Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on heterogeeninen ryhmä sairauksia ja on tarvetta tehokasta ja kohdennettua hoitomenetelmät. Tässä tutkimuksessa mahdolliset geenien ilmentymisen tietojen ja RNA-interferenssi tekniikka yhdistettiin etukäteen tulevia yksilöllisiä eturauhassyöpää terapeuttisia. Erottaa lupaavimmista

in vivo

prevalidated eturauhassyövän lääkekohteiden, bioinformatiivinen analyysi suoritettiin käyttäen genominlaajuisten geenien ilmentyminen tietoja 9873 ihmisen kudosnäytteitä. Kaikkiaan 295 geenit valittiin edelleen toiminnallisia tutkimuksia viljellyissä eturauhasen syöpäsolujen niiden suuren mRNA: n ekspression eturauhasen, eturauhasen syöpä tai metastaattisen eturauhassyövän näytteitä. Toinen, RNAi perustuu solujen elinkelpoisuuden määritys suoritettiin Vcap ja LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Perusteella siRNA tuloksiin, geeniekspressiomalleja ihmisen kudoksissa ja uutuus, Endoplasmakalvosto toiminto liittyy tavoitteet

AIM1

,

ERGIC1

ja

TMED3

sekä mitoosia säätö-

TPX2

valittiin lisävalidointia.

AIM1

,

ERGIC1

, ja

TPX2

osoitettiin olevan erittäin ilmaistaan ​​erityisesti eturauhassyövän kudoksissa, ja korkea mRNA ilmaus

ERGIC1

ja

TMED3

liittyy

AR

ja

ERG

onkogeeni ilme.

ERGIC1

hiljentäminen säädetty erikseen leviämisen

ERG

onkogeeni positiiviset syöpäsolujen ja esti ERG mRNA ilmentymisen näissä soluissa, mikä osoittaa, että se on voimakas huume tavoite ERG positiivinen alaryhmässä eturauhasen syöpiä.

TPX2

ilmaisu liittyy PSA epäonnistuminen ja

TPX2

hiljentäminen pienentää PSA ilmaisu, joka osoittaa, että TPX2 säätelee androgeenireseptorin välittämän signaloinnin. Lopuksi kombinatorinen käyttö microarray ja RNAi tekniikoita tuotti suuri määrä potentiaalisia uusien biomarkkereiden ja terapeuttisia kohteita, tulevan kehityksen kohdennettuja ja yksilöllisiä lähestymistapoja eturauhassyövän hallintaan.

Citation: Vainio P, Mpindi JP , Kohonen P, Fey V, Mirtti T, Alanen KA, et ai. (2012) suuren tuotantotehon Transcriptomic ja RNAi analyysi jakautuu

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

ja

TPX2

mahdollisina Drug Targets eturauhassyövässä. PLoS ONE 7 (6): e39801. doi: 10,1371 /journal.pone.0039801

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 lokakuu 2011; Hyväksytty: 31 toukokuu 2012; Julkaistu: 28 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Vainio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on tukenut Marie Curie Canceromics (MEXT-CT-2003-2728), EU-PRIMA hanke (sopimus # LSHC-CT-204-504587), TIME yhteistyöprojektin, Cancer Järjestöt, Suomen, Sigrid Juseliuksen säätiö, Suomen Akatemia ja Drug Discovery Graduate School in Turun yliopiston. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisimmin diagnosoitu maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus Länsi miespuolisesta väestöstä [1]. Kuitenkin eturauhasen syöpiä muodostavat heterogeenisen ryhmän tauteja ja jotkut miehet ovat edelleen todettu korkea-asteinen sairaus ja lopulta epäonnistua käsittely [1], [2]. Huolimatta fenotyyppiset ja molekyylitason heterogeenisuus tauti on puute vankka ja erityisiä prognostiset biomarkkerit erottaa veltto ja aggressiivinen syövät varhaisessa taudin vaiheissa. Lisäksi puutteen vuoksi tehokkaiden prognostisia ja terapeuttisia biomarkkerit sekä kohdennettua terapeuttisina, kliinisessä hoidossa on vielä kaukana henkilökohtaista.

