Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on erittäin heterogeeninen ja koostuu eri alatyyppejä, jotka ovat erilaisissa ero vaiheittain. Hiljattain tunnistettu integriini-vuorovaikutuksessa proteiinien Kindlin-1 ja Kindlin-2 ovat aktivaattoreita transmembraanireseptoriproteiinia integriinien että tärkeä rooli syövän etenemiseen. Tässä raportissa esitetään ilmaisun profiilit Kindlin-1 ja Kindlin-2 keuhkosyövässä käyttämällä potilaan näytteitä ja vakiintunut niiden vastaavuus keuhkosyöpään etenemiseen. Olemme havainneet, että Kindlin-1 ilmentyi epiteeli-johdettu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, erityisesti okasolusyöpä keuhkosyöpä, mutta ilmennetään matalalla tasolla huonosti eriytetty suuri keuhkosyöpä. Kuitenkin Kindlin-2 oli hyvin ilmaistu suuri keuhkosyöpä. Sekä Kindlin-1 ja Kindlin-2 ei havaittu ilmaistu tai ilmaista erittäin alhaisilla tasoilla neuroumpieritteisissä johdettu pienisoluinen keuhkosyöpä. Tärkeää on, että Kindlin-1-ilmentymisen määrä korreloi positiivisesti erilaistumista okasolusyöpä keuhkosyöpä. Yllättäen olemme huomanneet, että erittäin homologisia Kindlin proteiinit, Kindlin-1 ja Kindlin-2, näytetä torjua toiminnallisten roolien keuhkojen syöpäsoluja. Kohdunulkoinen ilmentyminen Kindlin-1 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut estivät

in vitro

solujen vaeltamiseen ja

in vivo

kasvaimen kasvua, kun taas Kindlin-2 edistää näitä toimintoja. Mekanistisesti, Kindlin-1 kielletty epithelail ja mesenkymaalitransitioon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä soluja, kun taas Kindlin-2 parannettu epithelail on mesenkymaalitransitioon näissä soluissa. Yhdessä olemme osoittaneet, että Kindlin-1 ja Kindlin-2 differentiaalisesti säätelevät keuhkosyöpäsolua etenemistä. Lisäksi ekspressiotasot Kindlin-1 voidaan mahdollisesti käyttää markkerina keuhkosyöpä erilaistumista ja kohdistaminen Kindlin-2 voi estää invasiivisen kasvun suuri keuhkosyöpä.

Citation: Zhan J, Zhu X, Guo Y, Wang Y, Wang Y, Qiang G, et ai. (2012) vastapäätä rooli Kindlin-1 ja Kindlin-2 in keuhkosyövässä. PLoS ONE 7 (11): e50313. doi: 10,1371 /journal.pone.0050313

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 18 lokakuu 2012; Julkaistu: 29 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Zhan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (NSFC) keskeinen hanke 30830048, Ministry of Science and Technology of China 2010CB912203 ja 2010CB529402, NSFC31170711, 111 projekti opetus- ja Beijing Natural Science Foundation 7120002 on HZ, ja myös avustuksen Staffan Strömbladin Center for biotieteiden Karolinska Institutet. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on monimutkainen sairaus, joka voidaan histologisesti luokitella pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC), joka edustaa lähes 20% keuhkosyöpä, ja suurin osa on ei-pieni-solujen keuhkosyöpä (NSCLC), joka edustaa yli 80% keuhkosyöpä [1]. NSCLC kattavat okasolusyöpä (SCC), adenokarsinooma (AC), ja suuri karsinooma (LCC) [2]. Erittäin pitkälle, kohtalainen eriytetty ja huonosti eriytetty karsinoomat voidaan nähdä SCC ja AC. Keuhkosyöpä on varsin heterogeeninen kasvaimen kasvussa, invaasiota ja etäpesäkkeiden sekä tulosten käsittelyn jälkeen. Keuhkosyöpä eri erilaistumista tila näkyy ristiriitaisuuksia maligniteetti, esimerkiksi alhaisen eriytetty keuhkosyövän ovat pahanlaatuisia kuin korkean eriytetty syöpien, joka on nopeasti kasvava ja erittäin metastaattinen.

