Krooninen sairaus

tiivistelmä

DRAM on lysosomaalisen kalvon proteiini ja on kriittinen p53-välitteisen autophagy ja apoptoosin. DRAM on mahdollinen kasvain heikentävän toiminto ja on vaimentua monissa ihmisen syövissä. Kuitenkin sääntelyn DRAM ilmaisun on huonosti kuvattu toistaiseksi. Täällä, osoitimme, että seerumideprivaation indusoi voimakkaasti DRAM ilmentymistä maksan syöpäsoluja ja ydin DNA-sekvenssin DRAM promoottori on olennainen sen reagoida seerumideprivaatiolle. Olemme lisäksi havaittu, että euchromatin merkkiaineita aktiivista transcriptions edustaa diasetyyli-H3, tetra-asetyyli-H4 ja trimetyyli-H3K4 ytimessä promoottorialueen DRAM geenin ilmeisesti lisääntyneet ajasta riippuva tavalla upon seerumideprivaation, ja samanaikaisesti dimetyyli- -H3K9, joka on herterochromatin markkeri liittyy vaiennetaan geenejä, oli aika riippuvaa laskua. Lisäksi kromatiinin remodeling tekijä Brg-1 on rikastettu ytimessä promoottorialueen DRAM-geenin, jota tarvitaan seerumin puutteen indusoimaa DRAM ilmaisua. Nämä havainnot pohjustettiin lisätutkimuksia DRAM-geenin ilmentymisen.

Citation: Ni P, Xu H, Chen C, Wang J, Liu X, Hu Y, et al. (2012) seerumistarvaatio indusoi DRAM ilmentäminen Liver Syöpäsolut kautta histoni Räätälöinti Sen Promoottori Locus. PLoS ONE 7 (12): e50502. doi: 10,1371 /journal.pone.0050502

Editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 24 lokakuu 2012; Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Ni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Science and Technology komitean Shanghai Metropolitan (11ZR1423100); National Science Foundation of China (myöntää nro .: 30772233, 30873057 Y. Lu, ja 81172028 Z. Hou); Tärkeimmät Basic Project Shanghai Municipal Science and Technology komission (nro .: 08JC1413600); Shanghai komitean Science and Technology (11DZ2260200); ja 985 Kasvain yhteinen Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

inaktivoituminen solukuoleman polkuja on keskeinen osa syövän etenemisen [1]. Erilaisia ​​mekanismeja normaaleissa ihmisen soluissa vedota solukuoleman ja hävittää vaurioituneita soluja, jotka voivat kasvaa poikkeavasti muodostaa kasvaimia [2] – [4]. Normaalioloissa macroautophagy (jäljempänä ’autophagy ”) on tiukasti säädeltyä kalvoon seurantaprosessia hajottamiseksi ja kierrätystä sytosolin proteiinien ja soluelimiin klo pohjapinta tasoilla. Se voidaan saada aikaan yli perustason vasteena erilaisiin ärsykkeisiin, kuten ravinteiden nälkään, infektio, genotoksisia aineita tai sytokiinejä [5] – [8]. Autophagy voivat toimia erilaisissa yhteyksissä joko edistää tai estää solujen eloonjäämistä [1], [5], [7], [9] – [11], mikä viittaa siihen, että se voi olla tärkeä patologinen rooli syövän synnyssä.

Ihmisen

DRAM

(vahinko-säännelty autophagy modulaattori) geeni tunnistettiin p53-aktivoitu-geeni, joka koodaa erittäin konservoitunut lysosomaalisen kalvon proteiini ja muodostuu 238 aminohapon pituinen [12]. DRAM ei ole vain kriittinen kyky yliekspressoitu p53 tai DNA-vaurio-aktivoitua p53 moduloida autophagy [13], mutta myös p53: n kykyä indusoida apoptoosia [9]. DRAM on erityisesti paikallistettu lysosomeihin, organelle osallistuvat viimeisessä vaiheessa autophagy [12]. Siksi on todennäköistä, että DRAM voi säädellä autophagosome-lysosomifuusio, prosessi tarvitaan sukupolven autophagolysosomes.

