Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Bispesifiset T-solujen kytkentäosa (purra

®) ovat yhden ketjun bispesifisen konstruktioita dual spesifisyys CD3 T-soluissa ja pinta-antigeenin kohdesoluihin . Ne voivat saada aikaan polyklonaalisia sytotoksisen T-soluvasteen, joka ei rajoitu T-solureseptorin (TCR) spesifisyyden, ja pinta-MHC-luokan I /peptidi-antigeeni-kompleksit. Käytetään ihmisen EpCAM /CD3-bispesifinen purra

® vasta-rakentaa AMG 110, me täällä arvioida, missä määrin pinnan ilmentyminen PD-L1, sytoplasmista ekspressiota indoleamine-2,3-deoxygenase tyypin 1, Bcl-2 ja serpin PI- 9, ja läsnäolo transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β), interleukiini-10 (IL-10) ja adenosiini viljelyalustassa voi vaikuttaa uudelleenohjattujen hajoamiselle AMG 110 kytkettynä T-soluja.

Methods

seitsemän tekijöitä, jotka kaikki osallistuvat estämällä T-solujen toimintoja syöpäsoluja, testattiin ihmisen EpCAM ilmentävien kiinanhamsterin munasarja (CHO) kohdesoluja tasolle, joka useimmissa tapauksissa ylitti havaittu monissa ihmisen syöpäsolulinjoilla. Co-kulttuuri kokeissa käytettiin määrittämään vaikutuksia veronkiertotapausten EC

50-arvot ja amplitudi ohjataan hajoamiselle AMG 110, ja purra

®-indusoi aiemmin lepää ihmisen perifeeristen T-solujen.

Ensimmäisen

estävä vaikutus ohjataan hajoamiselle AMG 110 mukana T-soluja havaittiin, kun yli-ilmentymisen serpin PI-9, Bcl-2, TGF-βand PD-L1. Estävä vaikutus induktio T-soluproliferaation havaittiin ainoastaan ​​CHO-solut yli-ilmentävät IDO. Missään tapauksessa yksittäinen kiertämistä mekanismi sulatettu kohdesolut täysin vastustuskykyinen purra

® aiheuttama hajoamiseen, ja jopa erilaisia ​​yhdistelmiä ei.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että erilaiset mekanismit palveluksessa syöpäsolujen torjua T-soluja ei voi inaktivoida AMG 110 kytkettynä T-soluja, ja että estäviä vaikutuksia havaittu

in vitro

voidaan voittaa kohonneita purra

® vasta-konstruktio.

Citation: Deisting W, Raum T, Kufer P, Baeuerle PA, Münz M (2015) vaikutus Diverse Immuunijärjestelmän veronkiertotapausten syöpäsolujen T solut tarttuvat EpCAM /CD3-bispesifinen vasta Muodosta AMG 110. PLoS ONE 10 (10 ): e0141669. doi: 10,1371 /journal.pone.0141669

