Krooninen sairaus

tiivistelmä

esiintyvyys tiettyjen infektioiden UK eturauhassyöpäpotilaille tutkittiin. Serum 84 potilasta ja 62 valvonnan testattiin neutralisointimenetelmät ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus (XMRV) kirjekuori. Reaktiivisuutta ei havaittu potilaan näytteissä. Lisäksi vielä 100 eturauhasen DNA-näytteet testattiin XMRV, BK-virus,

Trichomonas vaginalis

ja ihmisen papilloomavirukset nukleiinihapposekvenssien havaitsemiseen tekniikoita. Huolimatta osoittavat DNA eheys ja määrityksen herkkyyttä, emme onnistuneet havaita mitään näiden aineiden DNA-näytteitä, bar yksi näyte, joka oli heikosti positiivinen HPV16. Siksi päättelemme, että nämä infektiot ovat poissa tässä tyypillisessä kohortin miesten eturauhassyövän.

Citation: Groom HCT, Warren AY, Neal DE, Bishop KN (2012) Ei Todisteet Infektio UK Eturauhassyöpä Potilaat, joilla on XMRV, BK Virus,

Trichomonas vaginalis

tai ihmisen papilloomavirus virukset. PLoS ONE 7 (3): e34221. doi: 10,1371 /journal.pone.0034221

Editor: Mark Wainberg, McGill University Aids-keskus, Kanada

vastaanotettu: 22 marraskuu 2011; Hyväksytty: 24 helmikuu 2012; Julkaistu: 28 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Groom et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Britannian Medical Research Council [KNB U117592729] ja Wellcome Trust [KNB 084955]. KNB on Wellcome Trust Career Development Fellow. Tekijät haluavat tunnustaa tukea Cambridgen yliopisto, Cancer Research UK, ja National Institute for Health Research, joka rahoittaa Cambridge Bio-lääketieteellinen tutkimuskeskus, Cambridge, Iso-Britannia. Human Research Kudospankki tukee NIHR Cambridge Biomedical Research Centre. Tekijät haluavat myös antaa tunnustusta tuella National Cancer Research Eturauhassyöpä: mekanismit Progression ja hoito (PROMPT) yhteistyönä (avustus koodi G0500966 /75466), joka on rahoittanut kudokseen ja virtsaan kokoelmiin Cambridge. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) vaikuttaa merkittävästi maailmanlaajuiseen tautikuormituksesta johtuu syövästä ja on yleisin syöpä miehillä Britanniassa (https://info.cancerresearchuk.org/cancerstats). Nykyinen seulontamenetelmiä ja potilastietojen hallinta päätökset haittasivat perustavanlaatuinen puute käsityksen luonnollinen historia tauti, joka on todennäköisesti monitekijäinen. Tutkijat ehdotti tarttuvaa syy jo 1950 ja sen jälkeen erilaisia ​​taudinaiheuttajia on liittynyt tauti (katsaus esitetty [1]). Vaikka epidemiologiset tutkimukset osoittavat, että on ollut hankkia sukupuolitauteja riskiä PC, mitään lopullista yhdessä tietty infektio on osoitettu. Päätimme samanaikaisesti tutkia esiintyvyys neljästä eri tartunnanaiheuttajia, jotka ovat kukin itsenäisesti liitetty tietokoneeseen. Meidän tavoitteena oli lisätä mahdollisuuksia havaita tutkimalla näytteitä hyvin kuvattu kohortin potilaista, joilla on vaikea PC.

Ensinnäkin, etsimme uuden gammaretrovirus, ksenotrooppiset hiiren leukemiavirus (MLV) liittyvien virus (XMRV ), joka eristettiin familiaalinen PC potilaskudos vuonna 2006 [2]. Toinen, suurempi, kontrolloidussa tutkimuksessa vuonna 2009 ehdotti, että XMRV liittyi korkealaatuisesta kasvaimia ja ei rajoitu familiaalinen PC tapauksissa [3]. Kuitenkin useat myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet mitään yhteyttä XMRV ja tämä yhdistys on pysynyt kiistanalainen. Vaikka tämä käsikirjoitus oli valmisteilla tekemässä tutkimuksessa Paprotka

et al.