On osoitettu, että DRAM on mahdollinen kasvain heikentävän toiminto ja on vaimentua monissa ihmisen syövissä [ ,,,0],12]. Vaimennussäätely DRAM mRNA näissä syöpäsoluissa tapahtuu sekä suoralla hypermetylaation sisällä CpG saari promoottorialue tästä geenistä ja muiden, vielä tuntemattoman, mekanismit, kuten epigeneettiset muutokset ydinhistonien lähellä DRAM-geeniä [12]. Tässä raportissa olemme tunnettu ihmisen DRAM-geenin promoottori ja tunnistettiin DNA-sekvenssit ovat olennaisia ​​sen sääntelyä.

Tulokset

seerumistarvaatio stimuloi DRAM ilmentymistä maksassa syöpäsoluissa

Deprivation seerumin indusoi apoptoosia ja autophagy monissa solutyypeissä, mukaan lukien HepG2 ja HepB3 soluja. Nämä havainnot sai meidät tutkimaan, seerumistarvaatio voisi aiheuttaa DRAM ilmentymistä maksan syöpäsoluja. HepG2 ja Hep3B-soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. Nämä solut pestiin PBS: lla kolme kertaa ja syötettiin media jättämällä FBS eri ajanjaksoina. Saatu solut kerättiin ja koko RNA: t uutettiin. Ilmaisu DRAM mRNA tutkittiin kvantitatiivisen RT-PCR (qRT-PCR). Sekä HepG2 ja Hep3B solujen mRNA DRAM merkittävästi indusoi 24 tunnin jälkeinen seerumideprivaation, ja saavutti korkeimman tason 48 h (kuvio 1A, B) vastaavalla tavalla, mikä viittaa siihen, että seerumideprivaation indusoi DRAM ilmentymistä maksassa syöpäsoluissa . Taso DRAM proteiinien HepG2-soluissa eri ajankohtina tutkittiin western blot määrityksiä. Johdonmukaista ilmaus DRAM mRNA havaitsemat qRT-PCR, DRAM proteiinia heikosti havaittiin 3 tunnin kuluttua seerumideprivaation ja saavutti korkean tason 24 ja 48 tunnin seerumideprivaation (kuvio 1 C).

(A) mRNA tasolla DRAM-geenin kun seerumideprivaation eri ajankohtina kvantitoitiin reaaliaikaisen RT-PCR HepG2-soluissa. (B) DRAM ilmentyminen Hep3B soluissa on samanlainen kuin HepG2-soluissa. (C) analyysi DRAM-proteiinin ilmentymistä HepG2-soluissa. CD166 toimi positiivisena kontrollina seerumistarvaatio aiheuttama proteiinin ilmentymisen. Soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. Nämä solut pestiin PBS: lla ja syötettiin DMEM jättämällä FBS eri ajankohtina. Saatu solut kerättiin ja koko RNA: t ja kokosolulysaateille uutettiin ja ilmaisu DRAM-mRNA: n ja proteiinin tutkittiin qRT-PCR: llä tai western blotilla. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (D) esto proteiinisynteesiä ei vaikuta seerumistarvaatio aiheuttama DRAM ilmentymisen HepG2-soluissa. Soluja käsiteltiin CHX (10 mM) alla seerumideprivaation 24 tuntia, ja kokonais-RNA uutettiin analyysiä varten DRAM ilmaisun reaaliaikaisella PCR: llä. Kaikki tulokset esitetään keskiarvoina ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. **,

p

0,01 tasolla käyttäen t-testiä.

Voit selvittää uutta proteiinisynteesiä vaadittiin seerumideprivaation aiheuttavan DRAM ilmaisun Sykloheksimidi (CHX) levitettiin että seerumivapaassa 30 minuutin estää uuden proteiinin synteesiä. Esikäsittely HepG2 solujen CHX ei estänyt seerumin puutteen indusoimaa DRAM ilmentyminen (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että säätely DRAM ilmaisu on riippumaton proteiinisynteesiä HepG2-soluissa.

