Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin keuhkosyövän, joka sisältää noin 75-80% kaikista keuhkosyövässä. Gemsitabiini on hyväksytty kemoterapiaa huumeiden NSCLC. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusi strategia parantaa terapeuttista tehoa Gemsitabiini varten NSCLC että samanaikaisesti iRGD peptidi. Osoitimme, että hinnat positiivisten ilmentymisen avp3, a vp 5 ja NRP-1 A549 solulinjassa oli 68,5%, 35,3% ja 94,5%, tässä järjestyksessä. Määrä Evans Blue kertynyt kasvaimen Evans Blue + iRGD ryhmässä oli 2,5 kertaa suurempi kuin Evans Blue ryhmän. Määrien kasvu esto kasvaimia iRGD ryhmä, gemsitabiini ryhmä ja gemsitabiini + iRGD ryhmässä oli 8%, 59,8% ja 86,9%, tässä järjestyksessä. Tulokset mekanismi tutkimukset osoittivat, että PCNA ilmentymistä gemsitabiini + iRGD ryhmässä laski 71,5% verrattuna, että gemsitabiini ryhmässä. Määrä apoptoosin gemsitabiini + iRGD ryhmässä oli 2,2 kertaa kuin Gemsitabiini ryhmään. Näin ollen, kasvain-tunkeutuva Peptide iRGD voi parantaa kasvaimeen tunkeutuvat kyky ja terapeuttista tehoa Gemsitabiinin A549 ksenograftin. Yhdistetty soveltaminen Gemsitabiini kanssa iRGD voi olla uusi strategia parantaa kliinistä terapeuttista tehoa Gemsitabiini potilailla, joilla on NSCLC.

Citation: Zhang Q, Zhang Y, Li K, Wang H, Li H, Zheng J (2015) romaani strategia parantaa terapeuttista tehoa Gemsitabiini Non-pienisoluinen keuhkosyöpä kasvain-Penetrating Peptide iRGD. PLoS ONE 10 (6): e0129865. doi: 10,1371 /journal.pone.0129865

Academic Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ”, ITALIA

vastaanotettu: 25 lokakuu 2014; Hyväksytty: 13 toukokuu 2015; Julkaistu: 12 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (BK2012146, https://www.jstd.gov.cn/), National Natural Science Foundation of China (81301946, https://www.nsfc.gov.cn/), Jiangsu lääninhallitus Education Foundation (JHB2012-34, https://www.ec.js.edu.cn/), Kiina Postdoctoral Science Foundation rahoittaman hankkeen (2013M540467, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), ja Xuzhou Medical College Foundation (2012KJZ23, https://www.xzmc.edu.cn/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien kaikkialla maailmassa ja edelleen osoittavat lisääntyvää esiintyvyys [1, 2]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin keuhkosyövän, joka sisältää noin 75-80% kaikista keuhkosyövässä [3]. Diagnoosi usein tehty potilailla myöhäisvaiheen sairaus, ja lähes kaksi kolmasosaa kaikista tapauksista, syöpä on jo levinnyt yli lokalisoitu alueella aikaan diagnoosi [4-6]. Tämä rajoittaa vaihtoehtoja hoidon ja johtaa huonoon ennusteeseen kanssa mediaanielossaolosta alle 12 kuukautta [7, 8]. Useimmat potilaat NSCLC läsnä leikkaushoitoon sairaus, ja siksi nykyinen hoitovaihtoehtoja kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat lievittävä parhaimmillaan [7, 9]. Monet perinteiset sytotoksiset lääkkeet, kuten vindesiini, karboplatiini, etoposidi, ifosfamidi, syklofosfamidi ja mitomysiini, on käytetty monoterapiana tapauksissa NSCLC. Viimeisten vuosien aikana, joitakin uusia kemoterapeuttiset aineet kuten vinorelbiini, paklitakseli, Doketakseli ja gemsitabiini on sovellettu hoitoon NSCLC. Nämä kemoterapeuttisten aineiden ainoastaan ​​tarjota pieniä parannuksia kokonaiselossaoloaikaa [10].