Lisäksi säätelemällä kehittäminen ja ylläpito eturauhasen, androgeenien tukea kehitystä ja kasvua useimpien ensisijainen eturauhasen syöpiä, ja androgeenireseptorin (AR) roolissa onkogeenin eturauhassyövän [3] – [7]. Niinpä androgeeniablaatio on tällä hetkellä hoidossa valinta edenneen eturauhassyövän. Vaikka androgeenireseptorin tukos aluksi johtaa hyvä hoitovaste, se on lähes koskaan parantava [2]. Androgeenista riippumaton syöpäsolujen tyypillisesti alkaa näkyä hoidon aikana, joka lopulta johtaa toistuvia hormoni tulenkestävät tauti [8], [9]. Sen lisäksi, että vallitsevan muutoksiin AR ilmentymistä ja toimintaa, noin puolet eturauhassyöpänäytteissä satama onkogeenisessä geeni fuusio yhdistää androgeenisäädellyn transmembraaninen proteaasi seriini 2 (

TMPRSS2

) onkogeenisella ETS transkriptiotekijöiden [10]. Useimmiten fuusiokumppani on

ERG

(v-ETS erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin linnun), jonka jälkeen

ETV1

(ETS variantti 1),

ETV4

, ja

ETV5

[11] – [13]. ERG-mRNA ei ilmenny terveillä eturauhasen kudoksissa, mutta seurauksena

TMPRSS2-ERG

geenin fuusio alussa karsinogeneesissä, merkittävään kasvuun ERG-transkriptin tasot voidaan havaita eturauhassyövissä. ETS geenifuusioissa edistää useita signalointireittien liittyy syövän muodostumista ja etenemistä, ja kohdunulkoinen

ERG

onkogeeni ilme on liittynyt tiettyyn molekyylimerkkiaineet eturauhassyövässä [14] – [19]. Vaikka

ERG

aktivoitumisen välittämä kasvaimia synnyttävän prosesseja voidaan ohittaa sisään edennyt eturauhassyöpä, hormoni-säädellään ilmentymä

ERG

on kuvattu säilyvän myös kastraatio kestävä eturauhassyövän, tukemalla tärkeä tämä uudelleenjärjestely myös edennyt sairaus [15], [20], [21]. Yhdessä ETS fuusiot ovat keskeinen molekyyli muutoksia ajo kehittymistä ja etenemistä erillisen luokan eturauhasen syöpiä, ja voisi näin ollen hyötyä täsmähoitoihin.

Viime vuosina kehittyneet molekyyligenetiikan tekniikoita yhdistettynä kehittämiseen uusien bioinformatiikan analyysi työkalut ovat tarjonneet tehokkaita tapoja tutkia kasvain geeniekspressioprofiilien, mikä helpottaa biomarkkereiden löytö, sekä potentiaalisten uusia lääkekohteita. Geeniekspressioprofilointi pystytään parantamaan diagnoosi ja lavastus taudin, antaa tietoa hoidon vastauksista ja johtaa vähemmän sivuvaikutuksia [22], [23]. RNA-interferenssi (RNAi) tekniikka mahdollistaa tutkia toiminnallisen vaikutuksen yksittäisiä geenejä syövän solujen ominaisuudet, kuten kasvua ja selviytymistä, lisäetenemisliikkeen kehittämiseen kohdennetun ja yksilöllisiä terapeuttisia [24] – [26]. Tässä tutkimuksessa, mahdollisuudet näiden tekniikoiden on yhdistää etukäteen valitsemalla geenien RNAi funktionaalisia määrityksiä käyttäen geenien ilmentyminen tietoja. Tunnistaa mahdolliset heikkoudet läsnä eturauhasen syöpiä, bioinformatiivinen mRNA ilmaisun analyysi suoritettiin ensin perustuva 9873 ihmisen kudosnäytteitä, kuten 349 eturauhassyöpä ja 147 ei-pahanlaatuinen eturauhasessa erottaa eturauhasen ja eturauhassyövän kudosspesifisiä geenejä. Toiseksi RNAi suurikapasiteettisten (HT) toiminnallinen profilointi valitun

in vivo

prevalidated mahdollista lääkekohteita tehtiin VCAP ja LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa, jotta voidaan tunnistaa geenejä ja väyliä välttämättömiä eturauhassyövän solujen lisääntymisen ja selviytymistä. Tulokset korosti mahdollisuuksia kohdistaminen Endoplasmakalvosto (ER), hapetus, aktiinisytoskeletonin ja mitoosia eturauhassyövän hallintaan, ja lisävalidointia tunnistettu

AIM1

(puuttuu melanooma 1),

ERGIC1

( endoplasmakalvosto-Golgi Väliosastossa proteiini 1),

TMED3

(transmembraaninen emp24 proteiinia liikenteen alalla, joka sisältää 3) ja

TPX2

(kohdistaminen proteiinia Xklp2) mahdollisina uusia lääkekohteita eturauhassyövässä.

