Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PDAC) liittyy lausutaan kollageeni-rikas strooman reaktio, joka on osoitettu myötävaikuttavan kemo-resistenssin. Olemme aiemmin osoittaneet, että PDAC solut ovat resistenttejä gemsitabiini kemoterapiaa kollageenin mikroympäristössä, koska lisääntyneen ekspression kromatiinin remodeling proteiinin suuren liikkuvuuden ryhmä A2 (HMGA2). Olemme nyt havainneet, että ihmisen PDAC kasvaimissa näyttää korkeampi histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi fibroottisissa alueilla. Osoitamme, että suhteessa soluja kasvatetaan kudosviljelymuoviin, PDAC soluja kasvatettiin kolmiulotteisessa kollageenigeelien, osoittavat lisääntynyt histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi, sekä lisääntynyt ilmentymä p300, PCAF ja GCN5 histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT). Kaatamalla HMGA2 vaimentaa vaikutusta kollageenin histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi ja vaikutusta kollageenin aiheuttamaan p300, PCAF ja GCN5 ilme. Samalla osoitetaan, että ihmisen PDAC kasvaimista HMGA2, osoittavat lisääntynyt histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi. Lisäksi osoitamme, että solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien, osoittavat paremman suojan gemsitabiinia. On merkittävää, alas-säätely HMGA2 tai p300, PCAF ja GCN5 HAT herkistää solut gemsitabiinin kolmiulotteinen kollageenin. Kaiken kaikkiaan tuloksemme lisätä ymmärrystä siitä, miten kollageenin microenvironment myötävaikuttaa kemoterapian resistenssin in vitro ja tunnistaa HAT mahdollisina terapeuttisina vastaan ​​tappava syöpä.

Citation: Dangi-Garimella S, Sahai V Ebine K, Kumar K, Munshi HG (2013) Kolmiulotteinen Kollageeni I Edistää Gemsitabiini Resistance in vitro haimasyöpäsoluissa kautta HMGA2 riippuva histoni asetyylitransferaasin Expression. PLoS ONE 8 (5): e64566. doi: 10,1371 /journal.pone.0064566

Editor: Edna Cukierman, Fox Chase Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2013 Hyväksytty: 16 huhtikuu 2013; Julkaistu: 16 toukokuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat: National Cancer Institute Grant # R01CA126888 veteraaniviraston Merit Grant # I01BX001363. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta valtavasti työtä, edistymisestä hoidossa haiman adenokarsinooma (PDAC) on ollut turhauttavan vähäistä [1], [2]. PDAC pysyy edelleen neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa, jossa -80% yhden vuoden kuolleisuus useimmille potilaille [3]. Tämä ei ole edistytty on osittain johtuu lausutaan kollageeni-rikas fibroottisten reaktio liittyy PDAC kasvaimiin [4], [5], joka myöhemmin rajoittaa toimituksen ja tehokkuus kemoterapian [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Viime aikoina olemme julkaistut että PDAC solujen kolmiulotteinen kollageenin mikroympäristölle aiheuttaa suuren liikkuvuuden ryhmä A2 (HMGA2), arkkitehtoninen proteiini, joka säätelee kromatiinirakenteeseen ja välittää myös kemoterapian resistenssin kollageenin rikas mikroympäristölle [6], [10], [11]. On merkittävää, HMGA2 ylössäädellään ihmisen PDAC kasvaimissa, erityisesti korkea-asteen kasvaimista imusolmukemetastaaseja [12], [13].

PDAC liittyy myös epigeneettiset muutokset, jotka on liitetty potilaaseen ennusteeseen [ ,,,0],14], [15]. Translaation jälkeinen histonimodifikaation kuvioita havaitaan immunohistokemiallisesti oli osoitettu ennustavan ennusteen kaksi suurta kohorttia PDAC hoidettujen potilaiden kemoterapian [14], [15]. PDAC potilaille, joiden kasvaimet osoittivat heikkoa ilmentymistä histoni H3 lysiinin 27 tri-metylaatio (H3K27Me

3) tai histoni H3 lysiinin 9 di-metylaatio (H3K9Me

2), jotka ovat merkkejä suljetun kromatiinin (heterochromatin) ja geeni tukahduttaminen [16], [17], [18], oli huomattavasti lyhyempi eloonjäämisaste kuin PDAC potilailla, joiden syöpiä näkyy korkea histoni H3K27Me

3 tai histoni H3K9Me

2 ilmaisun [14], [15]. Kuitenkin PDAC potilaalla on matala histoni H3K4Me

2, joka on merkki avoimempi chromatin ( ’euchromatin) tila, osoitti myös lyhyempiä eloonjäämisaste kuin PDAC potilailla, joiden syöpiä näkyy korkea H3K4Me

2 ilmaisun [15] . Toisin kuin histoni metylaatio, joka liittyy sekä geenin aktivointia ja tukahduttamisen, histoni asetylaatio on vain ollut yhteydessä geenin aktivaatio liittyy euchromatin valtion [16], [17], [18]. Huolimatta selkeä yhteys histoni asetylaatio ja syövän kehityksen [19], [20], osuus hattuja PDAC etenemistä ei ole hyvin tutkittu.