Gemsitabiini on deoksisytidiinideaminaasia analoginen joka muuntuu in vivo aktiivisia metaboliitteja kuten difluorodeoxycytidine di- ja trifosfaatiksi [11]. Trifosfaatti analoginen Gemsitabiini korvaa yhden nukleiinihapon rakennuspalikoita (tässä tapauksessa, sytidiinin) aikana DNA: n replikaatiota. Tämä prosessi pidätykset kasvaimen kasvua ja johtaa lopulta apoptoosiin. Toinen tavoite Gemsitabiini on ribonukleotidireduktaasia. Difosfaatiksi analoginen sitoutuu aktiiviseen kohtaan ribonukleotidireduktaasin ja peruuttamattomasti inaktivoi entsyymin. Kun entsyymi estyy, DNA: n replikaatio ja korjaus lopetetaan, ja apoptoosin indusoi [11-13]. Gemsitabiini on hyväksynyt Food and Drug Administration (FDA) hoitona kehittynyt ja metastasoituneen NSCLC, haimasyövän, virtsarakon syöpä, munasarjasyöpä ja rintasyöpä yksin tai yhdessä muiden lääkkeiden kanssa [14].

kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että gemsitabiini voisi pidentää elinaikaa ja parantaa elämänlaatua potilailla, joilla on pitkälle edennyt NSCLC [14, 15]. Jotkut tutkimukset ovat raportoineet, että Gemsitabiini johdonmukaisesti tuottaa hoitovaste, jotka ylittävät 20%, kun sitä käytetään ainoana lääkkeenä [14, 16, 17]. Kuitenkin gemsitabiini usein ei saavuta riittävää tautien torjunnan takia riittämätön sytotoksisuuden kasvainsoluihin ja sietämättömiä sivuvaikutuksia. Keskimääräinen elinaika pitenee vain 2-4 kuukautta, ja useimmat potilaat kuolevat sairauden etenemisen [7, 9]. Siksi yksinkertainen kasvu annosta ei voi parantaa kuntoa potilaista; päinvastoin, se voi johtaa vakavia haittavaikutuksia.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ylitys verisuonen seinämän ja tunkeutumista kasvaimeen parenchyma vasten kohonnut interstitiaalinen paine kasvaimissa edelleen suuren haasteen terapeuttiseen tehokkuus useimmissa kliinisissä huumeiden [18]. Jotkut syöpälääkkeet voi vain tunkeutua etäisyydellä 3-5 solun halkaisijan päässä verisuonten kiinteitä kasvaimia [19]. Esimerkiksi pitoisuus doksorubisiinin pienenee eksponentiaalisesti, kun etäisyys kasvaimen verisuonten kasvaa, ja se saavuttaa puolet sen verisuonia pitoisuus pituus on noin 40 pm [20]. Jakelu trastutsumabi (Herceptin) sisäalueelle rintojen ksenograftien on hyvin heterogeeninen, mikä johtaa puute altistumisen monia kasvainsolujen havaittavia määriä lääkeaineen [21]. Näin ollen, lisääntynyt kasvaimen läpäisevyys voi olla hyödyllinen tapa parantaa terapeuttista tehoa kemoterapiaa huumeita.

iRGD on kasvain-tunkeutuva peptidi (CRGDK /RGPD /EY), jolla on tietty läpäisevyys kasvainkudoksissa ja kasvaimen verisuoniston [22]. RGD-tripeptidi iRGD voi sitoa integriinien avp3 ja a vp 5, ilmaukset, jotka rajoittuvat suuresti kasvaimet (mukaan lukien kasvaimen verisuonistossa ja solut) [22, 23]. Kun iRGD sitoutuu integriinien välisen peptidisidoksen aminohappojen K ja G pilkotaan proteolyyttisesti solun pinnalla liittyvä proteaasit; Sitten arvoituksellinen C-end Rule (CendR) motiivi (CRGDK /R) on alttiina. CendR motiivi sitoutuu sitten neuropiliini-1 (NRP-1). Aktivointi NRP-1 lisää läpäisevyyttä verisuonten ja tuumorikudokset, jonka avulla lääkkeet tunkeutua sisäiseen kudokseen kasvaimen paljon helpommin [22-24]. On todettu, että iRGD on arvokas potentiaali kohdistaminen koettimena molekyylikuvantamisen kasvainten ja lääkeaineen, ja voi parantaa tehoa lääkkeiden jopa 3-kertainen [24].

Tässä tutkimuksessa, yhdistimme Gemsitabiini kanssa iRGD hoitoon karvattomia hiiriä ksenografteissa ihmisen NSCLC perustettu A549 solulinjan. Tuloksemme osoittivat, että iRGD voisi tehokkaasti edistää Gemsitabiini estävän kasvainsolujen proliferaatiota ja indusoi tuumorisolun apoptoosia. In vivo terapeuttinen teho oli myös merkittävästi parannettu. Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoito iRGD voi olla lupaava tapa parantaa kliinistä tehoa Gemsitabiini hoitoon NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen NSCLC-solulinjaa A549 hankittiin Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), ja viljeltiin F-12K (Gibco, Grand Island, NY, USA) 10%: lla seerumia (Gibco, Grand Island, NY, USA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Virtaussytometria

