Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Platinum kemoterapian on standardi strategia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), kun taas chemoresistance edelleen suuri terapeuttinen haaste nykyisessä kliinisessä käytännössä. Nykyinen Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko estämällä NF-KB /miR-21 /PTEN reitin voisi lisätä herkkyyttä NSCLC sisplatiinia.

Methods

ilmentyminen miR-21 NSCLC kudoksissa määritettiin käyttämällä in situ. Seuraavaksi vaikutus miR-21 herkkyyteen A549-solujen sisplatiinin määritettiin in vitro. Olipa miR-21 säänneltyä PTEN ilmentyminen arvioitiin lusiferaasianalyysissä. Lisäksi onko NF-KB kohdistettu sen sitovia elementtejä miR-21-geenin promoottori määritettiin lusiferaasin ja siru määritys. Lopuksi mitattiin solujen elävyys ja apoptoosin alle sisplatiinihoitoon kun NF-KB estyi.

Tulokset

kohonnut miR-21 havaittiin NSCLC keuhkojen kudoksiin ja sen liittyi lyhyt elinaika. Eksogeeninen miR-21 edistää solujen eloonjäämistä, kun se altistetaan sisplatiini, kun taas miR-21 estäminen voisi kääntää tätä prosessia. RNA ja proteiini tasot PTEN oli vähentynyt merkittävästi eksogeenisten miR-21 ja 3′-alue PTEN osoitettiin olevan tavoitteeksi miR-21. Ilmaisu Mir-21 säädeltiin NF-KB: n sitoutumisen sen elementti promoottori, päätelmä todennettiin lusiferaasin ja siru määritys. Siten NF-KB: n RNA hiljentäminen suojaa soluja vastaan ​​sisplatiinin kautta vähentämällä miR-21 ilme.

Johtopäätös

modulaatio NF-KB /miR-21 /PTEN väylän NSCLC osoitti että esto tämän reitin voi lisätä sisplatiinin herkkyyttä.

Citation: Yang Z, Fang S, Di Y, Ying W, Tan Y, Gu W (2015) modulaatio NF-KB /miR-21 /PTEN Pathway herkistää ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja sisplatiinia. PLoS ONE 10 (3): e0121547. doi: 10,1371 /journal.pone.0121547

Academic Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE

vastaanotettu: 14 lokakuu 2014; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2015 Julkaistu: 23 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee taloudellisesti Program Jiangsun Health Department (H201341). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka käsittää okasolusyöpä, adenokarsinooma ja suuri solu erilaistumaton karsinooma, on yleisin keuhkosyövän [1,2]. Genetics on keskeinen rooli patofysiologisia mekanismi NSCLC [3,4], ja se johtaa ei-herkkyyden NSCLC platinapohjaisen kemoterapian [5], jolloin NSCLC on yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa [ ,,,0],1]. Siten on tarpeen kehittää uusia huumeiden, jotka perustuvat molekyyligenetiikan.

MikroRNA (miRNA) ovat sekaantuneet keskeisiksi modulaattoreina useiden kohdegeenien kautta endogeenistä RNA-interferenssi koneet [6]. Ne edistävät syövän biologian muuttamalla ilmaus niiden kohdegeenien [7]. miR-21 on yksi tyyppi miRNA, joka toimii voimakas modulaattori kasvainsolujen käyttäytymistä ja pahanlaatuisiksi [8]. On havaittu lisäävän solujen kasvua maksasyövän ja on osoittanut anti-apoptoottisia ominaisuuksia glioblastoma [9]. NSCLC, miR-21 myös on keskeinen rooli solujen lisääntymistä, invaasiota ja apoptoosin [10]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-21 säätelee ilmaus fosfataasin ja tensin homologin (

PTEN

) kautta suoraan kohdistaminen sen 3’alue (3’UTR) [8].

PTEN

, kasvainsuppressorigeenin, on keskeinen rooli sääntelyn solusyklin, apoptoosin ja muodostumista monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien NSCLC [10]. Se säätelee negatiivisesti solunsisäisen tason fosfatidyyli-3,4,5-trisfosfaatti (PI3K) soluissa ja toimii tuumorisuppressori negatiivisesti säätelemällä Akt signalointireitin [11]. Normaaleissa olosuhteissa, ilmaus ja aktivointi

PTEN

on tiukasti kontrolloitua, kun taas ilmaisuja miRNA ovat väärin säädellystä NSCLC. Muuttaminen

miR-21 /PTEN

todettiin pienisoluista keuhkosyöpää gefitinibin kanssa vastus [12].

