Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka nykyinen syöpälääkkeen protokollia ovat kohtuullisen tehokkaita, hoito liittyvä pitkäaikaisia ​​haittavaikutuksia aiheuttama puute spesifisyyttä syövän menettelyjä, edelleen haastava ongelma lapsilla onkologian. TAT-RasGAP

317-326 on RasGAP peräisin oleva solu-läpäisevä peptidin, joka toimii herkistävä erilaisia ​​anti-syöpähoitojen aikuisten kasvainsoluissa. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme vaikutuksen TAT-RasGAP

317-326 useissa lapsuudessa syöpäsolulinjoissa. RasGAP peptidin indusoiman solukuoleman analysoitiin useissa neuroblastooma, Ewingin sarkooma ja leukemia solulinjoja (sekä normaali lymfosyytit). Solukuolemaa arvioitiin käyttäen virtaussytometria menetelmiä puuttuessa tai läsnä ollessa peptidin yhdessä eri genotoxins käytetään klinikoilla (4-hydroperoxycyclophosphamide, etoposidi, vinkristiini ja doksorubisiini). Kaikki testatut lapsipotilailla kasvaimia, vasteena vähintään yhden genotoxin, herkistettiin TAT-RasGAP

317-326. RasGAP peptidiä ei lisätä solukuolemaa normaalin lymfosyyttien, yksin tai yhdessä useimpien testattujen kemoterapioiden. Näin ollen, TAT-RasGAP

317-326 voivat saada lapsia, joilla on kasvaimia lisäämällä tehoa syövän hoitomuotoja esimerkiksi mahdollistamalla vähennykset syövän huumeiden annostus ja siihen liittyvä lääkeaineen aiheuttamien sivuvaikutusten.

Citation: Chevalier N, Gross N Widmann C (2015) arviointi Kemoherkistävät Activity TAT-RasGAP

317-326 in Childhood Syövät. PLoS ONE 10 (3): e0120487. doi: 10,1371 /journal.pone.0120487

Academic Editor: Salvatore Papa, Institute of Hepatology – Birkbeck College, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 03 lokakuu 2014; Hyväksytty: 23 tammikuu 2015; Julkaistu: 31 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Chevalier et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: koskevat tiedot CGH joukko profiilit NB1 neuroblastooma johdettu-solulinjat saatiin kolmannelta osapuolelta: Dr. Aurélie Coulon ([email protected]) lastenlääkekomitean Oncology Research Unit, University Hospital Center (CHUV), Lausanne, Sveitsi) joissa lukijat voivat lähettää pyyntöjä datan.

Rahoitus: Varat käytetään FORCE Foundation – https://www.force-fondation.ch/(NC NG); MD-PhD apurahan Sveitsin National Science Foundation (nro 158116) (NC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä edustaa toista kuolinsyy lasten onnettomuuksien jälkeen teollisuusmaissa [1, 2]. Käsityksemme lasten syöpien on hyötynyt merkittävää edistystä yli neljän viime vuosikymmenen aikana. Vakiohoidot parantaa lapsipotilaiden kasvain kuuluu leikkaus, sädehoito ja intensiivinen multi-aine kemoterapiaan kuten etoposidi, vinkristiini, doksorubisiini ja syklofosfamidi [3].

Kehittyneissä maissa, kahdeksankymmentä prosenttia lapsista, jotka ovat diagnosoitu syöpä odotetaan hengissä 5 vuoden kuluessa hoidon jälkeen. Kuitenkin useimmat heistä kärsivät kroonisista sairauksista 40-vuotiaita [4]. Laajennettu valvonta lasten syöpä eloonjääneitä esittää suuren riskin hengenvaarallisten myöhään vaikutukset toisesta syöpäsairauksia, sydänsairaus ja keuhkosairauksien [5, 6]. Riski ennenaikainen kuolevuus on useimmiten määritetään käsittely-tekijät, kuten kumulatiivinen annos kemoterapiaa [7]. Siksi hoito liittyvä pitkäaikainen aiheuttamien sivuvaikutusten vaurio ei-kasvainsoluja haastava ongelma ja edelleen pääosin ratkaisematta. Kun lapset ovat määritelmän pitkäaikaisia ​​eloonjääneitä, on voimakas tarve kehittää matalan myrkyllisyys, kohdistaa paremmin ja tehokkaita uusia hoitostrategioita kaikenlaiseen lasten syöpien [8]. Strategiat kiertämään tällaisia ​​esteitä ovat parantaminen syövän huumeiden herkkyys ja kohti syöpäsoluja [9-11].

