Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solun morfologia määrää solun käyttäytymistä, signaalitransduktion, proteiini-proteiini vuorovaikutus ja vastata ulkoisiin ärsykkeisiin. Syövän, nämä toiminnot syvästi vaikuttaa resistenssin mekanismeja radio- ja kemoterapia. Mitä tulee tämän näkökohdan, tämä tutkimuksessa verrattiin genomin laaja-geenin ilmentyminen eksponentiaalisesti kasvavissa solulinjoissa eri kasvain yhteisöjä, keuhkosyövän ja okasolusyöpä, alle useamman fysiologisen kolmiulotteisia (3D) versus yksikerroksista soluviljelmässä olosuhteissa. Koko genomin cDNA mikrosiruanalyysi toteutettiin käyttäen Affymetrix HG U133 Plus 2.0 geeni siru. Merkitys analyysi microarray (SAM) ja t-testi-analyysi osoitti merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen 3D suhteen 2D-soluviljelmässä olosuhteissa. Nämä muutokset vaikuttivat soluväliaineen ja pääasiassa liittyy biologisiin prosesseihin, kuten kudoksen kehittäminen, soluadheesiota, immuunijärjestelmää ja puolustus vaste toisin liittyviä termejä DNA korjaukseen, josta puuttui merkittäviä muutoksia. Valitut geenit varmistettiin semikvantitatiivinen RT-PCR ja Western blottauksella. Lisäksi osoitamme, että 3D kasvua välittää merkittävä kasvu kasvainsolun radio- ja chemoresistance suhteessa 2D. Meidän tulokset osoittavat huomattavia geeniekspression eroja 3D ja 2D soluviljelmäjärjestelmiä ja osoittavat, että solujen vastata ulkoisiin stressistä kuten ionisoivan säteilyn ja kemoterapia-vaikuttaa oleellisesti erilainen ekspressio liittyvien geenien säätelyyn integriinin signalointia, solu muoto ja solu-solu yhteystiedot.

Citation: Zschenker O, Streichert T, Hehlgans S, Cordes N (2012) Genome-Wide geeniekspressioanalyysissä syöpäsoluissa paljastaa 3D kasvu vaikuttaa ECM ja prosessit Associated kanssa Cell Adhesion mutta ei DNA Repair. PLoS ONE 7 (4): e34279. doi: 10,1371 /journal.pone.0034279

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2010 Hyväksytty: 27 helmikuu 2012; Julkaistu: 11 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Zschenker et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus ja kirjoittajat olivat osittain tukee avustusta liittovaltion opetus- ja tutkimusministeriö, Saksa (BMBF Sopimus 03ZIK041 NC) sekä EFRE (Euroopan aluekehitysrahasto) Europäische Fonds für regionale Entwicklung, Europa fördert Sachsen (100066308). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mikroympäristölle on keskeinen säätelijä solujen käyttäytymisen [1], [2], [3]. Suuri elin työ on osoittanut, kuinka vuorovaikutuksia solujen kanssa soluväliaineen (ECM), yhtenä tärkeimmistä elementeistä mikroympäristön, edistää sääntelyn kriittisten solun toimintoja, kuten solun muodon /arkkitehtuuri, selviytyminen, lisääntymistä ja erilaistumista [2], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Cell-ECM vuorovaikutuksia myös ohjata geenien ilmentymistä ja chromatin organisaation kasvua ja ECM-riippuvaisella tavalla [10], [11]. Viimeaikaiset syntymässä havainnot osoittavat, että erityisesti kasvuolosuhteet on keskeinen rooli solujen vastata ulkoisiin ärsykkeisiin. Tämä kävi ilmi kolmiulotteisessa (3D) ex vivo soluviljelmissä kasvatettu ECM ja sferoidiviljelmiä malleissa [4], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17]. Mikä tärkeintä, nämä 3D soluviljelymalleissa paremmin jäljittelevät fysiologisia mikroympäristön kuin perinteiset päällystämättömiä tai ECM-esipäällystetty soluviljelmässä muovi [15], [18].

Sen lisäksi, että käyttö 3D soluviljelymalleissa kudosteknologian [ ,,,0],19], [20], [21] ja tutkimukset sikiön kehityksen ja fysiologian [18], 3D-soluviljelmiä liikkuvat yhä useammin myös syöpätutkimuksessa [7], [8], [9], [12], [16], [22]. Suurimmassa osassa tapauksia, kasvainsolulinjojen eri alkuperää osoittavat parannettu kestävyys radio- ja kemoterapian 3D-ympäristössä alustava lisääntynyt kyky muodostaa klooneja ja vähentynyttä apoptoosia [12], [13], [14], [16], [ ,,,0],17], [23], [24], [25], [26], [27]. Sen lisäksi merkittävä vaikutus integriinin välittämä solujen ECM vuorovaikutuksia [28], monimutkainen vuorovaikutus biokemiallisten signalointireittien ja biofysikaalisten /mechanotransduction liittyvien tekijöiden ajatellaan antavan tehostetun kasvainsolujen vastustuskyky joiden taustalla olevien mekanismien jäävät vielä sekä sen geeni ja proteiinin taso [2].

