Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

fenretinidi (4-HPR) on synteettinen retinoidi joka näyttelyitä voimakas antitumor ja chemopreventive toimintaa vastaan ​​eri maligniteetteja, mukaan lukien munasarjojen kasvaimia. Osoitimme aikaisemmin, että munasarjan syöpäsolujen, 4-HPR indusoi apoptoosia signalointiryöpyn alkaen reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto ja joihin solulimakalvostoon (ER) stressivasteen, Jun N-terminaalinen kinaasi-(JNK) aktivointi, ja induktio proapoptoottiset istukan Luun morfogeneettinen proteiini (PLAB). Koska viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että onkogeeni Kaikki1H-fuusioitunut kromosomista 1q (AF1q), joka on retinoiinihappo kohdegeenin, on osallisena apoptoosin useiden terapeuttisten aineiden kanssa, tutkimme sen mahdollista osallistumista indusoiman apoptoosin 4-HPR munasarjasyövän soluja.

Menetelmät /Principal havainnot

proteiinin ilmentymisen analyysi, suoritetaan munasarjasyöpäsoluja ja laajentaa muihin histotypes (rinta-, neuroblastooma, ja kohdunkaulan), kävi ilmi, että 4-HPR parannettu AF1q ilmaisun syöpäsolujen herkkä retinoidi mutta ei resistentit solut. Kautta geenien, AF1q havaittiin toiminnallisesti mukana 4-HPR-indusoitua apoptoosia in A2780, munasarjojen syövän solulinja erittäin herkkä retinoidien kasvua estävän ja apoptoottisten vaikutuksia. Esto signalointi välituotteiden 4-HPR apoptoottisia cascade osoitti, että AF1q upregulation on riippui ennen sukupolven ROS, induktio ER stressin vasteen, JNK aktivointi, ja PLAB upmodulation. Lopulta huomasimme, että suora yliekspressio AF1q, ilman ulkoisia ärsykkeitä, lisääntynyt apoptoosin munasarjasyövän solulinjoissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tutkimus laajentaa tietämystä 4-HPR vaikutusmekanismi, joka ei vielä ole täysin selvitetty, tunnistetaan AF1q uutena välittäjänä retinoidi syövän vastaista aktiivisuutta. Lisäksi osoitamme ensimmäistä kertaa, että AF1q on rooli puhkeamista pohjapinta apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, jolloin saadaan uutta tietoa tämän proteiinin, jonka biologinen toiminnot ovat enimmäkseen tuntemattomia.

Citation: Tiberio.Seudun P, Cavadini E, Callari M, Daidone MG, Appierto V (2012) AF1q A Novel välimiehen Basal ja 4-HPR-indusoitu apoptoosi munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 7 (6): e39968. doi: 10,1371 /journal.pone.0039968

Editor: Maurizio D’Incalci, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Italia

vastaanotettu 5 maaliskuuta 2012 Hyväksytty: 5 kesäkuu 2012; Julkaistu: 26 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Tiberio.Seudun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat varoja Italian kansalaisten, jotka jaetaan 5 × 1000 osuus niiden verojen maksamisesta tueksi Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori mukaan Italian lakien (INT-Institutional strategisia hankkeita ”5 x 1000 ’; www.lavoro.gov. se/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

retinoidien, suuri perhe luonnollisia ja synteettisiä yhdisteitä, jotka liittyvät rakenteellisesti A-vitamiini (retinoli), ovat tärkeitä molekyylejä, jotka säätelevät erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten alkion kehitys, erilaistumiseen, ylläpitoon epiteelikudokseen, lisääntymiselle , visio, leviämisen ja apoptoosin [1], [2]. N- (4-hydroksifenyyli) retinamidi (4-HPR), joka tunnetaan myös nimellä fenretinidi, on synteettinen A-vitamiinin johdannainen hyvin siedetty ihmisellä, joka on tullut yksi lupaavimmista retinoideja klinikalla ehkäisyyn ja hoitoon useiden maligniteettien [ ,,,0],3] – [7]. 4-HPR on osoitettu mahdollisesti vähentää esiintymistä munasarjasyöpä ja määrittää, premenopausaalisilla naisilla, vähennetään merkittävästi riskiä toisen rintasyövän, joka jatkuu ainakin 15 vuoden ajan [3], [6]. Vaikka 4-HPR vaikutusmekanismeja on ollut tärkeä tutkimuksen painopiste viime vuosikymmenen aikana, molekyylitason tapahtumia välittämiä retinoidi näyttävät monipuolinen ja ei ole täysin selvitetty [8]. Toisin kuin klassiset retinoidit (esimerkiksi all-trans-retinoiinihappo), joka usein aiheuttaa erilaistumista ja /tai sytostaasi aktivoimalla perheen ydin- retinoiinihapporeseptoreihin (RAR), 4-HPR on osoitettu herättävän erilaisia ​​biologisia vaikutuksia kautta sekä retinoidi reseptori riippuvainen riippumattomien mekanismien kautta [9].

