Krooninen sairaus

tiivistelmä

taustaa ja tarkoitus

Altered ilmaus MikroRNA (miRNA) tunnusmerkkejä monia syöpätyyppejä. Tutkimus yhdistysten miRNA ilmaisun profiilin ja syövän fenotyyppi voisi auttaa tunnistamaan yhteyksiä vapauttaminen miRNA ilmaisun ja onkogeenista polkuja.

Methods

Expression profilointi 866 ihmisen miRNA 19 peräsuolen ja 17 haimasyöpä ja Hyväksytty viereisten normaaleissa kudoksissa tutkittiin. Klassinen parillista t-testiä ja satunnainen metsä analyyseja sovellettiin tunnistaa miRNA liittyy kudosspesifisiä kasvaimia. Verkko-analyysi perustuu laskennallisen lähestymistapa kaivoksen assosiaatioita syövän tyypit ja miRNA suoritettiin.

Tulokset

Yhdistäminen kahden tilastollisten menetelmien leikkaa miRNA differentiaalisesti ilmaistut paksusuolen ja haiman syövät auttanut tuomaan esiin syöpäspesifisessä miRNA muutoksia. By miRNA-verkko analyysi kudosspesifisiä malleja miRNA vapauttaminen jäljitettiin: ajo miRNA olivat

miR-195, miR-1280, miR-140-3p

ja

miR-1246

in Kolorektaalituumorien, ja

miR-103, miR-23a

ja

miR-15b

in haimasyöpä.

Johtopäätös

Mirna ekspressioprofiileja voi tunnistaa syöpä erityisiä allekirjoituksia ja mahdollisesti käyttökelpoisia biomarkkereiden diagnosointiin kudosta tiettyjen syöpien. miRNA-verkko analyysi auttaa tunnistamaan muuttunut miRNA säätelyverkkojen joka voisi olla rooli kasvaimen synnyssä.

Citation: Piepoli A, Tavano F, Copetti M, Mazza T, Palumbo O, Panza A, et al. (2012) Mirna Expression Profiles Tunnista ohjainten ja peräsuolen ja haimasyöpä. PLoS ONE 7 (3): e33663. doi: 10,1371 /journal.pone.0033663

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 17 marraskuu 2011; Hyväksytty: 14 helmikuu 2012; Julkaistu: 30 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Piepoli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat ministeriön Italian terveysministeriön myöntää RC0903GA51, RC1003GA52, RC1103GA47, RC0903CH47, RC1003CH50, RC1103CH46, RC1003BS14 ja RC1102BS45 kautta tutkimusyksikkö gastroenterologian, tutkimusyksikkö Kirurgian ja yksikkö Biostatistiikka; ja Casa Sollievo della Sofferenza (IRCCS), San Giovanni Rotondo (FG), Italia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-proteiinia koodaavan RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geenin ilmentymistä pääasiassa tasolla proteiinisynteesiä [1]. Ne edustavat evoluution hyvin säilyneitä, joka ohjaa ratkaiseva solun prosesseja, kuten kehitys, erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, ja aineenvaihdunta [2]. Poikkeava ilmentyminen miRNA voi aiheutua poistetaan, mutaatio, ja metylaation miRNA-koodaavat geenit, joista monet sijaitsevat genomisen hauras kohdat tai -alueet usein poistettu tai monistettu syöpä [3]. Perustuen näissä tiloissa, ne ovat osoittautuneet vuorovaikutuksessa mahdollisten onkogeeneillä tai tuumorisuppressoreilla [4]. Monet miRNA ilmaistaan ​​kudos-spesifisellä tavalla, jossa profiilit ekspressoituu differentiaalisesti joko normaali ja neoplastisia kudoksia, ja kasvaimissa erilliset biologiset ominaisuudet. Lisäksi jotkut todisteet osoittavat miRNA profiileja, jotta luotettava tunnistaminen solun alkuperämaan kasvainten [5].