proksimaalinen alue DRAM-promoottorin on herkkä Nukleaasidigestio

tunnistamiseksi säätelyelementtejä, jotka vastauksena seerumideprivaatiolle DRAM promoottori, lähdettiin alun perin määritellä transkription aloituskohdasta (TSS) DRAM-geenin käyttämällä 5 ’RACE määrityksissä . DNA-sekvensointi vahvisti, että kolme PCR-tuotteet on nimetty tuote 1 (~216 bp), tuote 2 (~172 bp), ja tuote 3 (~106 bp) oli suoraan monistuksissa 5 ’UTR DRAM-geenin (kuvio 2A). Alin kaista (~47 bp) geelissä oli ei-spesifinen monistuminen alukkeiden itse. Ensimmäinen nukleotidejä Tuote 1, 2, ja 3 havaittiin A, T ja A (kuvio 2B). Tuote 1 ja tuote 2 oli 65 bp ja 20 bp ylävirtaan, kun tuote 3 oli 107 emäsparia alavirtaan ensimmäisen nukleotidin DRAM cDNA-sekvenssin löytyy Gene Bank of National Center for Biotechnology Information (Gene ID: 728655). Kätevä kuvaus Tästä eteenpäin mielivaltaisesti siirsi nukleotidi A tuotteen 1 kuten TSS (+1).

(A) Agaroosigeeli- osoitti useita 5’RACE PCR-tuotteita. (B) kartoitus mahdollisista TSS on

DRAM-geenin

. Nuoli osoitti sisäkkäistä reverse 5’RACE pohjamaali. Generacer PCR, joka perustuu RNA-ligaasia-välitteisen ja oligo-rajaaminen nopea monistus cDNA, suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-tuotteet erotettiin agaroosigeelissä, ja mahdolliset vanteet kerättiin ja varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. * Tarkoittaa ei-spesifisen monistamisen pohjamaalin himmentimet.

edelleen antaa vihjeitä etsimään säätelyelementit klo DRAM promoottori, suoritimme CHART-PCR-määrityksissä arvioida saatavuuden DRAM promoottorin DNA Nukleaasidigestio. Ytimiä eristetty HepG2 ja Hep3B-soluja hajotettiin DNaasi I tai MNase ja saatua genomi-DNA-fragmenttien välillä -7216 ja + 289 bp (suhteessa sijainnin TSS) analysoitiin käyttämällä kvantitatiivista PCR-määrityksissä (kuvio 3A). Tiedot esitettiin prosenttipiste välisen ehjän DNA-nukleaasi-käsiteltyjen näytteiden ja käsittelemättömän, ja olivat kääntäen heijastuu osuus suojatun DNA. DNA-fragmentit, jotka kattavat proksimaalisen promoottorin (R5, R6 ja R 7) olivat herkempiä DNaasi I ja MNase ruoansulatusta, erityisen R6 (-144-72), joilla pienin suojaa ~35% molemmissa soluissa tutkittiin, kun taas korkeammat suojausominaisuuksia DNaasi I tai MNase ruoansulatusta havaittiin R1 ja R2 alueella, mikä osoittaa, että DNaasi I ja MNase saatavuutta on rajoitettu proksimaalinen promoottorialue, erityisesti R6 alueelle (kuvio 3B).

(A) Kaavamainen esitys alukesarjoista käytetään CHART-PCR. (B) R6 alueella DRAM-promoottori on herkempi DNaasi I ja MNase ruoansulatusta. Genominen DNA eristettiin Hep3B ja HepG2-soluissa ja analysoitiin kvantitatiivisella PCR: llä. Tiedot esitettiin prosentteina pilkottu DNA: iden undigested DNA: t. (C) seerumideprivaation kasvattaa saatavuutta R5, R6 ja R7 alueiden nukleaasihajotuksen Hep3B ja HepG2-soluissa.

vaikutuksen tutkimiseksi seerumin puutteen DNA saavutettavuutta DRAM-promoottorin DNaasia I ja MNase ruoansulatusta, ytimiä eristetty HepG2 ja Hep3B soluja kasvatettiin seerumivapaassa 48 tuntia altistettiin Nukleaasidigestio ja CHART-PCR-analyysillä. Sitä, että kaikki R5, R6 ja R7 alueiden Nukleaasidigestio lisääntyi merkitsevästi molemmissa soluissa upon seerumideprivaation kanssa R6 alueen näyttämällä vähiten suojaustaso (kuvio 3C). Yhdessä nämä tiedot sekaantumaan että proksimaalinen alue DRAM promoottori sisältää otaksutun cis-säätelyelementtejä reagoi seerumideprivaatiolle.