viljellyt solut, 4-HPR on osoitettu estävän solujen proliferaatiota ja edistää apoptoosivälitteisiin, ainakin osittain, tuottamalla reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja tästä oksidatiivisen stressin [8] – [11]. Olemme aikaisemmin esittänyt todisteita siitä, että munasarjasyöpäsoluja, 4-HPR aiheuttaman apoptoosin kautta signalointiryöpyn alkaen ROS tuotanto ja joihin solulimakalvostoon (ER) stressivaste, Jun N-terminaalinen Kinase (JNK) aktivointi, ja induktio proapoptoottiset istukan luun morfogeneettinen proteiini (PLAB, joka tunnetaan myös NAG-1, GDF15, MIC-1, PDF, ja PTGFB) (ROS → ER stressiä → JNK → PLAB) [11], [12].

Kaikki1H -fuusioitunut kromosomista 1q (AF1q, joka tunnetaan myös MLLT11) geeni, joka sijaitsee kromosomissa 1, band 21, koodaa pientä proteiinia 9 kDa: n, joilla ei ole hyvin määritelty funktionaalisia domeeneja, ja niillä ei ole samankaltaisuutta muihin tunnettuihin proteiineihin [13]. Mekanismit säätelyyn AF1q ilmaisun on tutkittu mRNA ja proteiini tasoilla. Kasvu AF1q mRNA-tasojen on osoitettu retinoiinihappo (RA) -responsive neuroblastoomasoluja altistumisen jälkeen retinoidi, mikä tunnistaa AF1q kuin RA-kohdegeenin [14]. Viime aikoina on osoitettu, että AF1q mRNA: n ekspressio suoraan säädellään microRNA29b [15], kun taas proteiini alistetaan ubikitiinipromoottori-välitteisen hajoamisen proteasomin on centrosomal alueella [16]. AF1q määriteltiin aikoinaan onkogeenisessä tekijä sekaantunut translokaatio t (1; 11) (q21; q23) vastaa leukemiaa [13]. Lisäksi korkea ilmentymistaso Geenin raportoitu liittyvän Huonon lopputuloksen lapsipotilailla akuutti myelooinen leukemia (AML), aikuisten normaali sytogeneettiset AML, ja aikuisten myelodysplastinen oireyhtymä [17] – [19]. Vaikka biologiset toiminnot AF1q ovat suurelta osin tuntemattomia, mahdollisesti onkogeenisiä proteiinin toimintaa on myös ehdotettu kiinteiden kasvainten, kuten rintasyövän ja kilpirauhasen oncocytic ja kivesten itusolukasvaimet [20] – [23]. Sen lisäksi, että ehdotettu onkogeenisen rooli AF1q, on raportoitu, että proteiini voi säädellä BAD välittämää apoptoottista reitin kautta NF-kB, mikä pelissä rooli apoptoosin säätelyyn ja lääkeresistenssin [24], [25] . Väheneminen AF1q ilmentymisen kanssa vähensi doksorubisiinin herkkyys on havaittu ihmisen squamous karsinooma soluja, ja pudotus proteiinin on osoitettu vähentävän indusoimaa apoptoottista solu- kuolemaa useita terapeuttisia aineita, kuten doksorubisiini ja γ säteilyn [24], [ ,,,0],25].

Tässä tutkimuksessa selvitettiin osallistumista AF1q 4-HPR aiheuttama apoptoosin munasarjojen kasvainsoluissa. Tarjoamme todisteita siitä, että 4-HPR hoito parantaa AF1q ekspressiotasot syöpäsolujen herkkä retinoidi ja että upregulation on tärkeä tapahtuma 4-HPR signalointikaskadin, joka johtaa apoptoosin kautta ROS: n syntyminen, ER stressin vastaus, JNK aktivointi, ja PLAB ylössäätely. Lopuksi, AF1q yli-ilmentyminen, osoitimme roolin AF1q puhkeamista pohjapinta apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

Tulokset

4-HPR Aiheuttaa AF1q säätelyyn ylöspäin munasarjasyöpäsoluja Herkkä retinoidiseoksen mutta ei resistenttien solujen