yhteensä 1 x 10

6 A549-soluja inkuboitiin fluoresoivien-leimattujen vasta-aineiden laimennettu 100 ul: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestiin, suspendoitiin ja arvioitiin FACS-koneella (FACSCanto II, Becton-Dickinson, USA). Yhdistetyn isotyyppikontrollivasta-vasta-ainetta käytettiin kaikissa analyyseissä. Lopuksi kaikki tiedot analysoitiin FlowJo ohjelmisto (Puu Star, USA). FITC-konjugoitua hiiren anti-ihmisen integriini a vp 3-vasta-aineen ja integriini-a vp 5-vasta-aineet hankittiin Chemicon (CA, USA). Sovitetun isotyyppikontrollivasta-vasta-aine, FITC-konjugoitua hiiren IgG1κ, hankittiin eBioscience (San Diego, CA, USA). PE-konjugoitua hiiren anti-ihmisen NRP-1-vasta-aineen ja sen isotyyppikontrolli ostettiin MACS Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Nordrhein-Westfalen, Saksa).

Hiiret ja in vivo kokeissa

vivo kokeissa mukana 6 viikkoa vanhat naaraspuoliset BALB /C nude-hiirten (Vital River Laboratory animal Technology Co, Ltd, Peking, Kiina), joka pidettiin erityisen patogeenittomassa eläin laitoksen Experimental animal Center, Xuzhou Medical College (Kiina ). Eläimiä pidettiin kanssa 12 tunnin valo /pimeä sykli, lämpötilan (22 +/- 1 ° C) ja kosteus (55 +/- 5%) valvottuun tilaan. Kaikki hiiret saivat vapaa pääsy steriiliä vettä ja ruokaa. Kaikki häkeissä sijoitettu jopa 6 eläimiin ja sisälsi lastuja ja riippumaton paineilmajärjestelmällä. Kaikki eläin koemenettelyn hyväksyttiin ja tarkistaa Institutional Animal Care ja käyttö komitean Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine (SCXK 2012-0005). Aikana in vivo kokeissa eläimiä kaikissa koeryhmään tutkittiin päivittäin liikuntaa. Lopussa kokeen, hiiret tapettiin katkaisemalla kaula.

kasvain malli

Ihmisen NSCLC kautta luotiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, 1 x 10

7 A549-soluja injektoitiin vasempaan eturaajalla kainaloiden 6 BALB /c-nude-hiirissä. Kun kasvaimet kasvoivat noin 150 mm

3, kasvaimet kerättiin ja segmentoidaan kudosblokeista (4-6 mm

3 kooltaan). Sitten vasen eturaaja kainaloiden BALB /c-nude-hiiriin istutettiin s.c. kudoksen lohkojen avulla troakaarin. Hiiriä käsiteltiin, kun tuumorit kasvoivat haluttuun kokoon.

immunofluoresenssi

Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 200 mm

3, hiiret tapettiin, ja kasvaimet leikeltiin ja leikattiin kryostaatissa. Osat neljästä ryhmästä (n = 3), inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, jolla on sama anti-ihmis-a vP3, a vp 5 ja niiden isotyypin kontrollivasta-aineita, kuten ne, joita käytetään virtaussytometrianalyysin. Osat kahden ryhmän värjättiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen kanin anti-ihmis-NRP-1-vasta-aine (Abcam, Beverly, MA, USA) ja sen isotyypin kontrollivasta-aine (Abcam, Beverly, MA, USA). Sitten leikkeet värjättiin DyLight 549-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG (H + L), sekundaarista vasta-ainetta (EarthOx, San Francisco, CA, USA) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Kaikki Sitten leikkeitä havaittiin ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla (DS-Ri1, Nikon, Japani).

Kasvain läpäisevyyden määritys

Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 150 mm

3, yhteensä 50 mg /kg Evans Blue, 4 mg /kg iRGD, 50 mg /kg Evans Blue + 4 mg /kg iRGD 200 ul: aan PBS: ää, kuten ajoneuvon, tai 200 ui PBS: ää yksinään injektoitiin neljään ryhmään kasvaimen kantavien hiirten (n = 3). Kolmekymmentä minuuttia myöhemmin hiiret nukutettiin kloraalihydraatilla ja perfusoitiin sydämen kautta PBS: llä, 1% BSA: ta. Sitten elimet ja kasvaimen kudokset kerättiin. Evans Blue kvantifiointiin, 10 ui N, N-dimetyyliformamidia, lisättiin jokaista 10 mg kudosta. Homogenisoinnin jälkeen, seoksia inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, seokset sentrifugoitiin, ja supernatantit kerättiin. Lopuksi, kvantitointi suoritettiin mittaamalla absorbanssi 600 nm: ssä spektrofotometrillä (BioTek Epoch, USA).