Editor: Lucienne Chatenoud, Université Paris Descartes, RANSKA

vastaanotettu 26. tammikuuta 2015 Hyväksytty: 12 lokakuu 2015; Julkaistu: 28 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Deisting et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: rahoitus tutkimuksen on toimittanut AMGEN Inc., julkisesti listattu yritys, joka antoi tukea muodossa palkkojen tekijöille WD, TR, PK ja MM, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. AMGEN tukenut tätä tutkimusta, mutta koska kiinnostusta Tämän tutkimuksen tulokset. MPM Capital tuettiin muodossa palkkaa kirjailija PAB, joka aiemmin oli työssä mukaan AMGEN Research Munich, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit tämän kirjoittajan on nivelletty ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: rahoitus Tutkimuksen on toimittanut AMGEN Inc., työnantaja Wibke Deisting, Tobias Raum, Peter Kufer ja Markus Münz ja entinen työnantaja Patrick A. Baeuerle joka on nyt palveluksessa MPM Capital. Kaikki kirjoittajat ovat oman pääoman tehtävistä yhtiössä. AMGEN on keskittynyt kehittämiseen purra vasta-aineiden pahanlaatuisten sairauksien. AMGEN on valmistaja AMG 110. Sen lisäksi AMG 110, jota käytettiin tässä tutkimuksessa purra alustan omistaa muut purra molekyylien valmisteilla ja on yksi tuote markkinoille nimeltä BLINCYTO. Kirjoittajat Tobias Raum, Peter Kufer, Markus Münz ja Patrick A. Baeuerle pitää useita patentteja merkitystä purra alustalle, kuten patentin AMG 110. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaalit , yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Therapies harjoittaa potilaan sytotoksinen T-soluvaste ovat osoittautuneet tehokkaasti hoitaa ja lopulta parantaa syöpää. Esimerkiksi adoptiovanhemmat siirto ex-vivo laajennettu kasvain asuva T-solujen [1], esto immuuni paeta PD-1 /PD-L1 akselia monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) [2], sisäinen Leesioton ruiskuttamalla onkolyyttisten virus [3], tai edistää T-solujen erilaistumista ja tuhoavien säätelijä-T-solujen CTLA-4-antagonistisia mAb: t [4] ovat kaikki osoittaneet osittaisia ​​ja täydellisiä vasteita myöhäisvaiheen melanooman, myönteinen vaikutus etenemisestä vapaa tai kokonaiseloonjääminen, ja pitkäaikaisen remission jos ei paranna pienellä osalla potilaista. Tällä hetkellä, vaste oli näistä lähestymistavoista ovat rajalliset, ja siksi laaja biomarkkereiden ohjelmien tarkoituksena on ymmärtää kestävyys ja useista kliinisistä ohjelmia etsi yhdistelmien mahdollisesti lisää vastausprosentit ja pitkäaikaista hyötyä. Kaikki edellä mainitut lähestymistavat mahdollistavat sukupolvi, laajentamiseen ja systeeminen leviäminen kasvain-T-solukloonien, jotka tunnistavat syöpäsolut joko erityisellä MHC luokka I /peptidi-kompleksit.

purra

® vasta-konstruktioita harjoittaa sytotoksisten T solujen täysin erilainen [5]. He käyttävät liukoisen sovitinta pintaan kohdeantigeeniä syöpäsoluihin-as tyypillisesti tunnustettu monoklonaalinen vasta hoitojen-kanssa invariant CD3ε alayksikköä tahansa T-solureseptorin (TCR) T-soluissa. Mahdollisesti kaikki ennestään sytotoksisia T-soluja potilaalla, jotka voidaan kytkeä tämän lähestymistavan, jonka effektori-T-solut näyttävät tehdä hallitseva osuus antituumorivaikutuksen [6]. Kun purra

® teknologia, T-solujen tunnistaminen ja aktivointi ei ole enää riippuvainen T-solukloonien joissa tietyn TCR, ei liikenteen ja MHC I molekyylien syöpäsolun pinnalla tai proteolyyttisen sukupolvi, liikenteen ja pinta näyttö peptidiantigeeneillä [5]. CD19 /CD3-bispesifinen blinatumomab on säädetty kliinisen proof-of-concept että tämä ei-luonnollisia sitoutuminen T-solujen on erittäin tehokas ja voi saada suuri osuus kaikista ja NHL potilailla mielekäs kliininen vaste [7-9]. Blinatumomab (Blincyto

™) on äskettäin hyväksynyt FDA hoitoon potilaille, joilla on Philadelphia-kromosomi-negatiivinen uusiutunutta /refraktorista B-solun esiasteen ALL.

Tässä käytimme AMG 110, hyvin tunnettu EpCAM /CD3 -bispecific purra

® vasta-rakenteen, joka on kliinisesti testataan myöhäisvaiheen syöpäpotilaat eri karsinoomat [10, 11].

Syöpäsolut voidaan valita aikana syövän etenemisen lukuisia immuuni veronkiertotapausten, joka esimerkiksi voi vaikuttaa MHC luokka I /peptidi esitys [12, 13], tai sukupolvi, erilaistuminen, selviytyminen, muuttoliike ja laajentaminen spesifisten sytotoksisten T-solukloonien. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme, missä määrin seitsemän usein veronkiertotapausten vaikuttaa purra