Klassisen, tasauspyörästö ilmaus miRNA on arvioitu joko yksittäinen osatekijä tai ennakoivaa allekirjoitus [6 ], [7]. Kuitenkin suuri osa tieteellistä työtä kuluu nykyisin selvittämään niiden toiminnot: eniten miRNA ohjaus ainakin yhden mRNA, ja useimmat mRNA: t ohjataan useampia miRNA [8]. Monimutkaisuus tämän takana hienostunut mekanismi voidaan osittain lievittää tieto säilyttämisen tasoa eri miRNA. Todellakin, korkea säilyttäminen laajoilla phylogenetic etäisyydet auttaa rajoittamalla erilaisia ​​toimintoja, että miRNA voi pelata säännellä valvontaa lajin kehityksen ja fysiologian.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ekspressiomalleja miRNA peräsuolen (CRC) ja haimasyövän (PC) sen tarkoituksena tunnistaa miRNA säätelyverkkojen todennäköisesti mukana kasvaimia synnyttävän reittejä arvioimalla syöpää erityisiä allekirjoituksia analysoimalla suhdetta miRNA ilmaisun profiilin ja syövän suvusta.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet valinta ja RNA

Ensisijainen kasvain ja lähialueilla kuin syöpäkudoksissa saatiin kahdesta koulutusta kohortin 19 CRC potilaista ja 17 PC potilaita, ja kahdesta validointi kohortin 14 CRC ja 21 PC potilaiden .. tutkimus suoritettiin hyväksymisestä tieteellisen ja eettisen valiokuntien IRCCS ”Casa Sollievo della Sofferenza” Institute, San Giovanni Rotondo, FG (Italia). Potilaat antoivat tietoisen kirjallisen suostumuksen mukaan Italian lain yksityisyyden (määrätään henkilötietojen suojaa), joten yksilöitä ei voida tunnistaa tiedoista tai kuvien julkaisuun sisältyvien, ja hyväksynyt tieteellisen ja eettisen valiokuntien IRCCS ” Casa Sollievo della Sofferenza ”Institute. Kaikki kliiniset tutkimukset on tehty periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

Potilaan kliinisiä tietoja, kasvain sijainti, ja lavastus on esitetty taulukossa S1. Kudosnäytteet olivat flash jäädytettiin nestetypessä ja varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes nukleiinihappojen uutto. Noin 150-200 mg tuore kudoksia käytettiin eristämään kokonais-RNA uuttamalla fenolilla (TRIzol Reagent, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). RNA-pitoisuus ja puhtaus kontrolloitiin Nano Drop Specthophotometer. Agilent 2100 Bioanalyzer käytettiin mittaamaan määrän, eheys ja puhtaus pienten RNA: iden ja kokonais-RNA, ja ainoastaan ​​ei hajonnutta RNA: ta ominaista RNA eheyden numero 7. ilman DNA-kontaminaation merkkejä oli käsitelty.

Mirna mikrosiruja

Mirna mentymisprofiili määritettiin käyttämällä GeneChip® miRNA Array (www.affymetrix.com). Tämä joukko sisältää 46228 koettimia, jotka käsittävät 7815 anturi asetetaan, mukaan lukien valvonta, ja se kattaa 71 organismien kuten ihmisen, hiiri, rotta ja koira. Sisältö on johdettu Sanger miRBase miRNA-tietokannan V.11 (15 huhtikuu 2008, https://microrna.sanger.ac.uk). Koetinsarjojen kohdistaminen ihmisen snoRNAs ja scaRNAs ovat peräisin snoRNABase (www.snorna.biotoul.fr/coordinates.php) ja Ensembl (www.ensembl.org/biomart/martview) arkistoon, Lyhyesti, 1,5 ug kokonais-RNA: ta on merkitty käyttämällä 3DNA Array Detection FlashTag ™ RNA Labeling Kit (https://www.genisphere.com) mukaan valmistajan suosituksia. Ensimmäinen, poly (A) pyrstön suoritettiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, jonka tilavuus oli 15 ml reaktioseosta, joka sisälsi 1X Reaction Buffer, 1,5 ml MgCl 2 [25 mM], 1 ui ATP-seosta laimennettiin 1:500 ja 1 pl PAP-entsyymin. Toinen Flash-Tag Ligaatio suoritettiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan lisäämällä 4 ui 5X Flash Tag ligaatioseoksella Biotiini ja 2 ui T4 DNA-ligaasia osaksi 15 ui reaktioseosta. Reaktion pysäyttämiseksi, 2,5 ui Stop Liuos lisättiin. Näytteet hybridisoitiin, pestiin ja skannattu kanssa Affymetrix Scanner.