Ilmaisu ja aktiivisuus HAT proteiinien muuttuvat eri syövistä [21], [22]. Esimerkiksi p300 HAT on mukana aktivointi c-myc-promoottorin PDAC soluihin [23]. P300 HAT tarvitaan myös G1 /S solusyklin siirtymistä, koska downregulation p300 HAT aiheuttaa kasvun estämistä melanoomasolujen [24]. HAT myös moduloida chromatin tila soluissa, joissa GCN5 ja PCAF HAT on yleensä tarvitaan maailmanlaajuisesti histoni H3K9 asetylointi ja p300 HAT on yleensä mukana globaalissa histoni H3K27 asetylaatio [22], [25]. Mielenkiintoista, GCN5 HAT edistää laajaa ylläpidon aktiivinen chromatin aiheuttama myc onkoproteiinia [26].

Tässä raportissa tarkastellaan roolia ja sääntelyn p300, PCAF ja GCN5 hatut PDAC soluissa. Osoitamme, että kolmiulotteinen kollageenin mikroympäristölle kautta HMGA2 ilmaisun edistää histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi yhdessä p300, PCAF ja GCN5 HAT ilmaisun PDAC soluissa. Lisäksi osoitamme, että ihmisen PDAC kasvainten lisääntynyt fibroosia näyttö korkeampi histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi, ja ne ovat lisänneet HMGA2 ilme. Lisäksi PDAC solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien, osoittavat paremman suojan gemsitabiinia. Merkittävää on, vähen- tämisessä HMGA2 tai p300, PCAF ja GCN5 HAT herkistää solut gemsitabiinin kolmiulotteinen kollageenin. Kaiken kaikkiaan tuloksemme lisätä ymmärrystä siitä, miten kolmiulotteinen kollageenin mikroympäristön myötävaikuttaa kemoterapian resistenssin in vitro, ja perustaa HAT mahdollisina terapeuttisina vastaan ​​tappava syöpä.

Tulokset

Kollageeni kasvaa histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi

Äskettäin julkaisimme että PDAC solut kasvavat kollageenin rikas mikroympäristölle olivat suojattuja vaikutuksilta kemoterapiaa [6]. Osoitimme, että kemiallis-suojaus johtui lisääntyneen ilmentymisen HMGA2 [6], arkkitehtoninen proteiini osallistuu säätelyssä chromatin valtio [10]. Koska HAT on sidoksissa muutoksiin chromatin tilassa ja myös välittävät vastaus DNA vaurioita [19], [20], [21], [22], [27], [28], me tutki fibroosia ihmisen PDAC kasvainten liittyy muutoksia histoni asetylaatio. Koska p300 ja GCN5 hatut ovat mukana chromatin rentoutumista edistämällä asetylointi sivustoja DNA-vaurion ja helpottaa korjaus [27], [28], tarkastelimme muutokset asetylaatiossa histoni H3 lysiinitähteiden välittämän nämä kaksi hattuja. Kuten p300 HAT osallistuu tavallisesti globaalissa histoni H3K27 asetylaatio ja GCN5 HAT toiminnot säännellä globaali histoni H3K9 asetylaatio [22], [25], ihmisen PDAC kasvainnäytteestä värjättiin histoni H3K9 ja H3K27 asetylaatio IHC ja kolmivärimenetelmä värjätään teiksi fibroosia . Kuten kuvioissa. 1A ja 1B, on lisääntynyt histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi alueilla fibroosin verrattuna ei-fibroottisten alueilla. Määrällisesti suhteellisen värjäys osoitti, että oli ~ 2-kertainen nousu tumavärjäystä histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi alueilla fibroosin verrattuna ei-fibroottisten alueilla (Fig. 1 C). Sen määrittämiseksi, onko kollageeni microenvironment oli olekaan yhteydessä histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi, PDAC soluja (Panc1 ja CD18-solut) maljattiin kudosviljelymuoviin tai kolmiulotteisessa kollageenigeelien ja arvioitiin histoni H3K9 ja H3K27 asetylaatio Western-blottauksella. PDAC kasvatettujen solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien havaittu olevan histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi (Fig. 1 D).

