Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lung adenokarsinooma, yleisin alatyyppi keuhkojen syöpä, on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Huolimatta yrityksistä hoitoon keuhkosyöpä, joka on kertynyt, lupaavia uusia hoitoja tarvitaan edelleen. Tässä olemme huomanneet, että syklisen AMP: n vaste-elementti sitova proteiini (CREB) -CREB sitova proteiini (CBP) transkriptiotekijöiden kompleksin estäjä, naftoli AS-TR fosfaatti (NASTRp), on mahdollinen terapeuttinen aine keuhkosyöpään. Osoitamme, että NASTRp esti onkogeeniset solujen ominaisuudet läpi solusyklin pysähtymisen samanaikaisessa tukahduttaminen kasvain edistäviä autophagy down-asetusten Atg5-12 ja Atg7, ja kertymistä p62 ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Lisäksi NASTRp indusoima Endoplasmakalvosto stressin markkereita, kuten DDIT3 /CHOP, ja johti apoptoosin yhdessä Bim induktio. Nämä havainnot viittaavat siihen, että transkriptiotekijä /koaktivaattoria monimutkainen, CREB-CBP, voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde ja sen estäminen voisi olla uusi terapeuttinen strategia keuhkosyöpään.

Citation: Lee JW, Park HS, Park SA, Ryu SH, Meng W, Jürgensmeier JM, et al. (2015) romaani pienimolekyylisiä Inhibitor Targeting CREB-CBP Complex Hallitsee Anti-Cancer vaikutukset yhdessä Cell Cycle asetuksen Autophagy tukahduttamiseksi ja Endoplasmakalvosto Stress. PLoS ONE 10 (4): e0122628. doi: 10,1371 /journal.pone.0122628

Academic Editor: Hyun-Sung Lee, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 23 helmikuu 2015; Julkaistu: 21 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Cancer Institute apurahan R01-CA126801 (JSK), Pilot avustusta Yale Kattava Cancer Center (JSK), ja National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA-16359 (Yale Kattava Cancer Center).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa, ja on arvioitu, että 159480 keuhkosyöpäpotilaita kuolee Yhdysvalloissa vuonna 2013 [1]. Noin 25% keuhkojen adenokarsinooman, määräävä muoto keuhkosyöpään satama kasvaimia synnyttävän

KRAS

mutaatioita, ja tämä aiheuttaa merkittävän terapeuttinen haaste, koska

KRAS

mutaatiot liittyvät yleensä huonoon ennusteeseen ja kestävyys kemoterapian [2, 3]. Suora farmakologinen kohdentaminen aktivoitua KRAS mutantti proteiini on hävinnyt tähän mennessä siten, vaihtoehtoisia lähestymistapoja estää KRAS aktivoinnin signalointireitille harkitaan. Erityisesti KRAS ajaa aktivointi syklisen AMP elementin sitova (CREB) kautta RAF /MEK /ERK-signalointireitin pakottaa syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä. Siten, yksi vaihtoehto kasvun inhiboimiseksi KRAS mutantin kasvaimet voivat olla kohdistaa transkriptiotekijöiden (esim CREB), jotka ovat usein lopullisen säädin useita signaloinnin prosessien, ja se voisi mahdollisesti olla suunnattu riippumatta muutoksista alkupään signaloinnin osista syövän kehittymisessä, etenemisen ja invaasio /etäpesäkkeitä.

CREB on kriittinen transkriptiotekijä mukana normaalissa homeostaasin [4-6], aineenvaihdunta [7], muisti /oppiminen [8], useat syövät [9-12] ja immuuni sairauksien [13]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CREB on hyvin ilmen- tymisen lisääntymisen ja hyperfosforyloitunut useimmissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvain näytteet ja että tämä säätelyä merkittävästi liittyy huono eloonjäämisasteesta [10-12]. CREB fosforyloituu seriini /tähteiden riippuen ärsykkeet solunulkoisia osia ja useita alkupään kinaasien. Aktivoitu /fosforyloitu CREB värvää sen transkription koaktivaattori, CREB: tä sitova proteiini (CBP) ja cAMP-vaste-elementtiin (CRE) alue kohdegeenien [14]. Tämä rekrytointi CBP on kriittinen askel transkription aktivoituminen CREB [15]. Näin ollen, estää vuorovaikutuksen CREB-CBP voisi olla lähestymistapa inhiboida CREB transkriptionaalista aktiivisuutta. Itse asiassa, tunnistaminen pienmolekyylisalpaajien häiritsemällä muodostumista CREB-CBP kompleksin kautta kohdistaminen KID ja KIX domeenien CREB ja CBP vastaavasti on raportoitu käyttämällä NMR seulontaan [16]. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet, että yksi näistä estäjiä, 2-Naftoli-AS-E fosfaatti (KG-501), joka välittömästi kohdistuu KIX verkkotunnuksen CBP, johti häiritsi CREB-CBP monimutkainen, esti CREB-kohdegeenin induktion ja esti IL-1β välittämää angiogeeninen aktiivisuus NSCLC [10].