osalta geeniekspressiota, suuri on pyritty tunnistamaan tiettyjä diagnostisia, prognostisia ja terapia-seurata geenien ilmentymistä malleja koepaloja eri ihmisen maligniteettien [2], [5], [6], [29], [30], [31]. Kiehtovan, jotkut näistä tutkimuksista osoittivat vahvaa päällekkäisyyksiä in vivo ja 3D, mutta ei 2D soluviljelmässä aineistoja, mikä lopulta mahdollisti tunnistamisen geenin allekirjoitusten ennustavan eloonjäämisaste syöpäpotilailla. On vielä selvitettävä, onko muutoksia geenien ilmentymistä 3D vs. 2D kasvuolosuhteet voi selittää tai antaa vihjeitä tiettyinä stressin tai DNA: n korjautumista reittejä mukana tehostetun radio- tai chemoresistance 3D kasvanut syöpäsoluja. Jos näin on, kohdennettuja hoitomenetelmät vastaan ​​avain kasvainjouduttimet voitaisiin optimoida.

Tämän kysymyksen osoittamiseksi, tässä tutkimuksessa verrattiin pohjapinta geeniekspression kahden ihmisen syöpäsolujen linjat eri alkuperää ja vaihtelevilla geneettinen tausta 3D ECM rakennusteline tai tavanomaisissa 2D yksikerroksista olosuhteet ovat niiden käyttäytymistä, kun säteilyn ja kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, viljelyolosuhteet ja solun kaksinkertaistumisaikaa

keuhkotuumorisolulinjoissa A549 saatiin ATCC (Manassas, USA). Okasolusyöpä solulinjassa UT-SCC15 oli ystävällinen lahja R. Grenman (TYKS, Suomi). Perinteisen 2D-soluviljelmässä, soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM; PAA, Cölbe, Saksa), joka sisälsi Glutamax-I (L-alanyyli-L-glutamiini), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, PAA) ja 1 % ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, PAA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 7% CO

2. 3D-soluviljelmässä, solut maljattiin seoksesta, 0,5 mg /ml laminiinia-rikas soluväliaineen (Matrigel, BD, Heidelberg, Saksa) ja täydellistä DMEM-alustassa, kun kerros agaroosia (Sigma, Taufkirchen, Saksa) on 24- hyvin Soluviljelymaljassa (BD), kuten on julkaistu [12], [13], [14], [16].

kaksinkertaistaminen ajan kasvavien solujen yksittäiskerroksina soluviljelmässä pulloissa laskettiin standardimenetelmien mukaisesti. Lyhyesti, yksi solua maljattiin 2D- tai 3D-ja trypsinoitiin ja siirrettiin 10 ml: aan alustaa, joka sisälsi FCS: ää. Sen jälkeen kun varovasti sekoittamalla väliaineessa, 10 ui solu pipetoitiin Neubauer laskenta kammio käyttämällä sopivaa laimennusta. Solut 4 ruutua laskettiin mikroskoopilla (Zeiss, Jena, Saksa) ja solujen lukumäärä laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Soluille kasvavat 3D Matrigel ympäristö, soluja eristettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23], [33] käyttämällä Neubauer laskenta kammio.

3D ja 2D pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksissä

klonogeeninen eloonjääminen alle 3D olosuhteissa testattiin aiemmin julkaistu [15], [16], [17], [34]. Lyhyesti, yksi solua maljattiin 0,5 mg /ml matrigeeliin, johon oli lisätty DMEM /10% FCS /1% NEAA: ta. 24 tunnin kuluttua, yksi solut säteilytettiin (0-6 Gy) tai käsitelty lisäämällä Sisplatiini pitoisuuksilla (0,1, 1, 5, 10 uM, 24 h, Neocorp). Sisplatiini poistettiin 3- (2D) tai 15-kertainen (3D) pesu DMEM /10% FCS /1% NEAA. Sitten solujen annettiin kasvaa pesäkkeiden /soluklusterien. Klo 8 (A549) tai 11 päivää (UT-SCC15) jälkeen pinnoitus, kasvatettu pesäkettä /soluklusterien ( 50 solua) mikroskooppisesti laskettiin. 2D solujen eloonjäänti toteutettiin julkaistu [23]. Sen jälkeen kun 8 päivää (A549) tai 11 päivää (UT-SCC15), solut värjättiin Coomassie-sinisellä (Merck, Darmstadt, Saksa) ja pesäkkeet ( 50 solua) laskettiin. Pinnoitus tehokkuus laskettiin seuraavasti: numerot muodostuneiden pesäkkeiden /solumäärien päällystetty. Elossa fraktiot lasketaan seuraavasti: numerot muodostuneiden pesäkkeiden /(solujen lukumäärä päällystetty (säteilytetty /sisplatiini) × pinnoitus tehokkuus (säteilyttämätön /käsittelemätön)). Jokainen piste eloonjäämiskäyristä edustaa keskiarvoa eloonjääntifraktio kolmesta itsenäisestä kokeesta.