In vivo -tehokkuus tutkimuksissa

Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 100 mm

3 jälkeen 10 päivää, hiiret jaettiin neljään ryhmään (n = 6). Kaikkiaan 100 mg /kg gemsitabiini (Merck, Darmstadt, Saksa), 4 mg /kg iRGD, 100 mg /kg gemsitabiini + 4 mg /kg iRGD 200 ul: aan PBS: ää, kuten ajoneuvon, tai 200 ui PBS: ää yksinään injektoitiin hiirillä neljästä ryhmästä häntälaskimoon. Injektiot suoritettiin kahdesti viikossa yhteensä 8 kertaa. Tilavuus kasvainten mitattiin kahdessa kohtisuorassa suunnassa, jolla on paksuus, ja paino nude-hiirten laskettiin kolmen päivän välein. Tilavuus mitattiin käyttäen seuraavaa kaavaa: V = 0,5 x (W

2 x L), jossa V = kasvaimen tilavuus, W = pienempi kohtisuorassa halkaisija ja L = suurempi kohtisuorassa halkaisija. Päivänä 30 hiiret tapettiin, tuumorit kerättiin ja punnittiin. Kasvaimen kasvun estymisen suhteen (TGIR) laskettiin käyttäen kaavaa TGIR = (W – W

t) /W x 100%, jossa W on kasvaimen keskimääräinen paino kontrolliryhmässä ja W

t on keskimääräinen kasvaimen paino hoitoryhmässä. Kaikki kasvaimet leikattiin kahteen osaan vastaavasti, ja ne käsiteltiin kuten seuraavasta kuvauksesta.

immunohistokemiallinen värjäys

Yksi puoli kunkin kasvaimen korjattu lopussa hoidossa tutkimuksen kiinnitettiin 10% neutraalin puskuroituun formaliiniin, valettiin sitten parafiiniin ja leikataan 3-5μm osiin [26]. Kokeet suoritettiin streptavidiini-peroksidaasia järjestelmä (SP) mukaan valmistajan protokollan (ZSGB-BIO, Peking, Kiina). Lisääntyvät solun tuma-antigeenin (PCNA) havaittiin anti-PCNA-vasta (Abcam, Beverly, MA, USA). Kuvaus suoritettiin fluoresenssimikroskopialla (DS-Ri1, Nikon, Japani). Voit selvittää IOD indeksi PCNA viisi edustava visuaalinen alueet, jotka olivat positiivisia PCNA tutkittiin kustakin kasvain. PCNA-indeksi kullekin valitulle alueelle analysoitiin käyttämällä IPP ohjelmistoa.

TUNEL-määrityksessä

parafiinileikkeet valmistettiin kuten edellä on kuvattu. Apoptoottisten solujen havaittiin käyttäen TdT-välitteisen dUTP nick end merkintöjä (TUNEL) mukainen kitti valmistajan protokollan (Roche, Mannheim, Saksa). Lukumäärä TUNEL-positiivisten solujen laskettiin viidellä satunnaisesti valituilla aloilla kustakin kasvain, ja apoptoottisen indeksin kunkin kentän laskettiin prosenttiosuutena Tunel-positiivisten solujen suhteessa 100 satunnaisesti valittua solua.

Western blot analyysi

Toinen puoli kunkin kasvain oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä. Sitten koko proteiini uutettiin. PCNA havaittiin normaali Western-blottauksella, joilla on sama anti-PCNA-vasta-ainetta, kuten se, jota käytettiin immunohistokemian kokeessa. IRDye 800CW vuohen anti-kani-IgG (H + L) -vasta-ainetta (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. β-aktiini havaittiin myös sisäisenä kontrollina. Kuvat saatiin Odyssey (LI-COR, USA) ja intensiteetti kvantitatiivinen Western blot nauhat suoritettiin ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health, USA).

Tilastollinen

SPSS versio 16.0 for Windows käytettiin kaikkiin analyyseihin. Quantitative tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD); vertailu kahden ryhmän välillä suoritettiin riippumaton otoksen t-testi, kun taas useita näytteitä verrattiin yksisuuntainen ANOVA, jossa α = 0,05 taso testin. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkitsevä P 0.05.