Fermitin perheenjäsen 1 (FERMT1) koodaavat Kindlin -1 on FERM (4,1-Erzin-Radixin- moesiini) sisältävä proteiini, joka kuuluu Kindlin perheeseen. Kindlins ovat integrin- vuorovaikutuksessa, jotka säätelevät integriinin aktivaation kautta vuorovaikutus integriinin β-alayksikön sytoplasmisen domeenin [3], [4]. Kindlin-2 koodaaman FERMT2 havaittiin ohjaamaan kaksisuuntaisen signaloinnin integriini [5]. Kindlin nimettiin alkaen Kindler oireyhtymä, joka keksittiin vuonna 1954 esillä yhdistämällä epidermaalinen surkastuminen, levennetty kapillaareja ja kirjava ihon pigmentti [6]. Mutaatioita Kindlin-1 oli havaittu syy Kindler oireyhtymä [7], [8]. Viime aikoihin asti Kindlin perheenjäsen on liitetty etenemistä kasvaimia [9]. Kindlin-2 on osoitettu ilmentyvän pahanlaatuinen mesoteliooma ja säätelee tarttuvuus ja muuttoliike [10], ja ilmentymistaso Kindlin-2 liittyy herkkyyden eturauhasen syöpäsolujen sisplatiinin indusoimaa solukuolemaa [11]. Kindlin-2: n ilmentymisen havaittiin korreloivan kasvaimen invaasio, imusolmuke etäpesäke, ja potilaan lopputulokseen mahasyövän [12]. Kindlin-1: n on havaittu yli-ilmentynyt 60% keuhkosyöpä ja 70% paksusuolen syövän tutkittiin RNA ekspressiotasot kymmenestä potilaista [9]. Aivan hiljattain, Sin et al osoittivat, että Kindlin-1 on rooli rintasyövän kasvua ja keuhkometastaasitestissä [13]. Sen lisäksi ekspressio tuumorisoluissa, Kindlin-2 oli myös havaittu olevan erittäin ilmaistaan ​​kasvaimen strooman rakon syövissä [14]. Vaikka Kindlin-1 ja Kindlin-2 liittyvät syövän etenemisessä, Kindlin-3 on maksuihin, että hematopoieettiset häiriöt [15] – [19]. Kindlin-2 ilmaistaan ​​laajasti endoteelin ja vesicular sileän lihaksen [3], [20], ja on olennainen osa interkaloituneet levyjä, tarvitaan selkärankaisten sydämen rakenteen ja toiminnan [21]. Tähän mennessä tiedetään vain vähän rooleista Kindlin-1 ja Kindlin-2 keuhkosyövässä etenemiseen.

Tässä tutkimuksessa pyrimme vastaamaan ensinnäkin, että jos Kindlin-1 ja Kindlin-2 osansa keuhkosyöpä etenemistä. Koska suuri heterogenecity keuhkosyövän haluamme myös vastata, että jos Kindlin-1 ja Kindlin-2 ilmentyy differentiaalisesti eri keuhkosyövän ja tehtävät selvästi keuhkojen syöpäsoluja. Tätä varten olemme tutkineet ekspressiota Kindlin-1 ja Kindlin-2 paneelissa keuhkosyövän kudosnäytteistä ja kiinnitettiin huomiota verrata suhteellisia ekspressiotasoja Kindlin-1 ja Kindlin-2 samalla potilaalla. Kiehtovan tunnistimme vastavuoroinen roolin Kindlin-1 ja Kindlin-2 sääntelyssä syövän etenemisen sekä solujen ja eläinten. Yhdessä meidän havainnot tarjoavat uutta ymmärrystä Kindlin-1 ja Kindlin-2 in keuhkosyöpäsolua etenemiseen ja saattavat auttaa tulevia lääkkeiden kehittämisen kohti keuhkosyöpää terapeuttisia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics

eettisen komitean Pekingin yliopiston Health Science Center on hyväksynyt nykyisen tutkimuksen hiiren kokeiluja (Luvan numero: LA2011-73). Eettinen komitea Kiinan ja Japanin Friendship Hospital on hyväksynyt nykyisen tutkimuksen avulla keuhkosyöpä potilas tuumorikudoksista tutkimustarkoituksiin (Luvan numero: ZRLW-5) kantavassa käsitteleminen hiirillä ja ihmisen materiaalit olivat mukaisesti eettinen taso Helsingin julistuksen 1975 ja tarkistettu vuonna 1983.

Ekspressiovektorit, soluviljelmissä ja vakaa transfektio solulinjojen

Kindlin-1 täyspitkä cDNA kloonattiin ihmisen istukan cDNA-kirjastosta käyttäen alukkeita: CAGAATCCATGCTGTCATCCACTGACTTTAC (forward-aluke) ja GATCTAGATCAATCCTGACCGCCGGTCAA (käänteinen aluke). PCR-tuote kloonattiin pCRII-vektoriin, ja sitten edelleen kloonattiin pCMV10-3 × Flag-vektoriin (Sigma) käyttäen Hindlll-EcoRI-kohtiin. U1752, H1299, A549 ja U1810 solulinjoja ostettiin ATCC Yhdysvalloista tai Cell Collection Center of Pekingin unionin Medical School Kiinassa ja viljeltiin RPMI1640 (Invitrogen), jossa 10% FBS ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Soluja kasvatettiin 75 cm

