Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat luokan luonnossa esiintyviä pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka on kohdistettu proteiinia koodaavan mRNA: ta transkription jälkeisellä tasolla ja säädellä mutkikkaita geenien ilmentymisen. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että ihmisen eturauhassyövän Mirna

miR-125b

ilmennetään runsaasti, mikä johtaa negatiiviseen säätelyyn joidenkin tuumorisuppressorigeeneille. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen pidentämään tutkimukset osoittavat, että

miR-125b

tukahduttaa proteiinituotetta INK4a /ARF lokuksen, p14

ARF, kahdessa eturauhassyövän solulinjoissa, LNCaP (villi tyyppihyväksynnän p53) ja 22R

v

1 (sekä villityypin mutantti p53), sekä PC-346C eturauhassyöpäksenograftista malli lentivirally yli-ilmentynyt

miR-125b

. Tuloksemme korosta, että

miR-125b

moduloi p53 verkon estävät alas-säätely MDM2, mikä vaikuttaa p53 ja sen kohdegeenien p21 ja Puma joka on riittävä estämään apoptoosin. Kääntäen, eturauhassyövän hoitoon solujen estäjä

miR-125b

(anti

miR-125b

) lisännyt ilmentymistä p14

ARF, alentunut taso MDM2, ja apoptoosin induktio. Lisäksi yliekspressio

miR-125b

p53-puutosta PC3-solujen aiheuttama säätely alaspäin P14

ARF, mikä johtaa lisääntyneeseen soluproliferaatioon kautta p53-riippumattomalla tavalla. Täten voimme päätellä, että

miR-125b

toimii onkogeenin, joka säätelee p14

ARF /MDM2 signalointi, stimuloimaan syöpäsolujen kautta p53-riippuvaista tai p53-riippumaton toiminto. Tämä vahvistaa uskoamme, että

miR-125b

on potentiaalia terapeuttisena kohteena hallintaan Metastasoivassa eturauhassyöpää.

Citation: Amir S, Ma AH, Shi XB, Xue L, Kung HJ, Devere White RW (2013) Oncomir

miR-125b

vaimentaa p14

ARF moduloida p53-Dependent ja p53-riippumattoman Apoptosis in Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (4): e61064. doi: 10,1371 /journal.pone.0061064

Editor: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2012 Hyväksytty: 06 maaliskuu 2013; Julkaistu: 09 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Amir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana NCI apurahan CA136597 ja puolustusministeriön apurahan PC080488. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastasoitunut eturauhassyöpä (CAP), jonka etenee kastraatio korkilla (CRPC), on vakava uhka elämälle American men, jolloin arviolta 28170 kuolemaa tähän tautiin vuonna 2012 [1]. Metastasoivassa hatun tavallisesti käsitellään androgeenien puute hoitoa (ADT). Valitettavasti vika ADT tapahtuu väistämättä ja potilaan kasvaimen tulee CRPC. Tiedetään, että aikana CRPC etenemistä CaP solut käyttävät erilaisia ​​androgeenireseptorin (AR): sta riippuvainen ja riippumaton polkuja hengissä ja kukoistaa androgeenin-köyhdytettyä ympäristöön [2]. Vaikka useita yrityksiä on tehty kuvaamaan molekyyli- allekirjoitus CRPC, tarkka johtavien mekanismien CRPC ei täysin ymmärretä. Viime vuosina löytyminen MikroRNA (miRNA) on paljastanut uuden kerroksen monimutkaisuus, joka hallitsee mekanismeja säätelyssä CRPC [3], [4].

MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka toimivat sekvenssi-sääntelyviranomaiset geenien ilmentymisen kautta translationaalisen tukahduttamisen ja /tai transkripti pilkkominen [5]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA avainasemassa solujen prosesseissa erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin ja metabolisen homeostaasin [6]. Lisäksi miRNA voi toimia joko tuumorisuppressorien tai onkogeenien, riippuen siitä, onko ne suunnattu erityisesti onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [7]. Tässä suhteessa, tuumoria tukahduttavan miRNA ovat yleensä alle ilmaistaan ​​samalla onkogeenisen miRNA yleensä yli-ilmentynyt syövän [8]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että

miR-125b

on onkogeenisia. Yliekspressio

miR-125b

on raportoitu paksusuolen syöpä [9], virtsarakon syöpä [10], munasarjasyöpä [11] ja leukemia [12]. Olemme aiemmin raportoitu, että kliiniset CaP kasvaimia ilmaista kohonnut

miR-125b

verrattuna hyvänlaatuinen kudoksiin [13]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että

miR-125b

ilmenee vahvasti korkki, etenkin metastaattisen ja invasiivisia CaP kasvaimissa [14], [15]. Viime aikoina olemme tutkineet funktio

miR-125b

ja havaittiin, että yli-ilmentyminen

miR-125b

edistänyt ksenograftin kasvaimen kasvua sekä ehjä ja kastroitu hiirillä [16]. Lisäksi olemme osoittaneet, että

miR-125b

suoraan kohdistaa useita kasvain ehkäisevästä ja proapoptoottiset geenejä, mukaan lukien p53, BAK1 ja Puma [13], [16].