Tulokset

Expression of NRP-1, ανβ3 ja ανβ5 ihmisen NSCLC-solulinjaa A549

ilmentyminen integriinien rajoittuu pitkälti kasvaimet (mukaan lukien kasvaimen verisuonistossa ja soluja), ja muut sivustot angiogeneesin tai kudosten korjaamiseen [22, 27]. Neuropiliini-1 yli-ilmentyy myös monissa kasvaimissa [22, 28]. Kasvain-läpäisevä kyky iRGD riippuu pääasiassa molekyylien ανβ3, ανβ5 ja NRP-1 yli-ilmentyy syöpäsoluissa [18]. Jotta vahvistaa näiden molekyylien ilmentyminen ihmisen NSCLC A549, teimme virtaussytometrianalyysin. Kuten kuviossa 1A, positiivinen ilmaisu hinnat avp3, a vp 5 ja NRP-1 olivat 68,5%, 35,3% ja 94,5%, tässä järjestyksessä. Tämä tulos osoitti, että A549-solulinja voidaan luoda ihmisen NSCLC malli tutkia vaikutuksia samanaikaisesti iRGD.

(A) Expression analyysi avp3, a vp 5 ja NRP-1 A549-soluissa virtaussytometrialla. (B) Expression analyysin avp3, a vp 5 ja NRP-1 A549 ksenografteissa mukaan immunofluoresenssivärjäyksen. EG, koeryhmä; CG, kontrolliryhmä. Sekä avP3 ja a vp 5 värjätään vihreä. NRP-1 värjätään punaista. Ytimet värjäytynyt sinisiksi. Suurennos, × 400; Mittaviivat = 50 pm.

Vahvista ilmentymisen ανβ3, ανβ5 ja NRP-1 kasvainkudoksessa, kehitimme BALB /c-nude-hiiri ksenograftimallissa ihmisen NSCLC A549. Ilmaisu on avp3, a vp 5, ja NRP-1 edelleen havaitaan immunofluoresenssivärjäyksen. Kuten kuviossa 1B, a vp3 (vasemmalla), a vp 5 (keskellä) ja NRP-1 (oikea) on yli-ilmentyy Ksenograftikudoksista.

Kasvain-levinneisyys Evans Blue annetaan yhdessä iRGD

vahvista in vivo vaikutusta kasvaimeen tunkeutuvat peptidi iRGD, Evans Blue väriainetta käytettiin mallina lääkkeen onko iRGD voi edistää imeytymistä lääkkeen kasvaimeen [18]. Evans Blue on albumiini sitova väriaine, joka voi tunkeutua elinten kautta veri ja värjätä elimet sininen. Kontrolleihin verrattuna, kasvaimia Evans Blue + iRGD ryhmä oli värjätty syvempi sininen, mikä oli nähtävissä paljaalla silmällä. Kuitenkin, sininen väri normaalin elimissä, kuten sydän, maksa, perna, keuhkot ja munuainen, ei ollut ilmeistä (kuvio 2A ja 2B). Edelleen vahvistaa, että vaikutus iRGD nimenomaan edistämään ottoa Evans Blue väriaine osaksi kasvainkudoksen, Evans Blue kasvaimissa ja elinten uutettiin ja kvantitatiivisesti spektrofotometrisesti. Tulokset osoittivat, että yleensä määrä Evans Blue Evansin sininen ryhmä ja Evans Blue + iRGD ryhmässä oli suurempi kuin PBS tai iRGD ryhmä (kuvio 2C). Määrä Evans Blue on kasvainten Evans Blue + iRGD ryhmässä oli 1,5 kertaa suurempi kuin, että Evans Blue ryhmään (kuvio 2C). Mitä tulee muihin elimiin, mitään ilmeistä eroa ei havaittu Evansin sininen ryhmä ja Evans Blue + iRGD ryhmä (kuvio 2C). Nämä tiedot osoittivat, että iRGD on mahdollista nimenomaan edistämään ottoa huumeiden ja anna niiden tunkeutua kasvaimeen.

(EN) edustavat kuvat Evans Blue kertymisen normaalia elimiin ja kasvainten hiirillä, jotka saivat erilaisia ​​hoitoja. Sininen intensiteetti osoittaa maahan kerääntynyttä Evans Blue. (B) Kuvia kasvain (A). (C) kvantifiointi Evans Blue uutetaan kasvaimia ja elinten (A) OD 600 mittausta. n = 3; Virhepalkkien, keskiarvo ± SEM; ***

p

0,001.

terapeuttinen teho Gemsitabiini annetaan yhdessä iRGD

määrittää sopivan pitoisuuden Gemsitabiini in vivo kokeissa neljä annosta Gemsitabiini (80 mg /kg, 100 mg /kg, 120 mg /kg ja 140 mg /kg) käytettiin hoitamaan neljään ryhmään hiiriä kahdesti yhden viikon, kahden viikon vastaavasti. Kaksi viikkoa myöhemmin hiiret 80 mg /kg ja 100 mg /kg ryhmille vaikuttivat normaaleilta. Kuitenkin kävi ilmi, että hiiret 120 mg /kg ryhmässä puuttui energiaa ja kokenut ruokahaluttomuus. Lisäksi hiiret 140 mg /kg ryhmässä oli ripuli. Voit vähentää sivuvaikutuksia, päätimme annoksella 100 mg /kg in vivo kokeissa.