Tässä yhteydessä olemme aiemmin raportoitu, että solun läpäisevä johdettu peptidi p120 RasGAP proteiini , jota kutsutaan TAT-RasGAP

317-326, on kasvain-herkistävä eri syöpälääkkeet. Todellakin, vaikka se ei näytä mitään myrkyllisyyttä kohti solujen omasta, se tehokkaasti ja nimenomaan herkistää aikuisten kasvainsolujen

in vitro

ja

in vivo

erilaisiin syöpälääkkeiden, mukaan lukien kemoterapia [ ,,,0],12,13], ja fotodynaaminen hoito [14]. Mikä tärkeintä, se näyttää spesifisyys syöpäsoluja, koska se ei herkistä ei-tuumorisoluja genotoxin indusoiman apoptoosin [12, 14]. TAT-RasGAP

317-326 näyttää olevan ylimääräisiä syövän vastaisen toiminnan kuin kasvainsolujen herkistymistä kuin se on ollut viime aikoina osoittanut, että tämä peptidi voi haitata solujen vaeltamiseen ja invaasiota

in vitro

[15, 16] ja että tämä toiminta voidaan estää metastatization prosessi

in vivo

[17]. Tämä osoittaa, että RasGAP peptidiä on kyky toimia anti-metastaattinen yhdiste päälle sen kasvaimen herkistymistä vaikutuksia. Viime aikoina on osoitettu, että syövän ominaisuuksia TAT-RasGAP

317-326 ovat riippuvaisia ​​kahdesta tryptofaanitähdettä asemassa 317 ja 319 [16]. Kuitenkin toimintatapa TAT-RasGAP

317-326 ei ole täysin tunnettu. Aiemmin on osoitettu, että tämä peptidi ei suosi kasvainsolujen kuolemaa moduloimalla Ras aktiivisuus, MAPK signalointireittien, NF-KB: n transkriptionaalisen aktiivisuuden, Akt-proteiinia tasoja ja fosforylaatiotilaa [18, 19]. Lisäksi Bcl-2-perheen jäsentä, jotka säätelevät mitokondrio-riippuvaista solukuolemaa, osoitettiin olevan erikseen tarpeeton herkistävän aktiivisuuden peptidi [20].

Tämän vaikutus peptidin lapsuudessa syöpä on kuitenkin ei tunnettu. Molekyylibiologia lapsipotilaiden kasvainten eroaa syövistä aikuisilla monin tavoin. Koska synty eniten lasten syöpien näyttää tulevan häiriöihin normaalin varhaisen kehityksen, niitä kertyy vähemmän mutaatioita kuin aikuinen kasvaimia. Toisaalta vaikuttaa siltä, ​​että kehitys lapsipotilaiden kasvaimia hyvin riippuvaisia ​​epigeneettisellä muutoksia [21-23]. Tässä tutkimuksessa olemme siis tutki, TAT-RasGAP

317-326 pystyi tekemään lapsuuden kasvaimia herkempiä kliinisesti merkittäviä anti-kasvain huumeet.

Methods

Solulinjat ja viljelysoluja

CCRF-CEM [24], THP-1 [25] ja A673 [26] solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (viitteet CRL-8436, TIB-202 , CRL-1598 vastaavasti). LAN-1 [27] ja M-07e [28] solulinjat saatiin Leibniz Institute DSMZ-saksalaiseen mikro-organismien ja Cell Cultures (viitteet ACC655, ACC104 vastaavasti). EW-11 [29], TC252 [30] ja NB1 johdettuja [31] solulinjat on kuvattu aikaisemmin. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa. Neuroblastooma solulinjat (LAN-1, NB1-FBS, NB1-FBS-Re) ja EW-11 Ewingin sarkooma solulinjaa kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Paisley, UK), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco). NB1-NBM neuroblastooma primaarikasvaimen solut ylläpidettiin hermo emäksisessä väliaineessa valmistettu DMEM /F12 (Gibco), jota oli täydennetty 2%: B27 seerumitonta täydentää (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng /ml ihmisen emäksistä fibroblastikasvutekijää ( bFGF) (Peprotech), ja 20 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF) (Peprotech). CCRF-CEM ja THP-1-akuutti leukemia solulinjoja, ja A673 sekä TC252 Ewingin sarkooma soluja, viljeltiin RPMI 1640 (Gibco), joka sisälsi 10% FBS: ää. M07e, akuutti myelooinen leukemia solulinja, ylläpidettiin Minimum Essential Medium-alfa (MEMα) (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 5 ng /ml rekombinanttia ihmisen granulosyyttien-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) (Peprotech). Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit (PBL: t) eristettiin tiheyssentrifugaatiolla Ficoll-Paque kaltevuus (Lymphoprep; StemCell Technologies) buffy coats terveiden luovuttajien, saatu valtion Vaudin verensiirtopalvelu. Luovuttajat antoi kirjallinen suostumus mahdollinen käyttö niiden verta lääketieteelliseen tutkimukseen. PBL: t viljeltiin RPMI 1640 (Gibco), jota oli täydennetty 8% yhdistettyjen ihmisen seerumia ja johon oli lisätty 100 U /ml ihmisen rekombinantti-interleukiini-2 (Proleukin, Roche Pharma AG).