Kaikki microarray tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja raakadataa on talletettu ArrayExpress (tulonumero E-MTAB-752 paksusuolen syövän miRNA ekspressioprofiileja ja E- MTAB-753 haimasyövän miRNA ilmentymisen profiilit).

kvantitatiivinen arviointi miRNA käänteistranskriptiolla Real-Time PCR-määritys

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR) on miRNA suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA määritys (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI-PRISM 7700 Sequence Detection System. Kaksivaiheinen-protokolla edellyttää, käänteistranskription kanssa miRNA-spesifistä aluketta, mitä seuraa reaaliaikaisen PCR TaqMan-koettimia. Analyysit kohdistaa vain kypsiä miRNA, eikä niiden esiasteita. Lyhyesti, käänteistranskriptaasin reaktiot sisälsivät 10 ng RNA-näytteet, 50 nM stemloop RT pohjamaali, 10X RT-puskuria, 0,25 mM kutakin dNTP, 3,33 U /ul MultiScribe RT ja 0,25 U /ul RNaasi-inhibiittoria (kaikki ostettu cDNA Archive Kit of Applied Biosystems) tehtiin lopullisessa tilavuudessa 15 ui, ja niitä inkuboitiin termal cycler 30 minuutin ajan 16 ° C: ssa, 30 min 42 ° C: ssa, 5 min 85 ° C: ssa ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa. 20 ui PCR-reaktioseosta sisältyy 1,3 ui RT tuote (1:15 laimennettua), 10 ui TaqMan 2X Universal PCR Master Mix (NoUmpErase UNG) ja 1 ui TaqMan 20X MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) . Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppaisilla optinen levy 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 10 min. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen analyysi

Potilaiden perustason ominaisuudet raportoitu keskiarvo ± keskihajonta (SD) tai taajuuksilla ja prosentit jatkuvaan ja kategorisen muuttujia, vastaavasti.

kummankin koulutuksen ikäluokat, microRNA siru data normalisoitiin käyttämällä Tukeva Multi-array Average (RMA) algoritmi [9]. Jotta tiedettäisiin ilmentyvät eri miRNA välillä pariksi normaalin ja kasvaimen kudokset, kahta lähestymistapaa. Ensinnäkin, klassinen parillista t-testiä kontrolloiden väärien löytö määrä (FDR) sallitaan ranking miRNA mukaan niiden p-arvot. Toiseksi, satunnainen metsä (RF) analyysi [10] sovellettiin havaita miRNA paras valmiudet erotteleva kasvaimen pariksi normaaleista kudoksista. Radiotaajuustunnistuksessa on luokittelija, joka koostuu kokonaisuus puumaisesti luokittelijoiden. Tämän tekniikan mukaisesti, 100000 puita rakennettiin luokitella kudoksiin. Oppiminen sarja käytetään kasvaa jokainen puu oli .632+ bootstrap resample havaintojen. Puut annettiin kasvaa täyteen mittaansa ilman karsimisesta. Paras split kussakin solmussa valittiin satunnaisesti osajoukko miRNA. Vasemmassa-out havaintoja (eli ”out of bag” havainnot) olivat tuolloin ennustettiin saada luokitusta virheprosentti tarkasteltavan puu. Ennakoiva kyky luokittimen arvioitiin yhdistämällä yksi puu virhemääriä. Lisäksi satunnainen metsä kehys pystyimme merkityksen arvioimiseksi muuttujan katsomalla kuinka paljon luokitteluvirheeseen kasvaa, kun ”out of bag” tietoja, jotka muuttujan pennutoidaan ja kaikki muut jäävät ennalleen. Tärkeys metrinen käytettiin keskimääräinen väheneminen Tarkkuus (MDA). MDA on rakennettu permutoimalla arvoja kunkin muuttujan testipakkauksesta, tallennus ennustaminen ja vertaamalla sitä YK-permutoidun koepaketin ennustaminen muuttujan. Siksi on kasvu prosenttiosuus kertaa testin sarja on luokiteltu väärin, kun muuttuja permutoidaan. Seurasimme Strobl et al. [11] voitaisiin välttää puolueellisuutta muuttuja valinta: yksittäinen luokitus puuta rakennettu alinäytteenotto- vaihtamatta ja hyväksymällä ehdollisen permutaatio järjestelmää [12]. Olemme saaneet miRNA ranking mukaisesti muuttuvan tärkeää toimenpidettä. Lopuksi kaksi miRNA rankingissa, yksi klassisen analyysin ja yksi RF-analyysi, fuusioitiin saada luettelon differentiaalisesti ilmaisi miRNA. Korrelaatiot miRNA ilmaisu arvioitiin käyttäen Spearman kerrointa. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisen merkitsevyyden. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SAS Release 9,1 (SAS Institute, Cary, NC, USA) ja R satunnaisen metsien analyysejä (

randomForest

paketti).