onko terapeuttinen teho Gemsitabiinin paranee, kun sitä annetaan yhdessä iRGD, gemsitabiini ja iRGD oli samanaikaisesti hoitoon hiiret A549 ksenograftien, kuten on kuvattu menetelmät-osassa. Kuten kuviossa 3A kasvaimia Gemsitabiini + iRGD ryhmä kasvoi hitaammin kuin sen Gemsitabiini ryhmä, ja tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä. Tämä havainto on vahvistanut myös analyysi kasvaimen paino (kuvio 3B). Kasvuvauhti estämällä kasvainten analysoitiin edelleen. IRGD ryhmä, gemsitabiini ryhmä, ja gemsitabiini + iRGD ryhmä osoitti kasvaimen kasvun estäminen 8%, 59,8% ja 86,9%, tässä järjestyksessä. Nämä tulokset osoittivat, että iRGD voisi parantaa terapeuttista tehoa Gemsitabiini ihmisen NSCLC ksenografteja kun ne samanaikaisesti. Kehon paino shift analyysi kokeellisen hiirillä osoittivat, että kehon paino hiirten sekä Gemsitabiini ryhmä ja gemsitabiini + iRGD ryhmä laski noin 5% lopussa kokeen. Ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa näiden kahden ryhmän (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat, että iRGD ei ilmeisesti pahentaa sivuvaikutuksia Gemsitabiini.

(A) Kasvaimen tilavuus käyrä hoidon aikana. Nuolet osoittavat ajankohtana injektion. Päivä, jolloin hoito alkoi kirjattiin päivä 0. Kasvaimen tilavuus mitattiin joka kolmas päivä, kunnes päivä 30. (B) Keskimääräinen kasvaimen paino kunkin ryhmän lopussa hoidon. (C) Kehon paino siirtyminen käyrä hiirten kokeen aikana. n = 6. Virheviivat, keskiarvo ± SD; ns, ei merkittävää; ***

p

0,001.

inhibitio soluproliferaatiota käsittelyn jälkeen samanaikaisesti gemsitabiini ja iRGD

Gemsitabiini kohdistaa terapeuttista vaikutusta syöpää kautta inhibitio DNA-synteesin syöpäsoluissa ja keskeytyminen niiden etenemistä G1: stä S-vaiheeseen [3, 29, 30]. PCNA, 36-kDa: n proteiini, ilmentyy pääasiassa aikana S-vaiheen ja varhaisen G2 vaiheen solusyklin jakautuviin soluihin [31]. Näin ollen, PCNA voidaan käyttää markkerina soluproliferaation. Edelleen vahvistaa toimintaa iRGD voidaan vahvistaa kasvaimen vastainen vaikutus Gemsitabiini, ilmentymisen taso PCNA kasvaimissa on havaittu immunohistokemiallisella värjäyksellä. Kuten on esitetty kuviossa 4A, ilmentymisen taso PCNA väheni merkittävästi hiirillä, joita oli käsitelty Gemsitabiini (tai ilman iRGD) verrattuna ilmentymistasoon hiirillä, jotka saivat PBS: ää tai iRGD; ilmentymisen taso PCNA oli alempi hiirissä, jotka oli käsitelty gemsitabiini + iRGD verrattuna hiiriin, jotka hoidettiin gemsitabiini yksin. Sillä kvantitatiivinen analyysi Kuvion 4A, ilmentymistason PCNA että gemsitabiini + iRGD ryhmä pieneni noin 71,5% verrattuna, että gemsitabiini ryhmässä, ja tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4B). Lisäksi tuumorikudoksessa Gemsitabiini + iRGD ryhmä osoitti rakenteellisia poikkeavuuksia syövän pesiin ja morfologisia muutoksia useimmissa ytimeksi. Morfologiset muutokset ytimet kuvataan yksityiskohtaisesti myöhemmin käsikirjoituksen.