Koska tavoitteena on parantaa terapeuttisen yritetty keuhkosyövän kätkeminen KRAS mutantti, löysimme monikäyttöinen transkriptiotekijä estäjän nimeltään Naphthol AS-TR fosfaatti (NASTRp), kohdistaminen CREB-CBP kompleksi, kuten on voimakas syövän aine keuhkosyöpään. Yhdessä NASTRp osoitti selkeää tehoa useisiin biologisiin määrityksiin ja voi ja tulee olemaan potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa ihmisen syöpiin, erityisesti keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat, A549, NCI-H1734, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H23, NCI-H1975 ja NCI-H520-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) . Normaalin ihmisen tracheobronchial epiteelin (NHTBE) solut saatiin Lonza (Walkersville, MD, USA). Solulinjat siirrostettiin vähemmän kuin 6 kuukautta elvytys ja ei todennettu. Kaikki syöpäsolulinjat pidettiin alle 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI-1640-alustassa (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 1% Antibotic-Anti-sieni (Anti-anti, Life Technologies). NHTBE soluja viljeltiin BEBM täydennetty kasvutekijöiden ja hormonien, jonka manufactory (Lonza) ja kolme-demensional organotypic ilma-nesterajapinnan (ALI) soluviljelmää menetelmää hyödynnettiin NHTBE soluviljelmässä, kuten aiemmin on kuvattu [5, 17-19 ]. HEK293T-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1%: Anti-anti.

leviämisen, pesäkkeiden muodostumisen ja pehmeä agar määritykset

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille 2 x 10

3 solua /kuoppa RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% lämpöinaktivoitua FBS: ää ja ilman Anti-Anti. Soluja käsiteltiin naftoli AS-TR fosfaatin dinatriumsuolan suolat (NASTRp, Sigma-Aldrich, N6125), kuten 0-80 umol /l 96 tunnin ajan. Soluproliferaatiota mitattiin MTT tai CellTiter Glo luminoiva solunelinkykyisyysmääritys (Promega, Madison, WI, USA). Solujen elinkelpoisuuden ajoneuvon käsiteltyjä soluja oli asetettu 100% ja proliferaation. Pesäkkeiden muodostumista määrityksessä, solut ympättiin 6-kuoppalevyille 1 x 10

3 solua /kuoppa. Soluja käsiteltiin NASTRp 0, 5, 10, ja 20 umol /l ja muutettiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi NASTRp joka toinen päivä 10-17päivä jossa vaiheessa 0,1% (paino /tilavuus) kristalliviolettia (Thermo Scientific, NJ , USA) käytettiin visualisoimaan pesäkkeitä. Pehmeä agar määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, pesäkkeet värjättiin p-iodonitrotetrazolium violetti (Sigma-Aldrich) ja valitse elossa pesäkkeitä, ja sitten värjättiin pesäkkeet laskettiin käyttäen Image J ohjelmisto (NIH, USA). Pesäke määriteltiin mitään joissa on enemmän kuin 10 solua, kuten on esitetty 50 kuvapistettä Kuva J.