Methods

In Silico

Data Mining

GeneSapiens tietokannan [27] sovellettiin bioinformatically tutkia geenien ilmentymisen tasoilla koko 9783 ihmisen kudosnäytteitä. Lyhyesti, GeneSapiens (https://www.genesapiens.org/) on kokoelma 9873 Affymetrix microarray kokeiluja. Kaikki näytteet ovat reannotated ja normalisoitu mukautetun algoritmilla. Tiedot kerätään eri julkisista lähteistä, mukaan lukien Gene Expression Omnibus ja Array-Express ja kattaa 175 eri kudosten tyyppejä. Mean ilmentyminen Kunkin geenin määritettiin eturauhassyövässä (n = 349), terve eturauhasen (n = 147), ja kaikki normaalit kudosnäytteet (n

=

1476). Tiedot eturauhassyöpänäytteissä saatavilla GeneSapiens tietokannassa käytettiin myös

in silico

-parin analyysejä. Toiminnallinen geeni ontologian huomautuksia analysoitiin koekspressoi geenit (R 0,5 ja P 0,001) käyttäen DAVID toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun [28] ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) Software (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA).

Cell Culture

VCAP syöpäsolujen saatiin Kenneth pientä (University of Michigan, MI) tai ostettiin American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Ruotsi) ja kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA). LNCaP-solut saatiin Dr. Marco Cecchinin (University of Bern, Sveitsi) ja ylläpidetään T-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). PC-3, DU145 ja MDA-PCa-2b-solut hankittiin American Type Culture Collection (LGC Promochem AB), ja 22Rv1 soluja Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Saksa). Ei-pahanlaatuisen EP156T eturauhasen epiteelisolujen saatiin Dr. Varda Rotter (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) ja RWPE-1-solut hankittiin American Type Culture Collection (LGC Promochem AB). Ensisijainen eturauhasen epiteelisolujen (PrEc-) ostettiin Lonza (Lonza Ltd, Basel, Sveitsi). Androgeeni-riippumaton LNCaPs ja niiden vanhempien kollegansa saatiin Dr. Zoran Culig (Innsbruck Medical University, Itävalta) ja kasvatettiin RPMI-1640 (Invitrogen), joka sisältää puuhiilellä puhdistettua tai normaali naudan sikiön seerumia, vastaavasti. Synteettinen androgeenireseptorin R1881 ostettiin PerkinElmer.

Gene Knock-down käyttäminen RNA-interferenssi

Ennen seulonta, solujen määrä titrattiin sekä VCAP ja LNCaP erikseen varmistaa, että solujen lisääntymistä pysyi lineaarisena -exponentiaalipulssi vaihe koko kokeen ajan. Sillä RNAi tutkimuksia, neljä siRNA: t per geeni (HP GenomeWide, Qiagen) maljattiin 384-kuoppalevyille (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Saksa), jonka jälkeen lisätään transfektion aineen (siLentFect lipidi reagenssi, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) Opti-MEM (Invitrogen) ja sopiva määrä soluja (1500-2000 per kuoppa), automatisoidulla nesteenkäsittelyn robotti (Hamilton) ja nesteen annostelija (ThermoFisher). Lopullinen siRNA pitoisuus oli 13 nM. AllStars negatiivinen kontrolli (salattu siRNA, Qiagen) ja lipidejä vasta käytettiin negatiivisina kontrolleina, siRNA: t vastaan ​​

KIF11

(kinesiiniin perheenjäsen 11, SI02653770) ja

PLK1

(polo kaltainen kinaasi 1; SI02223844) käytettiin positiivisina verrokkeina. Validointia kokeissa solut transfektoitiin kaksi siRNA per geeni (

AIM1

: SI03126704, SI03212846;

ERGIC1

: SI03164763, SI04302872;

TMED3

: SI00746711, SI00746718;

TPX2

: SI00097188, SI00097195), kuten edellä on kuvattu sopiva levyt.

elinkykyyn ja apoptoosimäärityksessä

CellTitre-Blue (CTB) ja CellTiter-Glo (CTG) solu elinkelpoisuuden määritykset (Promega), ja ApoONE apoptoosin (induktio kaspaasi -3 ja 7 toimintaa) määritystä (Promega) suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden vastauksena 48 h tai 72 h siRNA hoitoon. Tulokset skannattiin EnVision Multilabel Platereader (PerkinElmer /Wallac).

normalisointi ja tilastollinen analyysi siRNA Screen Tulokset

Raaka saadut tulokset solujen elävyyden ja apoptoosin määritykset normalisoitiin käyttämällä

B

-score [29], ja siRNA vähentää solujen elinvoimaisuuden -2 SD peräisin mediaani hallintalaitteiden (vastaten P 0,05) vähintään kaksi näyttöä tai apoptoosin aiheuttamiseksi 3 SD (vastaten P 0.01) katsottiin antiproliferatiivisia tai proapoptoottisten osuma siRNA.

