Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) on erittäin aggressiivinen, ja nopeasti kehittää resistenssin terapia . SCLC solut ovat tyypillisesti herkkiä glukokortikoidien heikentyneen glukokortikoidireseptoriin (GR) lauseke. Tämä on tärkeää, kuten olemme aiemmin osoittaneet, että ilmaus GR siirtogeenin indusoi solukuolemaa

in vitro

, ja kasvaimen kasvu estyy

in vivo

. Kuitenkin taustalla mekanismi menetys GR ilme ei tunneta. SCLC solulinja, DMS79, on alhainen GR ilmaisua, verrattuna ei-SCLC solulinjojen ja normaalit keuhkoputken epiteelisolujen. Retrovirus-GR ilmentyminen DMS79 soluissa aiheuttanut aktivoituminen apoptoottisen reitin osoituksena selvä induktio kaspaasi-3: n aktiivisuuden. Metyloituvuutta GR promoottorin paljasti joitakin metylaatio 1D ja 1E edistäjiä GR-geenin, mutta arjen konstitutiivisesti aktiivinen 1C promoottori oli raskaasti metyloituja. Vuonna 1C promoottori oli erittäin merkitsevä lisäys DNA-metylaation paneelin 14 ihmisen SCLC-solulinjat verrattuna sekoitettu paneeli GR ilmentävät, ja ei-ilmentäviä solulinjoja, ja perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa. Lisäksi paneelissa SCLC solulinjojen oli merkittävä negatiivinen korrelaatio välillä havaittiin metylaatio 1C promoottorin ja GR-proteiinin ilmentymisen. Käänteinen GR geenin metylaatio DNA metyylitransferaasi estäminen aiheutti lisääntynyt GR mRNA ja proteiini ilmaisun SCLC mutta ei ei-SCLC soluissa. Tämä johti lisääntynyt Gc herkkyyttä, laski Bcl-2 ilmaisun ja nousi kaspaasi-3 aktiivisuutta SCLC soluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio vähentää GR-geenin ilmentymistä ihmisen SCLC-soluja, samalla tavalla kuin perinteisen tuumorisuppressorigeeneille.

Citation: Kay P, Schlossmacher G, Matthews L, Sommer P, Singh D, White A, et al. (2011) menetys glukokortikoidireseptorin Expression DNA Metylointi Estää Glukokortikoidi aiheuttaman apoptoosin in Human pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 6 (10): e24839. doi: 10,1371 /journal.pone.0024839

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 joulukuu 2010; Hyväksytty: 22 elokuu 2011; Julkaistu: 03 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Kay et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIHR Manchesterin Biomedical Research Centre ja Manchesterin yliopisto Alumni -alueella. PK ja GS on saanut BBSRC stipendi palkinto (https://www.bbsrc.ac.uk). GS on myös Barbara Mawer omistetun stipendi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

muutokset epigeneettinen tilan geenit ovat tärkeitä monissa ihmisen sairauksiin, mutta erityisesti syövän [1]. Jotkut näistä välittyvät muutoksia ilmaisun ja toimintaa DNA metyylitransferaasien, DMNT1, DNMT3A ja DNMT3B [2], [3]. Syöpäsolut tyypillisesti ovat hypermetyloitunut CpG-saarekkeiden liittyy tuumorisuppressorigeeneille [1], ja DNMT1 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt keuhkosyöpäpotilaita jotka tupakoivat [4]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet, että tupakansavun syöpää aiheuttavaksi aineeksi, nitrosamiini 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) 1-butanoni (tunnetaan myös nikotiinin johdettu nitrosamiinin ketoni; NNK) ei ainoastaan ​​indusoi geenimutaatioita, mutta lisää myös hypermetylaatiota useita tuumorisuppressorigeenin promoottorit, mukaan lukien sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori 2A (p16ink4a), ja syöttämällä liittyvät proteiinikinaasi 1 (dapk1), ja retiinihapporeseptorin b (RaRb) [4]. Tupakointi on merkittävä riskitekijä ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän, ja tupakointi on itse liittyy metylaatio yli 20 tuumorisuppressorigeeneille [5], [6].

Monet tekijät voivat vaikuttaa glukokortikoidin herkkyys, mukaan lukien geneettiset vaihtelu GR-geenilokuksen, ja ilmentyminen vuorovaikutuksessa proteiinien [7] – [10]. Olemme aiemmin osoittaneet, että ihmisen SCLC solulinjat ovat resistenttejä glukokortikoidi (Gc) hormonit ja huumeiden ja että tämä vastustus johtuu alentunut GR ilmaisun [11], [12]. Palauttaminen GR ilmentymisen soluissa transfektoimalla, tai virustransduktio on riittävä palauttamaan Gc herkkyys [12]. Kuitenkin vielä tärkeämpää, palauttaminen GR lauseke on myös riittävä indusoimaan apoptoosin SCLC-solujen sekä in vitro [13], ja myös ksenograftimallia [14]. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että GR on uusi tuumorisuppressorigeeniä varten SCLC, ja että menetys GR ilmaisun on sekaantunut SCLC synnyssä.