Quantitative käänteistranskriptio-PCR

qRT-PCR-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11 ]. Lyhyesti, kokonais-RNA puhdistettiin soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Käänteistranskriptio kokonais-RNA suoritettiin käyttäen MMLV-käänteistranskriptaasia (Promega). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Core reagenssit (Applied Biosystem, Life Technologies). Kaikki alukkeet ostettiin Keck (New Haven, CT, USA). Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja ribosomaalisen proteiinin L32 cDNA tasoja käytettiin endogeenista ohjaus. Aluke sekvenssejä käytetään qRT-PCR olivat seuraavat: sykliini A2; eteenpäin; 5′-CCAAGAGGACCAGGAGAATA-3 ’, käänteinen; 5’-CGGTGACATGCTCATCATT-3 ’, sykliini B1; eteenpäin; 5’-AGTCACCAGGAACTC GAAAA-3 ’, käänteinen; 5’-GTTACCAATGTCCCCAAGAG-3 ’, sykliini-D1; eteenpäin; 5’-CTTC AAATGTGTGCAGAAGG-3 ’, käänteinen; 5’-AGCGGTCCAGGTAGTTCAT-3 ’; Sykliini E2; eteenpäin; 5’-AGAGAGGAGGTCACCAAGAAA-3 ’, käänteinen; 5’-CAGGCAAAGGTGAAGGAT TA-3 ’, GRP78; eteenpäin; 5’-CACAGTGGTGCCTACCAAGA-3 ’, käänteinen; 5’- TGTCTTTTGTC AGGGGTCTTT-3 ’, CHOP; eteenpäin; 5’-AGCCAAAATCAGAGCTGGAA-3 ’, käänteinen; 5’-TGG ATCAGTCTGGAAAAGCA-3 ’, IRE1; eteenpäin; 5’-CTCTGTCCGTACCGCCC-3 ’, käänteinen; 5’GAAGCGTCACTGTGCTGGT-3 ’, Perk; eteenpäin; 5’-TCATCCAGCCTTAGCAAACC-3 ’, käänteinen; 5’-ATGCTTTCACGGTCTTGGTC-3 ’, ATF6; eteenpäin; 5’-GCAGAAGGGGAGACAC ATTT-3 ’, käänteinen; 5’-TTGACATTTTTGGTCTTGTGG-3 ’, XBP1; eteenpäin; 5’-CGAATGAG TGAGCTGGAACA-3 ’, käänteinen; 5’-GGCCATGAGTTTTCTCTCGT-3 ’, L32; eteenpäin; 5’-CAC CAGTCAGACCGATATGT-3 ’, käänteinen; 5’-ACGTTGTGGACC AGGAACT-3 ’. Reaaliaikaisen PCR data-analyysi suoritettiin käyttäen vertailevaa kynnys (Ct) menetelmä iCycler -lämpösyklilaitteella analysaattori ohjelma (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Tietokanta valmistelu, haku ja molekyylitason telakointi mallinnus

Kaikki mallinnus laskelmat suoritettiin neljän prosessorin MIPS R16000 Silicon Graphics Tezro käynnissä Sybyl 7.1 mallinnuksen Suite. Rakenteellinen sisältävät tietokannat yli 600000 rakenteita, jotka koostuvat saatavista yhdisteistä lähes 50 kaupallisilta myyjiltä kemiallisten tietokannoista [20]. Yhdiste kirjastot saatiin SDF-tiedostomuodossa [21] ja kaksiulotteinen samankaltaisuutta haku ajettiin kunkin tietokannan hyödyntämiseen DB haku komento. Tuloksena hittilistoille yhdistettiin yhteen yhteiseksi osuma listan kolmiulotteisen (3D) SLNs. DBslnfilter käytettiin suodattaa pois rakenteita, jotka sisältävät seuraavia ominaisuuksia: seokset, metallit, isotoopit, ei 3D koordinaatit, MW 100, tai MW 500. Osuma listan manageri sovellettiin poistaa kaikki yhdisteet, paitsi ne, jotka sisältävät karboksylaatit, fosfaatit ja sulfonamidit. KIX verkkotunnuksen koordinaatit saatiin ottamalla keskiarvo NMR rakenteet KIX domain (ATE ID: IKDX). KIX ja NASTRp koordinoida luotiin käyttäen phenix.elbow [22]. Telakka laskelmat tehtiin käyttäen HEX 6,3 [23]. Korrelaatio jollaisia ​​käytetään telakka on ”Shape + Electrostatistics”. Yhdiste samankaltaisuus seulonta suoritettiin käyttäen pubchem yhdisteet.

virtaussytometrinen analyysi ja apoptoosimäärityksessä

Virtaussytometria ja TUNEL-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. NCI-H441 ihmisen keuhkojen adenokarsinooman soluja käsiteltiin NASTRp seurasi värjäys PI /RNaasi värjäyspuskurilla (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Solusyklin jakautuminen analysoitiin BD LSRII virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja FlowJo ohjelmisto (Treestar, Ashland, OR, USA). Tunel määritystä, A549 ihmisen keuhkon adenokarsinooman soluja käsiteltiin NASTRp 48 tuntia ja sen jälkeen värjäys ApopTag Fluoreseiini suora in situ Apoptosis Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