Chemicals

käytetyt lääkkeet olivat vinkristiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), etoposidi (Sigma-Aldrich), 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC) (Niomech, Bielefeld, Saksa) ja doksorubisiini (Pfizer AG, Zurich, Sveitsi). Värjäytyminen käytetään suorittamaan virtaussytometrialla oli 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ja anneksiini V-FITC: tä (anneksiini V-FITC /7-AAD kit, Beckman Coulter, Miami, USA).

peptidisynteesi

TAT-RasGAP

317-326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD), TAT

48-57 (tästä lähtien kutsutaan TAT) (GRKKRRQRRR), TAT-Scrambled (GRKKRRQRRRGGWLDMTTVNRW) ja TAT-mutaation (GRKKRRQRRRGGAMWVTNLRTD ) syntetisoitiin biokemian laitoksen, University of Lausanne, Sveitsi kuten aiemmin on kuvattu [12].

Solumyrkkykoe

solut kasvavat suspensiossa (THP-1, M07e, CCRF-CEM ja lymfosyytit), kolmesataa tuhatta solua siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, ja sitä käsiteltiin osoitetulla annoksella 4-HC, etoposidi, vinkristiini tai doksorubisiinia läsnäollessa tai puuttuessa 10 uM TAT-RasGAP

317-326, TAT, TAT-salatut tai TAT-mutatoidut. Adherenttien solulinjoja (NB1-NBM, NB1-FBS, NB1-FBS-Re, LAN-1, EW-11, TC252, ja A673), kaksisataa tuhatta solujen annettiin kiinnittyä 48 tunnin ajan 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin sitten, kuten suspensiossa kasvavien solujen. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun lääkkeen inkuboinnin solut altistettiin virtaussytometria arvioida solun kuolemaan. Lyhyesti, joka tarttuu solulinjoja irrotettiin trypsiini-EDTA: a (Gibco) ja yhden solun suspensioita käsiteltiin ja värjättiin 1 ug /ml 7-AAD ja 50 ng /ml anneksiini V-FITC: llä 500 ul: sitomispuskuria. Vähintään kymmenen tuhatta solut analysoitiin. 7-AAD väriaine johdettua signaalia ei voi käyttää, kun solut käsiteltiin doksorubisiini koska 7-AAD ja doksorubisiini on samanlaisia ​​fluoresoivia ominaisuuksia (7-AAD emission aallonpituus: 525 nm; doksorubisiini emission aallonpituus: 530 nm [32]).

tilastollinen analyysi

Ellei toisin ole mainittu, kaikki kokeet on saatu kolmen tai useamman itsenäisen kokeen. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± 95%: n luottamusväli. Merkittävyys arvioitiin käyttäen t-testit suoritettiin Microsoft Excel 2010 seurasi Bonferroni korjauksia (eli eroja pidettiin merkittävinä, kun p-arvot 0,05 /n, missä n on määrä vertailujen). Tähdellä edustavat tilastollisesti merkitseviä eroja. Vuonna viimeinen numero, merkittävyys arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferroni (Dunn) t post-hoc testit käyttäen SAS-9.2-ohjelmisto (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Tulokset

tässä tutkimuksessa kolmenlaisia ​​lasten syöpien analysoitiin: neuroblastooma, leukemia, ja Ewing sarkooma. Joukossa lapsuuden maligniteetit, neuroblastooma on yleisin ekstrakraniaalisen kiinteä syöpä. Kuolemat johtuvat neuroblastooma osuus 15% kaikista kasvaimen liittyvän kuoleman lapsilla [33]. Monilääkeresistenttisyyttä, hankittu altistuminen chemotherapies, on merkittävä rooli tässä huono tulos [34, 35]. Leukemia on yleisin lapsuuden syöpä tyyppi ja edustaa kolmannes kaikista lapsipotilaiden kasvaimista [36]. Vaikka harvinaisempia kuin leukemia, Ewingin sarkooma on aggressiivinen syöpä, jolla on huono ennuste ja korkea uusiutumisen etäpesäkkeitä [37]. Lääkkeet Tässä käytetty kaikki käytetään klinikoilla. Niiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1.