säteilyttää soluviljelmissä

Säteilytys toimitettiin huoneenlämpötilassa käyttämällä kerta-annoksina (0-6 Gy) 200 kV X säteitä (YXLON Y.TU 320; YXLON, Kööpenhamina, Tanska) suodatettu 0,5 mm kuparia. Annos-nopeus oli noin 1,3 Gy /min 20 mA. Absorboitunut annos arvioitiin käyttäen Duplex annosmittarin (PTW, Freiburg, Saksa).

cDNA microarray

geeniekspressioprofiili mitattiin RNA uutetaan 5 x 10

6 solua kasvatettiin 3D- tai 2D-. Kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä NucleoSpin RNA II mukainen kitti valmistajan ohjeiden (Macherey-Nagel, Düren, Saksa). Menetelmät cDNA-synteesi, merkintöjä ja hybridisaatio suoritettiin valmistajan protokollan (Affymetrix) ja julkaistun [35]. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen Affymetrix ihmisen perimän geenilastuun HG U133 Plus 2.0. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi 90 ng kokonais-RNA, synteesi biotiinilla leimatun cRNA ja puhdistaa suoritettiin käyttäen 3 ’IVT Express Kit (Affymetrix). Hybridisaatiota varten 15 ug hajanainen cRNA inkuboitiin siru 200 ui hybridisaatio- liuosta Hybridization Oven 640 (Affymetrix) 45 ° C: ssa 16 tunnin ajan. GeneChips pestiin sitten ja värjättiin Affymetrix Fluidics Station 450 mukaan GeneChip- Expression Wash, Stain ja Scan Manual käyttäen GeneChip- hybridisaatio, pesu ja Stain Kit (Affymetrix). Mikrosiruja skannattiin Affymetrix GeneChip- Scanner 7G, ja signaalit käsiteltiin käyttäen GCOS (V.1.4, Affymetrix). Verrata näytteitä ja kokeissa RMA-algoritmia käytettiin (Expression Console, v.1.1), lisäanalyysi suoritettiin TIGR MeV (v.4.6.2). Kolme rinnakkaista käytettiin mikrosiruanalyysi ja tilastot. Sillä SAM-analyysi, Signal Log suhde 0,8 (-0,8) käytettiin kynnys, joka on yhtä suuri kuin kertainen muutos 1,6 ja -1,6, vastaavasti. Geenien ilmentyminen tiedot ovat saatavilla osoitteessa GEO tulonumerolla GSE17347. Geenien lista, toiminnallinen rikastamiseen käytimme ToppGeneSuite [36]. Väylät ja muut toiminnalliset ryhmittymiä geenejä tutkittiin ero sääntelyn avulla Visualisointityökalun GenMAPP (Ver. 2.1) kuten aiemmin on kuvattu [37].

SAM edellyttää tuloon ”delta” arvo. ”Delta” arvo määrittelee kynnyksen määrä vääriä positiivisia geenien validoitu aineisto. Tunnistaa luettelo mahdollisesti merkittäviä geenejä, laskimme väärä löytö määrä (FDR). Arvioitu FDR (mediaani määrä valheellisesti merkittäviä geenejä) kunkin annetun ”delta” ( ”delta” arvo) määritettiin standardin Tusher et al. [38].

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR

validointi microarray data PCR, kokonais-RNA eristettiin geeniekspressioprofilointi käytettiin. cDNA valmistettiin SuperScript ™ III käänteiskopioijaentsyymi- kit mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Karslruhe, Saksa). Lyhyesti, cDNA syntetisoitiin 20 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 1 ug DNaasi-käsiteltyjen kokonais-RNA, 1 ui oligo (dt)