immunoblotting, samanaikainen immunosaostus ja Immunofluoresenssimääritykset

natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja western blotting suoritettiin ekspression analysoimiseksi eri proteiineja. Solulysaatit lyysattiin RIPA-lyysipuskuria (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% SDS, 1% Natriumdeoksikolaatti, 1% NP-40), johon on täydellinen EDTA vapaa proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit cocktailit (Roche, South San Francisco, CA, USA) ja sille suoritettiin immunoblottauksella käyttämällä erilaisia ​​vasta-aineita. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-sykliini A2 (# 4656), anti-sykliini B1 (# 4138), anti-sykliini E2 (# 4132), anti-LC3B (# 3868), anti-ATG7 (# 8558), anti- -ATG5 (# 12994), anti-GRP78 /Bip (# 3177), anti-kaspaasi 3 (# 9665), anti-katkaistuun Caspase 3 (# 9579), anti-Phospho-CREB (S133; # 9198) ja anti Bim (# 2933), Cell Signaling Technology, anti-sykliini D1 Epitomics (# 2261-1, Burlingame, CA, USA), anti-p62 /SQSTM1 Amerikasta Research Products (03-GP62-C, Waltham, MA, USA ), anti-CHOP päässä Novus Biologicals (NBP2-13172, Littleton, CO, USA), anti-β-aktiini ja anti-FLAG Sigma-Aldrich (A2228). For co-immunoprecipiation määrityksessä, HEK293T-solut ko-transfektoitiin pcDNA3-HA-KIX (CBP; aminohapot 586-666) ja pcDNA3-Myc-KID (CREB, aminohapot 87-146 välillä transkriptin vaihtoehto A) käyttäen Lipofectamine 2000 ( Life Technologies). 48 tuntia transfektion jälkeen, solut, jotka on esikäsitelty NASTRp 3 tunnin kuluessa 10 uM forskoliinia (Sigma-Aldrich) anto lisää 1 tunti. Solulysaatit valmistettiin IP-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10% glyseroli, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100), johon on täydellinen EDTA-vapaa proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit cocktailit. Pre-puhdistaa lysaatit altistettiin immunosaostus käyttäen anti-HA-hiiren monoklonaalinen vasta-aine (MMS-101P, Covance, Princeton, NJ, USA) kanssa konjugoidun proteiini A /G PLUS-agaroosi (sc-2003 Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Käyttäen Flag-CREB1, jotka ilmentävät stabiilisti 293T, näitä stabiileja solut transfektoitiin pcDNA3-HA-KIX, minkä jälkeen hoitoja forskoliinin tai NASTRp kuten edellä on kuvattu. Immuunijärjestelmän komplekseja avattavasta anti-Phospho-CREB-vasta altistettiin SDS-PAGE ja Western blot. Sillä immunofluoresenssimäärityksellä, A549 ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinjoja käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia ja sen jälkeen kiinnitys 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kiinnitetyt solut läpäiseviksi 50 mg /ml digitoniinia PBS: ssä (D141, Sigma-Aldrich) ja vielä 10 minuuttia. Estetty solut 3% naudan seerumin albumiinia (BSA, A9647, Sigma-Aldrich) käytettiin koettimena primaaristen vasta-aineiden ja sen jälkeen konjugaatio Alexa Fluor 488 ja 568 aasin anti-kani-IgG-vasta-aineita (Life Technologies), ja p62 /SQSTM1 ja CHOP, vastaavasti . Stained solut asentaa Prolong Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI (Life Technologies) ja seurasi havainnon alla fluoresenssimikroskoopilla (Olympus America Co., Center Valley, PA, USA).

Kaplan-Meier piirtäminen analyysi

analysoimiseksi korrelaatio potilaan selviytymistä keuhkoadenokarsinooma ja ilmauksia autophagy proteiinia, kuten ATG7 (Affymetrix ID: 218670_s_at), ATG5 (210639_s_at) tai p62 /SQSTM1 (201471_s_at), otimme tietokantojen tulokset Kaplan-Meier piirturi (https://www.kmplot.com) [24] kriteerit; (1) yleiseen eloonjäämiseen (OS), (2) split potilaiden mediaani, (3) seuranta kynnys 9, (4) Histologia kuten adenokarsinooma, (5) Coxin kuten uni-variate ja (6) array laadunvalvonta ulkopuolelle puolueellinen taulukot.

TILASTOANALYYSI

Jokainen koe toistettiin ainakin kolme riippumatonta kertaa. Sillä sukupolvi kuvaajia ja tilastollisten analyysien, Graph Pad Prism-ohjelmiston (v.6) käytettiin.

P

arvot ryhmien välillä määritettiin kahden hännät parittomia Student

t

testejä.

Tulokset

tunnistaminen naftolin analogeja CREB-CBP transkriptio tekijä /koaktivaattoria kompleksin estäjät

aiemmin osoitettu, että CREB on kriittinen transkriptiotekijä kehittämiseen keuhkosyövän kautta osallistumista solujen eloonjäämistä, solusyklin etenemistä, lisääntymistä ja apoptoosia asetuksen [5, 6, 10- 12]. Ensin ehdotti, että CREB voi olla molekyyli tavoite ehkäisyyn ja hoitoon NSCLC [11]. Itse asiassa, osoitimme, että CREB säätelee IL-1β-säännelty CXC-kemokiinien, kriittinen solujen vaeltamiseen ja angiogeneesiä NSCLC käyttäen KG-501 [10]. Niinpä nämä tutkimukset johtavat perustelut tunnistamiseksi pienmolekyylisalpaajien kohdistaminen CREB transkriptioaktiviteettia kuvattu tässä tutkimuksessa. Tunnistaa paremmin yhdisteitä, me aluksi valitaan yhteensä 4547 yhdisteistä, joka koostui kaksiulotteisen samankaltaisuus sulku 80% käyttäen KG-501 rakenne kyselyn. Koska fosfaatin KG-501 rakenne pidettiin tärkeänä osana, vuokrasopimuksen osa, sen liukoisuuden, valinta sitten edelleen puhdistettu varmistaa sisältämät yhdisteet ryhmät katsotaan vastaavan fosfaatin ja tämä johti 67 lääkeaihioihin. Näistä pidämme tunnistettiin 6 yhdisteet naftolin analogeja, joilla on syövän vaikutukset, kuten on esitetty kuviossa 1A.