GR-geeni (NR3C1) on läsnä kaikissa, ligandi aktivoida transkriptiotekijä, joka on jäsen tumareseptorisuperperheen. On yhden kopion geeni kromosomissa 5, mutta sen rakenne on monimutkainen, ja suhteellisen vähän tiedetään siitä, miten transkriptio säädellään siitä [15]. Transkriptio ohjaa 9 promoottorit, joista kukin liittyy vaihtoehtoisen transkription aloituskohdasta. Seitsemän näistä promoottoreista ovat ryhmittyneet yhteen CpG-saarekkeen, yhteinen piirre taloudenhoito geeni [16]. Kaikki selostukset tuottaa aito täyspitkä GR proteiinia translaation aloituspaikasta sijaitsee yhteisessä eksonissa 2.

GR aktivoidaan Gc hormonit lisämunuaisen kuoren, tiukassa valvonnassa hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaisen (HPA). Tämä akseli on alle palautteen valvonta hippokampuksessa ja hypotalamuksen aktivoimalla GR proteiinin ilmaistu näitä sivustoja. Vaihtelevuus rotan HPA-akselin sävy on katsoneet muutoksiin hippokampuksen GR ilmaisun, säätelee muuttunut metylaation rotan GR eksoni 1-7 promoottori [17]. Tämä sijaitsee, kuten ihmisen, alkupään CpG-saarekkeen. Uudemmat tutkimukset ovat tutkineet metylaatiostatuksen useita vaihtoehtoisia ihmisen GR promoottorit perifeerisen veren mononukleaaristen solujen [16]. Nämä tutkimukset ovat paljastaneet laajoja, ja vaihteleva metylointi.

aivotursomuodostelmat ja hypotalamuksen GR on keskeinen rooli negatiivinen palaute valvonta hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaisakselin. Muuttunut GR ilmentymistä aivoissa johtaa uudelleen asettaminen sävy tämän neuroendocrine akselin ja tähän liittyy muuttuneisiin metyloinnin hermokasvutekijän indusoituvaa-A (NGFI-A, tai KROX, EGR1) sitoutumiskohtaan rotan eksonissa 1,7 promoottori homologisia ihmisen eksoni 1F promoottori [17] – [19]. Tämä metylaatio ohjattu muutos GR ilmaisun tuloksia seurauksia koko organismin, säätelemällä lisämunuaisen glukokortikoidien tuotanto.

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin rakenteessa GR promoottorin metylaation ihmisen SCLC-soluissa, ja osoitti, että suunnanmuutos metyyli merkkien lisääntynyt GR-proteiinin ilmentymisen, ja toiminta. Lisäksi olemme tunnistaneet negatiivinen korrelaatio GR 1C promoottorin metylaation ja GR proteiinin ilmentyminen poikki paneelin ihmisen SCLC solulinjoissa ja ihmisen kontrolli-soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kunnossapito

A549 ihmisen keuhko- epiteelikarsinooma solut, HEK-293 ihmisen alkion munuaissoluja, HeLa ihmisen kohdunkaulansyövän solut ja U20S ihmisen osteosarkooma-soluja (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, UK) olivat kaikki viljeltiin DMEM (Invitrogen) täydennettynä 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) (Invitrogen).

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä linjat NCI-H358 ja -H727 (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, Yhdistynyt kuningaskunta) ja NCI-H23, -H441 , -H1299 (American Type Culture Collection, USA) kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FCS ja 10 mM HEPES suosittelemia toimittajan.

Small Cell Lung Cancer (SCLC) käytetyt solulinjat tässä tutkimuksessa olivat 10’COR ”solulinjat Cor L24, Cor L27, Cor L31, Cor L32, Cor L42, Cor L47, Cor L51, Cor L88, Cor L99 ja Cor L103. Lisäksi käytettiin DMS 79, DMS 153, HC12 ja HX 148. Kaikki nämä solulinjat, jotka ovat peräisin potilaista, joilla patologisesti vahvistettu SCLC [20], [21], lukuun ottamatta Cor L32, joka oli peräisin potilaalta, jolla huonosti eriytetty squamous keuhkon. Tämä solulinja ei kuitenkaan ominaispiirteet SCLC [21]. Kaikki SCLC solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FCS ja 10 mM HEPES, kuten aiemmin on kuvattu [12].

Ihmisen perifeerisen veren mononukleaariset solut saatiin terveiden paikallisten luovuttajien mukaan LREC hyväksyntä 09 /H1013 /6.

