti [15], anti-inflammatoriset [16,17], anti-proliferatiiviset [18] ja syövän toimintaa [19]. Lisäksi, delfiniidi on osoitettu estävän EGFR signalointireitin, sekä invaasio rintasyövän solujen [20]. Kuitenkin suurin osa anti-syöpä ja anti-angiogeeninen toiminta raportoitu kirjallisuudessa perustuvat

in vitro

tutkimuksissa. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää vaikutukset delfiniidi solujen kasvuun ja apoptoosin

in vitro

ja kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä

in vivo

in NSCLC soluissa. Tuloksemme osoittivat, että delfiniidi on voimakas estäjä sekä EGFR ja VEGFR2 in NSCLC soluissa. Lisäksi, delphindin esti aktivoinnin PI3K, ja fosforylaatiota AKT ja MAPK. Tämä johti solujen kasvun inhibition ja apoptoosin induktiosta NSCLC-soluja. Lisäksi delphindin hoito esti kasvun NSCLC nude-hiirissä, jotka oli liitetty lasku ilmentymisen merkkiaineita solujen lisääntymisen ja angiogeneesin sekä apoptoosin induktion.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

delfiniidi ( 98%) hankittiin Extrasynthase (Lyon, Ranska). Monoklonaaliset ja polyklonaalisia vasta-aineita EGFR ja fosfo-EGFR, VEGFR2 ja fosfo-VEGFR2 ERK1 /2 (fosfo-p44 /42, Thr

202 /Tyr

204), JNK1 /2 (phospo-p54 /46 , Thr

183 /Tyr

185), p38 (fosfo-p38, Thr

180 /Tyr

204), PI3K, phopho AKT, Bcl2, Bcl-x L, Mcl-1, Bax, bak, sykliini D1, PARP, kaspaasi-3 ja -9 saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Polyklonaalisia vasta-aineita VEGF, PCNA ja Ki67 ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-hiiri-CD31-vasta-aine saatiin BD Biosciences (San Jose CA). Anti-hiiri- tai anti-kaniini-piparjuuriperoksidaasi-konjugaattia saatiin Millipore Corporation (Billerica, MA).

Solujen käsittely

Ihmisen NSCLC-solujen NCI-H441, SK-MES-1 ja A549 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). NCI-H441-soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), SK-MES-1-soluja viljeltiin EMEM-alustassa (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), ja A549-soluja viljeltiin Hamin F -12K väliainetta (Mediatech Inc., Manassas, VA), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia ja 100 mg /ml penisilliini-streptomysiiniä. Normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) solut saatiin Clonetics Airways Epithelial Cell Systems (Cambrex Bio Science, Walkersville Inc., MD) ja viljeltiin Keuhkoputken epiteelisolujen kasvua media, johon on lisätty kasvutekijöitä (Cambrex Bio Science, Walkersville Inc., MD). Soluja pidettiin standardeissa soluviljelyolosuhteissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 kosteassa ympäristössä. Delfiniidi (liuotettuna DMSO: hon), käytettiin solujen käsittely. Lopullinen DMSO-pitoisuus käytettiin 0,1% (v /v) kullekin käsittelylle. Annoksesta riippuva tutkimuksissa NCI-H441 ja SK-MES-1-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM) 3 ja 48 tuntia solujen täydellisen väliaineessa. Ohjaus soluja käsiteltiin pelkästään vehikkelillä. Lisäkokeissa, seerumia NCI-H441 ja SK-MES-1-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM) 3 tuntia ja sitten inkuboitiin ilman tai EGF: n (50 ng /ml, 15 min) tai ilman, ja VEGF: n kanssa (20 ng /ml; 30 min).

valmistaminen solulysaateista

Kun solu hoidon delfiniidi, väliaine aspiroitiin ja solut pestiin PBS: lla (10 mmol /l, pH-arvo 7.45). Sitten soluja inkuboitiin jääkylmää lyysipuskuria (10 mM HEPES (pH 7,9), 100 mM KCI, 10 mM EDTA, 20 mM EGTA: ta, 100 mM DTT, 20 mM PMSF: ää, 0,5% NP-40, jossa juuri lisätty proteaasi-inhibiittoreita leupeptiiniä, aprotiniini ja bentsamidiinin) 20 min. Solut kerättiin, ja lysaattia kerättiin mikrofugiputkeen ja vietiin 21,5-G: n neulalla hajottaa solun aggregaatteja. Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla 14,000g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti (kokosolulysaattia) kerätään, eriin ja käytettiin sitten päivänä valmisteen tai välittömästi säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä aikaan .