2 dosviljelmäpulloissa tai 60 mm: n annoksia 37 ° C: ssa kosteus 5% (v /v) CO

2. Media vaihdettiin joka toinen päivä. Perustamiseen stabiilien kloonien, jotka ilmensivät Kindlin-1 ja Kindlin-2 erikseen, H1299-solut transfektoitiin Flag-Kindlin-1, Flag-Kindlin-2 ja tyhjän vektorin käyttäen Lipofectamine. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut siirrostettiin ja lisättiin G418: aa loppukonsentraatiolla 1200 ug /ml. Yksittäiset kloonit, jotka ekspressoivat Kindlin-1 tai Kindlin-2 yhdistettiin, jotta vältetään klonaalisen vaikutuksia. Yhdistettiin solut ilmentävät Kindlin-1 tai Kindlin-2 käytettiin toiminnallisia tutkimuksia kuten tekstissä.

kasvain kudosten

Keuhkosyöpä kudosnäytteet saatiin Department of Torakaaliikirurgia Kiinan ja Japanin Friendship Hospital, Peking Kiina, ja ne leikattiin patologian osaston Health Science Center Pekingin yliopisto, Beijing China. Niistä 140 kasvainkudossektioista että käytettiin immunohistokemiallisia analyysejä, 65 ovat SCC, 43 ovat AC, 12 ovat LCC ja 20 ovat SCLC (taulukko 1). Kaikki nämä näytteet altistettiin Kindlin-1 ja Kindlin-2 värjäystä. Lisäksi 7 tuore keuhkosyöpä kudoksia kanssa pariksi kasvain läheisyydessä kudoksiin kuuluu 3 SCC, 3 AC ja 1 LCLC. Nämä kudokset käytetään erottamaan mRNA qPCR havaitsemiseksi Kindlin-1 ilmentymisen.

Western blot-analyysi

PBSTDS: ää hajotuspuskuria kanssa proteaasin läsnä ollessa cocktail estäjän (Roche Diagnostics, GmbH) käytettiin poimia kokosoluliuotteista. 80% solulysaateista lisättiin 20% 5 x SDS-latauspuskuria, sitten erotettiin 10% SDS-PAGE geelillä ja blotattiin PVDF-membraaneille (huokoskoko 0,45 pm). Primaaristen vasta-aineiden anti-Kindlin-1 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (1:500 laimennus; Clone 4A5.14, Milipore, USA), anti-Kindlin-2-hiiri monoklonaalinen vasta-aine (1:1000 laimennus; Clone 3A3, Milipore, USA), anti- -Vimentin kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1: 2000 laimennus, Epitomics, USA), anti-Ecadherin kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1: 3000 laimennus, Epitomics, USA), anti-N-caherin kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1: 10000 laimennos; Epitomics, USA ), anti-Flag-monoklonaalinen vasta-aine (1:10000 laimennus; Clone M2, Sigma, USA) ja anti-β-aktiini-hiiren monoklonaalinen vasta-aine (1:1000 laimennus; Clone C4, Santa Cruz, USA) inkuboitiin kalvojen kanssa erikseen alle kierto. Perusteellisen pesun jälkeen membraaneja inkuboitiin edelleen johdetun tunnistavien vasta-aineiden joko kanin tai hiiren Ig (Jackson Laboratories, USA). Lopuksi, nauhojen visualisoitiin parannetun kemoluminesenssin (Pierce).

Kvantitatiivinen PCR

Kvantitatiivinen PCR (qPCR) määritykset suoritettiin ekspression havaitsemiseksi Kindlin-1-mRNA: n keuhkojen kasvain kudoksissa. Lyhyesti, normaali kudos ja keuhkojen kasvainten koko mRNA: t eristettiin Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja 2 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, CA, USA). Sitten PCR suoritettiin käyttäen Taq PCR MASTERMIX (TIANGEN, Kiina) ja asetukset: 94 ° C 2 min; 94 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 30 sekuntia, 30 sykliä; 72 ° C 5 min. Alukesekvenssejä olivat seuraavat: ihmisen Kindlin-1, eteenpäin: TCATGTTGGAGGAGTGATGC, käänteinen: AAGCCAGCAATGCTTCTGTT; aktiinin, eteenpäin: CTGAGCGTGGCTACTCCTTC, käänteinen: GCCATCTCGTTCTCGAAGTC. PCR-tuotteet analysoitiin 2,5% agaroosigeelielektroforeesilla läsnä etidiumbromidilla visualisointia varten. Kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin myös tunnistamaan muutokset MMP mRNA-tasolla indusoi Kindlin-1 ja Kindlin-2 H1299 solulinjassa. MMP-2 eteenpäin: AGCTCCCGGAAAAGATTGAT, käänteinen: GGTGCTGGCTGAGTAG- ATCC; MMP-7 eteenpäin: GTCTCGGAGGAGATGCTCAC; reverse: TACCCAAA-GAATGGCCAAGT; MMP-9 eteenpäin: TCTTCCCTGGAGACCTGAGA; käänteinen: ATTTCGACTCTCCACGCATC. Suhteellinen kertaiseksi muutoksia qPCR määritettiin ΔΔCt menetelmällä.