solutasolla ja aktiivisuus p53 on ylläpitämä monimutkainen piiri koostuu p14

ARF /MDM2 /p53 [17]. p14

ARF varmistettiin olevan voimakas tuumorisuppressoriproteiinia sekä

in vitro

ja

in vivo

[18] ja on ehdotettu olevan tärkein jäsen tämän seurannan piirissä. Expression of P14

ARF indusoituu vasteena aktivoiduille onkogeenien kuten Ras [19], c-Myc [20], Abl [21] ja E2F-1 [22] sekä aikana monistus vanhenemista [23]. p14

ARF välittää sitomisen ja myöhemmän hajoamisen p53-antagonisti MDM2 kautta ubikitiinipromoottori /proteasomin reitin, joka johtaa vakauttamiseen (lisääntynyt puoliintumisaika) p53 [17] ja siitä seuraava aktivointi sen loppupään kohdegeenien, kuten p21 (sykliiniriippuvainen estäjä 1A), Puma (p53-ilmen- tymisen lisääntymisen välittäjänä apoptoosin), ja Bax (BCL2 liittyvä X-proteiinia) [24], [25]. Koska nämä molekyylit ovat keskeisiä komponentteja p53 verkossa, modulaatio niiden ilmaisun voi häiritä normaalia tasapainoa apoptoosin ja solujen lisääntymistä. Tämä havainto osoittaa edelleen tutkimuksemme osoittavat, että inaktivointi tai alas-säätely p53, Puma ja BAK1 mukaan

miR-125b

liittyy CRPC [13], [16].

edelleen valaista roolia

miR-125b

kehittämisessä CRPC ja sen taustalla molekyylitason mekanismit, tässä tutkimuksessa selvitimme osallistumista

miR-125b

moduloimaan p53 verkon kohdistamalla p14

ARF, joka tukee meidän tunnistaminen mahdollisen

miR-125b

sitoutumiskohta 3’UTR on

p14

ARF

geeni. Odotamme tutkimuksemme antaa uutta tietoa molekyylitason mekanismeja, jotka liittyvät kasvaimen kehittymisen ja kastrointi kestävä kasvu korkki ja apua soveltamisen helpottamiseksi

miR-125b

tavoitteeksi Cap hoitoon.

materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

Western blotting-analyysi, anti-P14

ARF (sc-8340), anti-MDM2 (sc-965), ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anti-BAK1 (3814), anti-Mcl-1 (4572), anti-Bcl-X

L, anti-kaspaasi-3 (9662), anti-SMAC (2954) ja anti-p21 (DCS60) hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-Puma (PC686), anti-p53 (OP43) Calbiochem (Billerica, MA); anti-β-aktiinin (klooni AC-15) Sigmalta (St. Louis, MO). Synteettinen

miR-125b

matkivat (miR-125bm) miRNA negatiivinen kontrolli (miR-NC), anti-

miR-125b

ja anti-miRNA negatiivinen kontrolli (anti-miR-NC) sekä pMIR-REPORT sivektorissa ostettiin Ambion (Grand Island, NY). Molemmat

p14ARF

siRNA (sip14) ja

BAK1

siRNA (siBak) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Solulinjat ja transfektio

Ihmisen CaP solulinjat PC3, 22R

v

1 ja LNCaP saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kaikki solulinjat olivat rutiininomaisesti ylläpidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, joka sisältää antibiootteja ja multivitamins. Ohimeneviä transfektion jälkeen solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille päivää ennen transfektiota ja pidettiin seerumin sisältävässä väliaineessa ilman antibiootteja. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin joko miRNA tai siRNA lipofektamiinia 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blot-analyysi