Koska AF1q osoitettiin rooli apoptoosin aiheuttama useita terapeuttisia aineita ja säänneltävä RA [14], [24], [25], pyrimme tutkimaan potentiaalinen panos proteiinin apoptoottisen aktiivisuuden synteettisen retinoidi 4-HPR. Analysoimme vaikutus 4-HPR käsittely AF1q ilmentymistä ihmisen munasarjasyövän A2780, joka on erittäin herkkä antiproliferatiivisia ja apoptoottista vaikutusta retinoidi [26], [27], ja sen vastine A2780 /HPR, joka on aiheuttanut vastustuskykyä 4-HPR [28]. Proteiinin ilmentyminen analyysi osoitti, että A2780-soluja konstitutiivisesti AF1q proteiinia, ja että hoito 5 ja 10 uM 4-HPR 24 tuntia lisäsi ekspressiota annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). Sen sijaan 4-HPR hoito ei aiheuta lisäystä AF1q proteiinin ilmentyminen in A2780 /HPR-solut, vaikka solut ilmentävät konstitutiivisesti (kuva 1B). Tällaisia ​​tietoja ehdotti yhdistyksen välillä AF1q induktion 4-HPR käsittely ja solujen herkkyyttä retinoidi.

Western blot analyysi AF1q ilmentymisen A2780 (A) ja A2780 /HPR (B) solut käsiteltiin 24 tuntia 5 ja 10 uM 4-HPR. Kontrollina lastattavaksi, blotteja inkuboitiin aktiini vasta-aineella.

4-HPR Parantaa AF1q ilmentäminen Muut munasarjasyöpäsoluja ja syöpäsolulinjoissa Eri Histotypes

arvioimiseksi onko 4-HPR aiheuttama AF1q säätelyä rajoitettiin A2780 soluihin tai edustettuna erottuva toimintatapa retinoidi, jatkoimme analyysin AF1q ilmaisun muille ihmisen syöpäsoluja eri herkkyyttä antiproliferatiivinen vaikutus 4-HPR. Hoito 5 uM 4-HPR 24 tuntia indusoidun AF1q kiihdytyssäätely herkällä munasarjasyövän solulinjoissa OVCA432 ja SKOV-3 [27] (kuvio 2A), sekä reagoiva soluissa eri histotypes, eli rintarauhasen adenokarsinooma T47D ja neuroblastooma SK-N-BE [27] (kuvio 2B). Sitä vastoin soluissa, jotka luontaisesti resistenttejä 4-HPR kasvua estävä aktiivisuus, kuten munasarjasyövän OVCAR-3 [27] ja kohdunkaulan karsinooman solulinjoissa HeLa (IC

50 10 uM, 72 h, tuloksia ei ole esitetty), ei 5 uM (tuloksia ei ole esitetty) eikä 10 uM 4-HPR hoitoa 24 tuntia aiheutti upmodulation of AF1q ilmentymisen (kuvio 2C). Tulokset viittasivat siihen, että 4-HPR aiheuttama AF1q säätelyä ei tapahtunut ainoastaan ​​A2780 soluissa, mutta oli tyypillistä syöpäsolujen reagoivat retinoidi.

Western blot analyysi AF1q ilmentymistä OVCA432 ja Skov-3 (A -solut), ja T47D ja SK-N-BE (B-solut), ja OVCAR-3 ja HeLa (C) solut käsiteltiin 24 tunnin ajan 4-HPR osoitetussa annoksilla. Kontrollina lastattavaksi, blotteja inkuboitiin aktiini vasta-aineella.

AF1q säätelyyn ylöspäin A2780 soluissa liittyy sen retinoidi kyky estää solujen kasvua ja aiheuttavat apoptoosia

analyysi yhdistyksen välillä AF1q ilmentymisen ja kasvaimen kasvua estävän ja apoptoottisten vaikutusten laajennettiin muita luonnollisia ja synteettisiä retinoidit, eli RA, ja N- (4-metoksifenyyli) retinamidi (4-MPR) ja 4-okso-N- (4-hydroksifenyyli) retinamidi (4-okso-4-HPR), kaksi 4-HPR metaboliitteja. Olemme aiemmin osoittaneet, että 4-okso-4-HPR on kasvua estävä vaikutus (IC

50 = 0,6 uM, 72 tuntia) ja indusoi apoptoosia A2780 soluissa, kun taas 4-MPR ja RA eivät vaikuta tällaisen kasvun (IC

50 10 uM, 72 tuntia sekä retinoidit) [27] – [29]. Kuten on esitetty kuviossa 3, A2780-soluissa hoidon RA, sekä 4-MPR, ei vaikuttanut AF1q ilmentymistä tai kaspaasi-3-aktivaation, kun taas 4-okso-4-HPR hoito johti kasvuun AF1q ekspression ja kaspaasi-3 katkaisun (kuvio 3). Tiedot osoittivat, että retinoidi-indusoidun AF1q säätelyä liittyi kyky inhiboida solujen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin.

Western blot analysiso varten AF1q ilmaisun ja kaspaasi-3 lohkaisu A2780 soluissa, joita käsiteltiin 24 tunnin ajan 10 uM RA tai 4-MPR, tai 3 uM 4-okso-4-HPR. Kontrollina lastaus, täplää inkuboitiin aktiini vasta-aineella.