soluliikkuvuus määrityksiä

TranswellTM kammiot (Costar) ja 8 mm: n huokoskoon käytettiin suorittamaan solun migraatiokokeessa. Ensimmäinen, Kollageeni tyyppi I käytettiin päällystämään alapintaan Transwell kalvojen 1 h huoneen lämpötilassa. Sitten, H1299-solut transfektoitu stabiilisti Flag-BAP (bakteeri alkalinen fosfataasi), Flag-Kindlin-1 ja Flag-Kindlin-2 ympättiin yläpinnan Transwell. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin muuttoliikkeen puskurissa (RPMI1640, 2 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 0,2 mM MnCl

2, ja 0,5% BSA) 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2, Transwell kalvot kiinnitettiin 4% formaldehydiä 15 minuutin ajan ja värjättiin kristallivioletilla 10 minuutin ajan. Vihdoin, 6 mikroskooppikentäs- valittiin satunnaisesti laskemiseksi siirtynyt soluista.

solun haavan paranemista kokeen, 48 h transfektion jälkeen yksikerrossoluissa oli naarmuuntunut tavallisella 100 ui pipetin kärki. Haavoittuneen yksisolukerrokset pestiin kahdesti poistamiseksi tarttumattomat solut 0,1 M PBS: llä (pH 7,2). Kaksitoista tuntia myöhemmin haava havaittiin 20 x tavoite (Nikon, Japani) ja mitattiin solun leveyden haavat. Kuusi mikroskooppikentäs- kunkin lautasen havaittiin ja valokuvattiin.

immunohistokemia (IHC) B

Lung kasvain dioja saatu Kiinan Japani Friendship Hospital olivat kaikki formaliinikiinnitetyt ja paraffinembeded. Deparaffinization ja nesteytys tehtiin ja sen jälkeen poistamalla endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus käyttämällä 0,3% vetyperoksidia 30 minuuttia ja mikroaaltouuni antigeenin haku 10 mM natriumsitraattipuskurissa (pH 6,0) 20 minuutin ajan. Käytimme affiniteettipuhdistettua polyklonaalista anti-Kindlin-1 (PKU Animal Facility) vasta-ainetta 2 ug /ml, ja monoklonaalinen anti-Kindlin-2 (Millipore, USA), 2 ug /ml suorittaa näissä kokeissa. Ensisijainen vasta-ainetta käytettiin 4 ° C: ssa yön yli. Sitten PV9000 2-vaihe plus Poly-HRP Anti-hiiri /kani IgG Detection System (Zhong Shan Jin Qiao) levitettiin. Streptavidiini-biotiini- peroksidaasi-menetelmä käyttää ilmaisuun ja diaminobentsidiini on haettu substraatin (ChemMate Detection Kit, DAKO). Hematoksiliini käytettiin vastavärinä. Negatiiviset kontrollit tehtiin jättämällä pois käytöstä ensisijaisen vasta-aineen.

Arviointi Immunohistokemian

Kaksi itsenäistä patologia arvioi kaikki immunovärjäyksin ja yksimielisyyteen perustelun keskustelua kirjattiin. Arviointi on luokiteltu 4 asteet: no reaktiivisuus merkitty 0, heikko reaktiivisuus kuin 1+, kohtalainen reaktiivisuus 2+, ja vahva reaktiivisuus kuin 3+.

In vivo

ksenografti kasvaimen kasvua kokeilla

Balb /c nude-hiiriin istutettiin ihonalaisesti kupeeseen 1 x 10

6 solua, jotka on stabiilisti yli-ilmentävät Kindlin-1, Kindlin-2 ja ohjaus- vektorin erikseen. Kasvaimet mitattiin niiden kokojen kahdeksaantoista päivää ja jatkettava tallennusta varten ilmoitettuun aikaan. Hiiret tapettiin käyttäen eutanasia, kun kasvaimen kasvua 1 cm halkaisijaltaan. Kasvaimet otettiin pois ja painotettuna.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit potilasaineistojen suoritettiin Kruskal-Wallisin testiä ja tilastollisia analyyseja pariksi näytteitä palveluksessa Studentin t-testiä. Kaikki tilastolliset analyysit SPSS version14.0. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkitsevä tasolla

P

0,05.