TAT-RasGAP

317-326 herkistää akuutti lymfaattinen ja myelooinen leukemia solujen eri kemoterapeuttisten aineiden osoittamatta mitään vaikutusta kasvainsoluja kohtaan itse

tutkimiseksi herkistymistä vaikutuksen TAT-RasGAP

317-326 leukemiasoluissa, kolmea eri solulinjoja altistettiin kasvavia pitoisuuksia sytostaatit puuttuessa tai läsnä ollessa 10 uM TAT-RasGAP

317 -326. Etoposidi, vinkristiini, doksorubisiini, ja 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC), aktiivinen muoto syklofosfamidi, olivat huumeita käytetään tässä, ja ovat kukin työskentelee tällä hetkellä klinikalla. Solukuolemaa arvioitiin käyttäen 7-AAD että etiketit kuolleita soluja, jotka ovat läpäiseviksi solukalvon ja anneksiini V, joka sitoutuu fosfatidyyliseriinin paljaana kuolleita soluja. Jotkut syöpälääkkeet käytetään tässä indusoi samanaikaisesti ulkonäön 7-AAD ja anneksiini V-signaalit (kuvio 1A esittää edustavat tapauksessa 4-HC). Toisin sanoen, heti kun solu tuli anneksiini V-positiivisia myös piristyi 7-AAD väriaine. Näin ollen meidän käsissämme, syöpälääkkeet, kuten 4-HC indusoi nekroosia samanlaisten kuoleman. Seuraavassa Kuvioissa 7-AAD tiedot ilmoitetaan löysimme niitä voidaan liittyä pienempi varianssi kuin saadaan anneksiini V värjäytymistä (kuvio 1 B). Ainoa poikkeus oli, kun doksorubisiinia käytettiin. Todellakin, tämä väriaine fluoresoi samankaltaisia ​​aallonpituuksilla kuin 7-ADD. Tässä tapauksessa siis anneksiini V tiedot esitetään. Nämä kokeet paljastivat, että TAT-RasGAP

317-326 merkittävästi herkistää leukemiasolujen lähes kaikilla testatuilla huumeiden (kuvio 2A). Kuitenkin joissakin olosuhteissa (esimerkiksi kun THP-1-soluja käsitellään vinkristiinin) kasvainsolujen ei reagoi hyvin TAT-RasGAP

317-326. Rajoitettu herkistymistä vaikutus RasGAP peptidiä ei välttämättä seurausta luontainen resistenssi lääkkeelle kuten CCRF-CEM-solulinja, joka on vinkristiini kestävä, on tehokkaasti herkistynyt TAT-RasGAP

317-326. Tämä kohta on erityistä kliinistä merkitystä, koska se osoittaa, että TAT-RasGAP

317-326 voi saada aikaan herkistyminen vaikutus kemiallis-resistentit solut.

. Kolmesataa tuhatta CCRF-CEM-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, ja sitä käsiteltiin 50 uM 4-HC. Solukuolemaa arvioitiin useiden ajankohtina (0, 3, 6, 12 ja 24 tuntia) käyttäen 7-AAD ja anneksiini V-FITC värjäystä. B. CCRF-CEM-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, ja sitä käsiteltiin osoitetulla annoksella 4-HC, etoposidi tai vinkristiini läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM TAT-RasGAP

317-326. 24 tunnin kuluttua lääkkeen inkuboinnin 7-AAD ja anneksiini V-FITC värjäys suoritettiin arvioimiseksi solukuolemaa. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide.

. Kaksi akuutti myelooinen leukemia solulinjoja (THP-1 ja M-07e) ja yhden T-akuutti lymfaattinen leukemia cell line (CCRF-CEM) ympättiin 6-kuoppaisille levyille, ja sitä käsiteltiin 4-HC, etoposidi, vinkristiini tai doksorubisiinia ilmoitettuina pitoisuuksina läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM TAT-RasGAP

317-326. 24 tunnin kuluttua lääkkeen inkuboinnin 7-AAD tai anneksiini V-FITC värjäys suoritettiin arvioimaan solukuolemaa (neljä viimeistä saraketta). Vaihtoehtoisesti (ensimmäinen sarake), soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla TAT tai TAT-RasGAP

317-326 yksin. 24 tunnin kuluttua, arviointi solukuoleman suoritettiin käyttäen 7-AAD värjäystä. B. Eristetty lymfosyyttejä kolme erillistä terveillä koehenkilöillä käsiteltiin, kuten on kuvattu kuviossa. 2A. Annostukset kemoterapeuttisten hoitoon käytetyt aineet terveen lymfosyyttien kolmen aineet ovat samanlaisia ​​kuin käytetään käsitellä T-ALL CCRF-CEM-soluja. Huomaa, että kuvaajat ovat peräisin yhden kokeissa, joissa lymfosyyttien käytetään välittömästi sen jälkeen, kun niiden eristäminen (jos viljelty

in vitro

, he kokevat korkea spontaanin apoptoosin, joka estäisi tarkka mittaus syövän huumeisiin ja peptidin n aiheuttamaa kuolemaa). T-ALL, T-akuutti lymfaattinen leukemia; AML, akuutti myelooinen leukemia; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P 0,05 t-testin jälkeen Bonferroni korjauksen.