® toimintatapa, joka voi mahdollisesti osallisena ennestään sytotoksisten T-solujen potilailla. Siksi keskityttiin niihin mekanismeihin, jotka voivat mahdollisesti vaikuttaa sytotoksisten T-solujen suorituskykyä ja jättää pois ne, jotka esimerkiksi heikentää T-solun, tunnustaa MHC I /peptidi-kompleksit. Tätä varten perustettiin jyrsijän CHO-solulinjat, jotka ilmentävät ihmisen EpCAM kuin pinta kohdeantigeeniä, että joko yli-ilmentävät proteiineja, joilla tiedetään olevan immuuni kiertämisen tai mahdollisia jossa immunosuppressiivisen tekijä lisättiin elatusaineeseen. Voimakkuus ja amplitudi ohjataan CHO-EpCAM: n hajoamista kohdesoluissa ja induktio T-soluproliferaatiota vasteena AMG 110 käytettiin lukemien sytotoksisen T-solun suorituskykyä.

PD-L1, adenosiini, IL-10 ja TGF -β selvitimme tekijöitä usein tuotettu syöpäsoluja, jotka sitovat negatiivinen sääntely pinnan reseptoreihin ilmaistuna sytotoksisia T-soluja. PD-L1-ilmentyy tuumorisolujen pinnalla ja ehkäisy sitoutumisen sen inhiboivan reseptorin PD-1 T-solujen mAb monoterapioita osoitettiin olevan huomattavia antituumorivaikutuksen kliinisissä tutkimuksissa [14, 15]. Adenosiini voidaan syntetisoida syöpäsoluja ja sitoo A2a ja A3-adenosiinireseptorit T-solujen pinnalla, mikä voi estää efektorifunktioita [16, 17]. IL-10 pidetään tulehdusta ehkäisevä sytokiini, joilla on laaja toiminta. Koska syöpäsolut voivat erittää IL-10, rooli karkaamisen immuunitutkimusohjelmasta on katsottava johtuvan IL-10 kasvaimissa [18]. Transkriptio- tukahduttaminen, TGF-β erittämä syöpäsolut voivat yleisesti downmodulate efektori-T-solujen toimintaa, esimerkiksi vähentämällä ilmaus granzymes A ja B, perforiini ja interferoni-gamma (IFNy), kun reseptoria sitova [19]. Sytoplasmisen proteaasinestäjä serpin PI-9 voi suoraan estää entsymaattisen aktiivisuuden grantsyymi B, joka on lopulta toimitetaan sytosoliin syöpäsolujen kautta sytolyyttisen synapsi muodostuneen T-solujen [20]. Bcl-2, tutkittiin anti-apoptoottisen soluliman proteiinin, joka voi vähentää alttiutta syöpäsolujen apoptoosin grantsyymi B [21]. IDO, selvitimme catabolic entsyymi, kun yli-ilmentää syöpäsolut voivat näännyttää mikroympäristöä välttämätön aminohappo tryptofaania ja vapauta immunosuppressiivinen aineenvaihduntatuotteita, kuten l-kynureniini tai 3-hydroksikynureniini, joka voi toleranssia T-soluja [22, 23].

lukuun ottamatta IFNy aiheuttama IDO, kaikki muut kiertäminen tekijöitä tutkittiin tasolle transfektoiduissa CHO-soluissa, jotka ylittivät ne löytyvät kuusi ihmisen syöpäsolujen linjat. Huolimatta tutkimalla ilmeisesti korkea kiertämisen tekijät, olemme havainneet vain vaatimattomia vaikutuksia jotkut uudelleenohjattujen lyysin ja induktio T-solujen lisääntymisen. Useimmissa tapauksissa estovaikutusta voitaisiin kompensoida suuremman annoksen purra

® vasta-rakentaa AMG 110, tai käännettävä farmakologisin keinoin. Purenta

®-harjoittavat T-solut voivat olla mahdollisuus olla aktiivisia syöpää vastaan, jotka ilmentävät erilaisia ​​usein immuuni veronkiertotapausten.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

AMG 110 saatiin Amgen Research (Munich) GmbH. Se on valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja puhdistettiin C-terminaalisen heksa-histidiini, kuten aikaisemmin on kuvattu [24].