Solut kasvatettiin 70-80 % konfluenssiin ja lyysattiin käyttäen soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technology), jota oli täydennetty fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (1 mmol /l). 20 minuutin kuluttua inkuboinnin jäissä, lysaatit sentrifugoitiin 13000 rpm: ssa 20 min ja proteiinin pitoisuudet supernatantissa määritettiin käyttäen BCA-pakkausta (Pierce, Rockford, IL). Kokonaisproteiinista (50 ug per näyte) 3 x proteiinin näytepuskuria [50 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 2% SDS: ää, 10% glyserolia, 0,25% β-merkaptoetanolia, bromifenolisinistä (1 mg /ml)] erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelissä (Bio-Rad, Hercules, CA), ja sitten siirretään Immobilon PVDF-kalvolle (Millipore, Billerica, MA). Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa /0,05% Tween 20 (TBST), kaivoa inkuboitiin tietyn primäärisen vasta-aineen, jonka jälkeen piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Proteiinivyöhykkeet näytetään tehostetun kemiluminesenssin. Ilmentymistaso proteiinin mitattiin kvantitatiivisella densitometrisellä analyysillä.

lusiferaasianalyysissä

Ihmisen

p14

ARF

3′-UTR-sekvenssin, joka sisältää otaksutun

miR-125b

sitoutumiskohdan monistettiin PCR: llä LNCaP cDNA ja kloonattiin pMIR-REPORT sivektorissa alavirtaan lusiferaasigeenin.

p14

ARF

3′-UTR ole tätä

miR-125b

sitoutumiskohta käytettiin kontrollina. PCR-tuotteet kloonattiin plasmidin varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Lusiferaasin määritys, soluja (4 x 10

4 per kuoppa) ympättiin 24-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin yhdessä toimittaja plasmidit ja 100 nM synteettistä miR-125bm tai miR-NC. PRL-SV40 Renilla lusiferaasi-plasmidia (Promega, Madison, WI) käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaksi päivää myöhemmin, solut kerättiin ja lyysattiin passiivista hajotuspuskuria (Promega). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual lusiferaasireportteri- määritystä (Promega). Lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitui Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Co-immuunisaostustesti

proteiini vuorovaikutus p14

ARF ja MDM2 havaittiin samanaikainen immunosaostus määrityksessä. Proteiinin kokonaismäärän teissa miR-125bm- tai miR-NC-transfektoitujen 22R

v

1-soluja valmistettiin soluhajotuspuskurin. Proteiinia (1,0 mg /0,5 ml) esipuhdistettiin sekoittamalla 20 ui proteiini A helmiä ja supernatantti immunosaostettiin 4 ° C: ssa yön yli kanin anti-p14

ARF polyklonaalista vasta-ainetta tai kaniinin normaalilla IgG: llä (Cell Signaling Technology). Saostuneet proteiinit fraktioitiin 12% SDS-PAGE-geelissä, jota seuraa Western blot havaitseminen MDM2-proteiinin käyttäen anti-MDM2-vasta-aine.

TUNEL-määrityksessä

TUNEL-määritys suoritettiin käyttäen

in situ

solukuoleman havaitseminen kit (Roche, Indianapolis, iN) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, p53-positiivisia 22R

v

1 tai p53-null PC3-solut (1 x 10

5 /kuoppa) ympättiin yksittäisiin kuoppiin 4-Kaivokammio dioja. 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin 50 nM

miR-125b

, 50 nM anti-

miR-125b

ja 100 nM sip14, yksin tai erilaisina yhdistelminä. Käsittelemättömät ja säteilytettyjä soluja käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina. Väliaine poistettiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja objektilasit huuhdeltiin kahdesti PBS: llä, joka on kiinnitetty kiinnityksen liuosta (4% paraformaldehydillä PBS: ssä, pH 7,4) 1 tunnin ajan RT: ssä. Kiinnityksen jälkeen leikkeet huuhdeltiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin läpäiseväksi liuokseen (0,1% Triton X-100) 2 minuutin ajan jäillä. 50 ui TUNEL Reaktioseoksen (50 ui entsyymiliuosta + 450 ui etiketin liuosta) lisättiin kuhunkin diaan. Sillä negatiivinen kontrolli, vain 50 ui etiketin lisättiin. DAPI käytettiin ydin- vastavärinä. Laseja inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä 60 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Fluoresenssimikroskopialla visualisoimiseksi tehtiin solujen ja hankkia digitaalisia kuvia käyttäen eksitaatioaallonpituutta on alueella 450-500 nm, ja havaitaan alueella 515-565 nm.