Osoittaneet todennäköisen rekombinanttia alkuperää XMRV [4]; Näiden esi viruksia on sittemmin lisäksi tunnettu [5]. Äskettäin Martinez-Fierro ja työtovereiden havaittu ihmisen papilloomavirus virukset (HPV) 20%: PC tapauksissa PCR [6]. Korkean riskin HPV ovat ruokamyrkytysepidemian kohdunkaulan syövän ja niiden E6- ja 7 proteiinit kykenevät ikuistaneeksi eturauhasen solujen [7]. Polyoomavirusten myös mahdollisuuksia syövän synnyn ja BK-virus (BKV) on tehty useita havaittu PC yksilöitä, viimeksi kudosta, virtsan ja plasman [8], [9]. Lopuksi loinen

Trichomonas vaginalis

(TV) tiedetään aiheuttavan eturauhastulehdus ja osoitti hieman lisääntynyt esiintyvyys PC äskettäin tapauskontrollitutkimuksessa [10]. Näin ollen nämä kolme patogeenien tutkittiin lisäksi XMRV.

tutkitaan PC kudosten DNA XMRV, BKV, TV ja HPV nukleiinihapot sekä testaus- PC potilaiden seerumit läsnäolon neutraloivien vasta-aineiden XMRV Env. Huolimatta todistetaan määrityksissä olivat erittäin herkkiä, yksikään potilas näytteet olivat positiivisia infektio, lukuun ottamatta yhden HPV-positiiviset DNA-näyte. Tuloksemme siis viittaavat siihen, ettei niillä ole mitään agenttien ja PC ja että kliinisiä lähestymistapoja ei pitäisi keskittyä torjumaan näitä tartunnanaiheuttajia miehillä.

Tulokset

Kahdeksankymmentä-neljä UK PC potilaalle ja 62 kontrolliseerumeita (miehistä, joilla on alhainen prostataspesifinen antigeeni (PSA) tai korkea PSA, jolla on negatiivinen biopsia) testattiin läsnä anti-XMRV-vasta-aineiden neutralointi määritystä, joka on kuvattu aikaisemmin [11]. Huolimatta validoitu monoklonaalinen vasta-aine valvonta osoittaa toistettavia neutraloivaa aktiivisuutta tässä määrityksessä, yksikään PC potilaiden seerumit osoittivat todisteita anti-XMRV vasta-aineita. Yksi seeruminäyte kontrollina, Q2, se osoitti erityistä reaktiivisuus vastaan ​​XMRV suurilla seerumissa (kuva 1).

infektiivisyys XMRV inkubaation jälkeen potilaan seerumista tai monoklonaalisia jousitus. Tarttuvuus (mitattuna suhteessa β-galaktosidaasi-yksikköä) on piirretty vasten vastavuoroisesti seerumin laimennosta (mustat symbolit) tai monoklonaalisia suspension (sininen datapistettä, monoklonaalinen 603, negatiivinen kontrolli; punainen datapisteitä, 83A25 ”, positiivinen kontrolli). Katkoviiva osoittaa taso tarttuvuuden puuttuessa seerumin /monoklonaalinen. Q1-10 ovat potilaan nimityksiä. Q2 näyttelyitä neutralointi.

Valitettavasti DNA ei ollut käytettävissä saman kohortin potilaista testattiin edellä ja niin DNA uutettiin vielä sadan eturauhassyöpä kudosnäytteitä toisesta samoin hyvin tunnettu kohortti. DNA-näytteet testattiin eheys

hgapdh

PCR ja 96 osoittivat havaittavan tuotteen kerta kierroksen (osajoukko on esitetty kuviossa 2A). Neljä näytettä joka epäonnistui monistamaan tuote sisällytetty lisätestejä kontrolleina määrityksen saastuminen. Uutettua DNA: ta testattiin XMRV sisäkkäisten PCR-monistamalla virus

gag

geenin kuten aiemmin on kuvattu [2]. Tämä PCR luotettavasti tunnistaa yksittäisiä kopioita plasmidia valvonnan laimennettiin ylimäärin ihmisen DNA: ta jokaisessa kokeessa (kuvio 2B). Tämä PCR pystyy myös havaitsemaan liittyvien gammaretroviruses (MLV: t), mukaan lukien löydetty endogeenisia viruksia hiirissä. Kuusi 100 PC DNA-näytteiden antoi tuotteen odotettua kokoa (kuvio 2C). Kuten XMRV liittyy -endogeenisten läsnä hiirillä, läsnäollessa kontaminoivien hiiren DNA voi johtaa myönteiseen tulokseen tässä PCR. Voit hallita tätä, positiiviset näytteet testattiin myös hiiren DNA: sta käyttäen PCR spesifinen hiiren endogeenisen retroviruksen elementti intrakisternaalisen hiukkasia (IAP) [12]. Tämä PCR voi havaita alhainen hiiren DNA johtuen suuresta määrästä IAP: t hiiren genomeja (kuvio 3A). Kaikki kuusi näytettä, jotka olivat positiivisia XMRV