Western blot-analyysi

Western blotting, 30-50 ug proteiinia erotettiin yli 8-12% Tris-glysiini-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Lyhyesti, kalvon blokattiin ja tutkittiin sopivan primaarisen ja sekundaarisen vasta-aineen HRP-konjugaattia ja sen jälkeen kemiluminesenssin ja autoradiografialla, kuten aiemmin on kuvattu [20].

solunelinkykyisyysmääritys

vaikutus delfiniidi solujen elinkelpoisuuden määritettiin 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT). Solut (NHBE, NCI-H441, A549 ja SK-MES-1) maljattiin 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle ja käsiteltiin 5-100 uM pitoisuuksilla delfiniidi 48 tuntia. 1/10 tilavuus 10xMTT liuosta (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 2 tunnin ajan, ja absorbanssi rekisteröitiin mikrolevylukijalla 540 nm: ssä sen jälkeen, kun liukoiseksi vähentää MTT DMSO. Vaikutus delfiniidi kasvuun esto arvioitiin prosenttia solujen elinkykyä, jossa DMSO-käsitellyt solut otettiin 100% elinkelpoisia.

hoito Kateenkorvattomien nude-hiirten

neljä-viisi viikkoa vanha nainen kateenkorvattomissa ( nu /nu) nude-hiiriä hankittiin NCI-Frederick National Laboratory for Cancer Research ja sijoitettu alle patogeenivapaissa olosuhteissa, joissa on 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä aikataulussa Animal Resource Facility University of Alabama at Birmingham mukaisesti Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. Eläin protokollaa käytetään tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja University of Alabama at Birmingham, ja eläin protokolla numero on 120609365. Eläimet ruokittiin phytochemical dieetin AIN-76 SEMI PD (Test ruokavalio, Richmond, IN)

halun

. Hiiret injektoidaan subku- kiinteä määrä NCI-H441-soluissa (4×10

6 50 ui RPMI + 50 ui matrigeeliä) kussakin kylki aloittamista kasvaimen kasvua. Eläimet olivat sitten satunnaisesti kolmeen ryhmään, joissa oli 6 eläintä kussakin ryhmässä. Ensimmäisen ryhmän eläimet saivat i.p. injektio DMSO: ta (100 ui), ja se toimi verrokkina. Eläimiä ryhmien 2 ja 3 sai i.p. injektio delfiniidi (1 mg /eläin ja 2 mg /eläin vastaavasti) 100 ul: ssa DMSO: ta kolme kertaa /viikko. Kasvaimen koot mitattiin kahdesti viikossa, ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla ½ (

L

1 ×

L

2 x

H

) , jossa

L

1 on pitkä halkaisijaltaan,

L

2 on lyhyt halkaisija ja H on korkeus kasvain. Kaikki eläimet lopetettiin CO

2 hengitysteitse ja kuolema vahvistettiin niskanmurrolla kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden noin 1200 mm

3 kontrolliryhmässä. Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin sitten SK-MES-1-soluissa. Kaikki toimenpiteet suoritettiin olivat ohjeiden mukaisesti käyttöön ja hoitoon koe-eläinten ja hyväksynyt IACUC.

immunohistokemia ja immunofluoresenssivärjäyksen

viisi mikrometrin leikkeet leikattiin, parafiini ksyleenissä, niihin lisätään etanolia, ja pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Antigeenin haku, osat kuumennettiin 95 ° C: ssa 30 minuutin ajan sitraattipuskurissa (pH 6,0). Lyhyesti, leikkeitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin tietyn piparjuuriperoksidaasileimattua sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi leikkeitä inkuboitiin diaminobenzidene peroksidaasin substraattiliuosta 2 minuuttia ja vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä ratkaisu. Immunofluoresenssivärjäystä jälkeen antigeeni haku, leikkeitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin Alexafluor-488 leimatun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Objektilasit asentaa Vectashield kiinnitysväliaineet sisältäviä DAPI ja analysoitiin alla fluoresenssimikroskoopissa.