Koska keskeinen asema miR-21 /PTEN väylän NSCLC, jäljelle jää kysymys siitä, miksi ilmaus

miR-21

lisääntyy NSCLC. Suoritimme bioinformatiikan haku (https://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi) ja löydettiin neljä sitovia elementtejä NF-KB: promoottori

miR-21

geeni. Lisäksi yksi tutkimusryhmä osoitti, että DNA aiheuttaman vaurion

miR-21

säätelyä ja edistää rintasyövän soluinvaasiota käytettäessä NF-KB-riippuvaisella tavalla [13]. Siksi oletimme, että NF-KB lisäsi tasolle

miR-21

, mikä vähensi

PTEN

ilmaisu transkription jälkeen edistää solujen eloonjäämistä alle sisplatiinihoitoon NSCLC; siksi, estämällä NF-KB /miR-21 /PTEN reitin voisi olla potentiaalinen lääke kohde NSCLC.

Methods

Tissue mikrosirujen

Tissue mikrosiru (TMA) valmistettiin kudoksista peräisin 34 potilasta NSCLC ja 10 potilasta ilman NSCLC tammikuun 1999 ja elokuun 2007 tutkimus tehtiin mukaisesti Helsingin julistuksen (1989) ja hyväksyi paikallinen eettinen komitea (Nanjing ensimmäinen sairaala, Nanjing Medical University, Nanjing, Kiina). Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Edustava pinta-ala on huolellisesti valittu joukosta hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) -stained kohta, ja sitten 1,5 mm: n kudoksen ydin oli saatu vastaavasta parafiinilohkoihin. Sen jälkeen parafinoidut materiaali leikattiin 5 um: n leikkeitä ja asetettiin objektilasille, mitä seurasi värjäys HE tai in situ -hybridisaatio (ISH). Leikkeitä tarkasteltiin valomikroskoopilla (Olympus, Japani). NSCLC diagnosoitiin kaksi riippumatonta patologit mukaan unionin International Cancer valvonta (UICC) luokitusjärjestelmä, 7. painos. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin seuraavasti: 0, ei solujen värjäys; 1, heikko värjäytyminen; ja 2, voimakas värjäytyminen. Prosenttiosuus värjätään solut luokiteltiin käyttäen 3-arvosana asteikolla: 0, ei positiivisten solujen; 1, 50% positiivisia soluja; ja 2, 50% positiivisia soluja.

ISH

ISH on

miR-21

suoritettiin valmistajan protokollan (MK10013, Boster, Kiina). Lyhyesti, sen jälkeen, kun deparaffinization dioja ksyleenissä ja etanoli, laseja inkuboitiin 3% H

2O

2 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sitten digestoitiin pepsiinillä 10 min ajan 37 ° C: ssa. Huuhtelun jälkeen veteen, Levyjä kiinnitettiin 1% PFA DEPC (Generay, Kiina) 10 min. Sitten leikkeitä pestiin kolme kertaa vedellä ja inkuboitiin esihybridisaatiopuskurissa 4 h 42 ° C: ssa ja hybridisaatio puskurissa yön yli 42 ° C: ssa miR-21 koetin (5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3 ’). Objektilasit pestiin seuraavasti: 2 x SSC: ssä 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa, kaksi kertaa; 0,5 x SSC: ssä 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, kun; ja 0,2 x SSC: ssä 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, kerran. Kudos inkuboitiin estopuskurissa 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten inkuboitiin streptavidiini-biotiini-kompleksin (SABC). Kun oli pesty kolme kertaa PBS: llä, levyt inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi polymeerin konjugaattia vielä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen ne värjättiin 3,3-diaminobentsidiinillä ja vastavärjättiin hematoksyliinillä (Sigma-Aldrich, USA).

Soluviljely

HEK293-solut ja A549-solut kasvatettiin ja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen (DMEM, Invitrogen, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, USA), penisilliinillä 100 U /ml ja streptomysiiniä 100 ug /ml (Gibco).

plasmidin ja yhdistelmä-DNA-lentivirus-

ihmisen

NF-KB

(p65)-geenin fragmentti monistettiin PCR: llä, kloonattiin pcDNA3 ja insertio vahvistettiin sekvensoimalla. Sitten plasmidi pcDNA-NF-KB: n pilkottiin EcoRI /Xbal. Digestoitu tuotteet ajettiin elektroforeesilla agaroosigeelissä.