Kliininen eturauhasessa näytteitä

33 ensisijainen eturauhaskasvainnäytteissä (19 ERG onkogeeni positiivisia ja 14 ERG negatiivinen) ja 3 ei-pahanlaatuinen eturauhas- näytteet tässä tutkimuksessa käytettiin on kuvattu aiemmin [30].

kvantitatiivinen käänteiskopioijaentsyymi- PCR

validointi mRNA ekspressiotasoja suoritettiin käyttäen TaqMan kvantitatiivinen käänteistranskriptaasia PCR (qRT-PCR) analyysi ( suomi DNA Microarray keskus, Centre for Biotechnology, Turun yliopisto). RNA-näytteet uutetaan RNeasy Mini Kit (Qiagen) on käänteisesti cDNA: ksi (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) ja PCR-reaktio Näytteet analysoitiin 96-tai 384-kuoppainen formaatti. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttäen ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) ja määrittäminen suoritettiin käyttämällä

ΔΔCT menetelmällä RQ Manager 1.2 ohjelmisto (Applied Biosystems). Kolme rinnakkaista näytettä tutkittiin havaitsemiseen kohde-mRNA: n ilmentymisen ja β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus. Alukkeet ja koettimet suunnitellaan ja valitaan avulla Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche Diagnostics) (tukeminen taulukko S1).

Western Blot analyysi

kokosolulysaateista valmistettiin käyttämällä hajotukseen -puskuria (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-merkaptoetanoli 10% glyseroli, bromifenolisinistä). Vasta-aineita käytetään mukana anti-AR (1:1,000, Neomarkers, Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA), anti-PSA (1:1,000, A0562, DakoCytomation, Glostrup, Tanska), sekä toissijainen Alexa Fluor (1: 4000, Molecular Probes, Invitrogen) vasta-aineet. β-aktiinin (1:5,000, vasta-aine, Sigma) käytettiin latauskontrollina. Signaali havaittiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) mukaan valmistajan ohjeiden.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001) ja Pearsonin korrelaatiokerroin.

Tulokset

Korkea -throughput seulonta tulokset Korosta rooli Endoplasmakalvosto ja Mitosis liittyvät geenit säätelyssä eturauhassyöpä Cell Growth ja Survival

valitse

in vivo

prevalidated mahdollisia lääkkeiden tavoitteet ja biomarkkereita lisätutkimuksiin viljellyissä eturauhasen syöpäsolut geenin ilmentyminen tietoja saatavilla GeneSapiens tietokannassa hyödynnettiin. Yhteensä 295 eturauhasen ja /tai eturauhassyövän geenejä on valittu perustuu korkeaan mRNA: n ekspression eturauhasen, eturauhasen syöpä tai metastaattisen eturauhassyövän kudosnäytteitä, ja siRNA-kirjasto rakennettiin toiminnallinen tutkimuksissa (kuvio 1). Sillä RNAi tutkimuksia 4 siRNA: ita per geeni hankittiin ja levy perustuu HT siRNA näytöt suoritettiin VCAP ja LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa. VCAP on malli TMPRSS2-ERG positiivinen eturauhassyöpä, ilmentävät villityypin AR, kun taas LNCaPs satama mutantti

AR

(T877A) on laajennettu ligandin spesifisyys. Tunnistamiseksi terapeuttisesti merkityksellisinä geenien ja reitit eturauhasen Karsinogeneesin muutoksia solujen elinkelpoisuutta ja apoptoosin induktio (kaspaasi -3 ja 7 aktivointi) tutkittiin kuten päätepisteissä (tukeminen taulukko S2).

lämpökarttana esittely keskimääräinen geenien ilmentymisen tasoja 295 geenien (x-akseli) on valittu edelleen RNAi etsintä kaikissa kudoksissa (terve ja pahanlaatuisten) läsnä GeneSapiens tietokantaan (y-akseli). Asema eturauhassyövän (ylempi tähti) ja terveet eturauhasen (alempi tähti) on ilmoitettu. Väri havainnollistaa ilmentymisen taso eri kudoksissa, ja harmaa puuttuvat arvot. Heatmap piirretään perustuu valvomatta hierarkkinen klusterointi.