Quantitative real-time PCR (qPCR) määritys käytettiin ulkoisiin validointi kohortteja vahvistaa microRNA array tuloksia, jotka arvioitiin käyttäen Comparative Threshold sykli (CT) menetelmää ja oletuksena kynnys asetukset. Suhteellinen ilmauksia miRNA laskettaisiin 2

-ΔΔCt kaava [13] käyttäen U6 pieni ydin- RNA (RNU6B) kuin normalisointia ohjaus. Koska 2

-ΔΔCt muunnettuja arvoja ei normaalisti jakautunut, vertailut tehtiin käyttämällä ei-parametriset Wilcoxonin testi sen arvioimiseksi tilastollisen merkityksen ylös- tai alaspäin sääntelyä. Sillä qPCR validointi analyysien, me pidetään otoskoko 14 aiheita tarjota 90% teholla (jossa on kaksipuolinen alfa = 0,05) havaitsemaan säätely ylöspäin vähintään 2 tai alas-säätely korkeintaan 0,5 kunkin miRNA ilme suhteen 2

-ΔΔCt käyttämällä ei-parametrinen Wilcoxonin testi ja 1 kun nollahypoteesi.

Verkko analyysi

kummankin koulutuksen kohorttien undirected ja painotettu verkko rakennettiin, jossa solmut ja reunat ovat miRNA ja niiden korrelaatioita (jos merkittävät), tässä järjestyksessä. Niinpä reunat eivät suuntautuneet koska korrelaatio on symmetrinen, ja painotettu Spearman kerroin. Paksuus reunojen heijastaa suuruus painoja. Jotta kaivaa kriittinen solmut pois sekä CRC ja PC verkkojen me lainattu joitakin menetelmiä yhteiskuntatieteiden, ja arvioitiin seuraavat

keskeisyyden

toimenpiteet:

aste

,

betweenness

ja

klustereiden kerroin

[14], [15] kullekin verkkoon. Lopuksi miRNA on luokiteltu vastaavasti.

Kaikki nämä toimenpiteet (tai mittarit) perustuvat luettelointi linkkien tai lyhimmän polkuja. Yksityiskohtiin, olkaamme määritellä polku, sen kanssa joukko solmuja, kuin Vuorottelevia solmuja ja reunat, alkaa ja päättyy siten, että kukin reuna yhdistää sitä edeltävän ja sen menestyminen kärki. Asetamme pituus polun olla summa käänteisen painot sen reunasta. Ajatuksena on, että korreloi miRNA minimoida välinen etäisyys solmujen tai, toisesta näkökulmasta, sitä lähempänä kaksi solmua ovat sitä enemmän he ovat korreloivat. Siksi me laskea etäisyys kahden solmun ja kirjoitettu, koska vähimmäispituus tahansa polku yhdistää ja. Määritelmän mukaan jokaiselle.

Degree

keskeisyys perustuu ajatukseen, että tärkeät solmut ovat ne, joilla on eniten yhteyksiä muihin solmuihin kaaviossa. Se on usein tulkittu heti mukaan solmujen perustettujen verkon kautta. Antaa paino reuna, joka yhdistää solmu kanssa solmun aste keskeisyys solmu on, jossa joukko reunoja, jonka mukaan korkeampi on aste arvo, sitä tärkeämpää (maailmanlaajuisesti korreloi) on solmu .

Betweenness

keskeisyyden mittaa vaikutuksen solmu on yli epäsuora korrelaatio ei naapurin solmuja. Betweenness, sen perusversio, on yhtä kuin osa lyhimpiä polkuja solmuparien välillä, jotka kulkevat solmun kiinnostava. Sen matemaattinen lauseke, jossa on määrä lyhimpiä polkuja ja, ja on määrä lyhimpiä polkuja kyseiseen läpäisee kärki. Kärkipisteet, joita esiintyy monissa lyhimmän polun välillä kaikki kärjet ovat korkeammat betweenness, ja sitten suurempi merkitys välillisten korrelaatioita.

klusterointi kerroin

on mitta määrin solmut kuvaajan yleensä klusterin yhdessä, tai muut ehdot, siinä esitetään määrällisesti solmut vuoksi, missä määrin niiden naapurit ovat olemaan

klikki

(täydellinen graafi) kanssa. Klusterointi kerroin solmun on tällöin osuutta yhteyksiä solmujen sen naapurustossa jaettuna linkkien määrä, jotka voisivat mahdollisesti niiden välillä. Tiivistetysti, se ilmaistaan, jossa määritellään välittömästi kytketty naapureita asettaa ja. Sen ”painotettu” muotoilu perustuu painot