gag

olivat myös positiivisia käyttäen IAP PCR (kuvio 3B, taulukot 1 ja S1). Alkuperän selvittämisen kannalta näiden bändejä tarkemmin, amplikoneista kloonattiin ja sekvensoitiin. Fylogeneettistä analyysi sekvensoitiin ”

gag

” amplikonien tukenut väitettä, että ne olivat peräisin kontaminoivaa hiiren nukleiinihappo (kuva S1).

Kentät A-C esittävät 1% agaroosigeeleillä värjätty etidiumbromidilla. Kaikille, M osoittaa merkki, W osoittaa vettä, numerot vasemmalla ilmaisevat koko merkkiaineiden emäsparia, nuolet osoittavat odotettua bändi koko eri PCR. A) havaitseminen

hgapdh

DNA eristettiin PC kudoksesta DNA-näytteistä 1-24 käyttäen yhden kierroksen PCR. Odotettu PCR-tuotteen koko 225 emäsparia. B) Vakiokuvaajan määrittää detektioraja XMRV

gag

sisäkkäistä PCR. Kymmenkertaisesti sarjalaimennoksia 10

6-1 molekyyliä kohti ui XMRV plasmidi (pcDNA3.1 /VP62) tehtiin taustalla ylimäärin ihmisen genomi-DNA: ta. Toinen kierros vahvistus tuotteet

gag

nested PCR näkyvät. Numerot edellä kaistat osoittavat tulon määrä molekyylejä. Odotettu PCR-tuotteen koko 413 emäsparia. Sekvensoimalla hitaampi siirtyvät heikko juova on ”0” kaista (ihmisen genomista DNA: ta yksin) osoitti tämän olevan ei-spesifisen monistamisen ihmisen geenejä (tuloksia ei ole esitetty). C) havaitseminen XMRV

gag

sekvenssit DNA eristettiin eturauhassyöpään kudosnäytteistä. Toinen kierros vahvistus tuotteita potilasalaryhmässä näkyvät kohdassa (B). Näytteet 4, 8 23, 60, 62 ja 72 ovat positiivisia.

Kentät A ja B esittävät 1% agaroosigeeleillä värjätty etidiumbromidilla. Kaikille, M osoittaa merkki, numerot vasemmalla ilmaisevat koko merkkiaineiden emäsparia, W osoittaa vesi, nuolet osoittavat odotettua bändi koko eri PCR. Tuotteet näkyvät kokeena eroavuuksista johtuen amplikoni pituudet. Vertailukohtana on noin tuhat IAP kopiota hiiren genomia. A) sisäiset sisternaalinen A-tyyppinen hiukkanen DNA monistettiin sarjalaimennoksia hiiren DNA (0,001-10

3 genomiyksikköä joko C56BL /6 tai

Mus Spretus

). Tuotteet yhden kierroksen monistaminen on esitetty. Numerot edellä kaistat osoittavat useita hiiren genomiyksikköä PCR-reaktiossa. B) Tuotteet PCR-monistus sisäisen sisternaalinen A-tyyppinen hiukkanen DNA valitaan PC kudoksesta DNA-näytteitä. Numerot edellä kaistat osoittavat potilaan nimityksiä. Näytteet 4, 8, 23, 60, 62, 70 ja 72 ovat positiivisia. +/- Osoittaa positiivinen tai negatiivinen tulos

gag

PCR (kuva 2).