A, B

. Ihmisen haiman kudossiruina (TMA), joka sisältää 24 näytteet immunovärjättiin IgG kontrollivasta-aineen tai histoni H3K9 ja histoni H3K27 asetylointi (Ac). TMA myös kolmivärimenetelmä värjättiin teiksi fibroosia.

insets

osoittavat suurempi suurennos kuvia värjäyksen ohjaus IgG, ja histoni H3K9Ac ja histoni H3K27Ac.

C

. Kvantitointi histoni H3K9Ac- ja histoni H3K27Ac-positiivisten solujen tehtiin käyttämällä Adobe Photoshop CS3-ohjelmisto. *, P 0,01 suhteessa jaksoon, joissa alhainen fibroosia.

D

. Panc1 ja CD18-soluja kasvatettiin kudosviljelmässä muovista tai kolmiulotteisessa kollageenigeelien 24 tuntia. Solut hajotettiin ja immunoblotattiin varten histoni H3K9Ac ja H3K27Ac käyttäen α-tubuliinin kuin latauskontrollina. Tulokset edustavat ainakin neljä itsenäisen kokeen.

tutki myös vaikutusta kollageeni I pinnoille ( ”kaksiulotteinen kollageeni) on histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi. Kuten esitetään Supplemental kuvassa. S1, kollageenipäällysteisiin pinnat olivat vaihtelevia vaikutuksia histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi. Histoni H3K9 asetylointi korotettiin kaksiulotteinen kollageenia Panc1 soluissa, mutta ei CD18 soluissa. Sen sijaan, histoni H3K27 asetylointi lisättiin kaksiulotteinen kollageenia CD18-soluissa, mutta ei Panc1 soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kaksiulotteinen kollageenin pinnat voivat aiheuttaa jossain määrin, histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi. Koska kasvainsolut in vivo ympäröivät kollageeni [4], [5], maljaussolut kolmiulotteisessa kollageeni on edustavampi malli tutkia vaikutusta kollageenin haimasyövän solujen käyttäytymiseen.

HMGA2 säätelee kollageenin indusoimaa H3K9 ja H3K27 asetylointi

Olemme aiemmin osoittaneet, että kollageeni microenvironment kasvoi HMGA2 ilmentymistä PDAC soluissa [[6] ja kuvio. 2A]. Sen määrittämiseksi, ovatko HMGA2 välittämää kollageenin indusoimaa histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi, HMGA2 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi 2 eri siRNA: t in Panc1 ja CD18 solujen (Fig. 2B) ja vaikutus histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi määritettiin. Kuten kuvioissa. 2C ja 2D, HMGA2 siRNA vähentynyt kollageenin indusoimaa histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi sekä Panc1 ja CD18 solujen. Koska meidän in vitro kulttuureissa luoda HMGA2 sääntely histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi, tutkimme seuraavaksi, missä määrin ihmisen PDAC kasvainnäytteestä jotka yli-ilmentävät HMGA2 näyttöä lisääntyneestä histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi. Kuten on esitetty kuviossa. 2E, ihmisen PDAC kasvaimista HMGA2 ilme osoitti myös lisääntynyt histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi. Yhdistyksen välinen HMGA2 ja H3K9 asetylointi meidän TMA oli tilastollisesti merkitsevä (p = 0,03), kun taas yhdistyksen välillä HMGA2 ja H3K27 asetylointi tiettyjä kehityssuuntia kohti merkitys (p = 0,10).

. Panc1 ja CD18 soluja kasvatettiin kudosviljelymuoviin tai kolmiulotteisessa kollageenigeelien 24 tuntia ja immunoblotattiin varten HMGA2. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

B

–

D

. Panc1 ja CD18-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai 2 eri HMGA2 siRNA: t, annettiin toipua yön yli ja sitten upotettu kolmiulotteinen kollageenin 24 tuntia. Lysaatit Sitten immunoblotattiin varten HMGA2 (

B

), histoni H3K9Ac (

C

) ja histoni H3K27Ac (

D

) käyttäen α-tubuliinin kuin latauskontrollina. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

E

. Ihmisen haiman TMA immunovärjättiin HMGA2 (

jäljellä

), histoni H3K9Ac (

keski

) ja histoni H3K27Ac (

oikea

).