kolmiot

keskittynyt solmut verkkoon. Se on määritelty Horvath ja Zhang [16], kuten jossa on paino reunan yli, ja näin ollen tuotteen painot reunat, jotka muodostavat suljetun kolmion solmuja. Alkaen paikallisen määritelmän klusterointi kertoimen, raportoimme sen keskimäärin valmisteeseen Schank ja Wagner [17] koko verkon suhteena summa tuotteiden ryhmittely kertoimien ja yleinen painon funktio, ja painon funktio itse eli missä on yleinen paino toiminto. Paino toiminto valitaan yleensä joukosta muuttujia, jotka paremmin kaapata verkon topologia tutkittavana. Pienempi

keskimääräinen painotettu Clustering Kerroin

toimenpide osoittaa tärkeämpi solmun suhteista verkostoon kestävyyttä.

Verkot on laadittu ja analysoitiin mukautetun erillinen työkalu kirjoitettu C # ja rakennettu yli kirjastossa NodeXL 1.0.1.174 [18].

tulokset

Altered miRNA ilmentymistä potilailla, joilla on CRC ja PC

Vertasimme miRNA profiilit 36 ​​paria kiinteitä kasvaimia ja viereisten nontumorous kudoksiin koulutukseen ikäluokat (19 CRC ja 17 PC) avulla microRNA mikrosiruja. Ihmisen miRNA (

on-luki-

) ja kudokset ryhmiteltiin hierarkkisen klusterointi analyysi (kuvio 1). Jokainen merkitty koetin värikoodattu rinnastaa tason ilmaus miRNA suhteessa sen mediaani ekspressiotason koko kudosnäytteet asettaa (sininen, pieni, punainen, korkea) (kuva 1).

miRNA profiilit 36 pariksi kudosnäytteiden 19 kolorektaalisyövän (oranssi laatikko) ja 17 haimasyöpä (green box) potilasta klusteroituja. 36 pariksi yksilöt ovat riveissä (värillinen palkit) ja 866 miRNA ovat sarakkeissa. T, kasvain kudos; N, vierekkäiset normaalia kudosta.

Differentially ilmaistu miRNA CRC ja PC

Jotta voitaisiin tunnistaa miRNA differentiaalisesti ilmaistut pariksi normaaleissa ja tuumorikudoksissa, kahta lähestymistapaa: klassinen Paired t-testi kontrolloiden väärien löytö määrä (FDR) ja RF-analyysi. Ensimmäisessä analyysissä 42 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistut CRC (taulukko 1). Kaksikymmentäviisi niistä yliekspressoituina jossa

HSA-miR1246

osoittaa korkeimman kertamuutosta arvo (12,0-kertainen). PC, 128 miRNA olivat differentiaalisesti (katso taulukko S2). Erityisesti 34 miRNA kanssa p 0,01, 30 osoitti korkeampia ekspressiotasoja kasvainkudoksessa, jossa

HSA-miR-23a

näyttää korkeimman kertamuutosta arvon (9,3-kertainen), kun taas 4 lisää miRNA olivat alassäädetty (taulukko 2).

selville mahdollinen olemassaolo ortologeja muissa lajeissa, ja käyttää niitä sisäisiä menetelmiin valvonnan, ihmisen miRNA löytyy muuttunut kahdessa kiinteässä kasvaimia tarkastettiin 71 muuta vesieliöstössä array: kaikkiin vapaasti ortologeja ihmisen miRNA (tästä eteenpäin,

on-luki-

tullaan nimitystä

asennuspalveli-

) osoitti merkittävä ero ilmaus samanlaisia ​​fold-muutos nämä organismit (taulukko S3).

oikeellisuus RF luokittelu esityksiä erotteleva kasvain normaalista kudoksesta ilmoitettiin moniulotteinen skaalaus arvioidusta läheisyys matriisi tontteja (kuva 2) näyttämällä samankaltaisuuksia tai eroavaisuuksia tietoja. Kunkin kasvaimen tyyppi, joukkoon tärkeimpien miRNA mukaan MDA, saatiin (kuvio 3, paneelit A ja B).