(A) immunohistokemiallinen värjäys analyysi. PCNA-positiivisten solujen osat värjätään ruskea. Ytimet värjäytynyt sinisiksi. Edustavia luvut kustakin ryhmästä näkyvät; n = 6; Suurennos, × 400; Mittaviivat = 50 pm. (B) Vastaava kvantitatiivisen analyysin tulokset PCNA on esitetty (A). Viisi kenttää kustakin kasvainkudoksen kohta valittiin satunnaisesti laskettaessa IOD arvoa positiivisen alueen kautta IPP-ohjelmisto, joka osoitti määrä antigeenin ilmentymisen. (C) Western blot-analyysi. Yhteensä proteiinia kasvainkudoksessa uutettiin. PCNA havaittiin β-aktiini sisäisenä kontrollina. n = 3. (D) kvantitatiivinen analyysi tulosten PCNA esitetään (D). Intensiteetti kunkin liuskan analysoitiin ImageJ ohjelmisto. Keskimääräinen voimakkuudet PCNA standardoitu ß-aktiini. Virhepalkkien, keskiarvo ± SD; ns, ei merkittävää; ***

p

0,001.

edelleen varmistamiseksi ilmentymistason PCNA, poimimamme peräisin olevan proteiinin kokonaismäärän kasvainkudoksessa kussakin ryhmässä. Tasot PCNA havaittiin Western-blottauksella kanssa β-aktiini sisäisenä kontrollina. Kukin liuska skannattiin, ja kvantitatiivinen analyysi suoritettiin ImageJ ohjelmisto. Ilmaisu taso PCNA tuumorikudokseen hiirten että gemsitabiini + iRGD ryhmä väheni merkittävästi verrattiin hiiristä Gemsitabiini ryhmässä (kuvio 4C ja 4D).

Yhdessä nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että terapeuttinen tehokkuus Gemsitabiini on parantunut, kun sitä annetaan yhdessä kasvaimeen tunkeutuvat peptidi iRGD.

induktio apoptoosin samanaikaisesti gemsitabiini ja iRGD

on osoitettu, että Gemsitabiini voi estää DNA: n replikaatio ja korjaus, joka lopulta johtaa solun apoptoosin [3]. Vahvista parempi terapeuttinen teho samanaikaisesti gemsitabiini ja iRGD, apoptoottisten solujen käsitellyissä ksenografteissa todettiin käyttäen TUNEL määritystä. Kuten on esitetty kuviossa 5A, enemmän apoptoottisia soluja näkyi kasvainten gemsitabiini + iRGD ryhmässä kuin kasvainten gemsitabiini ryhmästä. Apoptoottista indeksiä määriteltiin prosentteina TUNEL-positiivisia soluja verrattuna solujen kokonaismäärässä. Mukaan tilastollinen analyysi kuvassa 5B, määrä apoptoosin Gemsitabiini + iRGD ryhmässä oli 2,2 kertaa kuin Gemsitabiini ryhmään. Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että iRGD tehostettu terapeuttista tehokkuutta Gemsitabiinin NSCLC ksenografteissa.

(A) apoptoottisten solujen kasvaimen kudokset havaitaan TUNEL määrityksessä. TUNEL-positiivisia ytimien värjätään ruskea, ja TUNEL-negatiiviset ytimet värjäytynyt sinisiksi. Esitetyt luvut edustavat kuusi kasvaimia kussakin ryhmässä. Nuolet osoittavat apoptoottisten kappaleiden. Suurennos, × 400; Mittaviivat = 50 pm. (B) kvantitatiivinen analyysi apoptoosin indeksin kussakin ryhmässä. Prosenttiosuus TUNEL-positiivisten solujen laskettiin 100 satunnaisesti valittua kasvainsolujen osiota kohti. Viisi osat laskettiin per kasvain. n = 6; Virhepalkkien, keskiarvo ± SD; ***

p

0,001.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida uudelleen käyttöön iRGD peptidin osoittanut parannettu keskittymisen ja terapeuttista tehoa huumeiden NSCLC ksenograftissa perustettu A549 linja, joka osoitti korkean ilmentymisen avp3, a vp 5 ja NRP-1. Tuloksemme osoittivat, että iRGD pystyi merkittävästi lisätä kasvaimen levinneisyys Evans Blue sekä terapeuttista tehoa Gemsitabiini ihmisen NSCLC ksenograftin. Mitä pidemmälle arviointi osoitti, että lisääntymistä ja apoptoosia kasvainsolujen iRGD + gemsitabiini ryhmässä oli enemmän esti merkittävästi kuin että kontrolliryhmissä.