F

. Suhde HMGA2 ja histoni H3K9Ac tai H3K27Ac arvioitiin Fisherin testiä.

HMGA2 säätelee kollageenin indusoimaan p300, PCAF ja GCN5 HAT ilmaisun

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus kolme ulotteinen kollageenigeelien on p300, PCAF ja GCN5 hatut Panc1 ja CD18 solujen. Kuten edellä, p300 HAT osallistuu tavallisesti globaalissa H3K27 asetyloinnin ja GCN5 ja PCAF HAT toimivat säätelemään globaali H3K9 asetylaatio [22], [25]. PDAC solujen kolmiulotteinen kollageenigeelit, osoittavat lisääntyneen ilmentymisen p300, PCAF ja GCN5 HAT (Fig. 3A). Sen osoittamiseksi, että nämä hatut asiassa välittävät kollageenin indusoimaa H3K9 ja H3K27 asetylointi in PDAC soluissa, p300, PCAF ja GCN5 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi käyttäen yhdistelmä kolmesta eri siRNA: iden in Panc1 ja CD18 solujen (Fig. 3B), ja vaikutus H3K9 ja H3K27 asetylaatio määritettiin. Yhdistelmä siRNA: iden vastaan ​​p300, PCAF ja GCN5 vähentynyt kollageenin aktivoimaan histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi sekä Panc1 ja CD18 solujen (kuviot. 3C ja 3D).

. Panc1 ja CD18-soluja kasvatettiin kudosviljelymuoviin tai kolmiulotteisia kollageenigeeleissä 24 tuntia. Solut hajotettiin ja immunoblotattiin varten p300, PCAF ja GCN5 histoni acetyltrasferases (HAT) käyttäen α-tubuliinin kuin latauskontrollina. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen

B

–

D

. Panc1 ja CD18-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai yhdistelmällä siRNA: iden vastaan ​​p300, PCAF ja GCN5 (HAT siRNA); annettiin toipua yön yli ja sitten upotettu kolmiulotteinen kollageenigeelien 24 tuntia. Lysaatteja immunoblotattiin vastaavalle HAT proteiinit (

B

), ja histoni H3K9Ac (

C

) ja H3K27Ac (

D

). Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

E, F

. Panc1 ja CD18-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai yksittäisten siRNA vastaan ​​p300, PCAF ja GCN5; annettiin toipua yön yli ja sitten upotettu kolmiulotteinen kollageenigeelien 24 tuntia. Lysaatteja immunoblotattiin varten histoni H3K9Ac (

E

) ja H3K27Ac (

F

). Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Olemme lisäksi tutkineet suhteellinen osuus p300, GCN5 ja PCAF on histoni asetylaatio käyttäen yksittäisiä siRNA sijasta kolme yhdistetään siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 3E, transfektio yksittäisten siRNA: iden vastaan ​​p300, PCAF tai GCN5 vähentynyt histoni H3K9 asetylointi sisään Panc1 soluissa. Kuitenkin transfek- yksittäisten HAT siRNA: t in CD18 soluissa oli vain vähäinen vaikutus tai paradoksaalisesti kasvanut histoni H3K9 asetylointi sisään CD18 soluissa. Transfektio GCN5 siRNA tai PCAF siRNA CD18-solujen määrä nousi histoni H3K9 asetylaatio. Kiinnostavaa kyllä, se oli viime aikoina osoittanut, että on lisääntynyt histoni H3K9 asetylointi in PCAF-null ja GCN5-null hiiren alkion fibroblasteissa [25]. Samoin vaikutus histoni H3K27 asetylaatio oli joko hyvin vähän tai lisääntynyt transfektion jälkeen joko GCN5 siRNA tai PCAF siRNA (Fig. 3F). Kuitenkin transfektio p300 siRNA vähentää histoni H3K27 asetylointi sekä CD18 ja Panc1 soluja.

Koska osoittaa, että HMGA2 säätelee kollageenin indusoimaa histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi (Fig. 2), tutkimme sitä, missä määrin HMGA2 välitti myös kollageenin indusoimaa p300, PCAF ja GCN5 ilme. Kuten on esitetty kuviossa. 4, HMGA2 siRNA vähentynyt p300, PCAF ja GCN5 tasoilla sekä Panc1 ja CD18-soluja kasvatettiin 3D kollageenia.