TAT-RasGAP

317-326 itsessään ei aiheuttanut solukuoleman testatuista leukemia solulinjoja, jopa kaksi kertaa suurempi pitoisuus (20 uM) kuin yksi käytetään aiheuttaa herkistymistä vaikutus (10 uM) (kuvio 2A).

TAT-RasGAP

317-326 ei näy myrkyllisyys kohti ei ollut kasvainta lymfosyyttejä terveillä henkilöillä .

on osoitettu aikaisemmin käyttämällä ei-kasvain ikuisti ihmisen keratinosyyttejä (HaCaT) ja navan verisuonten endoteelin (HUV-EY-C) solut, jotka TAT-RasGAP

317-326, yhdessä erilaisten genotoxins, ei herkistä ei-kasvainsoluja [12]. Tässä tutkimuksessa käytimme eristetty lymfosyytit kokoverestä terveillä potilailla tutkia selektiivisyys RasGAP peptidiä kohti syöpäsoluja. Käytimme samaa annoksia kemoterapeuttisia aineita hoitoon terveitä lymfosyytit, joita käytetään hoitoon CCRF-CEM-T-akuutti lymfaattinen leukemia (T-ALL)-solulinjassa (kuvio 2A). Kuvio 2B esittää vaste perifeerisen veren lymfosyytit (PBL: t), jotka ovat peräisin kolmesta eri terveillä koehenkilöillä (alistaa A-C) RasGAP peptidiä yhdistelmänä tai ei siinä genotoxins käytetään kuviossa 2A. RasGAP peptidin itsessään ei ole mitään myrkyllisyyttä kohti PBLt. Herkkyys ei ollut kasvainta lymfosyyttien testatuilla kemoterapian yksinään oli samanlainen herkkyys CCRF-CEM-solulinja (jopa hieman lisääntyä doksorubisiinin varten terveillä koehenkilöillä A ja C). Se havainto, että syöpä ja normaalin lymfosyyttien olivat yhtä herkkiä genotoxins oli jotenkin yllättävää, koska logiikka käyttää tiettyä kemoterapia on, että se kohdistaa edullisesti pahanlaatuisia soluja. Kuitenkin tärkeitä tietoja peräisin Kuvio 2B on, että TAT-RasGAP

317-326 ei herkistää PBL: sen etoposide-, vinkristiinille ja doksorubisiini välittämän kuolemaan. Peptidi kuitenkin ollut joskus herkistää PBL: 4-HC (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että TAT-RasGAP

317-326 voi vaikuttaa elinkelpoisuuden normaalien solujen joissakin hoitoyhdistelmissä.

TAT-RasGAP

317-326 voi voimistaa genotoxin indusoimaa solukuolemaa Ewingin sarkooma

laajempi tutkimus TAT-RasGAP

317-326 ei-leukemia lapsuusajan syöpä, tehoa TAT-RasGAP

317-326 testattiin myös Ewingin sarkooma soluissa. Tulokset osoittavat, että RasGAP peptidiä pystyy myös herkistää näiden solujen eri genotoxins, vaikkakin vähemmässä määrin kuin leukemioissa (kuvio 3). Joissakin tapauksissa ei ole herkistymistä havaittu (esim. Silloin, kun vinkristiini käytettiin A673 ja TC252 solulinjat). Tässäkin TAT-RasGAP

317-326 yksinään ei osoittanut mitään myrkyllisyyttä kohti Ewingin sarkooma soluja (kuvio 3).

kolme Ewingin sarkooma solulinjoja (EW-11, A673 ja TC252) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja 24 tunnin kuluttua käsiteltiin 4-HC, etoposidi, vinkristiini tai doksorubisiinin ilmoitettuina pitoisuuksina läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM TAT-RasGAP

317-326. Yksi päivä myöhemmin, solukuolemaa arvioitiin. 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P 0,05 t-testin jälkeen Bonferroni korjauksen.

Euroopan NB1 neuroblastooma johdettu-solulinjat suoraan surmansa TAT-RasGAP

317-326

Hankitut chemoresistance on merkittävä syy epäonnistumiseen hoitoon neuroblastooma. Arvioida vaikutuksen TAT-RasGAP

317-326 soluissa, jotka altistettiin suuria annoksia kemoterapian ja siksi, että mahdollisesti ovat hankkineet resistenssin näille sytotoksisten aineiden, valitsimme ensisijainen kasvainsolujen yksittäisen potilaan eri vaiheissa sairaus. NB1 solut ovat suuri riski vaiheessa 4 ensisijainen neuroblastoomasoluilla peräisin luuytimen näytteitä, jotka muodostetaan alkudiagnoosin (NB1-NBM ja NB1-FBS) ja tämän jälkeen uusiutunut multi-agentti kemoterapiaa (NB1-FBS-Re) (kuvio 4A ). NB1-FBS: ää ja NB1-FBS-Re solulinjoja viljeltiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) sisältävä DMEM-alustassa, kun taas NB1-NBM solut perustettiin hermo emäksisessä väliaineessa (NBM). NBM on kantasolu salliva seerumitonta, bFGF-, EGF- ja B27-täydennetty väliaine tukemaan kasvua hermostopienasoluille, kudoksen alkuperän neuroblastooma [38, 39].