Normaalit ihmisen keuhkoepiteeliverrokkiin kerättiin keuhko resektio yksilöitä leikkauksen jälkeen keuhkosyöpään, täysin, ilmoitti potilaan suostumus.

Hoidot

tarvittaessa soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 100 nM deksametasonia (Sigma-Aldrich) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% C0

2 ennen lyysin. Tietyissä kokeissa soluja inkuboitiin ajoneuvon tai 5 uM 5’Azadeoxycytidine (Sigma-Aldrich) 72 tuntia tai 5 päivää. Käsittelyn jälkeen 5’Azadeoxycytidine joitakin soluja käsiteltiin edelleen 72 tuntia 100 nM deksametasonia.

immunoblot-analyysi

Solut hajotettiin käyttämällä 1 x RIPA-puskuria (100 mM Tris-emäs, 150 mM NaCl, 1% Igepal, 2,5% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EDTA) .Tämä puskuri sisälsi myös proteaasi-inhibiittorit (Roche). Sentrifugoinnin jälkeen 30 minuutin ajan 10000

g

supernatantit kerättiin ja niistä määritettiin proteiinipitoisuus käyttäen Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad). Sitten näytteet laimennettiin latauspuskurissa [0,125 M Tris-HCI (pH 6,8), 0,1% natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 20% glyserolia, 0,2% β-merkaptoetanolia, 0,001% bromophenolblue]. Solu-uutteita (50 ug) analysoitiin sitten SDS-PAGE: lla ja Western blotting, kuten on kuvattu [22], [23]. Ensisijainen käytettävät vasta-aineet olivat hiiren monoklonaalinen anti-hGR (klooni 41, 1:2500), joka sitoo N-terminaalisen alueen GR (BD Biosciences), kanin polyklonaalinen anti-hGR (P-20, 1:500) nostatettu peptidi kartoitus on C-päähän GRa (Santa Cruz) ja hiiren monoklonaalinen α-tubuliinin (1:5000) (Sigma-Aldrich). Sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin olivat piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri (1:5000) ja anti-kani (1:5000) (GE Healthcare). Määrällisesti proteiini tasoilla, Densitometrinen analyysi suoritettiin. Täplät skannattu ja tiheysmittaus kunkin kaistan analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa. Sisäisen kuormituksen valvonta (αTubulin) oli myös määrällisesti ja tulokset normalisoitiin näitä lukemia. Tämä analyysi suoritettiin 3 erillistä blots kutakin koetta varten ja keskiarvo lasketaan.

Reporter Gene määritykset

Solut ko-transfektoitiin 2 ug TAT3-lusiferaasi-konstrukti [13] ja 0,5 ug pCMV

Renilla

lusiferaarikonstrukti (korjaamaan transfektion tehokkuus) käyttämällä Fugene 6 (Roche). Joissakin tapauksissa solut transfektoitiin myös 1 ug GR-ekspressiovektoriin (pFUNC1-GR-EYFP) [13]. Soluja käsiteltiin dex, kuten aiemmin on kuvattu Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega), kuten aiemmin on kuvattu [8].

retrovirusinfektioiden

pFUNC1-EYFP tai pFUNC1 -GR-EYFP transfektoitiin HEK293 retroviruksen tuotannon käyttämällä Fugene HD (Roche, UK), kuten transfektioreagenssin klo 03:02 reagent:DNA suhde. Infektio retroviruspartikkeleiksi osaksi DMS 79 soluihin suoritettiin yksityiskohtaisena ennen. Infektion jälkeen, soluja viljeltiin normaalin kasvun väliaineessa, joka sisältää seerumia 72 tunnin ajan.

pilkottiin kaspaasi-3-määrityksen

DMS 79 soluja, jotka ilmentävät GR-EYFP tai EYFP laitettiin poly-L-lysiini päällystetty peitinlaseja ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä. Solut tehtiin läpäiseviksi PBS /0,2% Triton x 100. Pesun jälkeen soluja blokattiin PBS /0,1% Tween-20 + 5% aasi seerumia. Anti-ACTIVE kaspaasi-3 pAb (Promega, UK) laimennettuna 1:250 estopuskurissa lisättiin soluihin ja inkuboitiin yön yli. Toissijainen vasta-aine, inkubointi suoritettiin pimeässä käyttämällä Alexa Fluor 546 aasin anti-kani-IgG: tä (Invitrogen, UK) laimennettuna 1:500 PBS: ssä. Pääliliuskat asennetaan käyttäen pidentää Gold DAPI (Invitrogen, UK).