Panc1 ja CD18-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai 2 eri HMGA2 siRNA: t, annettiin toipua yön yli ja sitten päällystetty kolmiulotteinen kollageenigeelien vielä 24 tunnin ajan. Lysaatit analysoitiin sitten p300 (

), PCAF (

B

) ja GCN5 (

C

) HAT käyttäen α-tubuliinin kuin latauskontrollina. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

PDAC solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien suojataan gemsitabiini

Olimme aiemmin osoittaneet, että PDAC solujen kolmiulotteinen kollageenin geelit suojattu vaikutuksilta gemsitabiinin ja edelleen lisääntyä [6]. Siten tutkimme vaikutus kollageenin CD18 soluissa gemsitabiinihoidon. CD18 soluja muoville tai kolmiulotteisessa Kollageenigeelejä hoidettiin gemsitabiinin 24 tuntia ja sitten ne trypsinoitiin tai altistetaan kollagenaasilla louhinta. Sitten solut maljattiin uudelleen päälle muovi- tai kolmiulotteinen kollageenigeelit, ja kyky solujen muodostamiseksi pesäkkeitä arvioitiin 5 päivää. Noin 5% CD18 solujen muovi gemsitabiiniryhmässä muodossa monisoluisten pesäkkeiden suhteessa käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 5A). Sen sijaan yli 50% CD18-solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien gemsitabiiniryhmässä muodossa pesäkkeitä (Kuva. 5A).

. CD18 soluja kasvatettu muovi- tai kolmiulotteisessa Kollageenigeelejä jätettiin käsittelemättä tai gemsitabiiniryhmässä 24 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin ja uutetaan pois kollageenin kollagenaasikäsittelyn. Solut maljattiin uudelleen päälle kudosviljelymuoviin tai kolmiulotteisessa kollageenigeelien alhaisella tiheydellä (

jäljellä

). Solut valokuvattiin 5 päivää myöhemmin ja laskettiin (

oikea

). **, P 0,001. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

B, C

. CD18-solut transfektoitiin ohjaus siRNA, HMGA2 siRNA (

B

) tai yhdistelmä siRNA: ita vastaan ​​PCAF, GCN5 ja p300 (

C

), annettiin toipua yön yli ja sitten maljattiin kollageenia geelit 24 tuntia. Solut käsiteltiin sitten gemsitabiinin kanssa 24 tunnin ajan, uutetaan pois kollageenin kollagenaasikäsittelyn ja sitten maljattiin uudelleen kolmiulotteisen kollageenigeelien alhaisella tiheydellä. Solut valokuvattiin 5 päivää myöhemmin ja laskettiin. *, P 0,05. Tulokset edustavat vähintään 3 itsenäisen kokeen.

HMGA2 ja hattuja välittävät suojan gemsitabiini kolmiulotteisessa kollageenigeelien

Kuten aiemmin osoitettu, että HMGA2 siRNA vähentynyt leviämisen PDAC solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien seuraavat gemsitabiinihoidon [6], tutkimme vaikutus HMGA2 siRNA on PDAC solujen kollageenin seuraavissa gemsitabiinihoidon. CD18-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai HMGA2 siRNA, ja gemsitabiiniryhmässä 24 tuntia ja kasvoivat kolmiulotteisessa kollageenigeelien. Solut uutettiin sitten pois kollageenin ja maljattiin uudelleen kollageenin pienitiheyksistä vielä 5 päivää. CD18-solut transfektoitu HMGA2 siRNA osoittavat vähentänyt pesäkkeiden lukumäärästä verrattuna CD18 transfektoitujen solujen ohjaus siRNA (Fig. 5B). Samoin tutkimme vaikutus siRNA: iden vastaan ​​p300, PCAF ja GCN5 hatut PDAC solujen kolmiulotteisessa kollageenigeelien seuraavat gemsitabiinihoidon. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, CD18-solut transfektoitu p300, PCAF ja GCN5 HAT siRNA osoittavat myös vähentänyt pesäkkeiden lukumäärästä verrattuna CD18 transfektoitujen solujen ohjaus siRNA.

Keskustelu

kollageeni-rikas kasvain mikroympäristölle olennainen rooli PDAC etenemisen sekä edistetään sekä kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ja suojella syöpäsoluja vastaan ​​kemoterapiaa [4], [29]. Se ei vain rajoittaa toimituksen kemoterapiaa syöpäsolujen [7], mutta se myös aktivoi signaalipolkuja rajoittavat vaikutukset kemoterapiaa [6], [7], [8], [9]. Aiemmin olimme julkaissut että induktio HMGA2 ilmentymisen kolmiulotteisessa kollageenin annettiin PDAC solujen vaikutuksen voittamiseksi kemoterapiaa ja edelleen lisääntyä [6]. Mielenkiintoista on, HMGA proteiinit äskettäin osoitettu lisäävän ilmentymistä ataksia-teleangiektasian mutatoitu (ATM), tärkein solu anturi genotoksinen stressi, mikä lisää vastustuskykyä DNA: ta vaurioittavien aineiden [30]. Tässä raportissa osoitetaan, että HMGA2 voi myös säätelemään p300, PCAF ja GCN5 HAT kolmiulotteisessa kollageenigeelien rajoittamaan vaikutuksia gemsitabiinin.