Tulokset

Kindlin-1 ilmentyy normaalissa keuhkokudoksessa ja eri alatyyppejä keuhkosyöpään

Kindlin-1 ilmentymisen keuhkosyöpä on alustavasti ehdotettu

9,13. Mitään ei kuitenkaan tiedetä yksityiskohtaisesti Kindlin-1 ilmentymisen eri alatyyppejä keuhkosyöpäpotilaiden. Ymmärtää posible involement on Kindlin-1 ja Kindlin-2 keuhkosyövän etenemisen, ensin tarkasteltiin ilmentymisen Kindlin-1 keuhkosyöpä potilaan kudoksiin käyttämällä immnohistochemistry (IHC), jossa affiniteettipuhdistettua polyklonaalista Kindlin-1-vasta-aine, jossa on normaali keuhkojen kudosten kontrollina. Olemme havainneet, että Kindlin-1 ei ollut havaittavissa normaaleissa keuhkorakkuloiden ja heikko signaali normaalissa keuhkojen verisuonissa näkyi (Fig. 1a-A). Mielenkiintoista on, että Kindlin-1 havaittiin hyvin ilmaistu sytoplasmassa ja ytimet kartion muotoinen solujen ja karan solut jaetaan sarakkeista epiteeli (Fig. 1a-B). Kuitenkin Kindlin-1 havaittiin heikosti ilmaistu colummar soluissa, pikarisolujen ei ilmenny kellarissa memberane. Keuhkojen kasvain kudoksissa, Kindlin-1 havaittiin hyvin ilmaistu sytoplasmassa sekä kalvo SCC (Fig. 1a-C). Lisäksi Kindlin-1 havaittiin kohtalaisen ilmaistu sytoplasmassa tumorous rauhasten epiteelin AC (Fig. 1a-D) ja heikosti ilmaistuna LCC (Fig. 1a-E). Yllättäen, mitään ilmentymistä Kindlin-1 lainkaan SCLC havaittiin (Fig. 1 a-F) (taulukko 2).

a. Kindlin-1 ilmentymisen kudoksissa normaalista ja eri alatyyppejä keuhkosyöpään tutkinut IHC. Kuvat näkyvät ovat normaaleja keuhko (A), Pseudo-ositettu värekarvallinen lieriöepiteeliin (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), ja SCLC (F). b. Määrittäminen mRNA tasojen Kindlin-1 raitista kliinisistä näytteistä mitattiin qPCR. c. Re-analyysit Kindlin-1 ilmentymisen Oncomine tietokantaan. Vasen: Kindlin-1 ilmentymisen uutettu Hou keuhkojen aineisto; Oikealla: Kindlin-1 ilmentymisen uutettu Garber keuhkojen aineisto. Tilastolliset analyysit eri potilasryhmissä tutkittiin Studentin

t

testiä. ** Merkitsee

p

0,01.

Lisäksi selvitimme Kindlin-1 mRNA: n ilmentymisen jopa juuri valmistettu kasvain kudoksia SCC, AC ja SCLC keuhkojen syöpäpotilailla. Olemme havainneet, että SCC: n osoitti suurempia Kindlin-1 ilmentymisen kuin AC, ja SCLC näytetään alin ilmentymisen Kindlin-1 joukossa erilaisia ​​keuhkosyöpäpotilaiden tutkittiin (Fig. 1b).

rohkaisevaa, että edellä Kindlin -1 mentymisprofiili määritettynä joko immunohistokemiallisesti tai qPCR tuki vielä uudelleen analizing Kindlin-1 mRNA: n ilmentymisen profiili potilaan aineistoja peräisin Oncomine Database (www.oncomine.com). Tutkittuaan Hou ja Garber keuhkosyöpään potilaan Affymetrix aineistoja, huomasimme, että Kindlin-1 ilmentymisen erityyppisissä NSCLC mRNA taso significanly lisääntyi (Fig. 1 c), joka on yhtä mieltä edellä IHC tuloksia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Kindlin-1 on todellakin erittäin expessed SCC tutkimalla eri potilasryhmien co-Horts.

Kindlin-1 ilmentyminen korreloi solujen erilaistumista SCC mutta ei AC

Em Tulokset osoittivat, että jopa SCC, Kindlin-1 ilme on heterogeeninen. Tämä viittaa siihen, että Kindlin-1 ilmentyminen voi vaihdella muutos solujen erilaistumista keuhkosyöpä. Tätä varten olemme analysoineet Kindlin-1 ekspression SCC eri vaiheissa solujen erilaistumisen. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että Kindlin-1 ilmentyy voimakkaasti hyvin eriytetty SCC kuin kohtalainen eriytetty SCC (Fig. 2-A ja -B); ja maltillinen eriytetty SCC ilmaistuna korkeamman Kindlin-1 kuin huonosti eriytetty SCC (Fig. 2-B ja C). Kuitenkin tämä suuntaus Kindlin-1 ilmentymisen löytyy SCC ei voitu soveltaa AC (tietoja ei esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että suurempi eriyttäminen vaiheessa vastaa korkeamman ilmentymisen Kindlin-1 in SCC (taulukko 2).

edustaja kuvat heijastava Kindlin-1 ilmentymisen SCC on valittu ja tilastolliset analyysit voivat olla taulukossa 2. A Well eriytetty SCC. B, Kohtalainen eriytetty SCC. C, Huonosti eriytetty SCC.