(A) Kemialliset rakenteet on s_elected naftolin analogeja. (B) Estovaikutus on naftolin analogien solujen kasvuun NCI-H1734 keuhkon adenokarsinoomasolulinjan. Solujen elinkelpoisuus 96 tunnin kuluttua hoitojen mitattiin MTT määrityksessä absorbanssi 590 nm. Kokeet kolmena rinnakkaismäärityksenä ja toistettiin vähintään kolme kertaa.

Sen määrittämiseksi, onko ehdokas yhdisteillä on syövän vaikutusta, ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinja, NCI-H1734, altistettiin eri pitoisuuksille 6 valittujen yhdisteiden. Kaikki yhdisteet osoittivat estävää vaikutusta solujen lisääntymistä kuten osoitetaan IC50 (kuvio 1 B). Näistä NASTRp oli tehokkain yhdiste näissä proliferaatiomäärityksissä esitetyllä: IC 50 = 3,701 umol /l.

vieressä suoritettu telakointi ja laskennan avulla NASTRp ja KIX verkkotunnuksen CBP ligandina ja reseptori, vastaavasti . Tulos osoittaa, että NASTRp on lähellä Arg-600 on KIX verkkotunnuksen CBP, kriittisen tähteen varten CREB-CBP vuorovaikutus, sopusoinnussa KG-501 (S1A kuvio; ref. [17]). Olemme lisäksi havaittu, että NASTRp poistetaan kokonaan paitsi vuorovaikutusta KIX ja lapsi kotransfektoidaan HEK293T soluissa, mutta myös vuorovaikutusta fosforyloidun täyspitkä CREBin ja KIX in Flag-merkityn CREB ilmentävät stabiilisti 293T cellsby yhteistyössä immunopresipitaatiomäärityksiä (S1B ja S1C Kuva). Näin ollen, NASTRp valittiin ja tutkitaan edelleen biologisiin määrityksiin on kuvattu tässä asiakirjassa.

Anti-cancer vaikutuksia NASTRp ihmisen keuhkosyövän solulinjat

määrittämiseksi syövän effiect of NASTRp, useita keuhkosyövän solulinjat valittiin solujen lisääntymisen määrityksessä. Aluksi päätimme -solut

KRAS

mutaatioita; A549 (KRAS-G12S), NCI-H1792 (KRAS-G12C), NCI-H441 (KRAS-G12V) ja NCI-H1734 (KRAS-G13C). Määrittää inhiboiva vaikutus solujen proliferaatioon, kukin solulinja altistetaan eri annoksia NASTRp. Yhdenmukainen anti-proliferatiivista vaikutusta NASTRp NCI-H1734-soluissa, kuten on esitetty kuviossa 2A, NASTRp dramaattisesti tukahdutetaan solujen proliferaatiota kaikissa keuhkosyövän solulinjoja

KRAS

mutaatioita testasimme (IC50 = A549, 3,574 uM, NCI-H1792, 11,769 uM; NCI-H441, 11,074 uM, NCI-H1734, 4,025 uM). Koska voimakas estävä vaikutus solujen proliferaatioon NASTRp laajensimme keuhkosyöpään solujen keuhkosyöpään solulinjoja kätkeminen

EGFR

mutaatioita, NCI-H1975 (EGFR-L858R /T790M) ja okasolusyöpä erittäin ilmentävät FGFR ja CREB, NCI-H520 (IC 50 = NCI-H1975, 8,891 uM, NCI-H520, 4,363 uM; ref. [11]). Havaitsimme myös, että NASTRp esti merkitsevästi solujen kasvua matalan seerumin sisältämien kunnossa käsittelyn aikana (S2 Kuva). Huomasimme, että NASTRp osoitti merkittävää antiproliferatiivista vaikutusta opinnäytetöitä keuhkosyövän solulinjat riippumatta sen geneettinen mutaatio asema.