Vaikka emme tutkia HMGA2 suoraan sitoutuu HAT promoottorit säätelevän HMGA2, toimimalla globaalin chromatin kytkin, on osoitettu säätelevän 1000 geenejä [31]. Jotkut näistä geeneistä säätelevät HMGA2 suoraan sitoutumalla promoottorisekvenssejä. Esimerkiksi, HMGA2 säätelee hTERT ilmentymistä sitoutumalla hTERT-promootterin ja aiheuttavat vähentynyt täyttöasteen HDAC2 on hTERT-promootterin [32]. Tämä johtaa paikallisesti lisääntyvään histoni H3K9 asetyloinnin ja transkriptio modulaatio hTERT [32]. Kuitenkin muut tutkimukset ovat osoittaneet, että HMGA2 voi epäsuorasti vaikuttaa geenin ilmentymisen aktivaation kautta signalointireittien, kuten induktio PI3K /Akt /mTOR /p70S6K signalointiryöpyn seuraavat yliekspressio HMGA2 in stroomasolujen [33]. Olemme aiemmin osoittaneet, että HMGA2 edistää ERK1 /2 signalointi haiman syöpäsoluissa 3D kollageenia [6]. Lisäksi olemme havainneet, että ERK1 /2 signalointi voi myös välittää kollageenin indusoimaa HAT ilmentymistä (Dangi-Garimella S. ja Munshi H. G., julkaisematon havainto). Siten on mahdollista, että HMGA2 sääntely hattuja kolmiulotteisessa kollageeni välittyy ERK1 /2 signalointi.

osoittavat, että lisääntynyt p300, GCN5 ja PCAF HAT ilmaisun 3D kollageenin edistää histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi . Tärkeää on, histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi useimmiten sijaitsevat transkription aloituspaikkoja ja rikastetaan klo promoottorit aktiivisesti puhtaaksi geenien [16], [18], ja siten muutoksia histoni H3K9 ja histoni H3K27 voi olla laaja ja syvällinen vaikutus geenien ilmentymistä ja cellular käyttäytymistä. On mahdollista, että kollageeni microenvironment voi myös moduloida asetylaatio muiden lysiinitähteiden. Kuitenkin on osoitettu, että GCN5 ja PCAF ovat tarpeettomia ja ne nimenomaisesti vaatii histoni H3K9 asetylointi fibroblasteissa [25]. PCAF-null fibroblasteja on säilyttämisen histoni H3K9 asetylointi ja osoitettava väheneminen histoni H3K9 asetylaation vain silloin GCN5 on pudotettiin näissä fibroblasteissa [25]. Mielenkiintoista, kirjoittajat vakuuttavasti osoittaa, että GCN5 voi acetylate histoni H3K14 in vitro määrityksessä, mutta ei muutosta histoni H3K14 Asetylointia havaittu, kun PCAF ja GCN5 tippuu alas in vivo [25]. Lisäksi vähen- tämisessä p300 ei vaikuttanut histoni H3K14 asetylointi in vivo, mutta väheni lähinnä histoni K3K27 asetylaatio [25]. On myös mahdollista, että muutokset histoni H3K9 ja H3K27 asetylointi voi johtua tukahduttamisen histonideasetylaaseja (HDAC: t) kolmiulotteisessa kollageenia. HDAC1 ja HDAC7 lisääntyvät ihmisen haiman kasvaimissa verrattuna normaaliin kudokseen [34], [35]. Lisäksi ilmaus jäsenten luokan I HDAC: t haimasyövän solulinjoissa on lisääntynyt verrattuna normaaliin HDPE soluihin [36]. Jatkossa tutkimuksissa, tutkimme onko kollageeni microenvironment moduloi ilmentymistä HDAC: t haimasyövän solulinjoissa.