WST-1-määritys

-soluja (4,5 x 10

3 /kuoppa) maljattiin 96-kuoppalevyille RPM1, joka sisälsi 10% FBS: ää. Oltuaan viljeltiin 24 tunnin ajan, solut transfektoitiin 50 nM

miR-125b

tai anti-

miR-125b

. Viiden tunnin ajan, soluja käsiteltiin tuoretta väliainetta. Tetratsolium-pohjainen soluproleferaatiomäärityksessä (WST-1, Promega) suoritettiin valmistajan protokollan.

-pesäkemääritys

22R

v

1 (3 x 10

3 /kuoppa) ja LNCaP (4 x 10

3 /kuoppa) päällystetään erikseen kuudessa-kuoppalevyille ja transfektoidaan

miR-125b

tai anti

miR-125b

pitoisuutena 100 nM käyttäen lipofektamiinia 2000. Kahden viikon kuluttua solupesäkkeet laskettiin värjäyksen jälkeen 20% metanolia ja kristalliviolettia.

Tulokset

miR-125b

down-regulation P14

ARF Cap soluissa

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tuumorisuppressorigeeniä p14

ARF on merkittävästi alassäädetty korkki kudoksissa [26]; kuitenkin, miten p14

ARF säätyy alas pysyivät huonosti. Käyttämällä TargetScan algoritmi, mahdollinen

miR-125b

sitoutumiskohtaan tunnistettu 3-’UTR on

p14

ARF

mRNA. Meillä on siis tutki vaikutusta

miR-125b

sääntelystä p14

ARF korkki soluissa. Voit tehdä tämän, LNCaP ja 22R

v

1-solut transfektoitiin synteettisellä miR-125bm nostaa cellular

miR-125b

runsauden tai anti-

miR-125b

tukahduttaa

miR-125b

aktiivisuutta. Kuten on osoitettu Western blot ja määrällinen densitometristen analyysit verrattuna miR-NC hoito, miR-125bm aiheuttama väheneminen p14

ARF ilmentymisen 80% LNCaP-soluissa (kuvio 1A, yläpaneeli) ja 60% 22R

v

1 (kuvio 1A, alapaneeli). Sitä vastoin anti

miR-125b

lisääntynyt p14

ARF tason 40% LNCaP (kuvio 1A, yläpaneeli) ja 30% 22R

v

1 (kuvio 1A, alapaneeli) verrattuna anti-miR-NC. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että androgeenien ajan säätelee

miR-125b

korkki soluissa [13]. Siten LNCaP ja 22R

v

1 soluja käsiteltiin 5,0 nM R1881 androgeenin ja ilmentymistason p14

ARF määritettiin. Havaittiin, että R1881 indusoi 80% vähennys p14

ARF LNCaP ja 20% lasku 22R

v

1 (kuviot 1A). Tutkimme myös taso p14

ARF on

miR-125b

-overexpressed PC-346C hiiren ksenografti kasvain [16], ja totesi, että taso p14

ARF proteiini vähennettiin 60 %

miR-125b

-overexpressed kasvain verrattuna miR-NC-ohjaus kasvain (kuvio 1 B). Sen määrittämiseksi, onko oletetun

miR-125b

sitoutumiskohta 3′-UTR P14

ARF mRNA vastaa sääntelyn p14

ARF by

miR-125b

, lusiferaasireportteri- vektoreihin, jotka sisältävät 3′-UTR-fragmentti

p14

ARF

geeni oli ko-transfektoitiin miR-125bm osaksi LNCaP. Kuten kuviossa 1C on esitetty, kotransfektiolla johti noin 50%: n vähennys entsyymin aktiivisuus LNCaP-soluissa. Olemme myös suorittaa lusiferaasin määritys 22R

v

1-soluissa, ja samanlainen tulos havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä tulokset kuvassa 1 kelpuutukselle säätelyyn p14

ARF by

miR-125b

korkki soluissa.

) Western blot-analyysi ekspressiotasot p14

ARF LNCaP (

top) ja 22Rv1 solut (

alhaalla

). Soluja kasvatettiin 10% FBS median transfektoitiin 50 nM miR-125bm tai anti

miR-125b

(anti-125b) 72 tunnin ajan tai käsitelty 5,0 nM R1881 androgeenireseptorin 48 tuntia. Sitten, 50 ug proteiinia per näyte analysoitiin. Sekä miR-negatiivinen kontrolli (miR-NC) ja anti-miR negatiivinen kontrolli (anti-NC) käytettiin kontrolleina, ja β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

B

) Western blot-analyysi ekspressiotasot p14

ARF, MDM2 ja p53 lenti-

miR-125b

-overexpressed PC-346C ksenografti kasvain. Sekä käsittelemättömän ksenograftin (untreat.) Ja lenti-miRNA kontrollivektori-tartunnan PC-346C ksenografti (vektori) käytettiin kontrolleina. Sekä

ja

B

, numerot alla geelit ovat keskimäärin kertaiseksi muutoksia p14

ARF-proteiinia kolmesta itsenäisestä geelit suhteessa vastaavaan valvontaa. Kertamuutoksia laskettiin skannaamalla p14

ARF bändejä ja normalisoi varten β-aktiini bändejä.