seerumistarvaatio saa aikaan muutoksia histonimodifikaation klo DRAM promoottori loci

Edelleen vahvistaa havainto, että proksimaalinen alue DRAM promoottori sisältää otaksutun cis-säätelyelementtejä seerumideprivaatiolle selvitimme histonimodifikaation asema tässä lokuksessa käyttämällä sirun määrityksiä. Histoni asetylaatiot kuten lysiinin asetylointi H3 ja H4 ovat yleisesti tiedetään liittyvän kanssa aktiivisesti puhtaaksi geenien ja avoin kromatiinirakenteeseen [14] – [16]. Spesifisten vasta-aineiden diasetyloituja H3 (K9 ja K14) ja tetra-asetyloidut H4 (K5, K8, K12 ja K16) käytettiin suorittamaan siru analyysi määrittää kuvion histonien muutostöissä DRAM promoottori lokuksen kanssa tai ilman seerumia. Vuonna Hep3B-soluissa sekä H3 ja H4 ovat asetyloitu R1, R6 ja R7 alue, jossa R6-lokukseen, jolla on suurin asetylaatio tasolla. Histoni asetylaatio oli ilmeisesti lisääntyi ajasta riippuva tavalla upon seerumideprivaation klo R6 ja R7 alueilla, mutta ei R1 alueen (kuvio 4A, B) B

Hep3B solut valmistettiin varten chromatin IP (chip) määritykset . Kromatiinin DNA: t immunosaostettiin spesifisillä vasta-aineilla on H3K4me3 (A), anti-di-asetyyli-H3 (B), anti-H3K9me2 (C) ja anti-tetra-asetyyli-H4 (D), ja rikastetun DNA-fragmentit reunustavat DRAM promoottori analysoitiin kvantitatiivisella PCR. Tulokset esitettiin määrä DNA talteen spesifisten vasta-aineiden suhteen DNA rikastaa sopivan IgG valvontaa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta. *: P 0,05.

Seuraavaksi tutkimme histoni metylaatiostatuksen lokukseen DRAM promoottori. Trimetyyli–H3K4, joka on euchromatic merkki [17] – [18], näytetään samanlainen kuvio diasetyyli-H3 ja Tetra-asetyyli-H4 in Hep3B solussa (kuvio 4C), kun taas dimetyyli-H3K9 pisteytettiin alhaisimpia R6 alueella osoitteessa perustason ja väheni yhdessä pitkäaikaisen seerumistarvaatio (kuvio 4D). Dimetyyli-H3K9 toimii signaali chromatin hiljentäminen rekrytoimalla HP1 proteiinit (heterochromatin proteiini 1) ja sulkevat toisensa pois H3-K9 asetylointi [19]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että transkription aktivointi DRAM-geenin korreloi lisääntyneen paikallisen euchromatic markkereita ja samanaikaisesti vähentynyt heterochromatic markkereita.

NF-KB ei ole vastuussa aktivoinnista DRAM-promoottorin

tunnistamiseksi minimaalinen säätelyelementtejä seerumin puutteelle DRAM-promoottori, eri fragmentit proksimaalisen DRAM-promoottori insertoitiin ylävirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-reportterivektoria. Transkription toiminta Näiden rakenteiden tutkittiin vuonna Hep3B ja HepG2-soluissa. Reportteri sisältävä -1741 /+ 299 fragmentti vain heikosti vastasi seerumideprivaatiolle, kun toimittajat, jotka sisältävät -863, -75, 19 /+ 299 fragmentteja näytetään merkittävä korkea lusiferaasi toimintaa reagoivat seerumideprivaatiolle. Huomiota herättävää on, toimittaja sisältävä + 28 /+ 299-fragmentti osoita mitään aktiivisuutta seerumideprivaatiolle (kuvio 5A). Nämä tiedot osoittavat, että cis-säätelyelementtejä seerumideprivaatiolle DRAM promoottori asui alueella reunustavan -19 /+ 28 nukleotidin (kuvio 5B). Promoottori reportteri, joka sisältää lyhyen DNA-fragmentti, joka sisältää -19 /+ 28 alueella nimettiin Luc-DCP jäljempänä.