Merkittävästi, osoitamme, että hattujen edistävät kemoterapian resistenssin kolmiulotteinen kollageenin. P300 HAT on osoitettu olevan osallisena DNA-vaurioita vastaus säätelemällä ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) korjaa [27]. Aktiivisuuden vähentämistä tai ilmaus p300 HAT tukahduttaa NHEJ, heikentää double-lohkon murtuma (DSB) korjaus- ja herkistää keuhkosyövän soluja säteilylle ja kemoterapia [27]. P300 HAT tarvitaan asetylointi histonien klo DSB helpottaa kromatiinin rentoutumista ja mahdollisen DNA korjaukseen [27]. Lisäksi GCN5 stimuloi ydin- Leikkauskorjauksessa edistämällä H3K9 asetylaatio ja chromatin rentoutumista paikoissa vaurioiden [28]. Mikä tärkeintä, se tunnustetaan yhä, että chromatin tila voi vaikuttaa soluvastetta kemoterapiaa. Vaikka enemmän kompakti heterochromatin voi rajoittaa laajuutta alkuperäisen DNA-vaurioiden [37], se voi myös rajoittaa pääsyä DNA: n korjautumista proteiineja. DNA korjaus altistuminen karsinogeeneille on tehottomampi sisällä heterochromatic alueita suhteessa vähemmän kompakti euchromatic alueilla [38]. Yhdenmukainen malli, jossa heterochromatin rajoittaa pääsyä proteiinit osallistuvat DNA: n korjaukseen, käsittely HDAC estäjä trikostatiini edistänyt euchromatin muodostumista ja lisätä DNA-vaurioita vastaus rintasyöpäsoluissa [39].

Vaikka emme ole tutkineet vaikutus kohdistaminen HAT in vivo, meidän havainnot viittaavat vahvasti siihen, että kohdentaminen HAT antaa meille mahdollisuuden lisätä tehoa kemoterapiaan hiirimalleissa haimasyövän ja potilailla, joilla on haimasyöpä. Tätä tukee myös havainnot, että avoimempi chromatin tilassa PDAC Tuumorinäytteet voi liittyä huonompi ennuste [14], [15]. Vaikka useat HDAC-inhibiittoreita on kuvattu ja tutkittu laajasti syövän etenemistä [40], [41], [42], vain rajoitettu määrä HAT-inhibiittoreita on kehitetty [22]. Lisäksi on tärkeää huomata, että PDAC hoidettujen potilaiden HDAC estäjä CI-994 ja gemsitabiinin ei osoittanut lisääntynyt hoitovaste verrattuna gemsitabiinin yksin [43]. Alkuperäinen synteettinen HAT estäjiä osoittautuneet tehokkaiksi estämään HAT aktiivisuus in vitro; Niiden käyttö rajoitti alhainen metabolinen vakaus ja köyhien solujen läpäisevyys. Käyttöä luonnossa esiintyvän HAT-estäjä anacardic happoa rajoitti myös huono solun läpäisevyyttä [44]. Vaikka luonnossa esiintyviä yhdisteitä, kurkuma ja garcinol on osoitettu olevan tehokkaita HAT-inhibiittoreita in vitro ja in vivo [22], ne osoittavat myös merkittävää ei-spesifistä aktiivisuutta. Äskettäin yhdiste C646 on suunnitellut virtuaalisen ligandin seulontaan ja sen osoitettiin olevan tehokas, erittäin selektiivinen, solun läpäisevä pienimolekyylisiä p300 HAT estäjä [45]. C646-estäjä estää solunsisäistä histoni asetylaatio ja hidastaa syöpäsolujen kasvua in vitro [45], [46]; kuitenkin, tehokkuus C646 eläinten ja ihmisten tutkimuksia ei ole raportoitu.

Kaiken kaikkiaan osoittavat, että kollageeni microenvironment in vitro rajoittaa tehokkuutta gemsitabiinin kautta HMGA2 riippuva HAT ilmentymisen (Fig. 6). Samalla osoitetaan, että HMGA2 ilmentyminen liittyy histoni asetylaatio ihmisen PDAC kasvaimissa, erityisesti alueilla fibroosin, mikä viittaa siihen, että lausutaan fibroottinen reaktio voi myötävaikuttaa kemoterapian resistenssin lisäämällä HMGA2-HAT signalointi. Koska hyvin vähän on edistytty hoidossa haimasyöpä, kohdistaminen HAT voisi olla uudenlainen lähestymistapa herkistää haimatuumorien kemoterapiaa.