AF1q lisääntymisen merkkejä on Toiminnallisesti Mukana indusoiman apoptoosin 4-HPR A2780 soluissa

Tutkia mahdollinen rooli AF1q 4-HPR-välitteisen apoptoosin, suoritimme AF1q hiljentäminen väliaikaisella transfektiosta A2780 solujen plasmidilla antaisi AF1q siRNA tai salattu nonsilencing siRNA käytettiin kontrollina. Transfektio AF1q siRNA pienentää sekä perus- ja 4-HPR aiheuttama AF1q ilmaisun ja selvästi vähentynyt 4-HPR aiheuttama apoptoosin, kuten lohkaisemalla kaspaasi-3 (kuvio 4), jotka osoittavat, että AF1q ollut rooli apoptoosin induktion 4- HPR A2780 soluissa. Samoissa koeolosuhteissa, emme tarkkailla modulaatio proapoptoottiset proteiinin BAD (kuva 4), on aikaisemmin osoitettu säänneltävä AF1q ihmisen levyepiteelikarsinooma karsinoomasolut [24], [25].

Western blot analysiso ja AF1q ilmentymistä, kaspaasi-3-pilkkoutumisen ja BAD ilmentyminen A2780-soluihin väliaikaisesti transfektoitu plasmidilla, joka sisälsi AF1q siRNA tai salattu nonsilencing siRNA lisäyksen jälkeen 5 uM 4-HPR 24 tuntia. Kontrollina lastaus, täplää inkuboitiin aktiini vasta-aineella.

AF1q osallistuu Apoptotic Signaling Cascade indusoima 4-HPR A2780 soluissa

aiemmin raportoitu, että 4 -HPR aiheuttama apoptoosin tapahtuu läpi signalointiryöpyn mukana ROS sukupolvi, ER stressin induktio, JNK aktivointi ja PLAB säätelyä (ROS → ER stressiä → JNK → PLAB) [11], [12]. Meillä on siis arvioida, onko AF1q oli mukana edellä mainitussa apoptoottisen reitin testaamalla vaikutuksia estämällä näiden signaloinnin välituotteita 4-HPR aiheuttama AF1q upmodulation. Tämän tavoitteen, A2780 solut ko-käsiteltiin 4-HPR ja, puolestaan, antioksidantin kanssa C-vitamiinia, ER stressiä estäjä salubrinal, ja farmakologiset JNK-inhibiittori SP600125, jotka on osoitettu estävän ROS: n syntyminen, eIF2α defosforylaatio, ja JNK aktivointi, vastaavasti, ja vähentävän huomattavasti 4-HPR aiheuttama apoptoosin samassa solulinjassa [11]. Lisättiin 100 uM C-vitamiini A2780 soluissa, joita käsiteltiin 5 uM 4-HPR 24 tuntia kumosi 4-HPR aiheuttama säätelyä AF1q (kuvio 5A). Vastaavasti, lisäksi 10 uM salubrinal tai 10 uM SP600125 vähenee voimakkaasti 4-HPR aiheuttama AF1q säätelyä (kuvio 5B ja 5C). Tutkia, onko säätelyä AF1q oli alavirtaan tapahtuma myös PLAB ylösajon aiheuttamien 4-HPR, PLAB on kaatanut käyttäen synteettistä siRNA kohdistaminen PLAB mRNA. Kuten on esitetty kuviossa 5D, hoitoon A2780 solujen PLAB-spesifisten siRNA pystyi voimakkaasti vähentämään 4-HPR aiheuttama PLAB sekä AF1q upmodulation verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu kontrollina siRNA. Toisaalta AF1q hiljentäminen ei vaikuttanut 4-HPR aiheuttama PLAB säätelyä (kuvio 5E). Edellä mainitut tulokset osoittivat, että A2780-soluissa AF1q upregulation on riippuvainen ennen aktivointia 4-HPR-indusoidun ROS liittyvät signalointikaskadin, ja että sen upmodulation tapahtui alavirtaan PLAB induktion (kuvio 6).

Western blot analyysi AF1q ilmentymisen A2780 soluissa, joita käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-HPR, kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia (A), 10 uM salubrinal (B), tai 10 uM SP600125 (C). (D) Western blot analyysi AF1q ilmentymisen A2780-soluissa stabiilisti transfektoitu plasmidilla, joka sisälsi PLAB siRNA tai salattu nonsilencing siRNA lisäyksen jälkeen 5 uM 4-HPR 24 tuntia. Kontrollina lastaus, blotteja inkuboitiin aktiinin vasta-aineella.