(A) Estovaikutus on NASTRp soluproliferaatioon ihmisen keuhkosyövän solulinjat. A549, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H1734, NCI-H1975 ja NCI-H520-solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla NASTRp RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 5% FBS: ää 96 tunnin ajan. Soluproliferaatiota arvioitiin CellTiter Glo määrityksellä, kuten on kuvattu menetelmät. (B) Pientiheyksinen pesäkemuodostusta kanssa NASTRp hoitoon. Solut, kuten single-soluviljelmiä ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla NASTRp annettiin kulttuurin, kunnes suuria pesäkkeitä oli näkyvissä. Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin laskea. (C) tukahduttaminen Anchorage riippumattoman kasvun NASTRp. Solut, joilla on alhainen tiheys agaroosia (0,4%), joka sisälsi eri pitoisuuksia NASTRp. NCI-H1734-soluja esitetään edustavat kuvat pehmytagar määrityksen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmen kuopan. *

P

0,05 vs. ajoneuvo.

Seuraavaksi tunnettu siitä NASTRp vaikuttaa pesäkkeiden muodostumista ja ankkurointi riippumaton solujen kasvua. Yhdenmukainen inhiboivaa vaikutusta NASTRp soluproliferaatioon, pesäkemäärät kaikkien keuhkosyövän solut dramaattisesti vähentynyt NASTRp käsittely kiinnittymisestä riippuvaisten ja riippumattomien solujen kasvua (kuvio 2B ja 2C, S3 kuvassa). Sen määrittämiseksi, oliko syövän vaikutus NASTRp on spesifinen keuhkosyöpä, teimme samankaltaisia ​​solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset haiman ja rintasyövän soluissa. Havaitsimme estäviä vaikutuksia NASTRp soluproliferaatioon ja pesäkkeiden muodostumista haimasyövän soluja (PANC-1, AsPC-1 ja SU.86.86.) Ja rinta- syöpäsolujen (MCF-7, MDA-MB-231 ja SKBR3) sekä (S4 kuvio). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että NASTRp inhiboi solujen proliferaatiota, pesäkkeiden muodostumisen ja ankkurista riippumaton kasvu ihmisen syöpäsoluja, mukaan lukien ainakin, keuhko-, haima- ja rintasyöpä solulinjoissa.

induktio solusyklin pysähtymisen kautta alassäätöä sykliinien tekijänä NASTRp

on osoitettu, että CREB säätelee solusyklin etenemistä läpi säätely ylöspäin sykliini proteiinien kuten sykliini D1 ja sykliini A2, jotka sisältävät CRE tekijöitä heidän promoottorialueille [25, 26] . Olemme myös vahvistaneet, että sykliinit sisältävät CRE elementtejä niiden promoottorien sekvenssianalyysillä perustuva analyysi käyttämällä julkisia tietokantoja (esim BioBase tai TESS). Kuten on esitetty kuviossa 3A, sykliini A2, B1, D1 ja E2 sisältää oletetun CRE alueita niiden promoottoreita. Määrittämään, onko CREB estäjä, NASTRp todellakin downregulates cyclines selvitimme ekspressiotasot solukierron liittyvien Sykliineiksi alle NASTRp hoitoa qRT-PCR ja western blot määrityksissä. Kuten on esitetty kuviossa 3B ja 3C, NASTRp dramaattisesti alassäädetty ilmaisuja Sykliinien kuten sykliini A2, B1, D1 ja E2 mRNA ja proteiini tasoilla. Lisäksi NASTRp vähentää populaatio solujen S-vaiheen solusyklin ja johti solusyklin pysähtymisen G1 ja G2 vaiheet NCI-H441-soluissa (kuvio 3D). Nämä tiedot osoittavat, että NASTRp tukahduttaa NSCLC solujen lisääntymistä, ainakin osittain, kautta alas-säätely keskeisten sääntelyviranomaisten solusykliä, Sykliineiksi.

(A) CRE promoottorit sykliini geenejä. Sekvenssianalyysi promoottorit geenien esiin potentiaaliset sitoutumiskohtia CREB-CBP. (B ja C) vaikutus NASTRp ilmaisun Sykliinien RNA (B, qRT-PCR) ja proteiini (C, Western blot) A549 (vasemmalla), NCI-H1792 (keskellä) ja NCI-H441 (oikealla). Ajoneuvo säätö asetettu 1 qRT-PCR. Sillä qRT-PCR tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. *

P

0,05 vs. ajoneuvo. (D) NCI-H441-soluja käsiteltiin 10 uM NASTRp 24 tuntia ja solusyklin jakautuminen määritettiin propidiumjodidivärjäys seuraa FACS-analyysillä.