Läheisyys matriiseja satunnaisesta metsä analyysi, jossa

x-

ja

y-

akselit ovat moniulotteisia skaalaus koordinaatit. Potilaat, joilla on samanlaiset miRNA ilmaisuja edustaa pisteiden lähelle toisiinsa, kun taas potilailla, joilla on erilaisia ​​miRNA ilmaisuja edustaa erillään oleviin. Punainen = kasvainkudoksessa, musta = viereiseen normaaliin kudokseen.

väheni keskimäärin Tarkkuus (MDA) mittana miRNA merkitys luokittelussa tuumorikudoksissa normaalista niitä arvioitiin satunnainen metsä analyysi. Ensimmäiset 42 tärkein miRNA kolorektaalisyövässä (paneeli A) ja 50 miRNA haimasyövän (paneeli B) esitetään.

vertailu miRNA allekirjoitus havaitsemismenetelmät

Kun tulokset jossa t-testiä ja RF yhdistettiin, huomattava päällekkäisyys miRNA havaittu joko CRC ja PC kudoksissa todettiin. Jonka leikkaa miRNA kanssa p 0,001 t-testin analyysi (taulukko 1) kanssa, jolla on korkein MDA RF-analyysi (kuvio 3A), ilmentyminen 24 miRNA oli merkittävästi muuttunut CRC (kuvio 4). Samanlaisella analyyttinen lähestymistapa (taulukko S2, ja kuvio 3B), 23 miRNA merkittävästi muuttuneet PC (kuva 4).

molemmissa kudoksissa merkittävää päällekkäisyyttä joukossa havaittu miRNA todettiin yhdistämällä t-testi ja RF tuloksia. Ryhmä 24 miRNA, jonka ilmentyminen merkitsevästi muuttunut Kolorektaalituumorien, saatiin leikkaa luettelon ensimmäisen 42 miRNA paras p-arvot, t-testi analyysi, jossa joilla oli suurin MDA, RF- analyysi. Samalla tavalla, 23 miRNA, joilla on muuttunut ekspressio valittiin haiman kasvaimia. * P 0,001; § RF 4,3; ** P 0,05; # RF 0,94.

Kuten kuviossa 4, miRNA ilme oli raskaasti kudosspesifisiä; todellakin, useimmat miRNA muuttuneeseen ilmaisua CRC ei differentiallly ilmaistu haiman kasvainkudoksen. Muuttuneen ilmentymisen vain kaksi miRNA jakoivat CRC ja PC:

miR 145

esiintyi 2,2-kertainen alassäädetty (p 0,001) CRC, ja 5,7-kertaisesti säädellä (p 0,01) PC, kun taas

miR-1280

oli 2,1-kertainen sääteli (p 0,001) ja 2,3-kertainen alassäädetty (p 0,05) entisessä ja jälkimmäinen syöpiä, vastaavasti (katso taulukko 1, taulukot 2 ja S2).

miRNA korrelaatiot ja syöpää miR verkon

Seuraava yritimme tarkistaa keskinäistä suhdetta aiemmin valittujen miRNA ilmoitetaan joko CRC ja PC kudosten avulla Spearmanin korrelaatiokerroin menetelmällä.

CRC, eri

astetta

Vastaavuussuhteet löydettiin 24 miRNA näytteille muuttunut ilme:

miR-106a

ei korreloi lainkaan, kun taas

miR-195

esillä eniten siteet ja otettiin juurisolmu 9 reunat (

astetta

15,86); 8 yhteyksiä havaittiin varten

miR-28-3p

(

astetta

15,66), ja 7 linkkejä

miR-1280

(

astetta

13.79)

miR-1246

(

astetta

13,05), ja

miR-140-3p

(

astetta

12,12) (kuvio 5, paneeli A) . Jälkimmäinen 3 solmuja myös yhdistetty

miR-28-3p

, joka osoitti korkeaa betweenness arvo. Viimeksi mainittua toimenpidettä, korkein arvo havaittiin

miR-1246

solmu josta monet lyhin polut välillä muut kärkipisteet esiintyä (taulukko S4). Toinen tärkeä solmu edusti

miR-18a

6 suhteita, joista 3 perustettu useita miRNA kuuluvat

miRNA 17-92a

klusteri. Kun mittasimme aste solmukohtien klustereiden (c

loistokiillotuksen kerroin

),

miR-378, miR-10b

ja

miR-31

näytti olevan

cliqu

e kanssa vertice in

miR-28-3p

. Voit tarkistaa luotettavuutta verkon, laskimme

keskimääräinen painotettu klustereiden kerroin

, ja arvioidaan osuus on miRNA yleistä tiiviyttä verkon. Heikoin tarkkailtiin

miR-1280, miR-195

ja

miR-140-3p

jotka olivat kärkipisteet täydellinen (kuviot 5, paneeli A ja taulukko S4).