4-HPR indusoi apoptoosia signalointiryöpyn johon oksidatiivisen stressin, ER stressin vastaus, JNK aktivointi, yliekspressio proapoptoottiset proteiinin PLAB, ja AF1q säätelyä.

AF1q on merkitystä induktioon Basal apoptoosi munasarjasyöpäsoluja

Tutkiakseen välisen yhteyden AF1q induktio ja apoptoosin alkaminen, analysoimme, suorista yliekspressio AF1q, ilman ulkoisia ärsykkeitä, voi aiheuttaa apoptoosin. Tämän tavoitteen, A2780-soluja transfektoitiin ohimenevästi vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) hännitetty AF1q vektori. Solut, jotka on transfektoitu vektorilla, joka koodaa GFP: tä käytettiin kontrollina. 48 tuntia transfektion jälkeen, ydin- pirstoutuminen ja chromatin tiivistyminen valvottiin vihreitä fluoresoivia soluja värjäämällä soluytimet Hoechst 33342 (kuvio 7A). Kuten kuviossa 7B (vasen paneeli), GFP-AF1q-yli-ilmentävät solut osoittivat merkittävää kasvua apoptoottisten tumien suhteessa kontrolliin transfektoitujen solujen GFP yksin. Samanlainen vaikutus havaittiin, kun analyysi suoritettiin OVCAR-3 soluja, toinen munasarjasyövän solulinja, joka, toisin kuin A2780-soluja, oli resistentti 4-HPR antiproliferatiivinen vaikutus, ja ei konstitutiivisesti ilmaista AF1q. Transfektio GFP-AF1q aiheuttama myös OVCAR-3 kasvua pohjapinta apoptoosin suhteen transfektiolla GFP (kuvio 7B, oikea paneeli). Nämä havainnot ehdottivat rooli AF1q puhkeamisessa apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

(A) Immunofluoresenssianalyysi on A2780-soluja transfektoitiin ohimenevästi GFP yksin (ylempi paneeli) tai GFP-merkityn AF1q vektori (AF1q-GFP ) (alempi paneeli). 48 tunnin jälkeen, GFP: n ja AF1q-GFP solut värjättiin Hoechst 33342 ja ydinvoiman morfologia tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla. Solut kohteisiin on merkitty nuolilla. Solut tiivistetyn ja hajanaista tumat tunnistettu ja pisteytettiin apoptoottisia soluja. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta on esitetty. Mittakaavapalkki edustaa 10 um. (B) Apoptoosi edustettuina prosentteina apoptoottisten solujen 100 vihreitä fluoresoivia soluja (vähintään 200 solua näytettä kohti) A2780 (vasen paneeli) ja OVCAR-3 (oikea paneeli) transfektoitu kuten (A). Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. Tähdet osoittavat merkittävää eroa (P 0,05).

Keskustelu

Viimeaikaiset havainnot että AF1q geeni, vieressä dokumentoidut kasvaimia synnyttävän toiminnon [17] – [23], on merkitystä apoptoosin asetuksessa syöpäsoluissa [24], [25] ja siitä, että se on kuvattu RA-kohdegeenin [14], sai meidät tutkimaan sen mahdollista osallistumista indusoiman apoptoosin synteettinen nonclassic retinoidi 4-HPR. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin AF1q uutena välittäjänä indusoiman apoptoosin 4-HPR ja toimittanut näyttöä rooli proteiinin puhkeamista pohjapinta apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. Osoitimme, että A2780, ihmisen munasarjan masolulinjassa erittäin herkkiä kasvua estävän ja apoptoottista vaikutusta retinoidi [26], [27], 4-HPR aiheuttama apoptoosin seurasi kasvu AF1q proteiinin ilmentymisen. Sen sijaan upmodulation on AF1q ei havaittu, kun A2780 /HPR-soluja, 4-HPR variantin peräisin A2780-soluja [28], käsiteltiin retinoidi. Analyysi AF1q ilmaisun, laajennetaan paneeli ihmisen syövän solulinjoista (munasarja-, rinta-, kohdunkaulan ja neuroblastooma) eri herkkyyksiä kuin 4-HPR antiproliferatiivista vaikutusta [27], vahvisti, että upmodulation proteiinin jälkeen 4-HPR altistus oli yhteinen piirre 4-HPR reagoiva soluissa, mutta ei tapahtunut syöpäsoluissa vastustuskykyisiä retinoidi.