C

) lusiferaasianalyysissä on

miR-125b

sitoutumisen 3′-UTR

p14

ARF

mRNA LNCaP-soluissa. Määritys toistettiin kolme kertaa kullekin kokeelle tehdään kolmella kuoppiin ja samanlaiset tulokset saatiin joka kerta. Edustaja Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (n = 3).

miR-125b

-p14

ARFsignaling säätelee p53 verkon

tutkimukset ovat osoittaneet, että p14

ARF kiihdyttää MDM2 hajoaminen, jolloin p53 ylössäätöä [27]. Meillä on siis kysyi: ei alas-säätely P14

ARF by

miR-125b

vaikuttaa ilmaus MDM2 ja p53 Cap soluja? Tämän kysymyksen, LNCaP ja 22R

v

1 soluja käsiteltiin miR-125bm ja tasot MDM2 ja p53 tutkittiin sitten. Verrattuna miR-NC, hoitoon LNCaP-solujen

miR-125b

aiheuttama dramaattinen kasvu MDM2 ilmaisun ja merkittävä väheneminen p53 tason (kuvio 2A, yläpaneeli). Samoin 22R

v

1 soluja,

miR-125b

hoito myös parannettu MDM2 ilmaisua ja vähentää p53 tasolla (kuvio 2A, alapaneeli). Kuten odotettua, miR-125bm välittämää säätely alaspäin p53 indusoi merkittävästi vähentää kaksi suoraa p53 -efektiboksejamme p21 ja Puma. Samoin

miR-125b

-overexpressed PC-346C ksenografti kasvain, MDM2 ekspressio lisääntyi kolminkertaiseksi ja p53-proteiini alas-säädellä 83% verrattuna vektorisäätö (kuvio 1 B). Vahvista alavirtaan tulokset estämällä p14

ARF, käytimme

p14

ARF

siRNA (sip14) vaientaa p14

ARF LNCaP ja 22R

v

1 solut. Kuten on esitetty immunoblottauksella, sip14 hoito vähensi ilmentyminen p14

ARF-proteiinia ja sen jälkeen voimistunut MDM2 tasolla ja vaimentua ilmentymistä p53 (kuvio 2B). Koska p14

ARF suoraan sitoutuu C-terminaalista MDM2, tutkimme vaikutus

miR-125b

proteiinien vuorovaikutus p14

ARF ja MDM2 samanaikainen immunosaostus in 22R

v

1 cap soluja. Havaitsimme, että MDM2 voidaan havaita anti-p14

ARF-vasta-aine saostetaan proteiinit, ei kontrolli-lgG-kytketty proteiineja, viittaa siihen, että endogeeninen p14

ARF kykenee muodostamaan kompleksin MDM2. Hoito

miR-125b

alassäädetty P14

ARFprotein, mikä aiheutti immuunisaostettujen MDM2 (kuvio 2C). Yhdessä data kuvassa 2 todistaa, että

miR-125b

säätelee p14

ARF /MDM2 /p53 signalointireitille.

) Western blot-analyysi MDM2 ja p53 miR-125bm saaneista LNCaP (

top) ja 22R

v

1 solut (

alhaalla

). Solut transfektoitiin 50 nM miR-125bm tai miR-negatiivinen kontrolli (miR-NC) 72 tuntia. Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) käytettiin havaitsemaan ekspressiotasoja MDM2, p53, p21 ja Puma.