Green pistettä kuvaavat solmut vastaavat 24 miRNA CRC verkon ja 23 miRNA PC-verkkoon. Reunat luonnehtivat merkittävät korrelaatiot, jonka paksuus kuvastaa Spearman korrelaatiokertoimet (sininen ja vihreä reunat käytetään positiivisia ja negatiivisia korrelaatioita vastaavasti). CRC verkossa, kuten esitetään A-kuvassa, m

IR-195, miR-28-3p, miR-1280, miR-18a

ja

miR-1246

näytteille korkein

painotettu

asteen listalla. Ei korrelaatio löytynyt

miR-106a

.

MiR-1246

on myös korkein

betweenness

listalla. PC-verkon, kuten on esitetty paneelissa B,

miR-103, miR-23a

ja

miR-15b

on korkein

astetta

ja kaikki liittyvät

miR-199-3p

sekä toisiinsa muodostaen neljä solmua

clique

. Lisäksi poistamalla näiden solmujen aiheuttaa syvin lasku keskimääräinen klusterointi kerroin listalla.

MiR-384

osoittaa korkeimman betweenness keskeisyyden toimenpide.

Kaksikymmentä ulos 23 miRNA joilla on merkittävä vapauttamisen PC kudoksista rivikytkeä kärkipisteet verkkoon useita reunoja vaihtelee yhdestä viiteen (

aste

: 8,88-1,92); vain 3 miRNA (eli

miR-30d *, miR-1280

ja

miR-493 *

) merkittävää korrelaatiota ei havaittu (

aste

: 0), ( kuvio 5, paneeli B). Erityisesti enimmäismäärä siteiden todettiin

miR-103

(

aste

: 8,88),

miR-23a

(

aste

: 8.84) ja

miR-15b

(

aste

: 8.38). Nämä 3 tärkeimmät solmut liittyivät kaikki

miR-199-3p

(aste: 6,03) ja nämä neljä miRNA ilmestyi välisen ristissä muodostavan neljän solmun klikki. Korkeimmat betweenness keskeisyyden toimenpide havaittiin

miR-384

(

betweenness

: 0,31), havaittiin kriittisesti sijoitettava välissä (siis vastuussa monista) keskipitkän kantaman korrelaatioita. Varmistimme olennaisuuden neljän solmun

klikki

mittaamalla yleistä luotettavuutta verkon (mitattuna polkuja irtisanominen) poistamisen jälkeen. Me lasketaan

keskimääräinen painotettu klustereiden kerroin

koko verkon poistamalla vuorostaan ​​solmuun. Erityisesti jälkeen ilman solmut

klikki

(

miR-103, miR-15b, miR-199-3p

ja

miR-23a

) alin riveissä eli 5,78, 5,85, 6,05 ja 6,14 saatiin, vastaavasti. Tämä havainto pinpoints näihin solmuihin niin toiminnallisesti asiaan ja toiminnan merkittävästä ainesosana koossapysyvyyttä verkon (kuvio 5, paneeli B ja taulukossa S4).

Validation qPCR

joukossa merkittävästi vapautettiin miRNA vuonna microarray tutkimus, 18 valittiin lisävalidointia kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (qPCR). Valinta näiden miRNA perustui kahden kriteerin tuloksista aiemmin kuvattu risteys analyysi, ja /tai niiden osallistuminen paksusuolen tai haiman kasvaimien synnyn (mukaan saaduilla tiedoilla). Kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin analysoimaan muuttunut ilmentyminen valitun miRNA, samoin kuin on RNAU6 valvontaa, kasvain ja normaaleissa kudoksissa otettu uusi validointi kohortteja 14 potilailla, joilla on CRC, ja 21 PC potilailla.

verrattuna normaaliin kudokseen ilme profiilin normalisoida 1, tuumorinäytteissä 14 CRC potilaat havaitsimme merkittävää ylössäätöä 3 miRNA (

miR-31, miR-21

ja

asennuspalveli- 708

), ja alle ilmaisun 7 toiset (

miR-145, miR-139-5p, miR-486-5p, miR-378, miR-140-3p, miR-143

ja

miR-30c

) (taulukko 3). Loput 8 miRNA (

miR-151-5p, miR-155 *, miR-17, miR-199-5p, miR-23a, miR-30a-5p, miR-455-3p, ja miR-kirjaimien 7 i

) ei esiintynyt merkittävästi muuttunut ilme.

kohortin 21 PC potilaista, 13 ulos 18 miRNA analysoitiin qPCR vuonna kasvainkudoksen verrattuna normaaliin näytteitä. Down-ilmentyminen havaittiin vain

miR-21

, kun taas yli-ilmentyminen havaittiin 12 miRNA (

miR-143, miR-145, miR-151-5p, miR-155 *, miR -199a-5p, miR-23a, miR-30a, miR, 30c, miR-21, miR-455-3p, miR-708

ja

miR-let-7i

) ja vain kaksi oli ei vapautui tilastollisesti merkitsevästi (

miR-30a ja miR-30c

) (taulukko 3).