Kuvia kerättiin Olympus BX51 pystyssä mikroskooppi käyttämällä 60 x /1,40 UPlanApo tavoite ja siepattiin käyttäen Coolsnap ES kamera (Photometrics) kautta MetaVue ohjelmisto (Molecular Devices). Erityiset kaistanpäästösuodatin sarjat DAPI, FITC ja Texas red käytettiin estämään vuotaa läpi yhdeltä kanavalta toiselle. Kuvat prosessoitiin ja analysoitiin käyttäen ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij).

natriumbisulfiittia Sequencing

Genominen DNA uutettiin useita käytetyt solulinjat tässä tutkimuksessa, joista oli käsitelty 5 ’Azadeoxycytidine (katso tulokset) käyttäen DNeasy veren ja kudosten (Qiagen). Puhdistettu genominen DNA sitten bisulfiitin muunnettava Epitect bisulfiittimutaqeneesi Kit (Qiagen). Tämä muunnettu DNA: ta käytettiin templaattina PCR-reaktiossa monistamaan tiettyjä GR promoottorialueet. GR-promoottorin alueet monistettiin (ja käytetyt alukkeet) olivat seuraavat:

Promoottori

1C (eteen- 5′-AGGTGGATCCGGAAGGAGGTAGYGAGAAAAGAAATT-3 ’; käännetyn 5’AGGTGAATTCACACRAACTCRCAAAATAAAAAAAA-3’).

Promoottori

1D (eteen- 5′- AGGTGGATCCTTTTATAAAAATTTTTTTGGTTGAGG-3 ’; käännetyn 5’AGGTGAATTCCCCCCTACTCTAACATCTTAAAAA).

Promoottori

1E (tulevaisuuteen 5’AGGTGGATCCTTAGAGTTATAAAAATTATAATTTGTGT-3 ’; käännetyn 5’AGGTGAATTCATACAAACAACTTTAAAATACCAAC-3’).

Kaikki alukkeet toimitti MWG-Eurofinsille.

PCR suoritettiin käyttäen Immolase polymeraasia (Bioline) seuraten valmistajan ohjeita. Sykliolosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 10 minuuttia, 30 sykliä, 95 ° C 30 sekuntia, 56 ° C: ssa 45 sekunnin ajan, ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, tätä seurasi lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 minuuttia.

PCR-tuotteet elektroforoitiin polyakryyliamidigeelin ja puhdistettiin käyttäen geeliä (Qiagen). Ligaatiot suoritettiin sitten käyttämällä näitä PCR-fragmentit käyttäen pGEM-T-easy-vektoriin (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Seuraavat transformaation JM-109 toimivaltaiselle bakteerit (Promega), pesäkkeet poimittiin ja niitä inkuboitiin yön yli LB-liemessä 37 ° C: ssa. Minipreparaattien (Qiagen) tehtiin näiden solujen suspensiot, jonka jälkeen restriktiodigestio käyttäen EcoRI (Roche) läsnäolon varmistamiseksi oikean insertin. Plasmidit, jotka sisältävät insertin sitten lähetettiin sekvensointiin käyttäen SP16 alukkeen DNA Sequencing Facility, Manchesterin yliopisto. Alustava tutkimus toteutettiin potentiaalisten metylaation ja vaikutukset 5’Azadeoxycytidine käyttäen DNA DMS 79 soluista. Tässä tapauksessa yksi klooni, analysoitiin kunkin ehdon (kukin yksittäinen promoottori, käsittelemätön tai käsitelty 5’Azadeoxycytidine). Syvällisempi tutkimus suoritettiin analysoida metylaatio 1C promoottorin paneelia SCLC solulinjoissa. Tässä tapauksessa 3 kloonit analysoitiin kohti solulinjaa.

Tilastot

Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS for Windows version 16 Muut tilastollinen analyysi suoritettiin vertaamaan metylaatiotasoilla tri Steve Roberts, Manchesterin yliopisto; käyttäen lineaarista regressiomallia. Yhtälö käytetään tähän analyysi oli seuraava:

Tulokset

Expression of GR heikentävät ihmisen SCLC solulinjaa, DMS79

GR-proteiinia mitattiin hSCLC solussa linja, DMS79 ja verrattiin kahteen Gc herkkien solujen linjat, HeLa ja A549 sekä kaksi Gc resistenttien solulinjojen, U2OS ja HEK293. SCLC solulinja DMS79 ilmaisee alhainen GR-proteiinia, joka on samanlainen kuin U2OS soluihin, ja selvästi paljon vähemmän kuin HeLa ja A549-solut (Fig. 1a). Vertailu paneelin ei-SCLC-solulinjat osoittavat, että ilmentyminen GR on pienempi SCLC-soluja (Fig. 1b). GR-proteiinin havaittiin ilmentyvän normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelin, korjattu keuhkojen kudokseen resektio keuhkosyöpä (Fig. 1 c).