Aiemmin olimme julkaissut että kollageenin microenvironment aiheuttama HMGA2 ilme [Dangi- Garimella S, et ai, [6]]. Olemme nyt osoittaa, että PDAC solujen kollageenin mikroympäristössä aiheuttaa HMGA2 riippuvaa HAT ilmaisun ja histoni H3 asetylointi, mikä viittaa siihen, että kollageenin microenvironment edistää euchromatin muodostumista. Tämän signalointireitin mahdollistaa PDAC soluja vastustamaan vaikutuksia gemsitabiinin kollageenin mikroympäristössä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit /reagenssit

GCN5 (sc-20698) , PCAF (sc-13124), ja α-tubuliinin (sc-8035) vasta-aineet hankittiin valmistajalta Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); p300 (05-257), histoni H3K9 asetylointi (04-1003), ja histoni H3K27 asetylointi (05-1334) vasta-aineet on saatu Millipore (Bedford, MA); ja HMGA2 vasta-aine oli peräisin Biocheck Inc. (Foster City, CA). Toissijainen vasta-aineet hankittiin valmistajalta Sigma (St. Louis, MO). Tyypin I kollageenin saatiin BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Gemsitabiini saatiin Eli Lilly (Indianapolis, IN). Nucleofector elektroporaatio kit ostettiin Lonza (Walkersville, MD). HMGA2 # 1 (279254), HMGA2 # 2 (279255), GCN5 (s5659), PCAF (s16894), ja p300 (s4696) siRNA: t hankittiin Life Technologies (Carlsbad, CA).

Immunohistokemia (IHC ) B

haiman kudossiruina (TMA) saatiin US Biomax (Rockville, MD) ja koostuivat 24 haiman ytimien mitataan 1,5 mm halkaisijaltaan ja 5 um paksu. Levyjä kolmivärimenetelmä värjätä tai värjättiin H3K9 asetylaatio H3K27 asetylaatio, ja HMGA2 standardin IHC menettelyjä [5], [6], [47]. Stained Näytteet arvostellaan asteikolla 0-3 seuraavin pisteytysjärjestelmä: 0-0% soluista värjätään; 1- 25%; 02.26.50%, tai 3 50%.

Soluviljely

Panc1 ja CD18 /HPAF-II saatiin ATCC (Manassas, VA). Soluja ylläpidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä) [6]. Solut testattiin STR profilointia Johns Hopkins geneettisiä voimavaroja Core Facility ja oli samanlainen profiili kuin sen ATCC verkkosivuilla.

upottaminen solujen kolmiulotteisessa tyypin I kollageenin geelit

Kollageeni seos (2 mg /ml) valmistettiin lisäämällä sopivat tilavuudet steriiliä vettä, 10 x DMEM ja NaOH: a ja pidettiin jäissä, kunnes sitä tarvitaan [6], [48], [49]. PDAC solut suspendoitiin kollageenin liuokseen ja annettiin geeliytyä 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Säännöllinen lisättiin sitten päälle geelistä ja inkuboitiin 24 tuntia.

Transfektio

Solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​HMGA2, GCN5, PCAF, p300 tai valvoa siRNA (50 nmol) käyttäen Nucleofector Kit R (Lonza), annettiin toipua yön yli ja sitten maljattiin kolmiulotteinen kollageenigeelit (2 mg /ml).

immunoblottauksella

Immunoblottaus tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [5], [50]. Kasvatettujen solujen kollageenin, matriisin liuotettiin ensin kollagenaasin (Worthington Biologicals, Lakewood, NJ), ja sitten hajotetaan, kuten aiemmin on kuvattu [6], [51].

Colony muodostavat määrityksessä

CD18 solujen kudosviljelymuoviin tai kolmiulotteisessa Kollageenigeelejä hoidettiin gemsitabiinia. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut trypsinoitiin ja uutettiin pois kollageeni, ja sitten maljattiin uudelleen päälle kudosviljelymuoviin tai kolmiulotteinen kollageenigeelien tiheydeltään pieni. Solut valokuvattiin 5 päivää myöhemmin ja laskettiin.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin kanssa GraphPad InStat (LaJolla, CA), käyttäen t-testiä analyysiä tai Fisherin testiä.

tukeminen Information

Kuva S1.

vaikutus 2D kollageenin histoni H3K9 ja histoni H3K27 asetylointi.

A, B

. Panc1 ja CD18-soluja kasvatettiin kudosviljelymuoviin tai kollageeni I-päällystetty kudosviljelylevyille (BD BIOCOAT Kollageeni I) 24 tunnin ajan. Solut hajotettiin ja immunoblotattiin varten histoni H3K9Ac ja H3K27Ac käyttäen α-tubuliinin kuin latauskontrollina. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0064566.s001

(TIF)