(A) Hep3B ja HepG2-soluja transfektoitiin ohimenevästi toimittaja plasmideilla, jotka sisältävät typistettyjä versioita promoottorialueen

DRAM

geenin ilmoitettu. Luc-DCP määritellään reportteri, joka sisältää lyhin promoottorialue (-19~ + 28). (B) Ydin-promoottorialue sisältää oletetun NF-KB: n sitoutumiskohtaa. Transkriptiotekijän sitoutumiskohdat esitetään ytimen promoottorialue (-19~ + 28) on lähdettävä web-ohjelmisto TFSEARCH ja Matlnspector ja mutaation tai deleetion plasmideja muodostettiin käyttäen kohdennetun mutageneesin menetelmällä. (C) mutaatio tai deleetio NF-KB-sitoutumiskohdan ei vaikuta ydin promoottorin aktiivisuutta.

Kun pyritään etsimään mahdollisia transkriptiotekijän sitoutumiskohdat -19 /+ 28 alueella, me seuraava tehtävä kattava bioinformatiikka analyysin ja löytänyt yhden kanonisen NF-KB-sitoutumiskohta asunut tällä alueella. Vahvista jos tämä otaksuttu NF-KB-sitoutumiskohta on toiminnallinen, teimme poisto ja mutaatio tällä sivustolla (kuvio 5B). Yllättäen poistaminen tai mutaatio tämän NF-KB-sitoutumiskohta ollut mitään näkyvää vaikutusta promoottorin aktiivisuutta reagoi seerumideprivaatiolle (kuvio 5C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että muut tekijät, ei NF-KB: n on tarpeen DRAM induktio seerumideprivaation.

keskeiset tekijät transkription koneiden kompleksin sitoutuneena proksimaalisen alueen DRAM-promoottorin

Brg I ja RNA-polymeraasi II pääkomponentit RNA-polymeraasi II holoenzymes, jotka osallistuvat geenin transkription [20]. Kro- päässä Hep3B ja HepG2-solut kerättiin ja saostettiin anti-Brg I ja anti-Pol II-vasta-aineita. Saostunut DNA: t arvioitiin reaaliaikaisen PCR. Brg I sidottu eniten DNA on R6 alueen molemmissa soluissa, kun taas Pol II sitoutuneena R6 ja R7 alueilla, joilla on suurempi affiniteetti kuin R4 alueen (kuvio 6A). Silmiinpistävän, seerumideprivaation johti lisääntyneeseen sitoutumiseen Brg I ja Pol II DNA R6 alueen ja tällaiset korotukset nähtiin jo 5 min jälkeen seerumideprivaation ja saavutti korkeimman tason 30 min molemmissa soluissa (kuvio 6B).

(A) Brg-1 sitoutuu proksimaalisen alueen DRAM-promoottorin. ChIP määritykset suoritettiin Hep3B ja HepG2-soluissa. (B) seerumideprivaation parantaa Brg-1 ja Pol II sitoutumaan DRAM promoottori lokuksessa. (C) ehtyminen Brg-1 käyttämällä erityisiä kohdistamista shRNA poistetaan seerumideprivaation aiheuttama DRAM ilme.

Brg-1 tarvitaan seerumideprivaation induktion DRAM ilmaisun

Jotta voidaan tutkia roolia ja Brg I induktion DRAM ilmentymisen, HepG2-solut transfektoitiin siRNA oligojen vastaan ​​erityisesti Brm tai Brg I 24 tuntia, minkä jälkeen RT-PCR-määrityksissä (kuvio 6C, vasen paneeli). Induktion DRAM ilmentymisen seerumideprivaation poisti ehtyminen Brg I. Kuitenkin knockdovvn Brm ei vaikuttanut ilmaus DRAM (kuvio 6C). Nämä tulokset osoittavat, että Brg-I on välttämätöntä DRAM induktioon vasteena seerumideprivaatiolle.