Tilastollinen

Tulokset ilmoitetaan keskiarvona ± SEM. Tilastollinen analyysi kaikki tiedot suoritettiin Studentin t-testiä.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

delfiniidi hoito estää konstitutiiviset ja EGF-indusoitu fosforylaatio EGFR in NCI-H441-solujen

Aberrant aktivointi ja yli-ilmentyminen EGFR johtaa häiriöstä signalointipolkujen ratkaisevaa solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, syövän etenemisessä, angiogeneesissä ja etäpesäkkeiden [21]. EGFR yli-ilmentävät NCI-H441-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM, 3 tuntia) määrittää sen vaikutus EGFR. Kuten kuviossa 1A on esitetty, delfiniidi hoito vähensi merkittävästi ilmentyminen ja fosforylaatio EGFR NCI-H441-soluissa. Lisäksi, yliekspressio sen ligandin EGF, joka aktivoi EGFR, on tärkeä rooli tuumorigeneesissä NSCLC [22]. Siksi määritti delfinidiini EGF-indusoitu fosforylaatio EGFR ja havaitsi, että sen käsittely esti merkittävästi EGF-indusoidun aktivaation ja fosforylaatio EGFR (kuvio 1A). Samanlainen vaikutus delfiniidi fosforylaation EGFR havaittiin myös SK-MES-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Tämä osoittaa, että delfiniidi hoito vähentää sekä konstitutiivista ja EGF-indusoitu fosforylaatio EGFR.

[A] NCI-H441-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM) 3 tuntia täydelliseen solujen väliaineessa (vasen paneeli) . Oikeanpuoleisessa paneelissa, seerumia NCI-H441-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM) 3 tuntia ja sitten inkuboitiin ilman tai EGF (50 ng /ml) 15 minuuttia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja solujen lysaatit valmistettiin ja ilmaisu EGFR ja fosforyloitu-EGFR määritettiin. [B] NCI-H441-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM) 3 tuntia täydellisessä solumediumissa (vasen paneeli). Oikeanpuoleisessa paneelissa, seerumia NCI-H441-soluja käsiteltiin delfiniidi (5-60 uM) 3 tuntia ja sitten inkuboitiin ilman tai VEGF (20 ng /ml) 30 minuutin ajan. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja solujen lysaatit valmistettiin ja ilmaisu VEGFR2 ja fosforyloituu VEGFR2 määritettiin. Equal lastaus proteiinin varmistettiin strippaamalla immunoblot ja reprobing sen β-aktiini. Immunoblot-kuvassa ovat edustavasta kokeesta toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

delfiniidi hoito estää konstitutiivinen ja VEGF: n indusoiman fosforylaation VEGFR2 in NCI-H441-solujen

Samanlainen EGFR yli-ilmentyminen ja poikkeava aktivaatio VEGFR2 on myös raportoitu useissa syöpäsolujen lukien NSCLC [23]. Kuten EGFR, VEGFR2 läpikäy dimerointi ja VEGFR ligandista riippuvan fosforylaation ja aktivaation tuloksena häiriöstä alavirran signalointia. Tämä laukaisee mitogeenisestä, kemotaktisia, ja pro-eloonjääntisignaaleja sekä stimulaatio kasvaimen aluksen muodostumisen [24]. Siksi olemme myös arvioineet vaikutusta delfiniidi (5-60 uM, 3 h) ekspressioon VEGFR2 in NCH-H441-solujen ja totesi, että sen käsittely vähensi ilmaus VEGFR2 NCI-H441-soluissa (kuvio 1 B). Lisäksi, delfiniidi hoito inhiboi VEGF- indusoidun aktivaation ja fosforylaation VEGFR2 (kuvio 1 B). Samanlainen vaikutus delfiniidi on fosforylaation VEGFR2 havaittiin myös SK-MES-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että delfiniidi hoito estää konstitutiiviset ja VEGF: n indusoiman fosforylaation VEGFR2.