20 (50 uM) ja 1 ui 10 mM dNTP Mix, 4 ui 5 x ensimmäisen juosteen puskuria, 1 ui 0,1 M DTT: tä, 1 ui RNaasia OUT, ja 1 ui SuperScript III (200 U /ul). RNA: ta, dNTP: t ja oligo (dt) aluke sekoitettiin ensin, kuumennettiin 65 ° C: ssa 5 minuuttia, ja asetettiin jäihin, kunnes lisäksi jäljellä reaktion komponentit. Sitten reaktioseosta inkuboitiin 55 ° C: ssa 45 minuuttia ja pysäytettiin kuumainaktivoimista 70 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Samanlainen reaktio ilman käänteistranskriptaasia suoritettiin sen varmistamiseksi, ilman genomista DNA: ta. Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin geenien TXNIP, DUSP6, CEACAM1, NPC1 ja BCL2A1 käyttäen alukkeita taulukossa 1 (Eurofinsille MWG Operon, Ebersberg, Saksa), 2 ui cDNA: n ja Hotstar Taq-polymeraasia (Qiagen, Hilden, Saksa ) standardin PCR. Forward-alukkeet kaikkien geenien valittiin etsimällä alkuperäinen oligonukleotidisekvenssistä vastaavan geenin tunnistenumero Affymetrix geenin siru Affymetrix verkkosivuilla (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). Käänteinen alukkeet suunniteltiin perustuen geenisekvenssiin, joka on järjestetty Affymetrix www-sivulla. Hehkutus lämpötila oli 50 ° C käytettiin TXNIP, DUSP6 ja BCL2A1 tai 55 ° C: ssa CEACAM1 ja NPC1. Normalisointia, joka on β-aktiini-fragmentti 540 bp monistettiin samanaikaisesti käyttämällä alukkeita luetellaan taulukossa 1 [39]. Tulokset kolmen erillisen kokeen analysoitiin käyttämällä 1% agaroosia (Carl Roth, Karlsruhe, Saksa) geelit ja densitometrinen analyysi Image J® ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, USA) värjäyksen jälkeen geelit etidiumbromidilla (Carl Roth).

Yhteensä proteiinin tiivisteet ja Western-blottaus

Yhteensä uutteissa 4 päivän 3D ja 2D-soluviljelmiä eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla [13]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin muutettu RIPA-puskurilla (50 mM Tris-HCI (Carl Roth), pH = 7,4), 1% Nonidet-P40 (Sigma), 0,25% natriumdeoksikolaattia (AppliChem, Darmstadt, Saksa), 150 mM NaCl: a (VWR International, Darmstadt, Saksa), 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (Merck), täydelliset proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Mannheim, Saksa), 1 mM NAvó

4 (AppliChem), 2 mM NaF (AppliChem)). Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Kokonaisproteiinin määrä mitattiin käyttäen bikinkoniini- hapon määritystä (Pierce, Bonn, Saksa). Jälkeen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja proteiinien siirto nitroselluloosakalvoille (Schleicher Schüll, Dassel, Saksa), proteiinit havaittiin seuraavilla vasta-aineilla: anti-fibronektiinin (BD, Heidelberg, Saksa), anti-CTGF, anti- ErbB3 (Santa Cruz, Heidelberg, Saksa), anti-BCL2A1 (elinikä Biosciences, Seattle, USA) ja anti-β-aktiini (Sigma); piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla aasin anti-kani, aasin anti-vuohen ja lampaan anti-hiiri (Amersham, Freiburg, Saksa) sekundäärisiä vasta-aineita. SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, Bonn, Saksa) ja Amersham Hyperfilm ECL (GE, Munich, Saksa) käytettiin havaitsemiseen. Densitometria suoritettiin käyttäen Image J® ohjelmistoa. Kolmen erillisen kokeen ole tehty.

Tulokset

3D ja 2D solujen kasvua ominaisuudet ja solujen selviytymisen jälkeen sädehoidon tai kemoterapian

Solun muoto ja morfologia olivat erilaiset 3D- ja 2D solujen kasvun olosuhteissa (Fig. 1A). Neljä päivää sen jälkeen, kun pinnoitus, solut eksponentiaalisesti kasvava samanlaisia ​​kaksinkertaistamista kertaa (Fig. 1 B). Tämä samankaltaisuus solussa kaksinkertaistaa aikoina edellyttäen vertailukelpoisia koeolosuhteissa koko genomin geenien ilmentymisen analyysi. Tärkeää on, edellinen kokeissa arvioidaan säteilyn selviytymisen A549 ja UT-SCC15 solut toistettiin muodostaen perustelut esitetyn tutkimuksen linkki kasvun riippuvan radio- ja chemoresistance kasvua riippuvan geeniekspression muutoksia [11]. Under 3D olosuhteissa, molemmat solulinjat osoittivat merkittävästi korkeampia klonogeeniset eloonjääminen altistettaessa yhä kerta-annosta Röntgensäteiden tai kasvavia pitoisuuksia sisplatiinia verrattuna 2D (Fig. 1 C ja D). Nämä tiedot viittaavat siihen yhteyden kasvuolosuhteet ja solujen morfologia ja solujen radio- ja chemoresistance.