Solun elinkelpoisuus siRNA näytön tehtiin kolme toistoa ja apoptoosimäärityksessä kerran molemmissa solulinjoissa. Positiivinen kontrolli siRNA kohdistaminen tiedossa avain sääntelevät mitoosi etenemisen sekä eturauhassyövän solujen lisääntymistä, KIF11 ja PLK1 [31], [32], pystyivät merkittävästi vähentää solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2A) vahvistaa siten transfektion tehokkuutta. Rinnakkaismääritysten solujen elinkelpoisuus näytöt korreloivat positiivisesti (0,67 R 0,78 LNCaP ja 0,36 R 0,66 vuonna VCAP) molemmissa solulinjoissa tukemaan toiminnallisuuteen pääruutua (kuvio 2B ja tukeminen Taulukko S2).

. Katsaus normalisoitu LNCaP ja VCAP solujen elinkykyä näytön tuloksia (B-pisteet). Tulokset positiiviseen kontrolliin siRNA: t (KIF11 ja PLK1) on merkitty sinisellä, negatiivinen kontrolli kuoppiin (AllStars negatiivinen salattu siRNA ja puskuri vain) vihreänä, ja kohde- geeni siRNA harmaana. B. heatmap esittely solun elinkelpoisuuden näytön tuloksia (B-pisteet). Määritys toistettiin kolme kertaa niin LNCaP ja Vcap eturauhassyövän solulinjoissa. Sininen väri osoitti vähentynyt solujen elinkykyä, punainen lisääntynyt solujen elinkelpoisuus. Heatmap piirretään perustuu valvomatta hierarkkinen klusterointi. C. päällekkäisyyksiä RNAi näyttö osuma geenien (vähentynyt solujen elinkelpoisuuden vastauksena hiljentäminen) LNCaP ja VCAP solulinjoissa. D.

In silico

koekspressoimalla analyysi solujen elinkelpoisuuden osuma geenien eturauhassyöpänäytteissä. Geenit on järjestetty samassa järjestyksessä sekä y- ja x-akseli, ja korrelaatio (R) geenien välissä on merkitty väreillä. Punainen osoittaa positiivinen korrelaatio, sininen negatiivinen korrelaatio.

siRNA näytöt johti 94 potentiaali leviämisen edistämiseksi (osumia ainakin kahdessa solun elinkelpoisuuden näytöt) ja 97 antiapoptoottista geenien LNCaP. Niistä 94 jäljentää solujen elinkykyä osuma geenien 45 (47,9%) oli myös anti-apoptoottisia. Vuonna VCAP soluissa Lopullisessa osumatarkkuus oli 35 toistetuista leviämisen edistämiseksi ja 34 antiapoptoottisia osuma geenien, 9 (25,7%), josta edisti solujen elinkelpoisuus ja suojattu apoptoosin. Hiljentäminen 17 geenien johti anti-proliferatiivista vastetta sekä LNCaP ja VCAP soluja. (Kuva 2B-C ja tukeminen taulukko S2).

in silico

koekspressoimalla analyysi leviämisen osuma geenien (n = 112) on esitetty kolme suurta eturauhassyövän alaryhmiä eri mekanismeja solujen kasvun säätelyssä. Suurin joukko geenejä oli rooli ER ja Golgin laitteessa, eturauhanen kehitys, sekä hapettumisen vähentämiseen. Toinen alaryhmiä eturauhassyövän elinkelpoisuuden säätelevät geenit olivat mukana aktiinisytoskeletonin ja mitoosin (kuvio 2D).

Novel Otaksuttavat Prostate Cancer Drug Targets

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, ja

TPX2

valittiin edelleen Validation

RNAi näytöt vahvisti rooli useiden aiemmin julkaistu eturauhassyövän lääkekohteita kasvun ja apoptoosin säätelemiseksi geenien viljellyissä eturauhasen syöpä solut. Muun muassa nämä geenit sisältyvät

CLDN3

,

CYP4F8

,

EPHX2

,

FAAH

,

FOXA1

,

MTDH

,

ODC1

,

PLA2G2A

,

PLA2G7

,

SIM2

ja

UBE2C

[30], [33] – [41] (tukeminen taulukko S2).

neljä novel ehdokas lääkekohteita,

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, ja

TPX2

, valittiin lisätutkimuksia perustuu voimakasta ilmentymistä eturauhassyövässä verrattuna normaalissa eturauhasessa ja kaikki muut normaalit kudokset sisältyvät GeneSapiens tietokantaan (tukeminen kuvio S1), sekä niiden uutuuden säätelijöinä eturauhasen syöpäsolujen lisääntymistä ja apoptoosin.