Kindlin-1 ja Kindlin-2 ilmentyvät eri eri alatyyppejä keuhkosyövän

Tähän asti ei ole raportti Kindlin-2 ilmentyminen keuhkoissa syöpäsolun linjat sekä keuhkojen syöpäpotilailla. On mielenkiintoista tietää, jos molemmat Kindlin-1 ja Kindlin-2 ilmaistaan ​​keuhkosyöpäpotilaita. Tätä varten tutkimme Kindlin-2: n ilmentymisen samassa paneelissa potilasnäytteiden edellä mainituista. Vaikka Kindlin-2 havaittiin ilmaistu verisuonten normaalin keuhkojen kudoksia (Fig. 3a-A), Kindlin-2 havaittiin ilmentyy suuresti sytoplasmassa ja ytimet kartion muotoinen solut (Fig. 3a-B) samanlainen Kindlin-1 värjäystä, kuten on esitetty kuviossa. 1a-B. Tämä osoittaa, että sekä Kindlin-1 ja Kindlin-2 ekspressoituvat normaaleissa keuhkoputken epithilium. Mielenkiintoista, Kindlin-2: n ilmentymisen rakenteessa on aivan erilainen kuin Kindlin-1 SCC. Sen sijaan, että ilmaistaan ​​SCC ja AC, Kindlin-2 havaittiin hihgly ilmaistu kasvaimen stroomassa (Fig. 3a-C ja D), jotka toisin jyrkästi ekspressiokuviota Kindlin-1 tämäntyyppisiä keuhkosyöpään. Lisäksi Kindlin-2 havaittiin ilmentyy suuresti LCC on solukalvon ja ympäröivän kasvaimen strooman verrattuna heikon ilmentymisen Kindlin-1 LCC (Fig. 3a-E). Lisäksi, vähän tai ei positiivista värjäytymistä Kindlin-2 havaittiin SCLC (Fig. 3a-F), joka on samanlainen kuin Kindlin-1 värjäytymistä samaa solutyyppiä (Fig. 1a-F). Nämä IHC tulokset edelleen vahvistaa uudelleen analyysit Kindlin-2 mRNA: n ekspression Oncomine tietokantoihin Hou keuhko- ja Garber keuhkojen (Fig. 3b). Sarjassa SCC potilaan kudoksen osia, Kindlin-1 ilmentyy voimakkaasti tuumorisolujen, kun taas Kindlin-2 havaittiin ilmaistiin pääasiassa kasvaimen stroomassa (Fig. 3c-A, -B). Nämä havainnot osoittavat, että Kindlin-1 ja Kindlin-2 ilmentyvät differentiaalisesti keuhkosyövän soluja.

a. Kindlin-2: n ilmentymisen kudoksissa normaalista ja keuhkosyöpään kudosten tutkittiin IHC. Kuvat näkyvät ovat normaaleja keuhko (A), Pseudo-ositettu värekarvallinen lieriöepiteeliin (B), SCC (C), AC (D), LCC (E), ja SCLC (F). b. Re-analyysit Kindlin-2 ilmaisun Oncomine tietokantaan. Vasen: Kindlin-2 ilmaisun uutetaan Hou keuhko aineisto; Oikea: Kindlin-2 ilmaisun uutetaan Garber keuhkojen aineisto. Tilastolliset analyysit eri potilasryhmissä tutkittiin Studentin

t

testiä. ** Merkitsee

p

0,01. c. Vertailu ilmauksia Kindlin-1 ja Kindlin-2 SCC samasta potilaasta. Kuten näytetään Kindlin-2 ilmentyy voimakkaasti tuumorin strooman, mutta ei keuhkojen syöpäsoluja.

Taulukko 2 summerized ilmentymisen Kindlin-1 ja Kindlin-2 kasvaimissa eri keuhkosyöpäpotilaita. Kindlin-1 ekspressio oli positiivinen 84% keuhkosyöpäpotilaiden. Eri kasvain alatyypeistä sekä Kindlin-1 ja Kindlin-2 osoitti korkean positiivisia NSCLC kuin SCLC (

p

0,0001). Mielenkiintoista, sisällä NSCLC Kindlin-1 ilmaisi alhaisilla tasoilla LCC, kohtalainen AC, ja korkein ilmentymä Kindlin-1was löytyy SCC (

p

0,0001). Kuitenkin Kindlin-2 on vastavuoroinen ilmaus profiili: ilmentymistason Kindlin-2 on alhainen SCC, kohtalainen AC ja korkein ilmentymä Kindlin-2 havaittiin LCC (

p

0,0001) . Kiehtovan, The Kindlin-1 ekspressio havaittiin korreloivan erilaistumisen kasvaimia. SCC, joka koostuu levyepiteeleissä, ja AC koostuu rauhas epiteeli oli oli korkeampi Kindlin-1 ilmentymisen kuin LCC joka on luokiteltu erilaistumaton karsinooma (

p

0,0001). Lisäksi hyvin eriytetty SCC on korkeampi Kindlin-1 ilmentymisen kuin huonosti eriytetty SCC (

p

= 0,0024). Vertailun mitään korrelaatiota tunnistettiin Kindlin-1 ilmentymisen eriytetty AC (

p

= 0,8523). Samoin Kindlin-2 ilmaisua ei todettu korreloivan erilaistumista eri alatyyppejä keuhkosyöpään (

p

= 0,1759).