delfiniidi hoito estää proteiinin ilmentymistä PI3K ja fosforylaation AKT ja MAPK in NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa

vastustuskyky EGFR: n estäjien liittyy aktivoituminen PI3K /AKT ja MAPK signalointireitteihin [25]. EGFR /PI3K /AKT /MAPK signalointi on keskeinen rooli kasvainten synnyssä, solujen lisääntymisen tehostuneen, angiogeneesin, ja apoptoosin erilaisissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien NSCLC [21,26]. Kun PI3K /AKT signalointi aktivoidaan EGFR, se fosforyloi useita alavirran kohde-keskeisissä solujen prosesseissa myös solujen jakautumista ja apoptoosia. Treatment of delfiniidi (5-60 uM, 48 h), johti vähentyneeseen ekspressioon p85 (a säätelyalayksikkö) ja p110α (katalyyttisen alayksikön) PI3K NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 2A). PI3K säätelee fosforylaatio ja aktivaatio AKT, joka edistää solujen eloonjäämistä estämällä toimintoja pro-apoptoottisten proteiinien ja edistää induktio solujen eloonjäämistä proteiinien [27]. Seurauksena PI3K inhibition delfiniidi, AKT-fosforylaation väheni merkittävästi sekä NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 2A).

[A] NCI-H441 ja SK-MES-1-soluja hoidettiin 5-60 uM delphindin 48 tuntia määrittää sen vaikutus proteiinien ilmentyminen PI3K, fosforylaatiota AKT ja MAPK. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, solujen lysaatit valmistettiin ja proteiinia tehtiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblot-analyysillä ja kemiluminesenssidetektiolla. Equal lastaus proteiinin varmistettiin strippaamalla immunoblot ja reprobing sen β-aktiini. Immunoblot-kuvassa ovat edustavasta kokeesta toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. [B] Solujen elinkelpoisuus A549, NCI-H441, SK-MES-1 ja NHBE soluja käsiteltiin 5-100 uM delfiniidi 48 tuntia, määritettiin MTT-analyysi, kuten kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät”. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta eri kokeesta, jossa jokainen käsittely toistettiin 10 kuoppiin. [C] NCI-H441 ja SK-MES-1-soluja käsiteltiin 5-60 uM delphindin 48 tuntia määrittää sen vaikutus proteiinien ilmentymisen PCNA ja cyclinD1. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, solujen lysaatit valmistettiin ja proteiinia tehtiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblot-analyysillä ja kemiluminesenssidetektiolla. Equal lastaus proteiinin varmistettiin strippaamalla immunoblot ja reprobing sen β-aktiini. Immunoblottauksia kuvassa on edustavasta kokeesta toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

MAPK reitti on toinen signalointiryöpyn joka aktivoituu EGFR ja tärkeä rooli säätelyssä monia soluvasteita lukien soluproliferaatiota ja apoptoosin [28]. MAPK perhe koostuu kolmesta suureen alaryhmään: ERK (ekstrasellulaarisen signaalin säännelty proteiinikinaasi), JNK (c-Jun N-terminaalisen kinaasin) ja p38 MAPK [29]. ERK: t ovat pääosin mukana sääntelyssä mitogeeniaktivoidut lisääntymistä /erilaistumisen tekijöitä, kun taas JNK ja p38 MAPK suorittavat liittyviä toimintoja apoptoottisen solukuoleman [30]. Siksi olemme myös arvioineet vaikutusta delfiniidi on MAPK signalointia NSCLC soluissa. Olemme havainneet, että delfiniidi hoito vähensi merkittävästi fosforylaation ERK1 /2, JNK1 /2: n ja p38 sekä NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 2A).