välinen yhteys solun herkkyyttä 4-HPR syöpää ehkäisevistä vaikutuksista ja AF1q säätelyä ehdotti rooli AF1q otaksutuksi välittäjänä 4-HPR aktiivisuutta. Hypoteesi tukivat myös se, että AF1q ilmentyminen ilmentymistä selektiivi- sesti 4-HPR ja sen aktiivisen metaboliitin 4-okso-4-HPR, mutta ei RA tai 4-MPR, joka ei onnistunut indusoimaan solukuoleman A2780-soluissa [ ,,,0],27] – [29]. Puute induktio AF1q ja apoptoosin jälkeen haastava solut RA on sopusoinnussa ongelma, joka 4-HPR biologiset vaikutukset ja mekanismeista sen syövänvastainen toimintaa suuresti eroavat klassisen retinoidien [9] ja ovat sen sijaan enemmän lähellä kuvattuihin epätyypillisten retinoidien [30]. Suora yhteys AF1q säätelyä ja indusoiman apoptoosin 4-HPR osoitettiin AF1q vaiennettu, mikä johti vähenemiseen 4-HPR: n indusoiman apoptoosin, mikä osoittaa, että AF1q on, ainakin osittain, joka vastaa apoptoottisen vaikutusten aiheuttamien retinoidi munasarjojen syöpäsoluja.

Osoitimme aikaisemmin, että 4-HPR pystyi aiheuttamaan apoptoosin munasarjasyöpäsoluja aktivoitumisen kautta ROS → ER-stressi → JNK → PLAB signalointiryöpyn [11], [12 ]. Induktio kuten Cascade oli ominaista vain syöpäsolujen reagoi 4-HPR ja ei aktivoitu 4-HPR-resistenttien solujen [12]. Meillä on siis oletettu, että 4-HPR aiheuttama säätelyä AF1q, joka tapahtui vain soluissa herkkä retinoidien, voi olla välituote, jolla on edellä mainitun apoptoottisen reitin. Sopusoinnussa tämän hypoteesin, huomasimme, että säätelyä AF1q tapahtui alavirtaan ROS: n syntyminen, ER stressin vastaus, JNK aktivointi, ja PLAB säätelyä indusoi 4-HPR. Itse asiassa, estämällä reitin eri tasoilla käyttämällä puolestaan ​​antioksidantti C-vitamiinia, selektiivinen estäjä eIF2α defosforylaation salubrinal, ja JNK-inhibiittori SP600125 (kaikki aiemmin osoittautunut suojata A2780 soluja 4-HPR: n indusoiman apoptoosin [12]) , osoitimme, että 4-HPR aiheuttama AF1q säätelyä voimakkaasti vähentää. Lisäksi hiljentäminen on proapoptoottiset proteiinin PLAB (aiemmin osoitettu vähentävän 4-HPR aiheuttama apoptoosin [11]) aiheutti alentunut kyky retinoidi lisäämiseksi AF1q ilme. Toisaalta, AF1q hiljentäminen ei vaikuttanut kykyyn 4-HPR aiheuttaa PLAB säätelyä Edellä mainitut tulokset osoittivat, että AF1q oli välituotetta ROS liittyvien signalointiryöpyn aktivoidaan 4-HPR apoptoosin indusoimiseksi ja että AF1q upmodulation tapahtui alavirtaan PLAB induktion (kuvio 6). Kuitenkin osuus muiden ROS riippuvia signaaleja 4-HPR aiheuttama AF1q upmodulation ei voida sulkea pois. Ei ole yllättävää, olemme huomanneet, että AF1q on säädelty myös käsittelyn jälkeen 4-okso-4-HPR, 4-HPR polaarinen metaboliitti voi aktivoida edellä mainittujen apoptoottisen kaskadin (ROS sukupolven PLAB induktio) [31].

suostumuksella havaintojemme analyysin yhdestä julkisesti saatavilla microarray kokeilu aineisto 4-HPR-käsitellyn ja käsittelemättömän CD34 + neljästä kroonisen myelooisen leukemian potilailla (GEO liittymistä: GSE17480) osoitti, että retinoidi indusoi kuusi-kertainen AF1q mRNA: n ilmentymisen (P 0,01) (kuva S1). Samoissa soluissa, 4-HPR kykeni indusoimaan apoptoosin – ehdotettu välittyvän induktion oksidatiivisen stressin, mikä vahvistaa suhdetta ROS-välitteisen apoptoosin indusoiman 4-HPR ja AF1q yli-ilmentyminen.