Kindlin-1 ja Kindlin-2 vastakkain säännellä keuhkosyöpä solun etenemistä

in vitro

Koska Kindlin-1 ja Kindlin-2 ilmentyvät differentiaalisesti keuhkosyöpäsoluissa, on houkuttelevaa ymmärtää onko Kindlin-1 ja Kindlin-2 toimivat myös differentiaalisesti säännellä keuhkosyöpäsolua etenemistä. Olemme aikaisemmin havainneet, että Kindlin-2 oli erittäin ilmaistiin kasvaimen invasiivista edessä pahanlaatuinen mesoteliooma [10]. Tätä varten tutkimme ilmentymistä Kindlin-1 ja Kindlin-2

de novo

SCC jotka paikallistaa toissijainen sivustoja sisäisen keuhko levittämistä SCC potilaalle. Kuten on esitetty kuviossa. 4a-A, Kindlin-1 oli vahvasti ilmaistiin kasvaimen massan

de novo

SCC mutta heikosti ilmaistiin kasvaimen invasiivisia edessä. Kuitenkin Kindlin-1-värjäys on keskittynyt ytimet solujen kasvaimen invasiivista etuosaa

de novo

SCC, viittaa sytoplasmaan ja tumaan siirtymisen voi liittyä Kindlin-1 (Fig. 4a-A.Arrowed) . Sen sijaan, Kindlin-2 ei löytynyt ilmaistu samantyyppinen rakenne samasta potilaasta (Fig. 4a.B). Kiinnostavaa sytoplasmaan ja tumaan siirtymisen Kindlin-2 havaittiin myös kasvaimen leviämisrintamassa (Fig. 4a-B.Arrowed). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Kindlin-1, mutta ei Kindlin-2 osallistuu säätelyyn keuhkosyöpäsolua kolonisaatio SCC. Siksi jatkoimme luonnehtia ero roolin Kindlin-1 ja Kindlin-2 sääntelyssä keuhkosyövän etenemisen. Ensin havaittu ilmaisuja Kindlin-1 ja Kindlin-2 sekä epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) markers E-kadheriinin ja vimentiinin keuhkosyövän solulinjat, jotka ovat peräisin SCC, AC ja LCC ja havaitsi, että Kindlin-1 ja Kindlin- 2 oli differentiaalisesti ilmaistut keuhkosyövän solulinjoissa (Fig. 4b). Sitten perustettu H1299 solut stabiilisti yli-ilmentynyt Kindlin-1. Olemme havainneet, että EMT markkereita N-kadheriinin ja vimentiinin oli vaimentua keuhkosyövän H1299-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät Kindlin-1 kontrolliin verrattuna soluihin, jotka ilmentävät Flag-BAP (Fig. 4c), mikä viittaa rooliin Kindlin-1 estyminen EMT-ohjelman keuhkojen adenokarsinooma soluja. Lisäksi voi valvoa ero roolin Kindlin-1 ja Kindlin-2 sääntelyssä keuhkosyövän solun liikkuvuus, me suorittaneet hepatotactic migraatiokokeessa tyypin I kollageenia, joka välittää β1 integriinin liittyviä solumigraation. Huomasimme, että Kindlin-1 esti taas Kindlin-2 edistänyt H1299 soluvaelluksen Transwell määrityksessä (Fig. 4d). Samalla erillinen rooli Kindlin-1 ja Kindlin-2 sääntelyssä keuhkosyövän soluinvaasiota tutkittiin määrittämällä ilmentymistä metalloprotenases lukien MMP7, MMP-9 ja MMP-13. MMP7 ja MMP-9 todettiin vaimentua kanssa ektooppinen ilmentyminen Kindlin-1, kun taas MMP7 ja MMP-13: ilmentyivät kanssa ektooppinen ilmentyminen Kindlin-2 (Fig. 4e). Vuonna lyhytaikaisella transfektiolla, yliekspressio Kindlin-1 johtanut downregulation N-kadheriinin (Fig. 4f vasen paneeli), mikä viittaa estävä rooli Kindlin-1 EMT esiintyminen. Kuitenkin pudotus endogeenisen Kindlin-2 laski tasolle N-kadheriinin (Fig. 4f vasen paneeli), vaikutus, joka vastaa yli-ilmentyminen Kindlin-1. Lisäksi tutkimme ekspressiotasot Kindlin-2 perus- ja toisen LCC ja totesi, että Kindlin-2 oli vahvasti ilmaistu imusolmukkeissa metastasized LCC (Kuva. 4g-B, nuolella) verrattuna primaarikasvaimen samalta potilaalta ( kuva 4g-A). Tämä havainto viittasi siihen, että korkean tason Kindlin-2: n ilmentymisen voi vastata suuren potentiaalin LCC hyökkäystä. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että ero ilmaukset Kindlin-1 ja Kindlin-2 in keuhkosyöpäpotilaita vastaavat päinvastainen asetus solujen vaeltamiseen sekä solun invasiivisen valmiudet.