(A) Western blot -analyysi GR, ja tubuliinin proteiinin ilmentymisen U20S, HEK, HeLa, A549 ja DMS 79 solua. Blot edustaa 3 erillisestä kokeesta. (B) Vertailu GR-proteiinin ilmentymisen välillä SCLC, ja ei-SCLC (NS) solulinjat. Kvantitointi GR ilmaisun suhteessa tubuliinia esitetään keskiarvona +/- SEM (N = 3), jossa * osoittaa p 0,05, Studentin t-testi riippumaton näytteitä. (C) Vertailu GR-proteiinin ilmentymisen normaaleissa ihmisen keuhkoputken epiteelin (NBE) verrattuna ei-SCLC solulinja (A549), ja paneelin ihmisen SCLC-solulinjat. Kvantitointi GR ilmaisun suhteessa tubuliinia on esitetty. Keskiarvo n = 2 (D) analyysi GR-proteiinin ilmentymisen käyttäen pan-GR vasta-aine vastaan ​​GR N-päästä (N-termi), ja GRalpha erityinen GR vasta-aine vastaan ​​C-terminaalista (C-termi).

GR liikkui kaksi suurta lajia, ja suhteellinen runsaus näytti vaihtelevat solutyyppejä (Fig. 1a, b). Tämä saattaa heijastaa vaihtoehtoisen silmukoinnin on GRIS isoformia, tai vaihtoehtoinen luennanaloituskeskus käyttö [22] – [24]. Edelleen karakterisoimiseksi lajeja, immunoblot toistettiin käyttäen C-terminaalinen spesifistä vasta-ainetta, joka tunnistaa spesifisesti GRa (Fig. 1 d). Samanlainen ryhmittelyä, joka havaittiin kahden vasta osoittaa molemmat proteiinit jakavat yhteisen C pään domeeni, viittaa siihen, että proteiini monimuotoisuus kuuluu vaihtoehtoisen translaation aloituspaikasta käyttö.

Palauttaminen GR ilmaisun indusoi apoptoosia

vuonna DMS79 soluissa ilmentymisen GR-EYFP siirtogeenin retrovirusinfektiota lisännyt GR-EYFP proteiinin (Fig. 2a) ja apoptoosin osoituksena lisääntynyt pilkottiin kaspaasi-3 SCLC ilmentävät solut GR-EYFP (Fig. 2b). Näissä tutkimuksissa vain vähemmistö soluja tehokkaasti transdusoitu, joten alhainen runsaasti ilmaistuna fuusioproteiinin altaassa soluja. Lisäksi, siirtogeenin ekspression indusoiman apoptoosin, mikä vähentää GR-EYFP pitoisuus yhdistettiin solulysaateista [13], [14].

(A) DMS 79-solut infektoitiin joko GR-EYFP tai EYFP retrovirukset ja GR-proteiini arvioitiin 72 tuntia. (B) DM79 soluja käsitellään edellä kiinnitettiin immunohistokemiaan havaita lohkaistaan ​​kaspaasi-3. Solut värjättiin aktivoitu kaspaasi-3 ja sitten analysoitiin kolokalisaation joko GR-EYFP tai EYFP. Positiivisten solujen prosenttiosuus varten lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja EYFP tai GR-EYFP. Solumäärät johdettu 3 riippumatonta infektioita ja edustettuina prosentteina kaspaasi-3 positiivinen EYFP positiivinen keskiarvona +/- SEM (N = 3) *** osoittaa p 0,001, Studentin t-testi riippumaton näytteitä.

metylaatiostatuksen GR promoottorin SCLC soluissa

laski GR ilmentyminen SCLC solut voivat johtua muutos GR promoottori metylaatio, tai välillisen mekanismin. Siksi metylaatiotilan GR promoottorien DMS79 soluissa tutkittiin bisulfiitti sekvensoinnilla. Emme havainneet mitään DNA metylaatio promoottorit 1B, ja 1F. 1D ja 1E promoottori kukin oli vain yksi metyyli CpG, merkitty avoin laatikko (Fig. 3a, b). Sitä vastoin 1C promoottori oli neljä metyyli CpG: t (Fig. 3c). Havaitut metyloituja CpG: t sijaitsevat mahdollisten transkriptiotekijän sitoutumiskohtia, (CpG: t 6, 44 ja 52), tai sijaitsevat lähellä tällaisen sivuston (CpG 69) (Fig. 3c).