(A) edustaja kuvia ja kaavamaisen 2D (

i

,

iii

) ja 3D (

ii, iv

) solujen kasvua osoitteessa päivä 4 välittömästi ennen RNA: n eristämistä. Bars, 50 pm. (B) Kahdentumisajat 2D ja 3D-soluviljelmissä päivänä 4 jälkeen pinnoituksen. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± SD (n = 3). N. S., ei ole merkittävä. Klonogeenisten selviytymisen 2D- tai 3D-kasvaneet solut altistettiin kasvaville X-ray annoksia (2, 4 tai 6 Gy) (C) tai sisplatiinia pitoisuuksina (0,1, 1, 5, 10 uM) (D) käytetään 24 h maljaamisen jälkeen. Sisplatiini poistettiin 24 h 3- (2D) tai 15-kertainen (3D) pesu DMEM /10% FCS /1% NEAA. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± SD (n = 3, t-testi). * P 0,05; ** P 0,01. CDDP, Sisplatiini. Bar, 200 um.

Koko genomin geenin ilmentymisen analyysi A549 ja UT-SCC15 viljeltiin 3D- tai 2D-

genomin laajuinen geenin ilmentymisen analyysi suoritet- tiin käsittelemättömän olosuhteissa ja joiden tarkoituksena on tunnistaa spesifisen geenin ilmentyminen malleja yksittäisten geenien tai toiminnallisesti liittyvän geenin ryhmiä, jotka voidaan yhdistää kasvainsolujen radio- ja chemoresistance. Vuodesta geeni profilointi, hierarkkinen klusterointi ja tilastollisen analyysin avulla SAM, oli selvää, että kasvuolosuhteet vaikuttavat geeniekspressiomalleja (Fig. 2A ja B). Arvioitu vääriä löytö määrä (FDR) on 0 alas joukko ”delta” ( ”delta” = 2,873 A549; ”delta” = 2,445 in UTSCC15). Suurempi joukko geenejä differentiaalisesti ilmaistut A549 (376 selostukset) kuin UT-SCC15 (178 selostukset) soluja (Fig. 2A, taulukko 2, Taulukko S1 ja S2). 3D, A549 ja UT-SCC15 solut osoittivat enemmän geenejä säädellään ylöspäin kuin alaspäin säädelty verrattuna 2D (Fig. 2A ja B).

(A) Hierarkkinen klustereita geenien 2D- ja 3D-soluviljelmissä päivänä 4 jälkeen pinnoituksen. Punainen osoittaa geenit ilmaistaan ​​keskimääräistä; vihreä valo osoittaa geenit ilmaistaan ​​alle keskitason ja musta merkitsee keskimäärin ilmaisun jälkeen merkitys analyysi mikrosirujen (SAM). ”Positiivinen” tarkoittaa geenejä yläreguloituja 3D vs. 2D. ”Negatiivinen” osoittaa geenien vaimentua 3D vs. 2D. (B) Plot lukumäärän selostukset vastaan ​​signaalin log suhdeluvut 3D vs. 2D soluviljelmissä A549 ja UT-SCC15 soluissa. (C) Gene ontologia riippuva piirtämisen absoluuttisina lukuina ja prosentteina muutettu merkittävästi geenien 3D versus 2D soluviljelmissä mukaan SAM analyysiin.

mukaan SAM, A549-solut oli 242 selostukset ylös – ja 134 alassäädetty taas UT-SCC15 soluilla oli 125 selostukset ylä- ja 53 selostukset alassäädetty (Fig. 2A ja B, taulukko S1 ja S2). Kiehtovan, nämä kaksi eri solulinjoista osoitti päällekkäisyyttä solukomponenttien ja biologisia toimintoja vaikuttaa alle 3D kasvuolosuhteissa osalta geeni ontologian (Fig. 2C, taulukot S3 ja S4). UT-SCC15 soluja, yleensä, osoittivat vähemmän geenejä modifioida 3D kasvu verrattuna A549-solut (Fig. 2A, taulukko S2). From yksi-yhteen geenin ilmentymisen vertailu, kävi ilmi, että muutokset tapahtuvat eri geenien saman ryhmissä solukomponenttien tai biologisia toimintoja solulinjassa riippuvaisella tavalla. Päälle SAM, t-testi analyysi suoritettiin, jossa 856-geenejä säädellään ylöspäin ja 721 alassäädetty 3D A549 soluviljelmässä suhteessa 2D (huomata: SLR kynnys +/- 0,8). UT-SCC15 solut, 429-geenejä säädellään ylöspäin ja 277 alassäädetty 3D verrattuna 2D. Päällekkäisyys erilaisesti ilmaisi geenien kun SAM ja t-testiä varten 3D-to-2D vertailu osoitti 238 selostukset säädelty ja 128 selostukset säädellä vähentävästi A549-soluja ja 119 selostukset säädelty ja 52 selostukset säädellä vähentävästi UT- SCC15 soluja (taulukko S5 ja S6) .Nämä tulokset osoittavat, että liittyviä prosesseja soluadheesiota, biologinen tartunta, immuunijärjestelmän vasteita, puolustus vastauksia, kudosten kehitystä ja vastaus orgaanisen aineen pääasiassa säädellään ero geenien ilmentyminen, kun solut siirretään 2D 3D-matriisiin perustuva microenvironment. Ilman lausutaan ilmentyminen muuttuu liittyvien geenien DNA: n korjaukseen, se voidaan spekuloida, että radio- ja chemoresistance 3D kasvanut solujen tuloksia erityisesti, mutta tunnistamattomia, muutoksia solun arkkitehtuurin ja täten aiheuttama muutoksia solujen interactome kannalta signaalitransduktion ja proteiini -proteiini vuorovaikutusta.