NF-KB: n

-geenin fragmentti puhdistettiin geelistä uuttamalla ja sen jälkeen kloonattiin pLVX-IRWS-ZsGreen1. ShRNA konstrukti kohdistaminen NF-KB: n kloonattiin myös pLVX-IRWS-ZsGreen1. Rekombinantti Lentiviruksiin Lenti-shNF-KB ja Lenti-NF-KB tuotettiin ja titrattiin mukaan aiemman raportin [14]. Koko avoin lukukehys

PTEN

kanssa tai ilman

miR-21

Kohdennussekvenssi 3’UTR kloonattiin pcCS2 vektorin Myc tag rakentaa pcCS2-PTEN-3 ’UTR ja pcCS2-PTEN, vastaavasti.

transfektio

miR-21

matkii ja inhibiittori

FAM-modifioitu 2′-O-Me-oligonukleotidit syntetisoitiin kemiallisesti ja puhdistettiin suuren erotuskyvyn nestekromatografialla (GenePharma, Kiina). 2′-O-Me-miR-21 matkivat koostui RNA duplekseja on seuraava sekvenssi: 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 ’; sekvenssit 2′-O-me-miR-21-estäjän ja 2′-O-me-salatun oligonukleotidit olivat seuraavat: 5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 ’; ja 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 ’. Solut ympättiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti ja kasvatettiin 80% konfluenssiin. MIR-21-estäjä tai miR-21 jäljittelee pitoisuutena 50 nM kutakin transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) inkuboimalla Opti-Mem I media (Invitrogen) 4 tuntia. Solut siirrettiin sitten tuoreeseen elatusaineeseen. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, elatusaine korvattiin ja fluoresoivia kuvia hankittiin seurata transfektion tehokkuutta. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin analyysiä varten.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) valmistajan suositusten mukaan. Sillä

miR-21

qRT-PCR, kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttämällä miRNA-aluketta ja miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Saksa). Varsi-silmukka qRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR green PCR Master Mix (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Suhteellinen ilmentyminen arvioitiin vertaileva Ct menetelmä ja normalisoitiin ilmentymisen pieni nukleaarinen U6-RNA: ta. Havaitsemiseksi

PTEN

käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi Kit (Promega, USA) valmistajan suositusten. qRT-PCR suoritettiin käyttäen QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen).

GAPDH

mRNA-tasolla käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena kappaleena kolmessa riippumattomassa kokeessa. Reaktioissa cDNA käytettiin ei-mallin valvontaa, ja no-RT kontrollit myös perustaa sulkea genomisen DNA-kontaminaation. Suhteellinen kvantifiointi mRNA-ekspressio määritettiin käyttäen vertailevaan Ct menetelmällä.

Western blotting

Solut homogenisoitiin RIPA-puskurissa (Cell-Signaling Tech., US). Proteiinin pitoisuudet määritettiin käyttämällä BCA-pakkausta (Beyotime, Kiina). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten 0,45 um: n PVDF-kalvoille (Bio-Rad, USA). Membraanit blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween 20-puskurilla (TBST) 2 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavat primaaristen vasta-aineiden: anti-PTEN (1: 1000, Cell-signalointi Tech.), anti-kokonais-Akt (1: 1000, Abcam), anti-fosfori Ser473 Akt (1: 1000, Abcam) ja anti-GAPDH (1: 1000, Cell-signalointi Tech.), joka toimi latauskontrollina. Seuraavaksi kalvot pestiin kolme kertaa TBST: llä ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vuohen anti-kani IgG: tä (1: 5000) tai vuohen anti-hiiri-IgG: tä (1: 5000), Cell-signalointi Tech.) 2 h huoneenlämpötilassa. Blotit kehitettiin käyttäen kemiluminesenssi-kittiä (Millipore, USA), ja altistettiin röntgenfilmille. Bändit elokuva skannattiin ja analysoitiin käyttäen Image J.