bisulfiittimutaqeneesi sekvensointi suoritettiin uutettu genominen DNA DMS 79 soluja inkuboitiin 5’Azadeoxycytidine 5 vuorokautta (käsittelemätön kontrollina). Kuvan alkuperäinen sekvenssi (saatu genomin Browser) verrattiin vetysulfiitilla käsittelylle DNA-ohjaus ja 5’Azadeoxycytidine käsiteltyjen näytteiden. Bold, avoin laatikot korostaa tiettyjä metyloitu CpG: t, jotka osoittivat käänteinen metylaation jälkeen 5’Azadeoxycytidine inkubaation. Mahdollinen transkriptiotekijän sitoutumiskohtia lähellä metyloitu sivustot ovat merkitty harmaalla varjostus SP1 sitoutumiskohtaan ja tummanharmaa varjostus C /EBPβ sitoutumiskohta. (A) CpG metylaatio GR 1D promoottorialue DMS 79 soluissa. Yksittäiset CpG: t on numeroitu ja isoilla kirjaimilla. (B) CpG metylaatio tietyn alueen GR promoottori 1E peräisin DMS 79 genomista DNA. Yksittäiset CpG: t on numeroitu ja isoilla kirjaimilla. (C) Genominen DNA alue GR-promoottorin 1C päässä DMS 79-soluja. Yksittäiset CpG: t on numeroitu ja isoilla kirjaimilla. Kursivoitu teksti alku ilmoitetaan eksonin 1C.

SCLC solulinjoja ovat lisänneet metylaation GR 1C promoottori

Voit selvittää havaitut muutokset GR promoottori metylaatio havaittiin muilla ihmisen SCLC-solulinjat, paneeli 14 hSCLC solulinjoja vaihtelevalla GR ilmaisu verrattiin kahteen GR ilmentäviä solulinjoja, (A549 ja HeLa) ei-ilmentävä solulinja, (U2OS), ja perifeerisen veren mononukleaarisia soluja kuin ensisijaisen solun vertailu (Fig. 4a, b). Helmet ovat CpG dinukleotideissä asennosta 1 asentoon 69. On ilmeistä, että on olemassa usein metylaation kaksi viimeistä helmiä oikealla, joka edustaa CpG 68 ja 69. on läsnä kaikkialla paneeli SCLC-solujen, ja on myös nähdään kontrollisoluissa. Kuitenkin on myös selvästi lisääntynyt metylaatio asemissa 1-67 poikki SCLC paneeli, jolla ei ole mainittavaa klusterointi. Sen sijaan on hyvin vähän CpG metylaatio nähty asemissa 1-67 kontrolliryhmässä ohjauspaneeli (Fig. 4a, b).

Perimän DNA uutettiin (A) erityinen valvonta- solulinjoja, mukaan lukien ensisijainen ääreisverenkierron mononukleaaristen leukosyyttien terveestä luovuttajasta ja (B) 14 hSCLC solulinjat. Sen jälkeen bisulfiittikonversion 1C promoottorialue monistettiin PCR. 3 kloonit kohti solulinjaa sitten sekvensoitiin. Metylointi paneelissa SCLC solulinjojen ja ohjaus solulinjat näkyy ”helmet”. Kukin yksittäinen helmi edustaa yhtä CpG GR 1C promoottori numerojärjestyksessä vasemmalta oikealle. Valkoinen helmet osoittavat metyloimattomia CpG: t taas musta helmiä osoittavat metyloituja CpG: t. Kaikki 3 kloonit näkyvät kunkin solulinjan analysoitiin.

regressiomalli käytettiin vertaamaan metylaation välinen SCLC paneeli, ja kaikki valvonta solut (taulukko 1). Tämä osoitti, että oli merkittävä ero ryhmien metylaation CpG 69 erikseen; ja CpG- 68 ja 69 yhdessä, ja koko promoottorialueen. Merkittävä ero havaittiin myös ryhmien välillä kaikkien CpG: t ilman 68 ja 69 (taulukko 1).

GR promoottori metylaatio korreloi GR ilme

Across kaikki hSCLC solulinjoissa siellä oli monenlaisia ​​GR ilmaisun, vaikka kaikissa tapauksissa GR oli vähemmän runsaasti kuin HeLa ja A549-ohjaus solulinjoissa (Fig. 5a, b). Siellä oli myös merkitty vaihtelua runsaasti kahden GR proteiinilajit poikki solulinjoissa tutkittiin, mutta tämä analyysi sekä GR proteiini-isoformit tarkasteltiin yhdessä. Suhde GR 1C promoottorin metylaation ja GR-proteiinin ilmentymistä tutkittiin koko paneeli hSCLC solulinjoissa. Oli merkittävä korrelaatio määrä metyloitu CpG: t, ja GR-proteiinin ilmentymisen paneelin hSCLC solulinjojen; r

2 = 0,54 ja p = 0,01 (Fig. 5c).

(A) tyypillisen western blot GR ja tubuliinin 10 SCLC solulinjoissa sekä ohjaus solulinjat HEK (ihmisen alkion munuainen ), U2OS (osteosarkooma), HeLa (kohdunkaulan karsinooma) ja A549 (ei-pienisoluinen keuhkokarsinooma). (B) Densitometria suoritettiin 5 erillistä blotit määrittää tasot GR ilmentymisen suhteen tubuliinin. Kaavio osoittaa keskimääräisen korjattu GR ilme ± S.E.M. (C) välinen suhde metylaatio GR Promoottori 1C ja GR ilmentymisen paneelin ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Kaiken metylaatio (prosentteina) poikki promoottori 1C piirrettiin GR ilmaisua, jossa keskivirhe kutakin solulinjaa. Regressiolinjan oli merkittävästi erilainen kuin nolla (P = 0,01), ja sovituksen hyvyys oli r

2 = 0,54.