Validation microarray tietojen PCR ja Western-blottaus

microarray tietojen validointi, valitut geenit ja proteiinit tutkittiin käyttäen semikvantitatiivinen RT-PCR (tioredoksiinista vuorovaikutuksessa proteiinin (TXNIP) , kahteen eri fosfataasi 6 (DUSP6) karsinoembryonaaliselle antigeeni liittyvä soluadheesiomolekyyli 1 (CEACAM1), Niemann-Pickin tauti, tyypin C1 (NPC1) ja BCL2 kaltainen proteiini A1 (BCL2A1)) ja Western blotting (fibronektiini (FN1), sidekudoksen kasvutekijä (CTGF), v-erb-b2 erythroblastic leukemia virus-onkogeenin homologi 3 (ErbB3) ja BCL2A1), vastaavasti.

signaalin log suhteet valitaan geenien 3D- tai 2D-soluviljelmissä näkyvät Kuva 3. TXNIP ja DUSP6 läsnä geenien yhä ilmaistu molemmissa solulinjoissa kun viljellään 3D suhteessa 2D (Fig. 3). CEACAM1 induktio ja NCP1 ja BCL2A1 tukahduttamisen havaittiin vain 3D A549 soluviljelmissä (Fig. 3). Semikvantitatiivinen RT-PCR RNA-näytteet, joita käytetään microarray-analyysi vahvisti, indusoi TXNIP ilmentymisen 3D, kun kasvanut DUSP6 ilmentyminen voi vain vahvistetaan UT-SCC15 solut (Fig. 4A ja B). Parannettu CEACAM1 mRNA-tasot olivat havaittavissa sekä 3D A549- ja 3D UT-SCC15 soluviljelmissä, joka oli vahvistava A549- ja raja varten UT-SCC15 solujen suhteen DNA-siru data (Fig. 4A ja B). Geenit NPC1 ja BCL2A1 osoitti alentuneita tai vakaata genomiin laaja analyysi A549- tai UT-SCC15 soluissa, vastaavasti; tulokset vahvisti täysin semikvantitatiivisella RT-PCR: llä (Fig. 4A ja B).

Expression geenien TXNIP1, DUSP6, CEACAM1, NPC1 ja BCL2A1 on rajattu suhteellisen 3D vs. 2D soluviljelmät A549 ja UT -SCC15 soluja.

(A) Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. On esitetty 1% agaroosigeeleillä RT-PCR fragmentteja TXNIP, DUSP6, CEACAM1, NPC1 ja BCL2A1 mRNA: t eristettiin A549 tai UT-SCC15 soluissa. Näytteet monistettiin cDNA tuotetaan käänteisen transkription kokonais-RNA: 4-päivän ikäisen 3D ja 2D-soluviljelmissä. Kaikissa kokeissa (V1, V2, V3) ovat esillä. p-aktiinin ilmaisu toimi latauskontrollina (540 emäsparia). (B) Kuvaajat näyttö tulokset densitometrisen analyysin näyttämän mRNA ilmaisun jälkeen normalisoinnin P-aktiini. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± SD (n = 3).

Seuraavaksi eri joukko geenejä (FN1, CTGF, ErbB3, BCL2A1) tarkistettiin proteiinin tason Western-blottauksella. Signaali log suhteet näiden geenien tuottamat DNA-siru olivat: FN1 = 1,6 /n.c. (A549 /UT-SCC15); CTGF = 1,2 /-3,8 (A549 /UT-SCC15); ErbB3 = 2,2 /n.c. (A549 /UT-SCC15); BCL2A1 = -3.8 /n.c. (A549 /UT-SCC15) (Fig. 5A, Taulukko S1 ja S2). 3D A549 soluviljelmissä, proteiinin ilmentymisen analyysi vahvisti DNA-siru-pohjainen säätely ylöspäin fibronektiinin, CTGF ja ErbB3 sekä alas-säätely BCL2A1 (Fig. 5B ja C). 3D UT-SCC 15 soluviljelmistä ei osoittanut mitään muutoksia tutkittujen proteiinien, mukaan lukien CTGF, joka osoitti vahvaa tukahduttaminen mukaan meidän microarray-analyysi (kuvio. 5B ja C). Useimmissa tapauksissa nämä tiedot osoittivat samanlaisia ​​tuloksia välillä koko genomin laajuinen geenin ilmentymisen analyysi käyttäen microarray-muodossa ja RT-PCR: llä tai Western-blottauksella.