sivektorissa rakentaminen

Ihmisen

PTEN

3’UTR sisältävän siemenen sekvenssi

miR -21

sitoutumiskohdat monistettiin PCR: llä ja kloonattiin pMIR-REPORT vektori (Ambion, USA) välissä HindIII: lla ja Spel-kohta kehittää pMIR-PTEN-3′-UTR: sivektorissa. Seed sekvenssit mutatoitiin päällekkäisiä PCR-pidennyksellä. Mutatoidun PTEN-3′-UTR-fragmentti kloonattiin pMIR-REPORT vektori kehittää pMIR-PTEN-mut-3′-UTR-vektoriin. Sarja toimittaja rakentaa samalla 3’mutta eri 5 ’päähän miR-21-promoottori monistettiin PCR: llä. Kaikki PCR-tuotteet kloonattiin plasmidiin pGL4-Minimal (Promega) tuottaa pGL4-miR-21. Mutantti päällä vietiin plasmidiin overlap extension PCR: llä. Sen jälkeen PCR-tuote kloonattiin tuottaa pGL4-mut-miR-21. Kaikki konstruktit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Lusiferaasiaktiivisuus

Solut tiheydellä 2 x 10

5 kuoppaa kohti ympättiin 24-kuoppalevyille ja viljeltiin yön yli. Sillä

miR-21

määrityksessä solut kotransfektoitiin 0,8 ug pMIR-PTEN-3′-UTR tai pMIR-PTEN-mut-3′-UTR, 50 nM miR-21 matkivat tai estäjän tai salattu oligonukleotidi yhdessä 50 ng PRL-TK vektori sisäisenä kontrollina käyttämällä Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen). Jotta promoottori määritystä, solut kotransfektoitiin 1 ug pcNF-KB: n tai pcDNA, 20 ng lusiferaasireportteriplasmidi ja 10 ng Renilla lusiferaasireportteriplasmidi (Promega). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin talteen, ja lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen Dual lusiferaasireportteri- määritystä (Promega, USA). Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisena lusiferaasiaktiviisuuden raportoitu aiemmin [15]. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa kolmena kappaleena.

ChIP määritys

siru Testi suoritettiin käyttäen Magna siru /G Kit (Millipore) mukaan valmistajan suositusten. Lyhyesti, A549-solut olivat silloitettu 1% formaldehydiä (Sigma-Aldrich) 10 min ja reaktio pysäytettiin glysiinin. Silloitetut solut kerättiin kylmään PBS ja ultraäänellä kuusi 15-s pulsseja 50-s välein pienentää koko DNA kokoa 200-1000 bp. Leikatussa kromatiinin ja magneettiset helmet immunosaostettiin anti-NF-KB: n (ab7970; Abcam, USA) tai kaniinin normaalilla IgG: ssa yön yli 4 ° C: ssa rotaattoria. Magneettihelmi-vasta-aine-chromatin kompleksit pestiin kerran vähäsuolainen puskuri, jonka jälkeen peräkkäin korkea suolaa, LiCI ja TE puskureita. Kromatiinin kompleksit eluoitiin ja inkuboitiin 62 ° C: ssa 2 tuntia. DNA-näytteet otettiin talteen käyttäen spin sarakkeita. Siru näytteitä, reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR edellä kuvattua menetelmää.

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT)

solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua per kuoppa. 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin 100 nM miR-21 matkivat, miR-21-estäjä tai salattu oligonukleotidi. Yhdistettäväksi kokeiluja miR-21 matkivat ja pcDNA-PTEN, solut kotransfektoitiin pcDNA-PTEN (0,2 ug). Kasvualusta korvattiin tuoreella täydellistä elatusainetta kanssa tai ilman sisplatiinia (5 uM) 24 tunnin transfektion jälkeen mukainen aiemman raportin [16]. Kun oli kulunut vielä 24 h, 20 ui 5 mg /ml MTT: tä (dimetyyli tiatsolyyli difenyylitetratsoliumbromidi; Sigma-Aldrich) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan kostutetussa inkubaattorissa. Supernatantti heitettiin pois, ja 200 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanin. Optinen tiheys (OD) mitattiin 490 nm: ssä. Elinkelpoisuuden on solujen ilman hoitoa määriteltiin 100%, ja kannattavuus muiden ryhmien laskettiin erikseen kuin huijausta solujen.

Tilastot

Jatkuva muuttujat esitetään keskiarvona ± SD ja määritetään varianssin analyysiä (ANOVA) seurasi post-hoc

t

-testi SPSS 13.0 ohjelmistolla. Yhdistyksen välillä eloonjäämisaste ja

miR-21

ilmentyminen määritettiin käyttäen useita logistista regressioanalyysiä lukien seuraavat tekijät: ikä, sukupuoli, tupakoitsija ja histologia. Kaplan-Meier-analyysiä käytettiin arvioimaan määrä tapahtuman elinaika ja ensisijaisen avautumisessa. Tilastollinen merkittävyys määriteltiin

P

arvo on alle 0,05.