Vasta-aineet

Seuraavat vasta-aineet levitettiin. Virtaussytometriaa: hiiren anti-ihmis-PD-L1-APC (M1H1, eBiosciences), hiiren anti-humaani CD3-FITC (UCHT1; BD Biosciences), hiiren anti-humaani-CD25-APC (M-A251, BD Biosciences), hiiren anti-ihmisen EpCAM (B302 /323 /A3, Abcam), vuohen anti-hiiri-lgG (H + L) -APC (Jackson Immuno Research), hiiren anti-humaani-TGF-β-PE (9016; R solunsisäistä FACS tai Western blot-analyysi: hiiren anti-humaani-PI-9 (7D8, Abcam), hiiren anti-humaani GrB-APC (GB11, BD Biosciences), hiiren anti-humaani-Bcl-2 (100 /D5; Thermo Scientific) , hiiren anti-humaani β-Actin (AC-15, Thermo Scientific), kanin anti-humaani IDO (Abcam), vuohen anti-hiiri-anti-kani HRP-kytketty tunnistus vasta-aineiden (Thermo Scientific); stimuloiva ja neutraloivat vasta-aineet: hiiren anti-humaani CD3 (OKT-3, Janssen-Cilag), hiiren anti-humaani-CD28 (L293, BD Biosciences), hiiren anti-humaani-TGF-β (1D11; R eBiosciences) B

Rakentaminen, viljely ja testaus selviytyvän proteiinin ja stabiilisti ihmisen EpCAM ilmentäviä CHO-solulinjat

Lapsen kiinan hamsterin munasarja (CHO) soluja, jotka ilmentävät täysin pituuden matkan ihmisen EpCAM valvonnassa ja EF1α promoottorin (jonka Amgen Research (Munich) GmbH) transfektoitiin stabiilisti toisen ekspressioplasmidin koodaa joko ihmisen PI-9, IDO, Bcl-2, PD-L1, TGF-β1 , IL-10 tai vastaavan mock vektorin. Paitsi Bcl-2 (muodostettu geenisynteesillä, Geneart), kaikki paeta proteiinit kloonattiin ihmisen syöpäsolulinjoja.

jälkeen valinnan ja monistamisen proteiinin ilmentyminen saavutettiin lisäämällä metotreksaattia (Sigma-Aldrich), L-alanosiinia (TRC, Toronto) ja DCF (Hospira). CHO EpCAM: Escape proteiini double-transfektantit kasvatettiin suspensiona HyQ väliaineessa (HyClone) täydennettynä 1% penisilliini /streptomysiiniä (Biochrom AG), 500 nM metotreksaattia, 10 mM HEPES (Biochrom AG), 1,1 mM adenosiini (Sigma-Aldrich) , 50 uM L-alanosiinia, 1 mM uridiini (Sigma-Aldrich) ja 0,1-1 uM DCF 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa.

Expression of kalvoon sitoutuneet proteiinit EpCAM ja PD-L1 ja kalvoon sitoutuneiden TGF-β analysoitiin virtaussytometrialla, ilmentyminen PI-9 solunsisäisten FACS tai Western blot -analyysillä. Vertailun ilmaisun tasoilla, suhteellisen mediaani (= mediaani näyte /mediaani valvonta) näytteiden laskettiin. Expression solunsisäisten IDO: n ja Bcl-2 määritettiin Western blot -analyysillä ja kvantifioidaan Image J ohjelmisto. Ekspressiotasot eritetyn IL-10 ja TGF-β-proteiinien arvioitiin solujen supernatantissa 2,5x 10

5 /ml 48 tunnin kuluttua viljelyn ELISA käyttämällä Quanti Glo IL-10 ELISA-kittiä (R N = 5). Toiseksi vahvin oli vaikutusta ilmentymiseen pinnassa PD-L1 on CHO-EpCAM solut 5-kertainen pieneneminen teho oli tilastollisesti merkittävä (p = 0,04; N = 7). TGF-β indusoi 3-kertainen väheneminen teho lysis vahva suuntaus (p = 0,06; N = 5). Estävä vaikutus varmistettiin lisäämällä yhdistelmä-TGF-β viljelyalustaan ​​CHO-EpCAM kontrollisoluja (katso S2B kuvio). Olevaa 4-kertainen estävää vaikutusta Bcl-2 n

50 arvo lysis kehitys oli vaisua (p = 0,09; N = 3), ja tilastollisesti merkitsevä vaikkakin pieni vähennys (katso kuvio 2C) on prosenttiosuus lysoitiin solujen (p = 0,01; N = 4). Mikään muu vaikutuksia tehoa lyysin tai prosenttiosuuden lysoitiin solujen kuvattu kuvassa 2 oli tilastollisesti merkitsevä tai osoitti vahva trendi (S3A ja S3B kuvassa). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun CD3