keskustelu

miRNA jotka ilmentyvät eri erilaisissa syövissä voivat osallistua yhteistä muuttuneessa säätelyreittejä [19]. Siten tietoa niiden vuorovaikutuksessa olevaa verkko voi tarjota näkökulmasta muuttunut miRNA ja niiden rakenteessa sääntelyn (eli ylös- tai alaspäin-asetus). Tässä tutkimuksessa olemme profiloitu miRNA kahdessa eri kiinteässä syövän kudoksissa, CRC ja PC, testata onko uskottavaa ”allekirjoitukset” oli havaittavissa. Tätä varten olemme alun perin etsittiin miRNA ekspressoituu differentiaalisesti kasvaimia ja normaalin kudoksen kahden eri suvusta, ja sen jälkeen tunnistetaan ”kudosspesifinen” miRNA käyttämällä uutta tilastollista lähestymistapaa, eli RF luokitin. Jokaista syöpäkudoksessa pystyimme tuottamaan luettelon tarkinta ja merkittävästi vapautettu miRNA. Mielenkiintoista on, että kaksi listaa vain kaksi miRNA uusiutui mutta vastakkaiset malleja ilmaisun:

miR-145

ja

miR-1280

. Vaikka eri mallien ilmentymisen

miR-145

kirjataan [20], ei ole tietoa

miR-1280

ja sen käyttäytymistä kiinteä kasvain.

kattava analyysi vuorovaikutteisten verkkojen näiden miRNA osoittivat, että niiden vapauttaminen kuviot ovat kudosspesifisiä, kuten erilaisia ​​yhteyksiä (eli eri korrelaatio kuvioita) havaittiin niiden välillä kaksi suvusta. Lisäksi määritimme kriittisin miRNA ja tarkasti, että ne olivat erilaisia ​​CRC ja PC verkoissa.

Ymmärtääksemme sääntelymekanismeja että miRNA liittyy merkittäviä yhteyksiä molemmissa verkoissa, teimme kolmivaiheinen

in-silico

analyysi. Ensin paremmuusjärjestykseen solmujen avulla tunnettujen keskeisyys indeksit: painotettu

aste

ja

betweenness

. Vaikka entinen indeksi tarjotaan oivalluksia välitöntä vaikutusta kohdistaman kunkin solmun sen naapuruston (meidän tapauksessamme, niiden korrelaatio), jälkimmäinen tunnistetaan solmut välttämättömiä epäsuoran korrelaatioita, eli solmuja, jotka sijaitsevat poluilla korrelaation ja että jotenkin vaikuttaa pitkän kantaman korrelaatioita. Näin ollen meillä sijoittui solmut

klustereiden kerroin

indeksi, jotta voidaan mitata niiden koossapysymisasteen kanssa lähinaapureihin. Tavoitteena oli määrittää luotettavuutta verkkojen, etsimällä solmujen, jotka muutoin häiritä verkon arkkitehtuuria, kun ei oteta huomioon. Tätä varten me lasketaan klusterin kerroin koko verkkojen syklisesti poistamalla yksi solmu kanssa vastaavien reunojen ja käyttämällä

painotettua asteen

paino funktiona. Yleensä verkot puuttuu solmut tärkeää yleistä luotettavuutta näytteillä pienempi tulokset.

Kuten viime vaiheessa, me validoitu meidän

in-silico

arvioita manuaalisesti tarkastamalla kohdegeenien ja niiden signalointireitteihin. Näiden lähestymistapojen, havaitsimme, että suurin osa miRNA samanlaisia ​​vapauttamisen kuvioita liittyivät yhteinen tavoite geenien ja /tai säätelyreittejä (katso taulukko S5). Erityisesti CRC kolme pääasiallista solmua havaittiin:

miR-195, miR-18a

, ja

miR-1246

. Ensimmäinen solmu oli korkea suhde miRNA mukana MAPK signalointireitillä, kuten

in-silico

analyysi käyttäen DIANA-mirPath (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/index_multiple .php), paitsi

miR-31 ja miR-28-3p

, jotka kuuluvat EGF-reitin. Toinen solmu,

miR-18a

, kuului useita miRNA (

miR-17, miR-19b, miR-92a

) kuuluvat samaan klusteriin:

miRNA 17- 92a

.