Tulokset

miR-21

yliekspressoituu NSCLC keuhkojen kudoksiin

Lung kudoksissa 34 potilasta NSCLC ja 10 potilasta ilman NSCLC käytettiin tekemään TMA. Kliiniset ominaisuudet aineet on esitetty taulukossa 1. ilmentyminen

miR-21

havaittiin ISH. Intensiteetti

miR-21

värjäys lisääntyi merkitsevästi NSCLC soluissa. Lukemat oli merkittävästi lisääntynyt potilailla, joilla NSCLC (Fig. 1A ja B;

P

0,05). Lisäksi eloonjäämisaika väheni potilailla, joilla NSCLC, joilla oli korkea taso

miR-21

verrattuna niihin, jotka oli alhainen

miR-21

(Fig. 1 C;

P

0,05).

(A) ISH käytettiin havaitsemaan miR-21 on TMA 34 NSCLC ja 10 normaalin keuhkojen näytteitä. Vasen paneeli oli ISH ja oikea paneeli oli HE värjäystä. (B) värjäytymisintensiteettiä tilanne oli suurempi pienisoluista keuhkosyöpää verrattuna terveisiin koehenkilöihin verrattuna. (C) elinaika potilailla, joilla on korkea miR-21 oli lyhyempi kuin joka on alhainen taso miR-21. *

P

0,05 merkittävää eroa.

miR-21

moduloi eloonjäämisen A549

miR-21

jäljittelee käytettiin edustamaan eksogeenisen

miR-21

, ja

miR-21

inhibiittoria käyttää inhiboimaan endogeenisen

miR-21

. Taso

miR-21

että A549-soluja havaittiin reaaliaikainen PCR (Kuva. 2B). Seuraavaksi käytimme MTT-määritystä arvioida solujen elinkelpoisuuden A549-solut, kun se altistetaan sisplatiinihoitoon. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, solujen elävyys oli merkittävästi lisääntynyt soluissa käsiteltiin

miR-21

jäljittelee verrattuna kontrolliryhmään. Inhibitio

miR-21

sen estäjä vähensi solujen elinkelpoisuuden verrattuna kontrolliryhmään.

solujen valvontaa, miR-21 jäljittelee ja miR-21-estäjä transfektoitiin 100 nM salattu oligonukleotidi, miR-21 matkivat ja miR-21-estäjä, vastaavasti. (A) aika-akselilla kokeen. Sekoitetun oligonukleotidi, miR-21 matkivat tai estäjä annettiin 4h ennen sisplatiinihoitoon (5 uM). Ja 48 tuntia sisplatiinin jälkeen hoidon, solut kerättiin lisäanalyysiä varten. (B) mRNA: n ekspressiota PTEN on kääntäen verrannollinen kanssa miR-21. (C) miR-21 jäljittelee lisäsi solujen elinkelpoisuuden miR-21-estäjä pieneni, kun solut altistetaan sisplatiinihoitoon. (D) Western blottaus PTEN yhteensä Akt (t-Akt) ja fosfori Ser473 Akt. (E) graafinen esitys PTEN, t-Akt ja fosfori-Akt. miR-21 väheni ilmentymistä PTEN ja lisäsi suhde fosfori-Akt. * Verrattuna kontrolliryhmään, # verrattuna miR-21 matkivat ryhmä.

P

0,05 merkittävää eroa.

miR-21

säätelee

PTEN

ilmentymistä sitoutumalla sen 3′-UTR

bioinformatiikan haku osoitti, että

PTEN

, kasvain-estävä geeni, oli potentiaalinen kohde

miR-21

koska siellä oli otaksuttu

miR-21

sitovan kohdan siemen sekvenssin sisällä 3’UTR

PTEN

mRNA (Fig. 3A). Mittasimme mRNA: ta (Fig. 2B), ja proteiinin tasot PTEN (Fig. 2D) on A549-soluja, joilla on korkea tai alhainen miR-21. Käänteinen korrelaatio

miR-21

ilmaisun ja

PTEN

mRNA-ekspressio havaittiin.