(A) Signaalin log suhteet valitun geenin (FN1, CTGF, erbB3 ja BCL2A1 ) DNA microarray-analyysi suoritettiin Western blot-analyysi. (B) koko solulysaatit valmistettiin 3D ja 2D-soluviljelmissä päivänä 4 sen jälkeen, kun pinnoitus. SDS-PAGE ja Western blot -analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu kohdassa materiaalit ja menetelmät. Edustavia kuvat osoittavat ilmentymisen fibronektiinin (240 kDa), CTGF (38 kDa), ErbB3 (180 kDa) ja BCL2A1 (20 kDa). β-aktiini toimi latauskontrollina. (C) Densitomet- yksikköä proteiiniryhmänä esitetyn B kaavioidaan kun normalisoinnin P-aktiini.

Keskustelu

Menetys toiminnalliset ja fenotyyppisten ominaisuuksien ilmetä, kun soluja viljellään ex vivo 2D mikroympäristön [1], [4], [18], [20]. Tämä voidaan estää viljelemällä solut fysiologisessa 3D ECM tukirunkoja esitetty eri päätepisteissä kuten proteiinin ekspression, morfologia ja ennustaminen geenin allekirjoitusten kliininen tulos [2], [5], [6], [29], [30] . Kun otetaan huomioon nämä seikat, keskityimme mekanismeista moduloiva kasvainsolu herkkyyttä radio- ja kemoterapia. Vaikutusten arvioimiseksi perusinsuliiniannos geeniekspressioprofiilien on useamman fysiologisen 3D verrattuna keinotekoinen 2D soluviljelymalleissa, tämä tutkimus suoritettiin ihmisen epiteelin syöpäsolujen linjojen peräisin kahdesta yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti, eli keuhkojen (A549) sekä pään ja kaula okasolusyöpä (UT-SCC15) [40]. Valitaan eri solulinjasta malleja testataan laboratoriossamme, nämä kaksi syöpäsolun riviä vaihtelevat niiden alkuperä ja geneettinen tausta ja ovat hyviä esimerkkejä osoittavat prosurvival vaikutuksia kasvun 3D ECM Telineiden verrattuna tavanomaisesti käytetään kulttuuriin muovia [11], [ ,,,0],12], [13], [14]. Olemme osoittaneet merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen profiileja 3D vs. 2D soluviljelmissä. Kun taas geenien DNA: n korjaukseen polkuja jäi modifioimatonta, suurin osa muuttuneen geenien sekä solulinjat, jotka liittyvät biologisiin toimintoihin, kuten kudoksen kehittäminen, soluadheesiota ja puolustuksen vaste. Validointi microarray tietojen suoritettiin valittujen geenien mRNA ja proteiini tasolla.

3D-soluviljelmissä liikkuvat yhä useammin myös syöpätutkimuksessa sekä kudosteknologian, kehitys- ja solubiologian. Sillä hoitojen kehittäminen solu reagointikykyä on avainkysymys ja dramaattisesti erilainen 3D fysiologinen ympäristö verrattuna petrimaljaan olosuhteissa. Mitä klonogeeniset solujen selviytymistä altistumisen jälkeen röntgenkuvat tai laajasti sovellettu kemoterapeuttinen lääke sisplatiini, sekä A549 ja UT-SCC15 solut osoittavat lisääntynyt eloonjäämisluvut 3D suhteessa 2D. Koska nämä ovat vain kaksi esimerkkiä useasta [12], [13], [14], [15], [23], [24], paradigmoja ”soluadheesiota välittämä radioresistance” ja ”soluadheesiota välittämä lääkeresistenssi” pääasiassa tutkittiin tavanomaisissa ECM-pinnoitettu soluviljelymaljoille täytyy arvioida uudelleen ottaen vakavia muutoksia esim signaalitransduktion, DNA: n korjausprosessien jne huomioon solut kasvavat in 3D. Mikä tärkeintä, erot parametrit, kuten hypoksiaa, leviämisen ja säteilyannokseen, jotka ovat tunnettuja olennaisina tekijöitä solujen radioherkkyyttä voitaisiin jättää edellisessä syvällinen vertaileva analyysi välillä 3D- ja 2D-soluviljelyn olosuhteet [11]. Siten 3D ECM-pohjainen soluviljelymalli käytetään tässä kohtuullinen ja mahdollinen menetelmä tutkimusten kasvainsolun radio- ja kemosensitiivisyys ja taustalla olevien mekanismien.