AIM1

,

TMED3

ja

TPX2

olivat 17 geenien hiljentämisen joka indusoi antiproliferatiivisia vaikutuksia sekä Vcap ja LNCaP-solut, sekä apoptoosia ainakin yhden solulinjat. Hiljentäminen

ERGIC1

aiheuttama antiproliferatiivista vaikutusta erityisesti ERG onkogeenin positiiviset VCAP soluja (tukeminen taulukko S2).

AIM1

,

ERGIC1

ja

TMED3

olivat koekspressoidusta joukon geenejä toiminnallisesti annotoituna ER ja Golgin laitteeseen ja redox reaktioita, kun taas

TPX2

keskuudessa ilmaistiin osallistuvien geenien mitoosin (kuvio 2D).

AIM1 proteiini on jäsenenä βγ-kiteisen superperheen. Toisin kuin muut β- ja γ-crystallines, tiedetään spesifisesti ilmaistaan ​​pidentämällä linssin kuitua soluja, jotka käyvät läpi suuria muutoksia solun tukirangan arkkitehtuurin ja koostumuksen, AIM1 on ei-linssi rooli. Kuitenkin AIM1 proteiinisekvenssi on heikko samankaltaisuus filamentti tai aktiini-sitovien proteiinien, viittaa mahdolliseen rooli hallinnassa solumorfologian ja muoto [42].

AIM1

geeni paikantuu 6 Q21, sisällä otaksuttu tuumorisuppressori alue ihmisen melanooman, ja AIM1 ilme on osoitettu muuttua yhdessä tuumorisuppressiogeeneksi ihmisen melanooman malli [43]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että

AIM1

ei ole tärkein tuumorisuppressorigeeniä in del6q21 luonnollisissa tappaja solusyöpiä [44], [45]. Tukeminen mahdollista roolia

AIM1

tuumorisuppressorina, AIM1 metylointi on liittynyt nenänielusyöpä ja primaarikasvaimen invaasio virtsarakon syöpään [46], [47]. Toisaalta, AIM1 ilmentyminen on osoitettu olevan korkea TRAIL resistenttejä syöpäsolulinjoissa [48].

ERGIC1 on pyöräily membraaniproteiini edistää kalvon liikennettä ja selektiivinen kuljetus rahdin välillä Ger Väliosastossa, ja Golgin laitteessa [49], kun taas TMED3 on ainesosa päällystetty rakkulat, jotka ovat mukana kuljettamiseen lastin molekyylien ER: sta Golgin monimutkaisia ​​ja toimivat reseptorit eritystekijän lastin [50]. Vaikka tarkkaa roolia ERGIC1 ja TMED3 syövän vielä selvittämättä, toimintahäiriön proteostasis ja ER tiedetään indusoivan stressin vastaus (avattuna proteiini vaste), joka johtaa apoptoosin syöpäsoluissa [51], [52].

TPX2 yksinomaan ilmaistaan ​​jakautuviin soluihin siirtymisestä G1 /S loppuun asti sytokineesiin. Mitosis on suuri biologinen prosessi vapautettiin syövän ja tärkein biologinen prosessi kohteena sytotoksiset lääkkeet. Mielenkiintoista, TPX2 tiedetään olevan erittäin ilmaistaan ​​eri syövän kudoksissa, ja se on ehdotettu biomarkkerina huono ennuste [53] – [55]. Koska merkittävä säätelijä solusyklin ja sitova kumppani Aurora kinaasi, TPX2 on ehdotettu myös mahdollisena huumeiden tavoite useiden maligniteettien [56] – [58]. Kuitenkin, TPX2 ei ole tutkittu eturauhassyövän aiemmin. On ehdotettu, että TPX2 kohdennettu hoito voi olla tehokkaampaa kuin käyttää Aurora kinaasin estäjät, koska epäspesifisen luonteen tavanomaisen estäjät [58]. Lisäksi yhdistämällä TPX2 ja Aurora kinaasi kohdistettuja hoitomuotoja voi estää kehitystä lääkeresistenssin [59], [60].

validointi

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, ja

TPX2

Expression ja siRNA aiheuttama Target geenien in viljellyissä eturauhasen soluissa

mRNA ilmaus

AIM1

,

ERGIC1

TMED3

, ja

TPX2

tutkittiin kuudella eturauhassyövän (VCAP, PC-3, MDA-PCa-2b, LNCaP, DU145 ja 22Rv1) ja kolme ei-pahanlaatuista eturauhasen epiteelisolujen linjat (RWPE-1, PrEc-, EP156T) (kuvio 3A). Erityisesti

ERGIC1

ja

TMED3

havaittiin olevan erittäin ilmaistaan ​​syöpä, mutta ei ei-pahanlaatuisten solulinjojen. Niistä pahanlaatuisten solulinjojen