B

) Western blot-analyysi p14

ARF, MDM2 ja p53

p14

ARF

siRNA (sip14) hoidetun LNCaP (

Top) ja 22R

v

1 solut (

alhaalla

). Soluja käsiteltiin sip14 ja solujen tasolla p14

ARF, p53 ja MDM2 analysoitiin. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

C

) Co-immunosaostusanalyysi proteiinin välisen vuorovaikutuksen p14

ARF ja MDM2 in 22R

v

1 soluja. Solut transfektoitiin miR-125bm ja 1,0 mg proteiini immunosaostettiin anti-p14

ARF-vasta-ainetta tai kaniinin IgG. Saatu immunecomplexes käytettiin tason ilmaisemiseksi MDM2 Western blot -analyysillä käyttäen anti-MDM2-vasta-ainetta. Syöttö: 50 ug proteiinia kokosolulysaattia. IP: immunosaostus. IB: immunoblottauksella.

miR-125b

stimuloi proliferaatiota CaP solujen

Todettuaan säätelyyn p14

ARF /MDM2 /p53 signalointireitille by

miR-125b

, me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus sääntelyn p14

ARF by

miR-125b

Cap soluproliferaatioon. Tehdä tämän, sekä LNCaP-solujen ja 22R

v

1-solut transfektoitiin synteettisellä miR-125bm ja soluproliferaatiota määritettiin WST-1-määritystä. Kuten on esitetty kuvioissa 3A ja 3B, verrattuna miR-NC hoidon, transfektio miR-125bm johti 1,5-kertaiseen kasvuun solujen lisääntymisen sekä testatut solulinjat. Lisäksi teimme klooni muodostumisen määritykset. Samanlainen WST-1 tulosta,

miR-125b

stimuloi 1,0-kertainen nousu klonogeeniset eloonjäämisen LNCaP ja 2,5-kertainen parannus in 22R

v

1 soluja, ja lisäämällä anti-

miR-125b

aiheutti dramaattinen väheneminen pesäkkeiden lukumäärä verrattuna käsittelemättömiin ja anti-miR-NC-soluja (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset tukevat että downregulation p14

ARF by

miR-125b

helpottaa kasvua CaP solujen.

Solut transfektoitiin 50 nM miR-125bm tai 50 nM miRNA negatiivisen kontrollin (miR-NC) ja 5 päivää. Solulisääntyminen mitattiin WST-1 määrityksessä.

p14

ARF

siRNA (sip14) käytettiin verrokkina. Tulokset ilmaistaan ​​proliferaation että verrattuna miR-NC-käsiteltyjä soluja, ja esitetään keskiarvona ± SD (n = 4).

Anti

miR-125b

indusoitu apoptoosin korkki soluissa, jotka ilmentävät toimiva p53

Koska

miR-125b

säätelee p14

ARF /MDM2 signalointi ja lopulta vaikuttaa p53 verkko, arvioimme vaikutus downregulation p14

ARF by

miR-125b

apoptoosin p53-positiivisten CaP soluja. Ensimmäinen, testasimme vapautumisen mitokondrioiden SMAC (toinen mitokondrioissa johdettu aktivaattori kaspaasi) ja aktivoitu kaspaasi 3 (CAS-3) LNCaP ja 22R

v

1 solulinjoja, jotka ilmentävät funktionaalista p53: a. Kun verrataan miR-NC hoitoon, miR-125bm aiheutti 10%: n vähennys SMAC ja 40%: n vähennys aktivoitu CAS-3 LNCaP-soluissa, ja vähennys oli 20% ja 30% 22R

v

1-soluissa , vastaavasti (kuvio 4A). Nämä solulinjat käsiteltiin myös anti

miR-125b

. Verrattuna anti-miR-NC hoitoon, downregulation

miR-125b

indusoimaa noin-kertainen SMAC ja aktivoitu CAS-3 (kuvio 4A). Koska anti

miR-125b

ylössäätelee SMAC ja aktivoitu kaspaasi 3, me täten analysoitiin anti

miR-125b

aiheuttama apoptoottisen solukuoleman käyttämällä TUNEL määritystä. 22R

v

1-solut transfektoitiin miR-125bm tai anti

miR-125b

. Ei apoptoottista solukuolemaa havaittiin miR-125bm saaneista 22R

v

1 soluja. Sitä vastoin hoito 22R

v

1-solujen anti-

miR-125b

aiheutti 63% solujen apoptoosia (kuvio 4B). Validoida että

miR-125b

moduloi p53-riippuvaista apoptoosia p14

ARF, 22R

v

1 soluja käsiteltiin anti

miR-125b

, jonka jälkeen by

p14

ARF

hiljentäminen. Todettiin, että antisense

p14

ARF

(sip14) laski rajusti apoptoottista kuolemaa

miR-125b

-inactivated 22R

v

1 soluja (kuvio 4C) . Kuten odotettua,

p14

ARF

hiljentäminen stimuloitu proliferaatio näiden 22R

v

1-soluissa (tietoja ei esitetty). Lisäksi ekspressiotasot useita pro-apoptoottisia tekijöitä arvioida Western blot-analyysi. Todellakin, hoito anti-

miR-125b

indusoi säätelyä p14

ARF proteiinin 22R

v

1-soluissa, kun taas lisäys sip14 johti ilmeinen downregulation of p14

ARF (60%), p53: n (30%) ja BAK1 (70%), verrattuna sekoituskoodin siRNA hoitoa (kuvio 4D). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että

miR-125b Twitter /p14

ARF signalointi tavoitteet p53 verkko, säännellään p53-riippuvaista lisääntymistä ja apoptoosia korkki soluissa.