delfiniidi hoito inhiboi kasvua NSCLC-solujen

Koska yli-ilmentymisen ja poikkeava aktivointi EGFR ja sen alavirran signalointireitteihin estyy delfiniidi, tutkimme seuraavaksi sen vaikutus solujen lisääntymisen NSCLC-solujen käyttämällä MTT-määritys. NSCLC A549, NCI-H441 ja SK-MES-1-solut yli-ilmentävät EGFR ja VEGFR2 käsiteltiin delfiniidi (5-100 uM; 48 tuntia). Tulokset MTT-määritystä osoitti, että delfiniidi oli tehokas merkittävästi vähentää solujen kasvua A549 (4-70%; p 0,05-0,01), NCI-H441 (6-59%; p 0,05-0,01) ja SK-MES- 1-solut (9-73%; p ,05-,01) (kuvio 2B). IC

50-arvot delfiniidi arvioitiin olevan 55, 58 ja 44 uM A549, NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa. Olemme myös tutkinut, mitä vaikutuksia delfiniidi kasvuun normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelin (NHBE) solut samanlaisissa olosuhteissa ja totesi, että näillä annoksilla on vain marginaalinen vaikutus näiden solujen kasvua (kuvio 2B).

delfiniidi hoito inhiboi proteiinin ilmentymistä sykliini D1 ja PCNA in NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa

signalointireitteihin mukana aktivointi MAPK myös aktivoida useita tumaproteiinit, joka on ratkaiseva merkitys solusyklin etenemisen G1 S vaiheeseen. Tarkemmin, sykliini D1 on määritelty keskeiseksi alavirtavaikuttajainhibiittorit EGFR signaloinnin resistenttien NSCLC soluissa. Lisäksi EGFR mutantti NSCLC-solut on suurempi ekspressio sykliini D1 [31]. Hoito NCI-H441 ja SK-MES-1 NSCLC-solujen delfiniidi (5-60 uM; 48 tuntia) johti merkittävään vähentämiseen sykliini D1-proteiinin ilmentymistä annosriippuvaisesti (kuvio 2C). PCNA on tunnettu merkkiaine solujen lisääntymiseen aktiivisen aikana S ja G2 vaiheiden solusyklin ja sillä on tärkeä rooli aloittamisesta soluproliferaation [32]. Lisääntynyt ilmentyminen PCNA syöpäpotilailla on liittynyt huono eloonjäämisaste. Lisäksi, EGFR toimii myös transkriptiotekijän ja parantaa solujen lisääntymisen aktivoimalla ja vakauttaa PCNA [33]. Siksi tutkittiin, mikä vaikutus delphindin on PCNA ilmaisua ja todennut, että se vähensi PCNA proteiinin ilmentymistä sekä NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 2C).

delfiniidi käsittely moduloi Bcl2 perheen proteiinin ilmentymistä ja indusoi pilkkominen kaspaasien ja PARP NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa

aktivoituminen PI3K /AKT ja MAPK signalointi EGFR johtaa solujen lisääntymisen tehostuneen ja angiogeneesin, sekä estämällä apoptoosin. Hoito EGFR yli-ilmentävät NSCLC-solujen delfiniidi johti merkittävään eston PI3K /AKT ja MAPK signalointireitteihin. Olemme ensi tutkinut, mitä vaikutuksia delfiniidi on Bcl2 proteiinit alavirtaan PI3K /AKT. Hoito NCI-H441 ja SK-MES-1-solut, joissa delfiniidi vähentää huomattavasti ekspressiota anti-apoptoottiset proteiinit, kuten Bcl2, Bcl-x L ja Mcl-1 (kuvio 3A). Lisäksi olemme havainneet, että ilmaus proapoptootti- proteiinien Bak ja Bax lisääntyi merkitsevästi delfinidiini käsitellään NCI-H441 ja SK-MES-1-soluissa (kuvio 3A). Apoptoosi on erittäin säännelty prosessi, johon kaskadin tapahtumia, kuten proteolyyttinen aktivaatio kaspaasien. Sisällä apoptoottinen prosessi caspases voi toimia joko alullepanijoista tai pyöveleitä. Pyöveli caspases aktivoituvat niiden pro-entsymaattinen muoto saa aikaan muiden kaspaasien sisällä kaskadiin reaktion. Kun se on aktivoitu, kaspaasit katkaisevat erilaisia ​​solunsisäisiä proteiineja, kuten PARP ja eri proteiinikinaasien [34]. Siksi tutkimme seuraavaksi, onko delfiniidi hoidon (5-60 uM, 48 h) aiheutti kaspaasien aktivaatio tai pilkkomisen PARP, jotka molemmat ovat apoptoosin tuntomerkkejä. Olemme havainneet, että delfiniidi käsittely johti kaspaasi-9, kaspaasi-3, ja sen seurauksena pilkkominen PARP sekä NCI-H441 ja SK-MES-1cells (kuvio 3B).