Akt

on alavirtaan

PTEN

, ja olen myös vaikutti aktivoinnista

Akt

(Fig. 2D ja E). Verrattuna kontrolliryhmään,

miR-21

jäljittelee laski lusiferaasiaktiivisuutta, kun taas

miR-21

inhibiittori osoitti merkittävää kasvua suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus. Kun siemen sekvenssi

miR-21

sitoutumiskohdista mutatoitu, vaikutus

miR-21

lusiferaasiaktiivisuuteen ei havaittu (kuvio. 3B). Seuraavaksi koko avoin lukukehys

PTEN

kanssa tai ilman

miR-21

kohdentavan sekvenssin 3’UTR kloonattiin pcCS2.

Myc

tasolle, joka edustaa eksogeenista

PTEN

, väheni

miR-21

jäljittelee soluissa transfektoitu pcCS2-PTEN-3’UTR, kun taas siellä ei ollut merkittävä väheneminen

Myc

ilmentymisen

miR-21

jäljittelee soluissa, jotka on transfektoitu pcCS2-PTEN (Fig. 3C ja D). Nämä tulokset ymmärtää, että

miR-21

säädellä ilmentymistä

PTEN

A549-soluihin kohdistuvat sekvenssin PTEN 3’UTR.

(A) rakentaminen 3 ’UTR ja mutatoitunut 3’UTR PTENin osaksi pMIR-REPORT vektori. (B) Kun solut transfektoitiin pMIR-REPORT-PTEN-3’-UTR, lusiferaasiaktiivisuus lisääntyi miR-21 ja laski miR-21-estäjä. Vuonna transfektoiduissa soluissa pMIR-SELVITYS-PTEN-mut-3’UTR, lusiferaasiaktiivisuuden pysyi mitään merkittävää eroa kolmesta ryhmästä. (C): n avoin lukukehys PTEN kanssa tai ilman 3’UTR kloonattiin pCS2 vektoriin. Myc tag liitettiin PTEN erottaa sisäiset tai ulkoiset PTEN. (D) Graafinen esitys Myc osoitti, että yli-ilmentyminen miR-21 vähensi Myc ilmaisu taas miR-21-estäjä lisäsi ilme. Vaikka PTEN 3’UTR pudotettiin, ilmaus PTEN ei vaikuttanut miR-21. * Verrattuna kontrolliryhmään, # verrattuna miR-21 matkivat ryhmä.

P

0,05 merkittävää eroa.

NF-KB säätelee ilmentymistä miR-21 kautta sitoo promoottorin

Koska roolia

miR-21

NSCLC, pyrimme tutkimaan mekanismi yliekspressio

miR-21

in NSCLC. Bioinformatiikan analyysi ehdotti, neljä mahdollista sitovia osia NF-KB: n promoottori- alueen

miR-21

geenin (Fig. 4A). Siru reaaliaikainen määritys osoitti, että taso NF-KB: n vasta-aineen sitoutumisen

miR-21

promoottori oli enemmän kuin IgG (Fig. 4C,

P

0,05) mikä osoittaa, että NF-KB voi sitoutua suoraan kaikki neljä elementtiä promoottorin alueella

miR-21

geenin. Seuraavaksi subkloonattiin eripituiset

miR-21

promoottori ja sen mutaatio pGL4 ja kotransfektoitiin rakenteiden kanssa Renilla tai ilman pcNF-KB-A549-soluihin. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, pcNF-KB huomattavasti lusiferaasin aktiivisuus verrattuna pcDNA. Kun ensimmäinen sitova elementti (-2837) oli poistettu tai mutatoitu, ei ollut vähenemistä lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna täyspitkän promoottorin. Kun toinen elementti (-1211) poistettiin tai mutantit, oli merkittävä väheneminen lusiferaasiaktiivisuudessa. Kun kolmas osa on poistettu tai mutatoitu, ei ollut merkitsevää vähenemistä lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna siihen, kun toinen elementti poistettiin. Kuitenkin, kun sitoutuvat sekvenssit NF-KB olivat kaikki poistettu tai mutatoitu, oli myös merkittävä väheneminen lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna siihen, kun toinen elementti on poistettu tai mutatoitu. Nämä tulokset osoittivat, että toinen ja neljäs sitovat elementit saattavat edistää sääntelyn

miR-21

transkriptio NF-KB: n.