mukaan että apoptoottinen rooli ehdotti havaintojemme AF1q osallistuminen apoptoosin asetuksessa ja lääkeresistenssin on raportoitu toinen tutkimusryhmä [24], [25]. Kirjoittajat osoittivat, että ihmisen levyepiteelikarsinooma karsinoomasoluja, AF1q downregulation liittyi doksorubisiini-resistenttejä solu- fenotyyppi, ja että AF1q upmodulation aiheuttama lisääntynyt doksorubisiinin ja γ säteilyn indusoiman apoptoosin kautta transaktivaation proapoptoottiset proteiinin BAD kautta NF-kB [24], [25]. Sen sijaan, me emme ole noudattanut säätelyä BAD in AF1q-välitteistä apoptoosia indusoitiin 4-HPR A2780-soluissa. Itse asiassa, 4-HPR hoito ei moduloida BAD ilmaisua, eivätkä AF1q hiljentäminen aiheuttavat muutoksia sen proteiinipitoisuuden. Yksi mahdollinen selitys voisi olla, että AF1q saattavat eri tavalla vaikuttaa HUONO sen erilaisissa syöpäsolutyyppien ja /tai vastauksena vain tiettyihin ärsykkeisiin. On kuitenkin mielenkiintoista huomata, että, kuten 4-HPR ja 4-okso-4-HPR [12], [31], doksorubisiini ja γ säteilyn indusoiman apoptoosin on myös raportoitu olevan yhteydessä ROS [32] – [34]. Siksi on houkuttelevaa spekuloida, että AF1q välittämän apoptoosin voi riippua induktioterapialle oksidatiivisen stressin, paitsi 4-HPR ja 4-okso-4-HPR vaan myös muiden kemoterapia-aineiden, vaikka tällä hetkellä ei ole riittävästi näyttöä tukee tällaista hypoteesin.

tärkeä havainto Tutkimuksemme on osoitus roolin AF1q puhkeamista pohjapinta apoptoosin: AF1q upmodulation saadaan ohimenevä transfektiolla munasarjasyöpäsoluja aiheuttanut, ilman ulkoisia ärsykkeitä, joka on kasvaa apoptoottisen nopeuden, mikä osoittaa roolin AF1q aktiivisesti apoptoosin indusoimiseksi näissä soluissa. Kattava käsitys tarkka fysiologisia ja patologisia toimintoja AF1q on ehdottomasti alkutekijöissään. Kuitenkin muutamia tutkimuksia, jotka ovat tutkineet sen roolia paljasti, että se voisi olla osallinen sekä esto ja edistäminen syövän etenemisen [17] – [25]. Sen lisäksi, että todisteita rooli apoptoosin välittäjän, AF1q on määritelty onkogeenisen liittyvä tekijä hematologisia maligniteetteja sekä kiinteitä kasvaimia [17] – [23]. On huomionarvoista todeta, että samalla tavalla kuin raportoitu AF1q, PLAB on myös osoitettu olevan jolla on kaksi käyttötarkoitusta syövän etenemisessä [35]. Itse asiassa tämä transformoivan kasvutekijä-β-superperheen voidaan itse asiassa negatiivisesti tai positiivisesti moduloivat solujen lisääntymisen ja apoptoosin ja se voi myötävaikuttaa syöpään muuttoliikettä, invaasio, ja etäpesäkkeitä. Vaikka mekanismit säätelevät pleiotrooppisten toiminnot PLAB vielä ei ymmärretä hyvin, on ehdotettu, että proteiini voi toimia tuumorisuppressori alkuvaiheessa maligniteetti, kun taas se voi edistää syövän etenemisen pitkälle edennyt syöpä [35] . Kiehtova näkökohta on, että PLAB ja AF1q muita yhteisiä piirteitä: ne ovat molemmat RA-kohde- geenejä ja kykenevät indusoimaan apoptoosin ilman ulkoisia ärsykkeitä [11], [36]. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan määritellä tarkasti toiminnot AF1q ja tutkimaan mahdollisia yhteydestä PLAB ja AF1q esillä tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa suhde näiden kahden proteiinin.

Yhteenvetona tutkimuksessamme laajenee tietämystä toimintamekanismit 4-HPR, että vaikka tutkittu monia vuosia, ei ole vielä täysin selvitetty, [8]. Tunnistaminen uusia tavoitteita retinoidi on tärkeä kysymys, koska se voisi johtaa helpottaa tulevaa suunnittelua lääkeyhdistelmä strategioiden ja voittaa ja kehittymisen estämiseksi lääkeresistenssin. Lisäksi tarjoamme uutta tietoa aktiivisuudesta AF1q, syövän kaltainen proteiini, jonka biologiset toiminnot ovat suurelta osin tuntemattomia. Erityisesti, me raportoimme, että AF1q on mukana 4-HPR apoptoottisten ja kasvua estäviä vaikutuksia, ja että sen säätelyä riippuu aktivointi ROS liittyvien signalointikaskadissa aiheuttama retinoidi, siten löytää uusi suhde oksidatiivisen stressin ja AF1q. Lopuksi, me osoitamme ensimmäistä kertaa rooli AF1q induktioon pohjapinta apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, vaikka lisätutkimuksia, jotta voidaan määrittää molekyyli- mekanismeista AF1q-välitteistä apoptoosia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines ja reagenssit