Keskustelu

DRAM on mahdollisesti kasvaimen suppressoiva funktio ja on kriittinen p53 moduloida autophagy ja apoptoosin [ ,,,0],12]. Siksi löytö sääntelyn tekijöitä, jotka ohjaavat DRAM ilmaisu antaa kohteita uusille terapeuttisten. Kuitenkin sääntelyn DRAM ilmaisun on huonosti kuvattu toistaiseksi. Täällä me osoitettu ensimmäistä kertaa, että seerumideprivaation voimakkaasti indusoi DRAM ilmentymistä maksasyövän HepG2 ja Hep3B soluissa ja yksilöidään keskeisimmät DNA-sekvenssi DRAM promoottori, joka on välttämätön sen reagoida seerumideprivaatiolle.

Aiemmin DRAM tunnistettiin p53 indusoi geeni ja funktionaalinen p53-vaste-elementti sijaitsee 2,3 kb ylävirtaan DRAM-promoottorin [21]. Täällä, osoitimme, että seerumistarvaatio indusoi DRAM ilmaisun HepG2, p53 positiivinen solu, ja Hep3B, p53 negatiivinen soluja samalla tavalla, mikä viittaa p53 ei voi olla ratkaiseva tekijä osallistuu tähän induktioon [22]. Se on kuitenkin suurta kiinnostusta nähdä, jos on olemassa jokin yhteistyötä p53and seerumideprivaation sääntelyssä DRAM ilmaisun.

tulokset osoittivat, että mitä kauemmin fragmentti (-1714) heikosti vastasi seerumin nälkään. Oletamme, että pidemmällä fragmentti on olemassa tukahduttavia cis tekijöitä, jotka voisivat pienentää pohjapinta aktiivisuutta DRAM promoottori. Lyhyt versio promoottori ei sisällä tällaisia ​​elementtejä, ja näyttää korkea transkriptioaktiviteettia.

asetylointi ja metylointi lysiinijäännöksissä of ydinhistonin hännät ovat kriittisiä geenin transkriptio [23] – [24]. Asetylaatiot lysiinien H3 ja H4 ovat yleisesti tiedetään liittyvän kanssa aktiivisesti puhtaaksi geenien ja avoin kromatiinirakenteeseen [15] – [16], [25]. Johdonmukaisesti, havaitsimme, että Hep3B ja HepG2-soluissa lysiiniä asetylointi H3 ja H4 ilmeisesti lisääntyi ajasta riippuva tavalla upon seerumideprivaation ytimessä promoottorialueen DRAM-geenin. Trimetyyli–H3K4, joka on euchromatic markkeri aktiivinen transkriptio, näytetään samanlainen kuvio diasetyyli-H3 ja Tetra-asetyyli-H4 in Hep3B solussa. Sen sijaan dimetyyli-H3K9 pisteytettiin alhaisimpia R6 alueella on perustason ja oli aika riippuvaa laskua upon seerumideprivaation. Dimetyyli-H3K9 toimii signaali chromatin hiljentäminen rekrytoimalla HP1 proteiinit ja sulkevat toisensa pois H3-K9 asetylointi. Nämä tiedot viittaavat siihen, että seerumin puute voi aiheuttaa yhteistyöhön kokoonpano histoni ase- tyylitransferaaseja deasetylaaseja ja metyylitransferaasit, transkription monimutkainen tavoite kromatiinin muuttaa histoni-koodit. Emme kuitenkaan ole selvää, mitkä histoni määritteet rekrytoidaan tässä lokuksessa. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että muutokset tukahduttavia aktiiviseen histonimerkkien tapahtuvat ensimmäiset 15 minuuttia, ja eivät merkittävästi muutu lainkaan vasta 24 tuntia, kun taas mRNA DRAM lisättiin asteittain ja saavutti korkean tason vasta 24 tuntia ja 48 tuntia. Tämä näennäinen viive DRAM mRNA ilmentyminen voi johtua aika kokoonpanoon transkription koneen tehokkaasti ajaa DRAM-geenin ilmentymisen. Kuitenkin tarkka mekanismi on selvittämättä. Tällä hetkellä yritämme tunnistaa mahdolliset proteiini kompleksit, jotka voivat sitoutua tähän ytimeen DNA-sekvenssi DNA-pulldown ja massaspekrometria lähestymistapoja ja on tunnistettu useita proteiineja, kuten p300, jotka voivat mahdollisesti sitoutua ydin edistäjä DRAM. Heidän roolinsa sääntelyssä DRAM ilmaisun parhaillaan perusteellisesti kuulustellaan.