Vuonna 2009 Teesalu etal. Ensimmäinen raportoitu C-päähän sääntö peptidi (iRGD), ja osoittivat, että peptidi hallussaan aktiivisuus NRP-1-riippuvaisen solu-, verisuonten ja kudosten levinneisyys [32]. Myöhemmät raportit osoittivat, että iRGD voisi lisätä kasvaimensisäisenä levittämistä ja tuumorin vastaista tehoa Doksorubisiini [33-35], Paclitaxel [36, 37] ja endostatiini [38] konjugoimalla näiden lääkkeiden tai huumeiden ladattu ajoneuvojen eläinkokeissa. Toinen raportit osoittivat, että iRGD myös voisi lisätä kasvaimensisäisenä keskittymisen ja tuumorin vastaista tehoa Paclitaxel, doksorubisiini, Transtuzumab [24, 39], sisplatiini [40], antamalla samanaikaisesti näiden lääkeaineiden kanssa. Vuonna 2014 Akashi etal. kertoi, että Gemsitabiini oli coadministrated kanssa iRGD hoitoon haimasyövän hiiren malleissa [41]. Tietääksemme tämä tutkimus ensiksi osoittaneet tehoa yhdessä ylläpitäjä iRGD ja Gemsitabiini ihmisen NSCLC ksenograftissa perustettu A549 solulinjassa.

Akashi n raportti osoitti, että haimasyövän mallit yli-ilmentävät NRP-1 ovat herkkiä iRGD samanaikainen. Gemsitabiinihoidon plus iRGD peptidi johti merkittävään kasvaimen vähennys verrattuna Gemsitabiini monoterapiana Haimasyöpä mallit perustettu solulinjojen [41]. Tuloksemme osoittivat, että ανβ3, ανβ5 ja NRP-1, jotka välittävät kasvainta tunkeutuminen aktiivisuus iRGD, oli yli-ilmentynyt ihmisen NSCLC A549 ja ksenografti perustettu tämän solulinjan. Terapeuttinen teho Gemsitabiini merkittävästi parantaa samanaikaisesti iRGD hiiren NSCLC syövän malli. Yhdessä nämä tutkimukset vahvistivat vaikutuksia iRGD parantaa kasvaimensisäisenä levittämiseen ja syövän vastaista tehoa in NRP-1-yli-ilmentynyt syövän malleja.

Gemsitabiini on nukleosidianalogi laajalti käytetty ensilinjan kemoterapia kehittyneiden NSCLC [42 ]. Gridelli etal. raportoitu, että vaste (RR) joukossa 233 potilasta sai Gemsitabiini oli 16%, kun taas mediaani aika taudin etenemiseen ja yleistä (OS) oli 17 viikkoa ja 28 viikkoa, vastaavasti [43]. Päähän-2G vaiheen 2 tutkimus yhden aineen Gemsitabiini kehittyneiden NSCLC iäkkäillä potilailla esiintyi 17,6% RR, mediaani aika taudin etenemiseen oli 16,1 viikkoa mediaani on 41,3 viikkoa [44]. Useat muut tutkimukset käyttävät gemsitabiini yksin osoittivat samaa aktiivisuutta RR ja mediaani PFS ja OS vaihtelevat 16-38,5%, 3-5,4 ja +6,6-+7,7kuukausi vastaavasti [45-48]. Siksi terapeuttinen teho Gemsitabiini varten NSCLC on tilaa on edelleen parannettava. Tuloksemme osoittivat, että iRGD peptidi, tehostaa samanaikaisesti annetun Gemsitabiinin NSCLC ksenograftin. Nämä tulokset osoittivat mahdollisuuden, että iRGD parantaa vaikutusta Gemsitabiinin pienisoluista keuhkosyöpää.

Kuitenkin tehoa iRGD on vain tuntuva työnantajana solulinjassa. Kliiniset sovellus on harkita tarkoin. Nykyinen käsitys mekanismi, jonka iRGD parantaa terapeuttista tehoa Gemsitabiini varten NSCLC on rajallinen. Vaikka mitään ilmeistä sivuvaikutuksia havaittiin Tutkimuksessamme turvallisuutta tämän yhdistelmähoidon vielä tarkempaa arviointia. CendR motiivi iRGD voidaan käyttää myös virusten ja mikrobitoksiinien saadakseen pääsyn soluihin ja levitä sisällä elimistön kudoksissa [49, 50]. iRGD voi myös edistää käyttöönottoa Gemsitabiini osaksi normaaleissa kudoksissa, jotka ovat vaurioituneet, ja kudosten korjaamiseen, joka seuraa voi aiheuttaa lisää vahinkoa keholle.

Johtopäätös

Yhteenvetona kautta ihmisen NSCLC A549 nude mouse ksenograftimallissa, vahvistettiin, että iRGD voi edistää tuumorin solujen proliferaation ja apoptoosin induktio Gemsitabiini ja siten parantaa terapeuttista tehoa Gemsitabiini in vivo. Yhteistyössä anto Gemsitabiini ja iRGD voi olla uusi strategia parantaa kliinistä terapeuttista tehoa Gemsitabiinin pienisoluista keuhkosyöpää.