Suppression of autophagy ja induktio ER stressin ja solujen kuolemaan NASTRp

Mielenkiintoista on, havaitsimme useita ontelon kaltaisia ​​rakenteita sytosolissa NASTRp käsiteltyjä soluja. Sitten arveltu, että NASTRp voi tukahduttaa cytoprotective autophagy torjua kasvaimeen edistää rooli toimia kuin syöpälääke. Autophagy pidetään usein vaihtoehtona ravinnonlähteenä syöpäsolujen selviytymisen kun he ovat alle rajalliset kasvua tarjontaa. Näin ollen tutkimme autophagy markkereita, kuten LC3B muutos ja p62 /SQSTM1 hajoamista NASTRp hoitoon ihmisen NSCLC-soluja. Huomattavaa on, että p62 on keskeinen molekyyli hallintaan autophagic puhdistumaan polyubiquitinated proteiinien kautta suoraan sitoutumalla LC3 vuonna autophagosomes [27]. Vika autophagy aiheuttaa kertyminen p62, ubikitiinipromoottori konjugoimalla proteiini aggregaatteja ja vaurioituneet soluelimiin erityisesti mitokondrioiden [28, 29].

Olemme havainneet, että kaikissa solulinjoissa tutkittiin, p62 dramaattisesti kertynyt seurauksena NASTRp hoitoa annoksella -riippuvaista tavalla (kuvio 4A). Vaikka muut kriittiset autophagy liittyviä proteiineja kuten ATG7 ja ATG5-12 konjugaation tasot olivat merkitsevästi lasku seurasi NASTRp hoitoa, osoittaa tukahduttava vaikutus NASTRp on autophagy (kuvio 4A). Lisäksi NASTRp estetty pohjapinta autophagy vuon, kuten on esitetty mitään muutosta LC3B muuttaminen tai p62 hajoamista läsnä bafilomysiini A1 (V-ATPaasi-estäjän), joka estää liian myöhään vaiheet autophagy (kuvio 4B).

(A) Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla NASTRp RPMI-1640-alusta täydennettynä 5% FBS: ää 24 tunnin ajan. Solulysaatit altistettiin western blot määrityksessä mainituilla vasta-aineilla. (B) esto autophagy vuon mukaan NASTRp. NCI-H441-soluja käsiteltiin 20 uM NASTRp läsnä ollessa tai poissa ollessa bafilomysiini A1 (100 nM) 24 tuntia. Solulysaatit altistettiin SDS-PAGE /Western blot -analyysillä käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. (C) kertyminen p62 aggregaattien mukaan NASTRp. A549-soluja käsiteltiin 20 uM NASTRp 24 tuntia. Käsitellyt solut seurasivat immunofluoresenssivärjäyksen anti-P62-vasta. Mitta-asteikko: 10 um. (D) Mahdollinen kliinistä hyötyä NASTRp keuhkojen adenokarsinooma potilailla. Kaplan-Meier eloonjäämiskäyriä ihmisen keuhkojen adenokarsinooman aineistoja, jotka vertaavat kokonaiselossaoloaikaa välillä kasvaimet, joilla on korkea (punainen) tai alhainen (musta) ATG7 (vasen paneeli), ATG5 (keskimmäinen paneeli) ja p62 /SQSTM1 (oikea paneeli) geenien ilmentyminen Kaplan-Meier Plotter työkalu. Log-rank

P

arvot on esitetty.

kertymistä p62 vahvistettiin lisäksi soluihin käyttäen immunofluoresenssilla A549. Yhdenmukainen immunoblotting seurauksena p62 aggregaatteja ( 2-4 um) lisäsi merkittävästi sytosoliin seuraavissa NASTRp hoitoa verrattuna ajoneuvoon (kuva 4C). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa hypoteesin, että NASTRp voi estää kasvain edistäviä /cytoprotective autophagy, ainakin osittain, kautta ATG7 alassäätöä ja esto autophagy vuon mikä näkyy kertymistä LC3B-II ja p62.

koska korrelaatio potilaan selviytymistä keuhkoadenokarsinooma ja ilmauksia autophagy proteiineja, kuten ATG7, ATG5 tai p62 ei ole vielä raportoitu, me seuraavaksi teki selviytymisen analyysin keuhkoadenokarsinooma potilaista pisteytettiin

ATG7

,

ATG5

tai

p62

mRNA ilmaisuja käyttäen julkisia tietokantoja.

ATG7

-aiheiset tietokanta (ID: 218673_s_at), on 242 (49,8%) tapauksista korkea

ATG7

ilmaisun ja 244 (50,2%) tapauksista matalan

ATG7

ilme. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoittaa, että potilaat kätkeminen alhainen

ATG7

ilme oli huomattavasti parantunut eloonjääminen verrattuna niitä, joilla on korkea

ATG7

ilmaisu (kuvio 4D, top,

P

= 2.7e-06). Potilaat, joilla on alhainen

ATG5

ilme oli parempi eloonjäämisen sopusoinnussa

ATG7

tapauksissa (kuvio 4D, keskimmäinen,

P

= 1.1E-08). Sitä vastoin potilailla, joilla on korkea ilmentymisen

p62

oli merkittävästi parempi eloonjäämisen tulokseen verrattuna potilailla, joilla on alhainen

p62

ilmaisu (kuvio 4D, pohja,

P

= 9,7 e-07).