(A) koko pituudelta miR-21 on neljä NF -κB sitovia osia. Eripituisia miR-21-promoottori kloonattiin ja pGL4 vektoriin. Neljä elementtiä mutatoitiin yksitellen ja mutatoitu promoottorit kloonattiin myös sen pGL4 vektoriin. (B) suhteellisen lusiferaasiaktiivisuuden A549-soluja kotransfektoitiin pcNF-KB: n ja pGL4 raportointi vektori. (C) pelimerkin reaaliaikainen määritys osoitti, että NF-KB-vasta sitovat enemmän DNA normaalia IgG. Primer 1-4 tarkoittaa aluke sisälsi neljä NF-KB sitovia elementtejä ylävirtaan alavirtaan. *

P

0,05 merkittävää eroa.

NF-KB /miR-21 /PTEN reitin moduloi herkkyyttä A549-solujen sisplatiini

taso

miR-21

indusoitiin yliekspressio NF-KB: n ja inhiboi Lenti-shNF-KB, mikä laski ilmentymistä NF-KB (Fig. 5A).

PTEN

ilmentyminen korreloi käänteisesti NF-KB ilmentymistä (Fig. 5A). Solujen elinkelpoisuus A549-solut lisäsi merkitsevästi Lenti-NF-KB: n, kun ne altistetaan sisplatiinihoitoon (Fig. 5B). Soluissa, jotka on transfektoitu pcCS2-PTEN yli-ilmentää

PTEN

, vaikutukset yli-ilmentymisen NF-KB: n tai

miR-21

solun elinkelpoisuus A549-solut estyi (Fig. 5c) .

(A) mRNA ilmauksia NF-KB, miR-21 ja PTEN soluissa transdusoitiin Lenti-ohjaus, Lenti-NF-KB ja Lenti-shNF-KB. MIR-21 taso lisääntyi merkitsevästi, kun PTEN väheni soluissa transdusoitiin Lenti-NF-KB verrattuna kontrollivektorilla. MIR-21 taso oli merkittävästi vähentynyt, kun taas PTEN väheni soluissa transdusoitiin Lenti-NF-KB. (B) Solujen elinkelpoisuus lisääntyi Lenti-NF-KB taas laski Lenti-shNF-KB. (C) yli-ilmentäminen PTEN palautti herkkyyttä A549-solujen sisplatiinihoitoon verrattuna yli-ilmentymisen NF-KB tai miR-21. * Verrattuna kontrolliryhmään, # verrattuna Lenti-NF-KB ryhmä.

P

0,05 merkittävää eroa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että

miR-21

oli yläreguloituja potilaille, joilla on NSCLC, mikä osoittaa huono ennuste. Lisäksi todettiin, että

miR-21

indusoitu vastus NSCLC solulinjan sisplatiinin kautta kohdistaminen 3’UTR

PTEN

vähentää sen ilmentymisen transkription jälkeen. Lisäksi NF-KB translokoituu tumaan ja sitoutuu sen tiettyjä elementtejä

miR-21

geenin promoottori aiheuttaa

miR-21

ilme. Lopuksi, modulaatio NF-KB /miR-21 /PTEN reitin lisääntynyt herkkyys NSCLC-solujen sisplatiinihoitoon. Tuloksemme voisi tarjota uusia oivalluksia patofysiologinen mekanismi NSCLC ja ehdottaa uutta lääkettä kohde NSCLC.

miR-21

on havaittu yliekspressoituvan monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien maksasyöpä, eturauhassyöpä ja peräsuolen syöpä. Meidän Tässä tutkimuksessa poimimamme kudoksia potilailta NSCLC ja verrokeilla suorittaa TMA. ISH tulos havaittiin korkeampi

miR-21

potilailla, joilla on NSCLC vertailuryhmän henkilöillä. Lisäksi korkea

miR-21

osoitti huono ennuste potilaille NSCLC. Tätä tukevat monet aikaisemmat tutkimukset. Vuonna Markou et al. Tutkimuksessa 48 NSCLC makean pakastetut kudosnäytteiden kerättiin havaitsemiseksi

miR-21

ilmentyminen reaaliaikaisella PCR, ja todettiin, että

miR-21

oli yläreguloituja 16 29 ( 55,2%) uusiutunutta potilaista ja 15 23 (65,2%) kuolleen potilaista [17]. Lisäksi tupakoimattomilla, poikkeavasti lisääntynyt ilmentyminen

miR-21

havaittiin myötävaikuttaa keuhkojen syövän synnyn [18]. Kaksi meta-analyysit tiivisti tietoja eri tutkimuksista ja totesi, että yli-ilmentyminen

miR-21

oli itsenäinen ennustetekijä varten NSCLC [19], erityisesti Aasian ihmiset [20].