tuumorisuppressorin Brg-1 on keskeinen osa SWI /SNF chromatin- remontin monimutkaisia ​​[26]. Tämä kompleksi voidaan aktivoida geenin transkriptio remontin kromatiinirakenteeseen upon huolestuttavaa DNA-histoni vuorovaikutuksiin nukleosomit. Olemme osoittaneet, että Brg-1 on rikastettu ytimessä promoottorialueen DRAM-geenin ja tarvitaan seerumideprivaation aiheuttama DRAM ilme.

Proteiini Brm (Brahma) voidaan korvata Brg-1 ja täyttävät helikaasia /ATPaasi funktio kompleksin in vitro. Kuitenkin Brg-1 ja Brm eivät toiminnallisesti vaihdettavissa in vivo. Homotsygoottinen

Brg1

Knockout alkiot kuolevat ennen istutusta ja heterotsygoottinen hiiret ovat alttiita kehittämään kasvaimia [26] – [27], kun taas

BRM

aihiot ovat elinkelpoisia eivätkä kehittää kasvaimia [28] – [29]. Tasaisen, ehtyminen Brg-1 HepG2-soluissa lakkautetaan seerumideprivaation aiheuttama DRAM ilmaisu, kun taas ehtyminen Brm ei vaikuttanut DRAM ilmaisua. Brg-1: n on osoitettu avainasemassa säätelyssä solun apoptoosin ja autophagy, mutta kätyri mekanismit ovat epäselviä. Tunnistaminen DRAM on välittömänä kohteena Brg-1 uutta tietoa molekyylitason säätelyyn autophagy.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, transfektiot ja plasmidit

HepG2 ja Hep3B-soluja (ATCC) pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää (Gibco), 2 mM L-glutamiinia, ja penisilliiniä (50 U /ml) /streptomysiiniä (50 ug /ml) 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kostutetussa kammiossa.

Solut transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. SiRNA oligot erityisesti suunnattu BrgI (CGCGCUACAACCAGAUGAATT), BRM (GGAUUGUAGAAGACAUCCATT) tai negatiivinen kontrolli (ryntäily RNA, UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) hankittiin (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, Kiina).

käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR ) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen). Reaktioseoksen (20 ui), joka sisälsi 1 ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi, että käyttö PrimeScript RT-polymeraasia (Takara). Saatu cDNA: t analysoitiin kvantitatiivisella PCR: llä (Mx3000P real-ime PCR System, Stratagene, La Jolla, CA, USA) spesifisiä alukepareja DRAM ja GAPDH. Tulokset esitettiin suhteet koko mRNA tasot DRAM vastaan ​​β-aktiini.

5′-RLM-RACE

GeneRacer järjestelmä (Invitrogen), joka perustuu RNA ligaasilla välittämän ja oligo -capping nopea monistus cDNA, suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pakkaukseen varmistaa monistuminen vain täyspitkä transkriptien poistamalla katkaistu viestit monistusprosessia. DRAM-spesifisiä alukkeita (F, TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAGC, R, GCGAGCTCCAAGCGGACGCGACTAC) käytettiin monistamiseen PCR: llä käyttäen LaTaq GC-rikas PCR -järjestelmää (Takara, Inc., Dalian, Kiina).