on raportoitu, että viallisia autophagy läpi alassäädetty ATG7 johti kohonnut ER stressiä metabolinen maksasairaus [30]. Koska tukahduttaminen ATG7 mukaan NASTRp, me tutki vielä ilmentymistä ER stressin markkereita, kuten GRP78, CHOP, IRE1, PERK, ATF6 ja XBP1, onko NASTRp indusoi ER stressiä keuhkojen syöpäsoluja. Kuten kuviossa 5A, NASTRp aiheuttama ER stressiä ja aktivoitu laskostumattoman proteiinivaste (UPR), osoituksena säätely ylöspäin GRP78 [31] ja CHOP. Lisäksi ekspressiotasot muiden geenien, jotka liittyvät ER stressiä, kuten IRE1, ATF6, PERK ja XBP1 kasvoi myös seuraavat NASTRp hoitoa ihmisen syövän soluissa (kuvio 5A). Olemme vahvistaneet, että NASTRp sääteli tasolle GRP78 ja CHOP proteiinien aikaa ja annosriippuvaisen tavat (kuvio 5A ja 5B) ja havaittiin dramaattinen kasvu CHOP ilmaisun tumassa (kuvio 5C). ER stressi tuli ylipääsemättömiä läsnä ollessa NASTRp ja johti solukuoleman, kuten on esitetty lisääntynyt pilkottiin kaspaasi-3, Bim ilmaisun ja TUNEL-positiivisia pisteitä (kuvio 5B ja 5D).

(A) qRT-PCR analyysi biologisten merkkiaineiden ER stressin /UPR liittyvien geenien NCI-H441 käsiteltiin 20 uM NASTRp ajoissa kurssin tavalla. (B) NASTRp aiheuttamaa ER stressiä ja aktivoidaan UPR johti apoptoosin Bim induktio NSCLC solulinjoissa. Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla NASTRp 24 tunnin ajan ja solu- lysaatit alistettiin SDS-PAGE /Western blot -analyysillä käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. (C) lisääntymisen merkkejä CHOP mukaan NASTRp. NCI-H441-soluja käsiteltiin 20 NASTRp varten 0-24 tuntia. Ilmoitettuina ajankohtina solut kiinnitettiin ja altistettiin immunofluoresenssianalyysia anti-CHOP-vasta-ainetta. Cell kuvat olivat microphotographed käyttämällä fluoresenssimikroskooppia klo 60X suurennus. Mittaviivat: valkoinen; 10 um. (D) TUNEL-positiivisten solujen NASTRp-käsitelty (48 tuntia) A549-solut laskettiin ja analysoitiin suhteellinen% ja TUNEL-positiivisia soluja. *

P

0,05 vehikkeliä vastaan.

arvioitiin sitten on-kohde vaikutus NASTRp käyttäen normaalia ihmisen tracheobronchial epiteelin (NHTBE) solujen kaksiulotteinen (säännöllinen kudosviljelmässä ehto) ja kolmen dimentsional organotypic (ilma- neste rajapinta kulttuuri ehto; ALI) kulttuuri järjestelmät [5, 17-19]. Vaikka oli vähäinen tappaminen vaikutus NASTRp on NHTBE solut, solujen elinkykyisyys ole laskenut alle 50%, jopa 20 uM NASTRp hoitoa (kuvio 6A ja 6B). Kun taas P62 oli kertynyt keuhko- syöpäsoluja, p62 vuonna NHTBE soluissa oli muuttumaton seuraavat NASTRp hoidon (kuvio 6C). Nämä tiedot osoittavat, että NASTRp voi kohdistaa osaksi syöpäsolujen sijaan normaalia solun, erityisesti sisällä terapeuttisen ikkunan alueilla. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että NASTRp vaimentaa kasvaimen edistävää roolia autophagy kautta ATG7 alassäätöä ja p62 kertymistä, indusoi ER stressiä aktivointi UPR, ja lopulta johtaa solun kuolemaan ihmisen NSCLC-soluissa (kuvio 6D).

(A) solujen elinkelpoisuus määritys vasteena NASTRp on NHTBE soluja. (B) NHTBE soluja, jotka viljeltiin 3D organotyyppisissä ilma-neste rajapinta (ALI) järjestelmän NASTRp hoitoa. NHTBE-soluja käsiteltiin 10 uM NASTRp 96 tuntia. Edustavia kuvia saatiin käyttämällä vaihe-kontrastin valomikroskoopilla. (C) Ei muutoksia p62 tasolla NASTRp saaneilla NHTBE solu. NHTBE-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella NASTRp 24 tuntia.