ymmärtää vaikutus

miR-21

NSCLC,

miR-21

matkii ja sen estäjä käytettiin vastaavasti parantaa ja estää sen biologinen funktio A549 NSCLC solulinjassa. Todettiin, että eksogeeninen

miR-21

edistää solujen eloonjäämistä, kun se altistetaan sisplatiinihoitoon, kun taas

miR-21

inhibition johtanut päinvastaiseen toiminnon. Nämä havainnot todensi yhdessä tutkimuksessa, joka osoitti, että kohonnut

miR-21

lisäsi vastustuskykyä A549 solujen platinaa, kun taas pienentää

miR-21

laski tämän resistenssin [21]. Perustuu edellä havainnoista,

miR-21

voisi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde NSCLC. Taustalla mekanismi Sisplatiinin vastus NSCLC on monimutkainen, ja

miR-21

myös useita tavoitteita mukaan bioinformatiikan analyysi. Tutkia vaikutuksen I NSCLC ennen kuin se etenee syvemmälle kliinisen hakuvaiheessa kaksi olennaista kysymystä jatkuvat: miten vaikuttaa lopputulokseen NSCLC, ja kuinka minä ylössäädellään NSCLC.

Bioinformatics selvityksissä ehdotetaan tavoitteeksi sivusto

miR-21

3’UTR on

PTEN

mRNA. I on läsnä kasvaimeen estävä geeni, ja sen sääntelyn tuloksia monissa kiinteitä kasvaimia. NSCLC, I on ollut mukana keskeisenä edistäjänä synnyssä ja kasvaimen kasvua [22].

PTEN

tappio on tunnustettu mekanismi gefitinibin resistenssin NSCLC [23]. Kohdennettu poistetaan

PTEN

johtaa kehitystä NSCLC [24]. Näin ollen oletettiin, että

miR-21

, joka estää

PTEN

kohdistamalla sen 3’UTR, vaikuttaisi NSCLC patologinen prosessi. Alussa havaittu käänteinen suhde

miR-21

ja

PTEN

A549-soluissa. Sitten kloonattu 3’UTR

PTEN

osaksi pMIR-REPORT lusiferaasireportteri ja totesi, että

miR-21

matkii merkittävästi vähentynyt lusiferaasivaikutusta kun kotransfektoitiin pMIR-SELVITYS-PTEN-3 ’ UTR, kun taas mitään muutosta lusiferaasiaktiivisuudeksi huomata kun

miR-21

matkii kotransfektoitiin pMIR-SELVITYS-PTEN ilman 3’UTR. Aiemmat tutkimukset ovat myös tukeneet tätä päätelmää [25,26].

Yhtäältä

miR-21

säädellä ilmentymistä

PTEN

; Toisaalta, se on säännelty muut tekijät. Jotkut miRNA on omat promoottorit, kun taas toiset jakavat promoottori muiden miRNA varten miRNA geeni sijaitsee intronin isännän geenistä. Olipa miRNA on omat promoottorit tai osake promoottorit, niiden ilmaisua voidaan säädellä tiettyjen transkriptiotekijät, mukaan lukien p53 ja NF-KB: n, joka kohdistaa promoottorit. On neljä sitovia elementtejä NF-KB:

miR-21

geenin promoottori [27]. Näin ollen on mahdollista, että

miR-21

voitaisiin säädellä NF-KB: n kohdistaminen sen sitoutumisen elementtejä. Meidän ChIP määritys vahvisti, että NF-KB voi sitoutua suoraan kaikki neljä elementtiä promoottorin

miR-21

geenin. Kuitenkin vain elementit sijaitsevat -1211 ja -404 ja

miR-21

-geenin promoottori oli biologisen funktion mukaan lusiferaasiaktiivisuuden määritys. Tuloksemme oli osittain tukevat muiden tutkimusten. Eturauhasen syöpäsoluja, interferoni-indusoidun

miR-21

ilmentymistä tarvitaan NF-KB: n /p65 rekrytointia

miR-21

promoottori [27]. Ihmisen rinta MDA-MB-231 ja peräsuolen HCT116 kasvainsolulinjat, NF-KB: n havaittiin myös sitoutuvan

miR-21

-geenin promoottori [28]. NSCLC, NF-KB tunnistettiin ensimmäisen kerran säätelemään ilmentymistä

miR-21

sitoutumalla sen elementtien

miR-21

geenin promoottori.