. Vaaleanharmaa paksu nuoli päälle kuvion edustaa hoito ylläpitäjä potilaalle, jolta kolmen NB1 solulinjat perustettiin. NB1 solut ovat peräisin ensisijaisesti suuren riskin neuroblastooma luuytimen näytteitä. NB1-NBM ja NB1-FBS perustettiin alkudiagnoosin ja viljeltiin NBM ja DMEM, vastaavasti. NB1-NBM-Re perustettiin myöhemmässä relapsi ja viljeltiin DMEM. Kolme NB1 solulinjat käsiteltiin, kuten on kuvattu kuviossa 3. B. LAN-1-solulinja on johdettu korkean riskin neuroblastooma. LAN-1-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu kuviossa 3. M, kuukausi; BM, luuydin; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. * P 0,05 t-testin jälkeen Bonferroni korjauksen.

Kuvio 4A osoittaa, että NB1-NBM ja NB1-FBS solulinjat eivät näytä samaa herkkyyttä kohti testattu chemotherapies. Lisäksi tehokkuus TAT-RasGAP

317-326 parantaa tappotehoon 4-HC vaihtelee näiden kahden solun tukijalkaa: NB1-FBS-soluja havaittiin olevan hyvin herkkä herkistymistä peptidin vaikutusta, kun taas NB1-NBM soluja ei läsnäolo vaikuttaa TAT-RasGAP

317-326. Koska ainoa ero NB1-NBM ja NB1-FBS solulinjoissa on väliaineeseen, jossa ne viljellään, voisi hypoteesin, että aineenvaihduntaa NB1 solujen vaihtelee viljelyolosuhteissa toiseen ja että tämä differentiaalisesti moduloi herkkyyttä kasvainsolujen TAT-RasGAP

317-326.

sen tutkimiseksi, onko herkistymistä vaikutuksen TAT-RasGAP

317-326 oli edelleen tehokasta on uusiutunut neuroblastoomasoluja, vertasimme sen tehokkuuden välillä NB1-FBS soluihin ja NB1-FBS-Re soluissa. Molemmat solulinjat ovat viljellään samassa elatusaineessa. Hoito-ohjelman, jota käytettiin potilaan hoitoon on esitetty kuviossa 4A. Potilaasta, uusiutunut soluja, jotka olivat peräisin, on alttiina neljä lääkkeet (4-HC, etoposidi, vinkristiini ja doksorubisiini) testattiin tässä tutkimuksessa. Kuitenkin lukuun ottamatta 4-HC-käsitelty olosuhteissa, joissa voimme havaita vastuksen tämän lääkkeen NB1-FBS-Re solujen uusiutunut solut eivät vastustuskykyisempiä etoposidi, vinkristiini ja doksorubisiinin kuin solut, jotka ovat peräisin alkuperäisestä diagnoosista (kuvio 4A). Päinvastoin, NB1-FBS-Re solut näyttävät lisääntynyt herkkyys dok- verrattuna NB1-FBS-soluja. Kuitenkin TAT-RasGAP

317-326 herkistää kolme ensisijaista NB1 solulinjat, vaikkakin eri tasolle tehon mukaan solulinjan ja testattu kemoterapiaa (kuvio 4A).

Useimmissa tapauksissa TAT-RasGAP

317-326 ei indusoi kasvainsolun kuoleman itse. Olemme kuitenkin havainneet, että kolme NB1 johdettu-solulinjoja voidaan suoraan tappaneet RasGAP peptidiä (kuvio 4A). Tarvittavaa annosta aiheuttaa solukuoleman (20 uM) on kuitenkin suurempi kuin annos, jota käytetään herkistää solut genotoxins (10 uM).