) havaitseminen SMAC ja aktivoitu kaspaasi 3 (CAS-3) LNCaP (

jäljellä

) ja 22R

v

1 (

oikeus

) soluja. Solut transfektoitiin 50 nM miR-125bm tai 50 nM anti

miR-125b

(anti-125b) 5 päivää, ja tasot SMAC ja CAS-3 mitattiin Western blot-analyysi. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. Numerot alla geelit ovat keskimäärin kertaiseksi muutoksia SMAC ja CAS-3 kolmesta itsenäisestä geelit suhteessa vastaavaan valvontaa.

B

) havaitseminen anti-

miR-125b

indusoimaan apoptoosin 22R

v

1 soluja. Solut transfektoitiin käyttäen 50 nM anti-

miR-125b

72 tuntia ja apoptoottista solukuolemaa havaittiin käyttäen TUNEL määritystä. Vihreä ydin- fluoresenssi osoittaa apoptoottisen pilkkominen tuman DNA (

jäljellä

). Kvantitoimiseksi apoptoottisen solukuoleman, 400 solut laskettiin ja apoptoosin ilmaistaan% apoptoosin (apoptoottisten solujen /400 x 100%). Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin kolme kertaa ja tulos esitetään keskiarvo ± SE (n = 3) (

oikea

). Solut, jotka käsitelty säteilyttämällä (IR, 6 Gy) käytettiin positiivisena kontrollina.

C

) TUNEL määritystä apoptoottisen kuoleman 22R

v

1 soluja, joita oli käsitelty anti

miR-125b

seurasi

p14

ARF

antisense (sip14). Tulos ilmaistiin keskiarvona ± SE (n = 3).

D

) Western blot analyysit p14

ARF, p53 ja BAK1 tasoilla 22R

v

1 soluja.

Vasen

: 22R

v

1-solut transfektoitiin anti

miR-125

;

oikeus

: anti

miR-125

-transfected 22R

v

1 soluja käsiteltiin sip14. Sekä anti-miR-NC (anti-NC) ja ryntäily siRNA käytettiin kontrolleina.

miR-125b Twitter /p14

ARF signalointi välittää p53-riippumattoman kasvun estäminen

edellä kokeissa me validoitu että

miR-125b Twitter /p14

ARF signalointi on osallisena p53-riippuvainen mekanismeja korkki soluissa. Kuitenkin tutkimukset osoittivat, että inaktivointi p53-toiminto tapahtuu osaan metastasoituneen CaP [28], [29]. Onko

miR-125b Twitter /p14

ARF signalointi säätelevät solujen kasvua ja apoptoosin näissä p53 puutteesta korkit? Käytimme p53-null PC3 CaP solujen puuttua tähän asiaan. Tutkimme vaikutus muuttaa

miR-125b

toimintaa ilmentymisen tasoja p14

ARF ja MDM2 proteiineja. Samanlainen kuin p53-toiminnallisia LNCaP ja 22R

v

1 soluja, miR-125bm transfektio vähentynyt ilmentyminen p14

ARF 36% ja nousi MDM2 43% PC3-soluissa, kun taas anti-

miR-125b

indusoi selvää voimistumista p14

ARF ja lievää tukahduttamisen MDM2 (kuvio 5A). Seuraavaksi testasimme ovatko

miR-125b

vaikuttaa lisääntymistä ja apoptoosia PC3-solujen. Tätä varten, PC3-soluja käsiteltiin anti

miR-125b

ja apoptoottisten solujen havaittiin TUNEL-määritystä. Havaittiin, että käsittely anti

miR-125b

aiheutti 50% näiden solujen apoptoosiin (kuvio 5B). Koska BAK1 ilmoitettiin välittävän P14