DNA-näytteet testattiin myös läsnäolon BKV nested PCR. Huolimatta luotettavasti havaita yhden molekyylin BKV plasmidin toistuvista yrityksistä (pBR322-Dunlop, kuvio 4A), yksikään potilas näytteiden antoi kaistan sopiva koko (osajoukko on esitetty kuviossa 4B). Samoin potilaan näytteet olivat negatiivisia televisioon kaupallisesti saatavilla reaaliaikainen PCR-testaus kit (kuvio 4C). Tämä määritys kykeni luotettavasti havaitsemaan kymmenen kappaletta TV (kuvio 4C + D). Nämä negatiiviset tulokset eivät johtuneet epäonnistuminen uuttomenetelmä sisäisenä louhinta kontrolli monistettiin onnistuneesti. Kaikki DNA-näytteet testattiin sitten HPV ja kaikissa näytteissä, mutta yksi, joka oli heikko hybridisaatio HPV16, havaittiin olevan negatiivinen, vaikka onnistuneesta monistuksesta ihmisen DNA käyttäen pakkausta kontrollikoettimen kaikissa paitsi yhdessä näytteessä (näytteet 1-3 esitetty kuviossa 5). Yhteenveto näistä tuloksista kaikille 100 PC DNA-näytteiden annetaan taulukoissa 1 ja S1.

Kentät A ja B esittävät 1% agaroosigeeleillä värjätty etidiumbromidilla. Sekä M osoittaa merkki, numerot vasemmalla ilmaisevat koko merkkiaineiden emäsparia, nuolet osoittavat bändejä odotetunkokoisten toisen kierroksen (453 emäsparia). A) sarjalaimennoksia BKV plasmidin (pBR322-Dunlop) tehtiin 10

6-1 molekyyli (t) ja monistettiin nested PCR. Tuotteet toisen kierroksen vahvistus näkyvät. Numerot edellä kaistat osoittavat molekyylien lukumäärä PCR-reaktiossa. B) Tuotteet toisella kierroksella sisäkkäisiä PCR-monistus BKV osajoukosta PC kudoksen DNA-näytteitä. Numerot edellä kaistat osoittavat potilaan nimityksiä. C) monistaminen käyrä, joka esittää käyriä kvantitatiivinen PCR-reaktioissa havaitsemiseksi televisioon kvantifiointi Trichomonas vaginalis Advanced Kit. Sarjalaimennoksia positiivisen kontrollin näkyvät sekä puute vahvistus PC kudosten DNA-näytteet 1-50 (ei vahvistusta ja siten kaikki alle kynnysarvon linja). Tulot olivat seuraavat: int, sisäinen louhinta valvonta (havaittu erillinen suodatin), joka on 10

6 TV molekyylejä, b, 10

5 TV molekyylejä, c, 10

4 TV molekyylejä, d, 10

3 TV molekyylejä, e, 10

2 TV-molekyylejä, f, 10 TV-molekyylejä. Tontti näyttää delta Rn vastaan ​​jakson numero. D) Tontti Ct-arvoja vastaan ​​log positiivisen ohjaustulon pitoisuus osoittamalla lineaarisuus, R

2 0,99.

HPV-DNA PC kudoksessa DNA-näytteistä havaittiin käyttäen INNO-LiPA HPV Genotyping Extra. HPV-DNA monistettiin näytteistä käyttäen alukkeita säilyneisiin sekvenssit tuottaville biotinyloitua tuotteita. Biotinyloidut amplikonit Sitten hybridisoitiin nauhat laakeri konservoitunut ja tyyppikohtaista HPV koettimia. Bändejä osoittavat biotinyloitujen näyte-DNA osoittamaan kohteeseen. Marker on kohdistamiseksi nauhat, konjugaatti ohjaus vahvistaa reagensseja toimivat oikein, hDNA valvonta osoittaa läsnäolon ihmisen näytteen DNA, HPV (leveä) osoittaa sitoutumisen HPV-DNA koettimiin, jotka sitovat säilyneistä alueista. Kaikki muut pisteviivat osoittavat alueita sitovat erityisiä HPV esim HPV16 (esitetty). Numerot edellä nauhat ovat potilas nimitykset (vain 3 näytteen nauhat esitetty selvyyden vuoksi), -, negatiivinen kontrolli (vesi), +, positiivinen kontrolli (toimitetaan mukana). Tulos yhden HPV positiivinen ei ole esitetty, koska se oli liian heikko näkyvän skannatun kuvan.

Keskustelu

Laaja ja kiistelty kirjallisuutta on olemassa yhdistävä tartunnanaiheuttajien PC, erityisesti XMRV ja HPV [1], [13]. Koska meillä oli pääsy suuri, hyvin tunnettu kohortti PC potilaiden ja kokemuksen avulla molekyylitekniikkaa havaita viruksia, mielestämme olisi hyödyllistä tutkia läsnäolon neljä tekijää; XMRV, BKV, TV ja HPV, samassa PC näytteistä.