Kromatiini saatavuutta analyysi

esteettömyys DNA DNaasi I ruoansulatusta ja MNase (Takara, Inc., Dalian, Kiina) analysoitiin käyttämällä kromatiinin saavutettavuutta CHART-PCR kuten aiemmin on kuvattu [30] – [31]. Kokeet toistettiin kolme kertaa itsenäisesti. Primer paria eri alueilla seurasi: R1 (F: TCCAACCCTCATGGATGGCTTTTAG; R: ATTCAGTCACATCTTCAGGCTCTAC); R2 (F: ATGAATCAGTAGTAGGGCACGAAAG; R: CAGCCTGGTCAACAGATAGAG); R3 (F: TTGCGGGTCTCACTATATTGTCCAG, R: GGGCAGACTAGTATTTCAAGAGATC); R4 (F: TCCAGAACACAAATCCCTTTCACAG, R: GAGCCTTTATCACACCACTTCACTC); R5 (F: CGCTCTCCTGGAAAGCAGCACAATG, R: AGTGTTCAATGAGGTTCGCCAGGTC); R6 (F: ACCTCATTGAACACTTCTGCCCGAC; R: GCTCTTGCGCAACTCTGGAGAAAAG); R7 (F: CGAGTGTCCAAACCAAAAGCGAAAG; R: TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAG).

Kromatiini immunosaostuksella (chip)

ChIP määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden (Active motiivi, Carlsbad, CA, USA). Proteiini-DNA-kompleksit immunosaostettiin 4 ug vasta RNA-polymeraasi II (SC-9001, Santa Cruz Biotechnology), ja Brg1 (SC-10768); dimetyyli-H3-K9 (ab1220, Abcam), tetra-asetyyli-H4 (06-866, Upstate) ja diasetyyli-H3 (07-593, Upstate); ja trimetyyli-H3-K4 (9751, Cell Signaling Technology). Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja 1 ui saostuneen DNA: ta. DNA toipunut näytteistä, jotka sisältävät vasta-ainetta verrattiin IgG valvontaa suoritetaan alikvootteja samasta chromatin valmistelua. Tulokset esitettiin määrä DNA talteen suhteessa sopivan IgG ohjaus tarjoamia valmistajat. Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta.

rakentaminen DRAM promoottori-lusiferaasireportteri- plasmidit ja lusiferaasimääritystä

PCR-määritykset suoritettiin käyttäen alukesarjoja spesifinen

DRAM

promoottori (F-1714): AGGAACGCGTACTCCACGGCCACAGTGATCTCTTG; F (-863): TGGAACGCGTGGCCACATATGTTGGGCTCAGACTC; F (-75): TGACACGCGTGGTGGCCACTCTCACTGCTGCGAAG; F (-19): TGACACGCGTTCGGGGTGCGAGGCCCGGCACTC; F (+28): TGACACGCGTGTTGGGAGAAATAAATCCTTTTCTC; R (+299): CGTACTCGAGCGGGCTTGTTGCGAAACGAGTGAAG). Nämä PCR-tuotteet kloonattiin MluI /XhoI-kohtiin pGL3-Basic-vektoriin (Promega, Madison, WI, USA). Promoottori mutaatioita ja deleetioita saatiin aikaan PCR-pohjainen kohdennettu mutageneesi (Takara), käyttäen vastaavia plasmidia malleja. Sillä nukleotidisubstituution ja poistetaan minimaalinen promoottori, kahdeksan nukleotidin DNA-sekvenssin GCGCGCGC käytettiin korvaamaan villityypin DNA: n minimaalisen promoottorin, tai ydin NF-kB sitoutumiskohdan poistettiin käyttäen kohdennetun mutageneesin menetelmällä. Promoottori reportteri plasmidit transfektoitiin lyhytaikaisesti soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). pTRL-TK-plasmidia (Promega) kotransfektoitiin sisäisenä kontrollina arvioimiseksi transfektion tehokkuutta. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, tuloksena solut kerättiin talteen ja valmisteltiin lusiferaasiaktiivisuus analyysiä. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasireporttiterilla koejärjestelmässä (Promega) mukaan valmistajan protokollan kanssa illuminometer (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA).

Western Blot analyysi

Solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskuriin (Beyotime Inc.). Solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 15000 g 10 minuutin ajan. 20 ug kokonais-proteiinien erotettiin 8% SDS-PAGE-geeleillä. Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti Immobilon P-membraanille (Millipore). Länsi-blotteja aiemmin on kuvattu [32]. Vasta-aineet DRAM (AP1825a, Abgent) ja β-aktiini (SC-130656, Santa Cruz Biotechnology) ostettiin.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset arviot suoritettiin käyttäen t-testiä. P-arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Kevin M. Ryan jakamiseen DRAM plasmidi.