+ T-solujen sijasta käytettiin CD8

+ T-soluissa, kuten efektori- solupopulaation (katso S4 kuvio).

estävä toiminta IDO, PD-L1, ja TGF-β voidaan kumota farmakologisen tarkoittaa

IDO oli ainoa kiertämisen tekijä tässä tutkimuksessa, mikä johtaa kovaan eston AMG 110 aiheuttaman T-solujen lisääntymistä (katso kuva 1). Sen osoittamiseksi, että inhibitio johtui entsymaattiseen aktiivisuuteen IDO, lisäsimme 0,5 uM tryptofaani solun elatusalustaan ​​ja se analysoitiin solukierron by CFSE-pohjainen FACS. Kuten on esitetty kuviossa 3A, täydentämisen tryptofaani täysin päinvastainen inhibition AMG 110-indusoidun solun pyöräily IDO-ilmentävät CHO-EpCAM-soluissa.

(A) analyysi CD3

+ T-solujen proliferaatiota, kun 120 h yhdessä viljelemisen ohjaus- EpCAM

+ CHO-solujen ja IDO-ilmentävien, EpCAM

+ CHO-solujen läsnä tai poissa ollessa 500 uM tryptofaani (Trp) ja ilman 1 ug /ml AMG 110. (B ) Annos-riippuvainen, ohjataan kohdesolun hajoamisen vanhempien EpCAM

+ CHO-solujen ja EpCAM

+ CHO TGF-β transfektantit +/- 50 ug /ml TGF-β neutraloivat anti-ihmis-TGF-β-vasta-aineen läsnä ollessa, AMG 110 ja CD3

+ T-solujen in E: T-suhteella 4: 1 72 tunnin kuluttua inkubaation. (C) annos-riippuvainen ohjataan hajoamista kohdesoluissa valvonnan EpCAM

+ CHO-solujen ja EpCAM

+ CHO PD-L1-transfektanttien kanssa ja ilman 5 ug /ml anti-ihmis-PD-L1-neutraloivien vasta-aineen läsnäolo AMG 110 ja ennalta stimuloi CD8

+ T-soluja. E: T-suhde oli 1: 1, kokeessa kesto 24 h.

estävä vaikutus nähdään, kun TGF-β on ohjataan kohdesolujen hajoaminen ilmentävien ja erittävien ihmisen TGF-β voisi olla päinvastaiseksi, kun läsnä on 50 ug /ml neutraloivaa anti-TGF-β-vasta-ainetta (kuvio 3B). Vähentynyt hajoamista PD-L1 ilmentävien CHO-EpCAM-soluissa AMG 110 voi olla täysin päinvastainen, kun läsnä oli 5 ug /ml antagonistista anti-PD-L1-vasta-aineen (kuvio 3C). Anti-TGF-β ja anti-PD-L1-vasta-aineiden tai PI-9 inhibitio shRNA ei ollut vaikutusta lyysiin syöpäsolujen, jotka ekspressoivat vastaavia kiertämisen tekijät alhaisella tasolla (katso S4d, S4E ja S4F kuviossa).

Ohjattu kohde solun hajoamista havaitaan vaikka kaikki seitsemän veronkiertotapausten ovat läsnä yhdessä viljelemisen

Useat kiertämistä tekijöitä tässä tutkimuksessa voi toimia

trans

, kuten TGF-β, IL-10, PD-L1, IDO ja adenosiini. Vain Bcl-2 ja serpin PI-9 proteiineja, jotka rajoittuvat solulima syöpäsolut, voi. Me täällä yritettiin luoda yhteistyössä kulttuuri immunosuppressiivinen ympäristön joilla on kaikki seitsemän tekijän läsnä samanaikaisesti. Yhdessä kunnossa, jokaisen kuuden transfektoitujen CHO-EpCAM-solulinjat oli läsnä sama määrä ja 1 mM adenosiini lisättiin viljelyalustaan. Jopa tässä tilassa, ohjataan hajoamista havaittiin vielä (kuvio 4). Kuitenkin huomattava vaikutus prosenttiosuus hajoamiseen näkyi yhä useampia tekijöitä yhdistettynä.