Viime vuosina on ollut paljon kiinnostusta ja kiistelyä yhdistyksen XMRV PC. Määrityksessä pyritään havaitsemaan immuunivasteen XMRV, yksi seeruminäytettä tutkimuksessamme pystyi neutraloimaan viruksen (Q2, kuvio 1). Kuitenkin tämä seerumi oli alhaiselta PSA ohjaus yksilön ja siksi ei ollut yhdessä PC. Tämä neutralointi määrityksessä oli samanlainen kuin se, jota Arnold

et ai.

, Paitsi että pseudo- viruksen kaltaisia ​​partikkeleita käyttää perustuivat MLV sijaan HIV [14]. Tämä mahdollisesti edustaa väärän positiivisen tuloksen johdosta epitoopin ristireaktiivisuutta. Valitettavasti ei vielä seerumin testausta reaktiivisuus Western blot tai DNA testausta PCR olivat saatavilla tämän yksilön. Lisäksi emme löytäneet mitään todisteita, että kanoninen XMRV [2] PC DNA-näytteiden PCR. Kuusi näytettä monistettu tuote

gag

PCR vaan olivat myös positiivisia hiiren DNA, mikä viittaa siihen, että tämä PCR oli monistettu endogeenisia hiiren retrovirussekvenssejä jotka ovat läsnä suuria kopioiden lukumääriä hiirissä (kuviot 2 ja 3). Fylogeneettistä analyysi amplikonien tukee tätä hypoteesia (kuva S1). Lisäksi yksi

gag

negatiivinen näyte oli positiivinen IAP PCR, joka osoittaa, että IAP PCR pystyy monistamaan kontaminoivan hiiren DNA, joka ei havaittu

gag

PCR.

Yhdessä meidän serologiset ja PCR tiedoissa ei ole yhdistyksen gammaretroviruses ja PC. Tämä on samaa mieltä viimeaikaisten geneettisten todisteiden alkuperän määrittämisessä XMRV joka osoittaa, että XMRV liittyvät virukset eivät ole oikeastaan ​​ihmispatogeenien [4], tarkistetaan [15]. Huolimatta tekee kaikkensa eristämään DNA ja suorittaa määritykset hiiren vapaa tilat käyttämällä uusia laitteita ostetaan Tässä tutkimuksessa meidän IAP PCR tulokset korostavat saastumista näytteiden kanssa hiiren DNA. Itse asiassa, se on viime aikoina raportoitu, että aiemmin positiivista näytettä voi johtua saastumisen [16], [17], [18]. Saastuminen on ongelma keskusteltu laajasti XMRV kirjallisuudessa [13]. Tutkijat käyttävät erittäin herkkä nukleiinihappoa tekniikoita havaita taudinaiheuttajille potilasnäytteistä tulisi varoa tulkitaan väärin ilmeistä positiivisia tuloksia [19]. Kun kyseessä on XMRV, useita menetelmiä saastuminen on mahdollista. Sekvensointi PCR-tuotteiden on olennaista sekä tarkistamalla läsnäolo hiiren DNA, joka voi johtaa tuotteisiin PCR johtuen korkeasta endogeenisten retrovirusten. Kuitenkin erittäin liittyvien endogeenisten sekvenssien tai kontaminoivan plasmidi-DNA ei välttämättä merkitä tällä menetelmällä. PCR määritykset on suunniteltu havaitsemaan nämä epäpuhtaudet on käytettävä [20]. Viral epäpuhtaudet tai saastumisen laboratoriossa peräisin tartunnan ihmisen soluja on mahdotonta erottaa

bona fide

tartunnan ihmiseen. Ainoa tapa vahvistaa näennäisesti positiivinen tulos ei itsenäisesti siitä kappaleita, minkä vuoksi on tärkeää, että useiden ryhmien suorittaa omia tutkimuksia. Vaikka tämä käsikirjoitus oli valmisteilla kaksi keskeistä paperit vedoten havaitseminen XMRV vuonna krooninen väsymysoireyhtymä potilaan näytteitä vedettynä valossa näyttöä saastumisen [21], [22], [23], [24].