AIM1

,

ERGIC1

, ja

TMED3

olivat korkeimmin ilmaistu VCAP, ja

TPX2

LNCaP-soluissa. Kaksi siRNA: t per geeni, valitaan perustuu kohde hiljentäminen tehoa, valittiin validointitutkimuksissa (kuvio 3B ja tukeminen Kuva S2). Tulokset 72 h solujen elinkelpoisuuden ja apoptoosimäärityksessä vahvisti antiproliferatiivinen vaikutus

TMED3

ja

TPX2

hiljentäminen molemmissa solulinjoissa. Kuten odotettua perustuva seulonta tuloksia,

ERGIC1

oli rooli erityisesti ERG onkogeenin ilmentävien VCAP solujen elinkykyä. Vaikka AIM1 siRNA: t pystyivät vähentää Vcap solun elinkykyä, ei ole johdonmukaista vaikutuksia havaittiin LNCaP-soluja (kuvio 3C). Kaspaasi 3/7 aktiivisuus tehostui pääasiassa vastauksena

TPX2

ja

TMED3

hiljentäminen LNCaP-soluissa, kun taas

TPX2

ja ERGIC1 hiljentäminen aiheutti apoptoosia VCAP soluissa sekä siRNA (kuvio 3D).

. MRNA ilmentymistä kohde- geenien 6 eturauhassyövän (VCAP, PC-3, MDA-PCa-2b, LNCaP, DU145 ja 22Rv1) ja 3 ei-pahanlaatuiset (RWPE-1, PrEc-, EP156T) eturauhasen solulinjoissa. Kunkin geenin suhteelliset mRNA ilmaisun RWPE-1 solulinja asetettu 1. B. validointi kohde- geenien. MRNA taso kunkin geenin valvonta näyte on asetettu 100%. C. Vaikutus kohde- geenien päälle VCAP ja LNCaP solujen elinkelpoisuuden 72 tunnin aikapisteessä. D. vaikutus kohde- geenien induktioon apoptoosin Vcap ja LNCaP-soluja 72 tunnin aikapisteessä. Tuloksia on verrattu salattu siRNA aiheuttamat muutokset ja merkitys antiproliferatiivisia ja pro-apoptoottisia vaikutuksia on osoitettu. KIF11 siRNA on käytetty positiivisena kontrollina.

AIM1

,

ERGIC1

, ja

TPX2

ekspressoidaan voimakkaasti Clinical Eturauhassyöpä näytteet

validointi kohdegeenin ilmentymisen kuviot kliinisissä eturauhasessa vahvisti, että AIM1, ERGIC1, ja TPX2 mRNA-tasot olivat merkittävästi koholla eturauhassyöpäkudoksille (n = 33), verrattuna ei-pahanlaatuinen kudosnäytteisiin (n = 3). Kaikki syövän näytteet ilmaisivat AIM1 mRNA korkeammalla tasolla kuin mitä tahansa ei-pahanlaatuinen näytteitä; kun ERGIC1 oli yli-ilmentynyt 94% (n = 31), ja TPX2 64% (n = 23), syövän näytteitä. Vaikka lupaavia tuloksia TMED3 ekspressiokuvioiden viljellyissä eturauhasen soluissa, TMED3 mRNA ilmentyi yhtä suuri kuin tasojen ei-pahanlaatuisten ja syöpää kudosten (kuvio 4A). Vertailun vuoksi mRNA-tasot avain eturauhassyövän onkogeenien AR ja ERG määritettiin myös samalla kliiniset näytteet, ja tulokset esitetään lämpökarttana kuvassa 4B. Neljästä mahdollisia uusia kohdegeenien,

ERGIC1

(R = 0,51) ja

TMED3

(R = 0,69) ekspressiokuvioiden korreloi voimakkaimmin kanssa

AR

lauseke (kuva 4C). Lisäksi, vaikka ERGIC1 ja TMED3 olivat erittäin ilmaistaan ​​sekä ERG negatiivisten ja positiivisten eturauhassyöpien, niiden mRNA-ekspressiotasot korreloi positiivisesti ERG ekspressiotasot ERG positiivisten näytteiden (P = 0,002 ja P = 0,007 vastaavasti) (kuvio 4D). Vertailu kohdegeenin ilmentymisen kanssa kliinisten parametrien paljasti, että

AIM1

korreloivat merkitsevästi (P ​​= 0,03) kanssa nuorena ( 60-vuotiaat) (kuvio 4E). Lisäksi korkea

TPX2

ilmaisu korreloi eturauhasen antigeenin (PSA) vika (P = 0,02), ja joihin liittyy suuria WHO: n luokitukset ja nuorena (kuvio 4F). Mitään tällaista yhdistykset löydettiin ERG1C1 tai TMED3 mRNA: n ilmentymisen.