Palauttaminen GR ilmaisun kääntyminen DNA: n metylaatio

Jos tappio GR ilmentymisen DMS79 soluissa johtui DNA: n metylaatio, ehkä seurauksena karsinogeneesiin, GR ilmentyminen voidaan ennustaa lisätä seuraavat käänteinen metylaation. 72 tunnin kuluttua hoidon 5’Azadeoxycytidine, GR mRNA-tasot kasvoivat dramaattisesti DMS79 soluissa verrattuna HEK ja A549-soluja, joissa ei ole muutoksia ilmentymistä havaittiin (Fig. 6a). Lisäksi 72 tunnin jälkeen, tai sen jälkeen 5 päivää inkubaation 5’Azadeoxycytidine, oli silmiinpistävää lisääntymistä GR-proteiinia (Fig. 6b). Toisin kasvu GR ilmentymistä nähdään DMS79 on väheni ilmentymistä U2OS soluissa, johtuen mahdollisesti toksisuutta (Fig. 6b).

(A) GR mRNA: n ilmentymisen normalisoida GAPDH vastauksena 72 tuntia hoidon 5’azadeoxycytidine (5’Aza) DMS 79 soluissa, GR puutteellinen HEK-solut, ja GR ilmentäviä A549-soluja. (B) Kaksi GR puutteellinen solulinjat, DMS 79 ja U2OS, käsiteltiin 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) 72 tunnin ajan ja 5 päivää (käsittelemättömät solut kontrollina). Lysaatit analysoitiin sitten Western blot GR ilmaisua. DMS 79 soluja, GR ilmentyminen normalisoitui vastaan ​​α tubuliinia, ja piirrettiin keskimääräinen GR ilme plus S.E.M. (N = 3). * Osoittaa p 0,01 verrattuna kantajalla käsitellystä kontrolli. (C) Paneeli ihmisen SCLC solulinjojen (ylempi paneeli) verrattiin paneelin ei-SCLC solulinjoissa (alempi paneeli) varten vasteen GR proteiinin inkubaation 5’Azadeoxycytidine (5’Aza).

vaikutus 5’Azadeoxycytidine verrattiin sitten ihmisen SCLC solulinjoissa ja ei-SCLC solulinjoja onko sääntelyä GR ilmentymisen metylaatio oli levinnyt keuhkosyöpä. Kolme neljästä SCLC solulinjat osoittivat lisätyn GR ilmaisun jälkeen 5’Azadeoxycytidine hoidon, verrattuna vain yksi neljästä ei-SCLC solulinjoissa (Fig. 6c).

lisäys GR nähty ilme DMS79 solut on ennustettu palauttaa Gc herkkyyden näihin soluihin. Itse asiassa nostettiin Gc transaktivaatio yksinkertaisen reportterigeeni (Fig. 7a). Suuruus Gc induktio oli huomattavasti pienempi kuin mitä havaittiin GR yliekspressio, mutta jälkimmäinen ei johda edellä-fysiologisia GR pitoisuudet kohdesoluissa (Fig. 7a).

(A) käsittely DMS 79 solujen 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) palauttaa Gc herkkyys. DMS 79-soluja käsiteltiin 5’Aza 72 tuntia transfektoitiin TAT3-lusiferaasireporttiterilla konstrukti. Soluja inkuboitiin sitten yön yli kanssa tai ilman 100 nM deksametasonia. Kaavio osoittaa keskimääräisen kertainen muutos (Dex käsitelty /käsittelemätön), (suhteellinen valo yksikköä), (kolmena kappaleena) plus S.E.M. (* = P 0,05). DMS 79-solut olivat myös kotransfektoitiin pFUNC1 GR-EYFP (positiivisena kontrollina) ja TAT3-lusiferaasireportteri- konstrukti. Soluja inkuboitiin sitten yön yli kanssa tai ilman 100 nM deksametasonia. Kaavio osoittaa keskimääräisen kertainen muutos (dex käsitelty /käsittelemätön) plus S.E.M. Kaikki tulokset normalisoitiin vastaan ​​Renilla ohjaus. Tulokset edustavat 3 eri kokeesta. (B) Bcl-2: n mRNA ilmaisun normalisoida GAPDH vastauksena 72 tuntia hoidon 5’Azadeoxycytidine (5 ’atsa) vuonna DMS79 ja HEK-soluissa. (C) Solujen käsittely Aza ja sitten deksametasonin tuloksia apoptoosin. Edustava kuva SCLC-soluja (CORL47) ja ei-SCLC-soluja (NCI-H358), käsiteltiin atsa kuten edellä on kuvattu. Soluja käsiteltiin sitten deksametasonia 72 tuntia, kiinnittää ja värjätä aktiivinen kaspaasi-3. (D) Demetylaatio johtaa huomattavaan kasvuun Gc välittämää apoptoosia SCLC soluissa verrattuna ei-SCLC soluissa. Apoptoosi mitattiin kaspaasi-3-aktivaation jälkeen 5’Aza ja deksametasonia kuten edellä on kuvattu. Harmaat pylväät edustavat soluja käsiteltiin deksametasoni, mustat palkit soluille käsitelty 5’Aza ja sitten deksametasonin kanssa. Kukin solulinja inkuboitiin kolmena kappaleena ja 100 solua laskettiin arvioida% positiivista värjäytymistä. Independent opiskelijan t-testissä * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001.