Olemme myös käyttää PCR-määrityksissä seulomiseksi potilaamme näytteitä kolmen taudinaiheuttajien aiemmin liitetty tietokoneeseen. Käytimme julkaistu alukkeita raportoitu havaita BKV PC näytteissä [25], ja kahden kaupallisen sarjat etsiä TV ja HPV. TV sarja on suunniteltu siten laajin havaitsemiseksi profiilin mahdollisimman jäädessä erityisiä televisioon genomiin. HPV määritystä käytetään jo seurata kohdunkaulan kudosnäytteitä ja voi tunnistaa 28 tyypit HPV, mukaan lukien kaikki tällä hetkellä tiedossa korkean riskin ja todennäköisen korkean riskin genotyyppien sekä useita matalan riskin tyyppejä. Jos yhdistys löydettiin tietokonetta tai mitä tahansa näistä taudinaiheuttajista sitten nämä määritykset antaisi nopeasti, helppo tapa seuloa potilaille ja tunnistaa ne, joiden anti-taudinaiheuttaja hoidot voivat olla hyödyllisiä. Kaikki määritykset validoitiin käyttäen positiiviset kontrollit (kuvio 4A, C ja D) ja laatu DNA: ta PC näytteistä arvioitiin monistamalla ihmisen geenien (kuviot 2 ja 5, taulukot 1 ja S1). Kuitenkin yksikään näytettä oli BKV tai TV ja vain yksi näyte positiivisen HPV (tyyppi 16). Tämä viittaa siihen, että nämä taudinaiheuttajat eivät ole yleisiä PC kudosten ja siten hoitoa infektioiden ei todennäköisesti auttaa potilaita yleensä.

Vaikka negatiivinen tulos on vaikea todistaa kiistattomasti, me väittävät, että meidän DNA näytteet olivat riittävän laatu monistamaan ihmisen valvontaa geenejä ja että vahvistus sisäisen valvonnan osoitti, että uutto- ei estänyt PCR. On mahdollista, että prosessi formaliinilla kiinnitys- ja parafiiniupotusta johti pirstoutuminen DNA. Jos näin olisi niin

hgapdh

ohjaus voi ainoastaan ​​vahvistaa mahdollinen havaitseminen amplikonien lyhyempiä kuin 225 emäsparia (HPV ja TV). Kuitenkin, jos esiintyvyys XMRV tai BKV olivat korkeat, voisi silti odottaa havaita virussekvenssit joitakin näytteitä, vaikka satunnainen pirstoutuminen. Lisäksi XMRV, BKV ja TV määrityksissä olivat kykenee havaitsemaan yksi-kymmenen genomin ekvivalenttia mikä käytetyt määritykset olivat erittäin herkkiä. Nämä tunnistus rajoja luotettavasti havaittu toistuvista yrityksistä. Tuloksemme tukevat päätelmiä Sfanos

et al.

Joka tutki esiintyvyys näiden aineiden PC materiaalia osana laajempaa tutkimusta keskittynyt havaitsemiseen bakteeritartunta eturauhasen [26]. Nämä kirjoittajat eivät myöskään voineet havaita mitään näistä taudinaiheuttajista PC potilailla lukuun ottamatta yhden positiivisen BKV tulos.

Tutkimukset että löytyy patogeenisen DNA eturauhaskudoksessa voi heijastaa saastuminen eturauhasen taudinaiheuttajien liittyvät proksimaalisen kudosten tai jopa ei-ihmisen lähteistä. Historiallinen yhdistys PC sukupuolitautitartunta voisi heijastaa lisääntynyt tulehdus johtuen infektio, mutta ei voi vaatia infektiota tietyn taudinaiheuttaja. Vaihtoehtoisesti tämä tutkimus ei ehkä sisälly merkittävin patogeeni tai riittävän suuri paljastaa pieni osuus kutakin aineista tutkittu. Yleisesti minimaaliseen altistumiseen sukupuolitautien tartuntojen viime aikoina, yhdessä suhteellisen pieniä määriä tutkimuksessamme, voi sulkea pois havaitseminen infektoituneiden yksilöiden. Kuitenkin kohortti tutki on joukko hyvin tunnettu potilaalla on vaikea sairaus, ja jos jokin edellä mainituista infektioista liittyy vahvasti PC, ja siksi kliinisesti merkityksellisiä, voisi odottaa ovat havainneet niitä tässä tutkimuksessa. Yhteenvetona toteamme, että XMRV, BKV, TV ja HPV eivät yleisiä tässä PC kohortin ja ehdottaa, että vaihtoehtoiset etiologia pitää PC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Patient näytteet kerättiin ottamalla viipymättä tutkimuksen eettisten hyväksyntää Trent Monikeskustutkimuksissa tutkimus- eettinen komitea ja tietoon, kirjallinen suostumus.