a. Expression of Kindlin-1 ja Kindlin-2 toissijaisessa

de novo

SCC peräisin invasiivisen SCC potilaalle. A. Kindlin-1 ilmentymisen

de novo

SCC. B. Kindlin-2 ilmentymisen

de novo

SCC samasta potilaasta kuin A. b. Vasen paneeli: Differential ilmentymistä Kindlin-1, Kindlin-2, E-kadheriinin ja vimentiinista erilaisissa keuhkosyövän solulinjat ohjaa aktiini lastauksesta. Oikea paneeli: kvantifiointi suhteellinen proteiinin ekspressiotasot. c. Vasen paneeli: pysyvää ilmentymistä Kindlin-1 in H1299-soluissa. Indikoitu sekoitetaan vakaa klooneja, jotka ilmentävät Flag-Kindlin-1. Oikea paneeli: kvantifiointi suhteellinen proteiinin tasot Kindlin-1 säänneltyjen N-kadheriinin ja vimentiinista. d. Kindlin-1 ja Kindlin-2 eri tavalla säädellä muuttoliikkeen H1299 soluissa. Näkyy on määrällinen ja juoni keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastolliset analyysit eri solujen ryhmien tutkittiin Studentin

t

testiä. ** Merkitsee

p

0,01. e. Kindlin-1 ja Kindlin-2 differentiaalisesti säännellä mRNA tasot MMP analysoitiin qPCR vuonna H1299 soluissa jotka ilmentävät pysyvästi Kindlin-1 ja Kindlin-2. Aseta osoittaa ilmentymistä Kindlin-1 ja Kindlin-2 tallissa sekoitettu kloonien sovellettu qPCR. f. Vasen paneeli: n ilmentyminen Kindlin-1 downregulates N-kadheriinin ja knockdovvn Kindlin-2 downregulates N-kadheriinin. Oikea paneelit: kvantifiointi suhteellinen proteiinin tasot Kindlin-1- ja Kindlin-2-säännelty N-kadheriinin. Tilastolliset analyysit eri solujen ryhmien tutkittiin Studentin

t

testiä. ** Merkitsee

p

0,01. g. Expression of Kindlin-2 imusolmuke metastasized suuri keuhkosyöpä potilaalle. A. Ensisijainen suuret keuhkosyöpä; B. Imusolmuke metastasized suuri keuhkosyöpä samasta potilaasta.

Kindlin-1 ja Kindlin-2 vastakkain säätelevät keuhkosyövän solujen kasvua käytettäessä

in vivo

hiiren ksenograftimallissa

edellä esitetyn perusteella havainto, että Kindlin-1 ja Kindlin-2 oli differentiaalisesti ilmaistut keuhkosyöpä potilasnäytteiden, ja vastakkain säännelty keuhkosyövän solujen vaeltamiseen

in vitro

, olimme kiinnostuneita tietämään, onko Kindlin -1 ja Kindlin-2 pelata selvä rooli sääntelyn kasvaimen kasvua

in vivo

. Tätä varten hiiren tuumoriksenografteja kanssa Kindlin-1 yli-ilmentymisen kasvoi hitaammin ja koot kasvaimet olivat pienempiä kuin kontrolli (Fig. 5a ja b). Kuitenkin kasvaimista Kindlin-2 yliekspressio kasvoi paljon nopeammin ja koot kasvaimet olivat paljon suurempia kuin kontrolli (Fig. 5a ja b). Mielenkiintoista, tuumorikudokset toipunut hiiren ksenografteista näytetään myös lisäsi N-kadheriinin ja vimentiinista ilmaisun Kindlin-2 yliekspressoivia kasvaimia, ilman muutoksia N-kadheriinin ja vimentiinista in Kindlin-1 yli-ilmentyy tai ohjaus kasvaimet (Fig. 5c). Nämä tiedot osoittivat selvästi, että Kindlin-1 ja Kindlin-2 paitsi vastakkain säännelty kasvaimen kasvua vaan myös kasvain invasiivisia potentiaali

in vivo

hiiren ksenograftimallissa.

a. Kasvaimen kasvua käyrä. Kasvaimen tilavuus H1299-Flag-Kindlin-1 ryhmä on huomattavasti pienempi kuin Flag-BAP ryhmä (

p

0,01 analysoidaan Studentin

t

testi) päivänä 22 ja välin volyymi Flag-Kindlin-2 ryhmä on ilmeisesti suurempi kuin Flag-BAP ryhmä (

p

0,01 analysoidaan Studentin

t

testi). b. Kasvaimet talteen hiiristä päivänä 27. c. Vasen paneeli: määrittäminen ilmauksia N-kadheriinin ja vimentiinista alkaen tuumoriksenografteissa jotka ilmentävät pysyvästi Kindlin-1, Kindlin-2 ja ohjaus- BAP Western blot-analyysit. Oikea paneeli: kvantifiointi suhteellinen proteiinin tasot Kindlin-1- ja Kindlin-2-säännelty N-kadheriinin ja vimentiinista. Tilastolliset analyysit eri kasvaimen ryhmien tutkittiin Studentin

t

testiä.