Lisääntynyt GR ilmentymistä hoitovasteen kanssa 5’Azadeoxycytidine johti tukahduttaminen pro-selviytymisen Bcl-2-geenin sekä HEK, ja DMS79 solut (Fig. 7b). Siellä oli myös lisääntynyt katkaistiin kaspaasi-3 aktivaatio SCLC soluissa, mutta ei ei-SCLC-solujen (Kuva. 7c 7d). On tärkeää huomata, että 5 päivän kuluttua inkubaation 5’Azadeoxycytidine oli solukuoleman induktioon, johtuen mahdollisesti reacquisition GR ilmaisun, tai asetuksen muiden selviytymisen geenejä.

Keskustelu

Epigeneettiset häiriöt ovat osallisina monissa ihmisen sairauksia kuten syöpää. Tupakansavu on tärkein ympäristö- agentti edistää SCLC ja äskettäin, savukkeen savu karsinogeeni, NNK, on ​​osoitettu saavan aikaan tietyn vaikutus edistää DNMT1 ilmaisun, ja toiminta [4]. Siksi tämä karsinogeeni voi toimia indusoimalla epigeneettisiä muutoksia keskeisten geenien patogeneesiin syöpä.

Olemme aiemmin osoittaneet, että glukokortikoidireseptorin on tehokkaasti kasvaimia estävä geeni SCLC, jonka ilmentymistä estetään, [12] . Olemme pidentäneet analyysi tässä tutkimuksessa osoittaa jälleen, että GR ilmaisu on pienempi paneeli SCLC-solujen verrattuna ei-SCLC-solujen tai normaali keuhkoputken epiteelisolujen. Reacquisition GR ilmaisun, ja glukokortikoidi herkkyyttä SCLC soluissa

in vitro

tai ksenograftikasvaimissa johtaa apoptoosin [13], [14]. GR ilmentyy useimmissa soluissa ja kudoksissa, ja kiinnostavuus pleiotrooppisia vaikutuksia soluihin. Kuitenkin suhteellisen vähän tiedetään miten GR geenien ilmentyminen säätelee, koska se on harvinaisen monimutkainen promoottori rakenne. Uudemmat tutkimukset ensisijainen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa määritelty erittäin yksittäisiä malleja GR promoottorin metylaation [16]. Tämä työ on myös kartoitettu mahdollisia, ja todistettu transkriptiotekijän sitoutumiskohtien promoottorit, joista suurin osa sisälsi CpG sivustoja, jotka voitaisiin metyloitu. Tämä viittaa siihen, että ero metylaatio ihmisen GR-promoottori on mekanismi ohjaamaan promoottorin käyttöä, ja niin GR-geenin ilmentymisen.

kolme GR promoottorit tutkittiin indeksi solulinjassa, DMS79, ja kaikki kolme sisälsivät metyloituja CpG-sivustoja . Lisäksi analyysi suoritettiin 1C promoottorin on osoitettu ilmentyvän kaikissa testatuissa kudoksissa, mukaan lukien keuhkojen [15]. Oli ilmeinen ja erittäin merkittävä kasvu CpG metylaatio poikki paneelia hSCLC solulinjojen verrattuna ei-SCLC A549. Mikä tärkeintä ei ollut kasvua kahden ei-ilmentäviä ohjaus solulinjoja (U2OS ja HEK293), mikä osoittaa, että 1C promoottori metylaatio ei tarvitse rajoittaa GR ilmaisua, mutta että muut mekanismit voivat soveltaa säädellä GR sen erilaisissa solutyypeissä. Laajempi vertailu hSCLC solujen ja heterogeeninen paneeli GR ilmentävät, ja ei-ilmentävien solulinjojen havaittiin myös erittäin merkittävää kasvua metyloitu CpG sivustoja hSCLC soluissa.