Plasmidit

HG1 on replikaatioinkompetentin johdannainen pcDNA3. 1 /VP62 kanssa deleetioita promoottorin alueella ja pakkaussignaali [27]. pLTR-LacZ on MLV-pohjainen retrovirusvektori, joka koodaa β-galaktosidaasi [27]. PBR322-Dunlop plasmidin (ATCC # 45025) saatiin Mike Imperiale (Ann Arbor) ja on kuvattu aiemmin [28].

Näytteiden keräys ja käsittely

seerumi näytteitä neljään potilaat analysoitiin: 30 alhainen PSA valvontaa, 32 korkea PSA mutta negatiiviset koepala valvontaa ja 84 PC potilaita. DNA eristettiin 100 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu PC viipaleiksi käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden, lukuun ottamatta näytteitä inkuboitiin lyysipuskuriin yön yli, joka takaa täydellisen tuhoutumisen. DNA eluoitiin 50 ul: aan eluointipuskuria ja pitoisuus määritettiin käyttäen NanoDrop spektrofotometriä.

Detection neutraloivien XMRV vasta-aineiden seerumissa

neutralointi, joissa käytetään XMRV on aiemmin kuvattu [11]. Monoklonaalisia vasta-aineita 83A25 ’ja 603 käytettiin positiiviset ja negatiiviset kontrollit vastaavasti ja soluja seurattiin elinkelpoisuuden silmämääräisesti aikaan sadonkorjuun.

PCR

Jaksot kaikkien alukkeiden on aiemmin kuvataan mainittu ja annetaan taulukossa 2. Yhden kierroksen PCR havaitseminen

hgapdh

ja sisäkkäistä PCR XMRV

gag

suoritettiin kuvatulla tavalla [2] käyttäen alukkeita hGAPDH-66F ja hGAPDH -291R ja GAG-OF, GAG-OR, GAG-IF ja GAG-IR. IAP DNA yhden kierroksen PCR: t suoritettiin kuvatulla tavalla [12] ja havaitseminen BKV suoritettiin sisäkkäistä PCR aikaisemmin kuvatulla [25] käyttäen alukkeita BKV

varten, BKV

rev, BKVnes

varten ja BKVnes

rev. Määrittämään herkkyyden, 10-kertainen sarjalaimennoksia 1 ja 10

6 molekyylejä pcDNA3.1 /VP62 varten XMRV, C56BL /6 tai

Mus Spretus

DNA IAP tai pBR322-Dunlop varten BKV, olivat testattiin käyttäen edellä PCR: t. Tuotteet kaikki yhden kierroksen /sisäkkäistä PCR: t analysoitiin geelielektroforeesilla. Havaitsemiseksi

Trichomonas vaginalis

, testattiin käyttämällä kvantifiointi Trichomonas vaginalis Advanced Kit (PrimerDesign Ltd) mukaan valmistajan ohjeiden avulla Mini Precision Low-Rox Mastermix (PrimerDesign) ja ABI 7500 Real- aika PCR System (Applied Biosystems). Sisäinen DNA: n eristys valvonta käytettiin kaikkia havaitsemismenetelmiä rinnalla positiivinen kontrolli standardikäyrä ja negatiiviset kontrollit sopivat kullekin määritystä. Monistaminen HPV DNA tyypitys suoritettiin käyttäen INNO-LiPA HPV genotyypityksen Extra Amp kit mukaan valmistajan ohjeiden. Kirjoittamalla suoritettiin sitten käyttämällä INNO-LiPA HPV genotyypityksen Extra kit koskevasta

Automaattinen

-LiPA instrumentti mukaan valmistajan ohjeiden (kaikki Innogenetics).