Viimeistele tutkinnan vaikutuksen TAT-RasGAP

317 -326 neuroblastoomakasvaimissa kasvaimen tyyppi, testasimme myös peptidin LAN-1, toinen neuroblastoomasolulinjasta peräisin aggressiivista vaiheessa 4 neuroblastooma. Kuvio 4B osoittaa, että RasGAP peptidiä näyttää lievä herkistyminen vaikutus kohti tätä solulinjaa. Toisin kuin NB1 johdetut solulinjat, TAT-RasGAP

317-326 yksinään ei kyennyt tappamaan LAN-1-soluissa (kuvio 4B), mikä tarkoittaa, että TAT-RasGAP

317-326 solukuolema ei ole spesifisyys yhteinen kaikille varhaishermosolukasvaimesta.

herkistävän aktiivisuuden TAT-RasGAP

317-326 on kuljettaa RasGAP peräisin oleva sekvenssi

arvioimiseksi spesifisyyden kemiallis-herkistävä aktiivisuus TAT-RasGAP

317-326, kolme erilaista ohjaus peptidit testattiin: peptidi, joka koostuu TAT-sekvenssin vain (TAT), peptidi, jossa RasGAP sekvenssi salattu (TAT-scrambled), ja peptidi, jossa ensimmäinen tryptofaani on RasGAP sekvenssin korvautuu alaniinijäännöksellä (TAT-mutaation). Tämä tryptofaania äskettäin osoitettu olevan olennainen herkistävän aktiivisuuden TAT-RasGAP

317-326 aikuisilla kasvaimissa [16]. Vaikutus TAT-RasGAP

317-326 ja kolme ohjaus peptidit testattiin CCRF-CEM-soluja yhdessä eri syöpälääkkeitä annoksilla, jotka annettiin suurin herkistyminen aktiivisuus voidaan havaita. CCRF-CEM-soluja käytettiin, koska tämä leukemian solulinja oli yksi tehokkaimmin herkistynyt RasGAP peptidiä. Kuvio 5A osoittaa, että kaikki kolme kontrollipeptidejä ollut taipumus hieman suosia kuoleman CCRF-CEM-soluja, kun yhdistetään eri syöpälääkkeitä, mutta useimmissa tapauksissa tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Sen sijaan, TAT-RasGAP

317-326 selvästi, ja aina merkittävästi, herkistyneet näiden solujen huumeita. Lievä herkistyminen vaikutus kontrollipeptidejä on todennäköisesti johtuu solun tunkeutuu aktiivisuus TAT ​​osan, joka saattaa vaikuttaa kielteisesti cellular homeostaasin [40]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun TC252 Ewingin sarkooma-solulinjassa ja NB1-FBS neuroblastoomasolulinjasta käytettiin: TAT-RasGAP

317-326 huomattavasti niiden herkkyyttä 4-HC, kun taas kolme kontrollipeptidit eivät tai ainoastaan minimaalisesti (kuvio 5B ja 5C). Nämä tiedot osoittavat, että kasvaimen herkistävä aktiivisuus TAT-RasGAP

317-326 vain vähän riippuvainen sen kyvystä tunkeutua soluihin kautta TAT solun läpäisevä sekvenssi. Näin ollen voidaan päätellä, että herkistävä aktiivisuus TAT-RasGAP

317-326 pääasiassa kuljettaa RasGAP peräisin oleva sekvenssi.

. CCRF-CEM-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, ja sitä käsiteltiin 10 uM TAT-RasGAP

317-326, TAT, TAT-salatut tai TAT-mutatoidut puuttuessa tai läsnä ollessa 4-HC, etoposidi, vinkristiini tai doksorubisiinin ilmoitettuina pitoisuuksina. 24 tunnin kuluttua lääkkeen inkuboinnin 7-AAD tai anneksiini V-FITC värjäys suoritettiin arvioimiseksi solukuolemaa. B-C. TC252 (B) ja NB1-FBS (C) solulinjoja käsiteltiin samalla tavalla, mutta yhdessä 4-HC. P10, TAT-RasGAP

317-326; TAT-S, TAT-Salattu; TAT-M, TAT-mutaation; 4-HC, 4-hydroperoxycyclophosphamide. Keinot samalla kirjaimella eivät eroa merkittävästi.

Keskustelu

tällä hetkellä käytössä hoitomuotoja lapsuuden kiinteitä syöpiä, kuten neuroblastooma ja Ewingin sarkooma, on oltava tehokkaampia ja erityisiä parantaa kliininen tulos. Leukemia on yleensä parempi 5 vuoden pysyvyys kuin lapsipotilaiden kiinteiden kasvainten, mutta pitkän aikavälin vaikutuksia hoidon edelleen tärkeä syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Lisäksi kehittynyt resistenssi tavanomaisen hoitojen vastaa pahenemisvaiheita ja huono tulos. Näin ollen löytää vähemmän myrkyllisiä ja tehokkaampia terapeuttisia aineita lasten hoitoon syöpien on välttämätöntä vähentää lääkkeen aiheuttama haitallisia sivuvaikutuksia ja siihen liittyvä kuolleisuus [3].

Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme vaikutus TAT -RasGAP

317-326 useissa lapsuudessa syövän solulinjoissa. Tämä RasGAP peptidin jo oli herkistää aikuisten kasvainsoluihin

in vitro

ja

in vivo

erilaisiin syöpälääkkeiden [12]. Tuloksemme osoittavat, että TAT-RasGAP

317-326 merkittävästi herkistää lapsuuden syöpäsoluja suurimman testatun olosuhteissa. Kuitenkin joissakin tapauksissa, kasvainsolut ei, tai mahdollisimman vähän, vastaa peptidin. Pediatrinen kasvain-herkistävää vaikutusta havainnollistetaan tässä tutkimuksessa saavutettiin käyttämällä puolet käytetystä peptidikonsentraatiosta aiemmin herkistää aikuisten syöpäsolujen (10 uM TAT-RasGAP

317-326 tässä tutkimuksessa eikä 20 uM paperissa on Michod et ai. [12]). Mahdollisesti annos TAT-RasGAP

317-326 voidaan kaksinkertaistaa lisäämään herkistävän tehoa peptidin olosuhteissa, joissa se oli vähemmän tehokasta. Koska primaarikasvaimen solut edustavat kliinisesti merkityksellisiä kunnossa, testasimme myös peptidin ensisijainen neuroblastoomasoluja, jotka ovat peräisin luuytimen näytteitä yhdellä potilaalla (kolme NB1 solulinjat osoittivat kuviossa 4). Tulokset osoittavat, että RasGAP peptidiä herkistää primaarikasvaimen solut, mikä viittaa siihen, että se voisi käyttää sen syövän vastaista aktiivisuutta kasvaimia käytettäessä

in vivo

yhteydessä.

vaikutusmekanismi TAT -RasGAP

317-326 jää määrittää täsmällisesti [18-20]. Alussa oletetaan, että työskentely on suuri paneeli solulinjojen ja sytostaattien antaisi meille mahdollisuuden piirtää kuvio, jota voidaan käyttää ennustamaan, minkä tyyppinen lapsuuden kasvainten näyttää herkkyyttä TAT-RasGAP

317-326 vastauksena tiettyyn huume. Tällaiset tiedot olisi hyödyllistä tulkita vaikutustapa TAT-RasGAP

317-326. Tätä tarkoitusta varten olemme analysoineet, miten puoli maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) kunkin kemoterapeuttinen aine muutettiin läsnäolo TAT-RasGAP

317-326 tietyn solulinjan (taulukko 2). RasGAP peptidin laski IC

50 useimmille genotoxins useimmissa solulinjoissa. Kuitenkaan mitään erityistä mallia, joka perustuu kasvaimen alkuperään tai Huumausainetyyppikohtaiset voitiin päätellä tiedot esitetään taulukossa 2. Me tarkasteltiin myös oliko joitakin yhteisiä erityisiä mutaatioita tunnettujen onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille (esim HRAS, KRAS, kansallisten sääntelyviranomaisten, HDM2, N-MYC, C-MYC, TAL1, FLI-1, MLL, p53 ja RB1) on analysoitu solulinjoissa. Jälleen, ei yhdistys löytynyt välillä spesifisten mutaatioiden syövän solulinjaa ja sen kyky olla herkistynyt RasGAP peptidiä.

Mielenkiintoinen piirre tässä tutkimuksessa on, että herkistymistä vaikutus TAT-RasGAP

317-326 voidaan differentiaalisesti moduloida solu- viljelyolosuhteissa. Tämä ominaisuus on osoituksena se, että NB1-FBS-soluissa, mutta ei NB1-NBM solut, ovat herkkiä peptidin vaikutusta. Nämä kaksi solulinjaa ovat peräisin samasta neuroblastooma kasvaimen alkuperäisen diagnoosin (katso kuvio 4), mutta ne viljeltiin eri mediassa. Nämä kaksi solulinjaa näyttää olevan sama genominen muutoksia. Itse asiassa ne on identtiset array-CGH profiileja samalla tyypillinen neuroblastooma liittyvä segmentaalista kro- mosomaalisen muutoksia (julkaisematon data). Joten jos nämä kaksi solulinjaa on sama joukko-CGH profiilit, mikä voisi selittää niiden eri herkkyys TAT-RasGAP

317-326? Yksi mahdollisuus on, että väliaineen, jossa ne ovat kasvaneet moduloimaan niiden aineenvaihdunta differentiaalisesti. Tämä saattaa puolestaan ​​vaikuttaa niiden herkkyys anti-syövän hoitomuotoja. On todellakin saatu todisteita siitä, että metabolinen tila syöpäsolujen on tärkeä rooli siinä, miten ne vastaavat syöpälääkkeet [41]. Toinen hypoteesi on, että eri solupopulaatiot valitaan päälle kohtia eri välineellä.