. MRNA ilmentymistä kohde- geenien 33 ensisijainen eturauhassyövän ja 3 ei-pahanlaatuiset eturauhasen kudosnäytteitä. Keskimääräinen ekspressio ei-pahanlaatuisen näytteet on asetettu 1. B. Heatmap visualisointi geenin-viisasta skaalataan suhteessa mRNA: n ilmentymisen arvot

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

,

TPX2

,

ERG

, ja

AR

33 ensisijainen eturauhassyöpäkudoksille. Heatmap piirretään perustuu ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi ilmaisua arvoja. Suhteellisen keskimääräisen ilmentymistaso normaalin vertailunäytteet oli asetettu 0. C. Co-ekspressiomalleja välillä ERGIC1 ja AR-mRNA: n, samoin kuin TMED3 ja AR-mRNA: n 33 ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä. D. ry ERGIC1 ja TMED3 mRNA: n ilmentymisen kanssa ERG mRNA: n ekspression ERG positiivinen ensisijainen eturauhasen kasvain (n = 19). E. suhteellinen mRNA ilmaus

AIM1

perusterveydenhuollossa eturauhassyöpänäytteissä verrattuna potilaan ikään. F. Suhteellinen mRNA ilmaus

TPX2

perusterveydenhuollossa eturauhassyöpänäytteissä verrattuna esiintymisen PSA vika, WHO kasvaimen ja potilaan ikä.

AIM1

,

ERGIC1

,

TMED3

, ja

TPX2

kaikki säätelemä

ERG

Oncogene ja androgeenien viljellyissä Eturauhassyöpä Cells

arvioida mahdollista roolia ERG ja AR säätelyssä nämä eturauhasen syöpäsolun kasvua edistävät geenit, vaikutus

ERG

ja

AR

vaiennettu, sekä androgeenideprivaatio ja stimulaation kohdegeenin ilmentyminen analysoitiin. Yllättäen

ERG

hiljentäminen vähensi mRNA: n ilmentymisen kaikkien neljän kohdegeenien Vcap soluissa (kuvio 5A). Lisäksi

AR

hiljentäminen vähensi mRNA ilmaus

AIM1

LNCaP-soluissa ja

TPX2

sekä VCAP ja LNCaP, kun taas ilmaus TMED3 mRNA lisääntyi (kuva 5B). Yllättäen vaikka

ERG1C1

ilmentyminen liittyi

AR

ja AR ajetaan

ERG

ilmaisun kliinisissä eturauhassyövissä, mitään suuria muutoksia ei havaittu ilmentyminen ERGIC1 mRNA: n ekspression vastauksena AR hiljentäminen. Huolimatta erilaisia ​​vaikutuksia AR hiljentäminen on kohdegeenin ilmentymistä, androgeenien puute vähentynyt ja synteettisen androgeenin R1881 indusoi ekspressiota kaikkien kohdegeenien LNCaP-soluissa verrattuna ekspressiotasot havaittiin androgen menettänyt olosuhteissa (kuvio 5C). Ilmaisu kohdegeenien tutkittiin myös LNCaP johdannaisten viljellä vakaa androgeenireseptorin ablatoitu olot matkien kastraatio kestäviä kasvaimia. Tulokset osoittavat merkittävää kasvua AIM1 ilmaisun ablatoitu soluissa verrattuna vanhempien viljeltyjen solujen normaalin media (kuvio 5D).

. Vaikutus 48 h

ERG

hiljentäminen sen ilmentymistä kohdegeenien VCAP soluissa. B. vaikutus 48 h

AR

hiljentäminen sen ilmentymistä kohdegeenien Vcap ja LNCaP-solut. C. Vaikutus 24 tunnin androgeenideprivaatio ja juokseva 24 h androgeenistimulaation (10 nM R1881) ilmenemistä kohdegeenien LNCaP-soluissa. D. taso kohde-mRNA ilmaisun LNCaP-soluissa viljelty normaalissa media (FBS) ja chargoal-riisuttu (CS-FBS) androgeenien ablatoitu media. E. vaikutus 72 h

TPX2

hiljentäminen proteiinien ilmentyminen AR ja PSA. β-aktiini on käytetty latauskontrollina. Tilastollinen merkitsevyys verrattuna ohjata kokeessa on ilmoitettu.

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ekspression mahdollisten uusien lääkekohteiden

AIM1

,