Amplicon analyysi

PCR-tuotteet kloonattiin pSMART® HCKan vektoriin käyttäen CloneSmart HCKan Blunt Cloning Kit (Lucigen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ligatoitu pSMART vektorit sekvensoitiin käyttämällä alukkeita esitetään taulukossa 2. Jaksot linjattu tarkoituksenmukaisen alueen

gag

vuonna XMRV sekvenssit saatavilla PubMed ja asiaan MLV-sekvensseihin käyttäen Megalign (DNASTAR LASERGENETM 8). Sekvenssit on talletettu GenBank (JQ048948-JQ048955). Lisätietoja sekvenssien ja liittymisen numerot on annettu kuvassa legenda. Malli valinta fylogeneettiseen analyysi suoritettiin käyttäen Modelgenerator 8.5: een [29] ja Bayes phylogenies ennustettiin käyttämällä yleisiä aika kääntyvä malli nukleotidisubstituutiosta ja gamma-hajautettu korko heterogeenisuus käyttämällä ohjelmaa MrBayes [30]. MCMC algoritmi ajettiin 4000000 sukupolville, näytteenotto puita jokaista 100 sukupolvea. ESS-arvot laskettiin käyttäen Tracer (https://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer). Konsensus puu oksa pituudet ja posteriori todennäköisyys tukea arvot sisäsolmut oli visualisoida Figtree (https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree), tonkia MoMLV kuin outgroup ja muokata Adobe Illustrator .

tukeminen Information

Kuva S1.

Fylogeneettinen analyysi

gag

järjestyksessä amplikoneja. Amplikonit päässä

gag

nested-PCR (kuvio 2) kloonattiin, sekvensoitiin ja sitä verrattiin samalla alueella tunnetuista XMRV ja MLV-sekvenssejä. Identtistä alkuperäisen paneelin poistettiin fylogeneettinen analyysi estämiseksi bias. Hakunumerot ovat seuraavat: PreXMRV1 (todennäköinen XMRV esi-sekvenssi, NC_007815.2), hiiren C-tyypin retrovirus (X94150), AKV (endogeeninen ekotrooppinen MLV, J01998), DG-75 (xenoptropic Moloney MLV variantti, AF221065), hiiren AIDS virus (S80082), 22Rv1 (XMRV peräisin 22Rv1 soluja, FN692043.2), VP62 (alkuperäinen XMRV eristää PC potilaan DQ399707). Xmv, Mpmv ja PMV (xenoptropic, modifioitu polytrooppinen ja polytrooppinen endogeenisten MLV) sekvenssit saatiin Jern

et al. PLoS Genet

, 2007. FB579966 ja FJ907198 raportoidaan isolaateista potilaasta ja 22Rv1 soluissa. Bayes phylogenies ennustettiin käyttämällä yleisiä aika kääntyvä malli nukleotidisubstituutiosta ja gamma-hajautettu korko heterogeenisuus käyttäen ohjelmaa MrBayes. MCMC algoritmi ajettiin 4000000 sukupolvien kaksi samanaikaista erillistä määritystä näytteenotto puita jokaista 100 sukupolvea. Lopussa analyysin PSRF = 1.000 ja keskihajonta = 0. ESS-arvot olivat 899 ja 959 varten kaksi määritystä (määritetään Tracer v1.5). Konsensus puu näytetään haara pituudet ja posteriori todennäköisyys tukea arvot sisäsolmut visualisoida Figtree v1.3.1, tonkia Moloney MLV kuin outgroup. Sequenced amplikonit näkyvät sinisellä. Nämä sekvenssit on talletettu GenBank-tietokantaan (JQ048948-JQ048955). Alun perin kuvattu XMRV järjestyksessä, VP62, näkyy punaisella. Tukea arvot, ja siksi luottamus, rajoittaa puute eroavuuksia

gag

kuitenkin klusterointi amplikonien endogeenisen retrovirussekvenssejä kannattaa niiden ollessa johdettu saastuttamaan hiiren DNA.

Doi: 10,1371 /journal. pone.0034221.s001

(TIF) B Taulukko S1.

Full nukleiinihapon tunnistamisen tulosten.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034221.s002

(DOC) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää George Kassiotis tarjota C56BL /6 ja

Mus Spretus

DNA, Mike Imperiale pBR322-Dunlop, Asif Tamuri apua tulkinnassa fylogeneettiseen analyysien ja John Doorbar varten hyödyllisiä keskusteluja. Näkemykset ja esitetyistä arvioista ovat kirjoittajien omia eivätkä välttämättä edusta Department of Health.