[A B] NCI-H441 ja SK-MES-1-soluja käsiteltiin 5-60 uM delphindin 48 tuntia määrittää sen vaikutus ilmentymisen Bcl2 perheen proteiinien ja lohkaisu kaspaasien ja PARP. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, solujen lysaatit valmistettiin ja proteiinia tehtiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblot-analyysillä ja kemiluminesenssidetektiolla. Equal lastaus proteiinin varmistettiin strippaamalla immunoblot ja reprobing sen β-aktiini. Immunoblottauksia kuvassa on edustavasta kokeesta toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

delfiniidi hoito estää kasvainten muodostumiseen ihmisen NSCLC-solujen istutettu atyymisissä paljaisiin hiiriin

Koska delfiniidi vähentää tehokkaasti solujen kasvua ja indusoi apoptoosin NSCLC-solujen

in vitro

, me seuraavaksi määritellään vaikutuksia delfiniidi koskevasta

in vivo

ksenografti- hiirimallissa istutettu NCI-H441 tai SK-MES-1cells. Kateenkorvattomissa nude-hiirissä istutettiin EGFR ja VEGFR2 yli-ilmentävät NSCLC-soluja, delfiniidi hoito johti merkittävään kasvaimen kasvun inhibitiota. Delfiniidi käsitellyt hiiret istutettu NCI-H441-solut osoittivat merkittävää kasvaimen kasvun esto (p 0,05-0,001) mukaan 27,92 ja 45,37% annoksella 1 ja 2 mg /eläin vastaavasti verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään (kuvio 4A). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus kontrolliryhmästä oli 1268,62 mm

3, kun taas delphindin käsiteltyjen ryhmien keskimääräinen kasvainten oli 914,38 mm

3 ja 693,01 mm

3 hiirillä, jotka saivat 1 ja 2 mg /eläin delfiniidi (kuvio 4A). Lisäksi delfiniidi käsittely johti myös merkittävästi kasvaimen kasvun estäminen kateenkorvattomissa nude-hiirissä istutettu SK-MES-1-soluissa. Hoito delfiniidi (1 ja 2 mg /eläin) johti 26.34 ja 46.01% kasvaimen kasvun esto verrattuna kontrollihiiriin. Nämä löydökset olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,05-0,001). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus delfiniidi hoidetuissa ryhmissä väheni merkitsevästi (913,42 mm

3 ja 671,18 mm

3) verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään (1241,18 mm

3) (kuvio 4B).

[A] Kahdeksantoista atyymisissä (

nu /nu

) female nude-hiiriin injektoidaan subku- 4×10

6 NCI-H441-solujen (50 ui RPMI + 50 ui Matrigel) kussakin kylkeen hiiren aloittaa kasvaimen kasvua ja sen jälkeen jaettiin sattumanvaraisesti kolmeen ryhmään (kuusi hiirtä kussakin). Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun solujen implantointia, hiiret ensimmäinen ryhmä sai i.p. injektio DMSO: ta (100 ui) ja toimi kontrollina. Hiiret ryhmien 2 ja 3 saivat i.p. injektio delfiniidi 1 mg /eläin ja 2 mg /eläin vastaavasti 100 ui DMSO kolme kertaa /viikko. [B] Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin SK-MES-1-soluissa. Kun kasvaimet alkoivat kasvaa, niiden koot mitattiin ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla ½ (

L

1 ×

L

2 x

H

), jossa

L

1 on pitkä halkaisijaltaan,

L

2 on lyhyt halkaisija, ja

H

on korkeus kasvain . Kaikki eläimet tapettiin, kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 1200 mm

3 kontrolliryhmässä. Keskimääräinen kasvaimen tilavuutta ohjaus- ja delphindin käsitellyissä ryhmissä piirrettiin ajan kuluessa sen jälkeen, kun kasvainsoluinokulaation. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001 verrattuna kontrolliryhmään.