Huolimatta tietoa vakava korjauksilla geeniekspressiomalleja erottamalla soluja kudosten ex vivo 2D soluviljelmissä [1], [41], [42], nämä havainnot ovat laajalti laiminlyöty. 2D, sekä joukko differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja geenien ilmentymisen tasoja solulinjoissa kasvaimen ja normaaleista kudoksista oli vähentynyt jopa 70%, ja oli vaihteluväli on noin 1,5-kertainen verrattuna peräisin kudoksiin, vastaavasti [43 ], [44]. Vertaamalla meidän mikrosiruanalyysi kanssa toisten työn, löysimme samanlainen geeniekspressioprofiilien. Esimerkiksi sekä A549 ja UT-SCC15 osoitti erottuva pohjapinta kaavoja koodaavien geenien proteiinien toimintojen modulaatio ECM kuten laminiinin, fibronektiinin, kollageenin, toteaminen samoin havaittu pohjapinta geeniekspressioanalyysiä 60 syöpäsolulinjoista ja niiden vastaava syöpä kudoksia ja tehty tutkimus melanooma [30], [42]. Nämä tulokset edelleen tukevat käsitystä, että 3D-soluviljelmissä ovat fysiologisia ja kudosten kaltaisia ​​kuin 2D. Huolimatta samanlainen kasvuvauhti testattuja ihmisen tuumorisolulinjoja, solujen erilaistumiseen liittyviä prosesseja muutoksia esim. ECM proteiinit voivat korostuneesti vaikutus reagointikykyä kasvainsolujen eri hoitomuotoihin.

asetettu etusijalle meille oli havainto, että 3D-soluviljelmissä erilaisesti ilmaista geenien mukana ”soluväliaineen” ja ”soluadheesiota” sekä puolustus vastaus ”mutta ei” DNA: n korjaukseen. Koska modulaatio liittyvien geenien säätelyyn solukoko ja tarttuvuus ei ole hämmästyttävää, kun solut siirretään Yksikerrosviljelmissä 3D-ympäristö, nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että ilmentymistaso erityisen liittyvien geenien DNA korjaukseen ei välttämättä liity toiminnallisesti havaitun solun käyttäytymistä. Meidän tapauksessamme, säteilytetty tai sisplatiini saaneista A549 ja UT-SCC15 osoitti suurempaa klonogeeniset selviytymisen alle 3D kasvuolosuhteissa verrattuna 2D; kuitenkin, vastaava lisäys ilmentymisen esim. DNA korjaavien geenien kuten PRKDC (proteiinikinaasi, DNA-aktivoitu, katalyyttinen polypeptidi), ATM (ataksia teleangiektasia mutatoidun) tai MDC1 (välittäjänä DNA-vaurioita tarkastuspiste 1) oli poissa. Lopullisesti ja toisin tutkia arvioimiseksi ennustaminen sädehoidon ja kemoterapian reagointikykyä, se voidaan arveltu, että merkittävä tekijä tässä parantunut eloonjääminen on todennäköisesti proteiinin interactome eikä transcriptome. Koskevien tietojen siirto penkki-to-sängyn terapiassa, on korostettava, että tuotetut tiedot Tuumorinäytteissä kanssa konservoituneiden fenotyyppejä, mukaan lukien geeniekspressioprofiilien, on todennäköisesti enemmän merkitystä kuin 2D-datan ja voidaan käyttää tunnistamaan olennaisen signalointi solmukohdat kohde terapia.

Yhteenvetona esitetyt tiedot osoittavat selvästi, että kasvuolosuhteet on merkittävä vaikutus geenien ilmentymisen. Koska 3D soluviljelmissä heijastavat fysiologisia kasvuolosuhteet ja antaa hoito vastustuskykyä syöpäsoluja, nämä havainnot viittaavat siihen, on transcriptome tasolla, solu muoto ja solu-solu kosketuksiin ovat kaksi tärkeimpiä tekijöitä solujen vastata ulkoisiin stressiä. Tämä käsite voidaan leviä realistisempi, suurempi monimutkaisuus, joissa rakenteelliset ja viestinnän muutoksia Proteome lisätä huomattavan vihjeitä säätelyyn solujen käyttäytymistä, erityisesti terapiassa vastarintaa. Jatkotutkimuksissa optimoidussa soluviljelymalleissa kuten 3D-ECM mallin perusteltua käsitellä transcriptomic ja proteomiikka mekanismeja kasvaimen solubiologian, syöpähoidon reagointikykyä ja arviointi uusien mahdollisten syövän kohteita.

tukeminen Information

Table S1.

geeniekspressioanalyysissä 3D versus 2D A549 soluviljelmissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034279.s001

(DOC) B Taulukko S2.

geeniekspressioanalyysissä 3D versus 2D UT-SCC15 soluviljelmissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034279.s002

(DOC) B Taulukko S3.

Gene ontologia Analysis, Cellular Component. Päällekkäisyys on merkitty kursiivilla /lihavoituna.