munasarjojen kasvainsolulinjoja A2780 (saatu Dr. Ozols, Bethesda, MD, USA) [31], OVCA432 (saatu Dr. Knapp, Boston, MA, USA ) [12], OVCAR-3 [12], SKOV-3 [12], ja neuroblastoomasolulinjasta SK-N-BE (kaikki kolme hankittiin ATCC, Manassas, VA, USA) [31] pidettiin RPMI 1640 (Lonza, Basel, Sveitsi), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. A2780 /HPR (eli A2780, jotka oli tehty resistenttejä 4-HPR kuten aiemmin on kuvattu [28]), soluja pidettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia, jota oli täydennetty 5 uM 4-HPR. Rintojen kasvain T47D (saatu Dr. R. Sutherland, Sydney, New South Wales, Australia) [31] pidettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia ja 0,25 U /ml insuliinia. Kohdunkaulan karsinooma solulinja HeLa, ostettu ATCC: ltä [31], säilytettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-alustassa (Gibco BRL, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO2: ta. 4-HPR, 4-MPR (molemmat toimitti ystävällisesti Dr. J. Crowell, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA), RA (Sigma, St Louis, MO, USA), ja 4-okso-4- HPR (syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [29]), liuotettiin 10 mM DMSO: ssa, ennen laimentamista kasvatusväliaineeseen ja säilytettiin -80 ° C: ssa pimeässä. C-vitamiinia (Sigma) ja JNK-inhibiittori SP600125 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) lisättiin soluihin 60 minuuttia ja 15 minuuttia ennen kuin 4-HPR, vastaavasti. ER stressin vasteen estäjä salubrinal (Calbiochem) lisättiin yhdessä 4-HPR.

immunoblot-analyysi

Proteiinit uutettiin hajottamalla solut natriumdodekyylisulfaattia (SDS) näytepuskuria (62,5 mM Tris- HCl: a [pH 6,8], 2% SDS), joka sisälsi 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml pepstatiinia, 12,5 ug /ml leupeptiiniä, 2 ug /ml aprotiniinia, 1 mM natriumortovanadaattia ja 1 mM natriummolybdaatti. Solu-uutteet käsitellä läntisen immunoblottauksella aikaisemmin kuvatulla [37]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Immunoblottausta ostettiin ilmoitetusta toimittajilta: AF1q alkaen Abnova (Taipei City, Taiwan, # H00010962-M01); pilkottu Kaspaasi-3 (Asp175) Cell Signaling Biotechnology (Beverly, MA, USA, # 9661); BAD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA, # 610391); PLAB R ja aktiini Sigmalta (# A2066).

Immunofluoresenssianalyysi

Solut, kasvanut ja transfektoitiin lasipeitinlevyn diat 24 mm petrimaljoille, fiksoitiin 4% paraformaldehydi huoneenlämmössä 10 minuuttia , pestiin PBS: llä ja sitten värjättiin Hoechst 33342 (Sigma) 2 ug /ml PBS: ssä 2 minuuttia. Objektilasit asennettu 0,1% (v /v) Mowiol (Calbiochem) ja katsella fluoresenssimikroskoopilla [kuvat tallennettiin Piste Insight digitaalikamera (Delta Sistemi) varustettu järjestelmä kuva-analyysi (IAS 2000 Delta Sistemi)] . Apoptoottisia soluja tunnistettiin analysoimalla ydin- morfologia. Green loisteputki soluja tiivistettyä ja hajanaista tumat tunnistettu ja pisteytettiin apoptoottisten solujen (vähintään 200 solua näytettä kohti).

rakentaminen GFP-leimatun AF1q Expression Vector

AF1q oli ohimenevästi ilmaistiin fuusioproteiini GFP-fuusioitu sen C-terminaaliin. AF1q koodaavan cDNA alueen riistää lopetuskodonista saatiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) plasmidista, joka sisälsi cDNA: n, joka koodaa ihmisen AF1q saatu Integrated Molecular Analysis of Genomes ja niiden Expression (IMAGE) Consortium (Livermore, CA, USA ) (cDNA-klooni KUVA: 305990). Käytimme eteenpäin oligonukleotidialuketta 5′-ACTCGAGCCACCATGAGGGACCCTGTGAG-3 ’[joka sisältää Xhol-restriktiokohdan ja Kozak-sekvenssi (CCACC)], ja käänteinen oligonukleotidialuketta 5′-ATCCGGATCCAGCAAGTCCAGTTCG -3’ (joka sisältää BamHI-restriktiokohdan). Monistusreaktio aloitettiin inkuboimalla näytettä 94 ° C: ssa 2 minuuttia, jota seurasi 15 sykliä, jotka koostuivat inkubaatio 94 ° C: ssa 30 s, 45 ° C: ssa 60 s ja 68 ° C: ssa 90 s ja 20