delfiniidi hoito estää merkkiaineita proliferaatiota ja indusoi apoptoosia kasvaimia Kateenkorvattomien nude-hiirten istutettiin NSCLC-solujen

Seuraavaksi tutkimme molekyylien ekspressiota liittyy solujen lisääntymistä ja apoptoosin tuumoriksenografteissa käyttämällä immunohistokemiallisesti. Kuten kuvassa 5, tulokset histokemiallinen analyysin tuumorisektioiden osoitti, että oli merkittävä lasku määrän ja intensiteetin soluproliferaation markkereita, kuten Ki67 ja PCNA in delfiniidi käsitelty kasvaimissa verrattuna niiden hoitamatta kontrolliryhmiin. Lisäksi, kun nämä kasvaimet arvioitiin värjäämällä aktiivista kaspaasi-3: tunnusmerkki apoptoosin, olemme havainneet, että oli merkittävä lisääntyminen ja intensiteetti aktiivinen kaspaasi-3 värjäytymistä kasvainten delfiniidi käsiteltyjen hiirten (kuvio 5A ja 5B).

Kateenkorvattomia nude-hiiriin istutettiin [A] NCI-H441, ja [B] SK-MES-1-soluissa. Hiiriä käsiteltiin delfiniidi, kasvaimen kudokset kerättiin 10% formaliinia ja lohkot valmistettiin parafiiniin ja immunovärjäyksen Ki67, PCNA ja halkaistut kaspaasi-3 suoritettiin kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Valomikroskooppikuvat osoittavat edustaja kuvia kolmesta itsenäisestä kasvainnäytteestä. Bar = 20 um.

delfiniidi hoito estää markkereita angiogeneesin kasvaimissa Kateenkorvattomien nude-hiirten istutettiin NSCLC-solujen

Kiinteä kasvaimet rekrytoida uusia verisuonia kasvuun, ylläpitoon, ja etäpesäkkeitä. Näin ollen, käyttämällä aineita, jotka tukahduttaa kasvaimen aiheuttama uusien verisuonten pidetään tärkeä strategia syövän hoitoon. Siksi monet nykyiset kliiniset hoitomuodot kohdistaa endoteelikasvutekijä (VEGF) ja CD31. Kasvaimen osat värjättiin anti-VEGF ja anti-CD31-vasta-aineita oli vähentynyt värjäytymisen intensiteetti on delfiniidi käsitellyissä ryhmissä. Tämä tutkimus osoitti selvästi, että delfiniidi hoito vähensi merkittävästi VEGF: n ilmentymistä ja CD31 verrattuna kasvaimen osien verrokkihiirten (kuvio 6A ja 6B).

Kateenkorvattomia nude-hiiriin istutettiin [A] NCI-H441, ja [ ,,,0],B] SK-MES-1-soluissa. Hiiriä käsiteltiin delfiniidi, kasvaimen kudokset kerättiin 10% formaliinia ja lohkot valmistettiin parafiiniin ja immunofluoresenssi CD31 ja immunohistokemia VEGF suoritettiin kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Valomikroskooppikuvat osoittavat edustaja kuvia kolmesta itsenäisestä kasvainnäytteestä. Bar = 20 um.

Keskustelu

on ollut hyvää vauhtia purkautuu mysteereistä syövän genetiikan ja biologian; mutta tärkein tehtävä on siirtää nämä löydöt uusiksi hoitomuotoja, jotka parantavat hoitotuloksia. Kohdennettu hoitomuodot ovat tulevaisuuden syövän hoitoon ja kehittää uusia terapeuttisia estäjiä signaalitransduktion molekyylien, erityisesti RTK, on ​​painopiste laajan tutkimuksen. Yliekspressio ja poikkeava aktivaatio RTK kuten EGFR ja VEGFR2 liittyvät korkeaan leviämisen hinnat, vähennetään apoptoosin, lisääntynyt angiogeneesi ja metastaasi [35]. Ne esitetään siis houkutteleva kohde lääkekehityksen vastaan ​​NSCLC [36,37].