ARF aiheuttaman apoptoosin p53-vajaiden solujen [30], arvioimme vaikutus

BAK1

hiljentäminen proliferaatioon miR-125bm-transfektoitujen PC3-soluissa. Todettiin, että miR-125bm indusoi 1,6-kertaisen kasvun eloonjääminen PC3-solujen (kuvio 5C), joka tukee edellinen havainto, että p14

ARF /MDM2 signaloinnin edistää p53-riippumaton mekanismi [31]. Vahvista asetus p53-riippumattoman apoptoosin

miR-125b Twitter /p14

ARF signalointi,

miR-125b

aktiivisuus suppressoitiin anti-

miR-125b

ja

p14

ARF

hiljennettiin RNAi. Havaitsimme, että

p14

ARF

hiljentäminen merkittävästi vähentynyt apoptoottisen kuoleman

miR-125b

-inactivated PC3-solut (kuvio 5D), ja myös edistänyt niiden leviäminen (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi ekspressiotasot p14

ARF ja BAK1 analysoitiin. Todettiin, että

miR-125b

inaktivaatio indusoi säätelyä p14

ARF, kun taas

p14

ARF

hiljentäminen päinvastaiseksi säätelyä p14

ARF (60%) ja myös aiheutti downregulation BAK1 (kuvio 5E). Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että sekä Bcl-X

L ja Mcl-1 välittäjänä P14

ARF aiheuttaman p53-riippumattoman apoptoosin. Nämä kaksi antiapoptooppinen tekijät täten analysoitiin. Emme havainneet niiden muutos

miR-125b

-inactivated,

p14

ARF

-silenced PC3-solut (kuvio 5D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että

miR-125b Twitter /p14

ARF signalointi pystyy säätelemään kasvun ja apoptoosin p53-puutosta CaP soluissa.

) havaitseminen P14

ARF ja MDM2 tasolla p53-null PC3-soluissa. Solut transfektoitiin 50 nM miR-125bm tai anti-

miR-125b

72 tuntia. Ilmaisu tasot molempien p14

ARF ja MDM2 analysoitiin Western blot -määritys. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

B

) havaitseminen anti-

miR-125b

indusoimaan apoptoosin PC3-soluissa. Solut transfektoitiin käyttäen 50 nM anti-

miR-125b

72 tuntia ja apoptoottista solukuolemaa havaittiin käyttäen TUNEL määritystä. Vihreä ydin- fluoresenssi osoittaa apoptoottisen pilkkominen tuman DNA (

jäljellä

). Kvantitoimiseksi apoptoottisen solukuoleman, 400 solut laskettiin ja apoptoosin ilmaistaan% apoptoosin (apoptoottisten solujen /400 x 100%). Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin kolme kertaa ja tulos esitetään keskiarvo ± SE (n = 3) (

oikea

). Solut, jotka käsitelty säteilyttämällä (IR, 6 Gy) käytettiin positiivisena kontrollina.

C

)

MiR-125b

edistää kasvua p53-null,

BAK1

-silenced PC3-soluissa. Soluja käsiteltiin 50 nM miR-125 miljoonaa 5 päivää ja solujen lisääntyminen mitattiin käyttämällä WST-1-määritystä. Tulokset ilmaistaan ​​kasvun estämistä suhteessa kuin miR-NC (keskiarvo ± SD, n = 4). Upotus: BAK1 ilmaisun

BAK1

-silenced PC3-soluissa.

D

) TUNEL määritystä apoptoottisen kuoleman PC3-soluja, jotka oli käsitelty anti

miR-125b

seurasi

p14

ARF

antisense (sip14). Tulos ilmaistiin keskiarvona ± SE (n = 3).

E

) Western blot analyysit p14

ARF ja BAK1 tasot PC3-soluissa.

Top: PC3-soluja transfektoitiin anti

miR-125

;

pohja

: anti

miR-125

-transfected PC3-soluja käsiteltiin sip14. Sekä anti-miR-NC (anti-NC) ja ryntäily siRNA käytettiin kontrolleina.

Keskustelu

Viimeaikaiset havainnot poikkeavan miRNA ilmaisun eri ihmisen syövissä ovat korostaneet, miten tärkeää on miRNA monissa biologisissa prosesseissa [5].

MiR-125b

on laajasti konservoitunut miRNA ja sen todettiin olevan koholla useita syöpiä, kuten CaP [14], [15]. Raportoimme aikaisemmin, että kliiniset caps korkean Gleason tulokset erittäin express

miR-125b

[13], ja että

miR-125b

suoraan kohdistuu p53, Puma ja BAK1, osoittaa antiapoptoottisena vaikutus läsnä ollessa ja puuttuessa androgeenien [16].