Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

leusiinirikkaita-toista sisältävän G-proteiiniin kytketty reseptori 5 (lgr5) on ehdokkaana markkeri peräsuolen syövän kantasoluja (CSC). Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme metylaatiostatuksen sisällä thelgr5 promoottori ja arvioidaan sen suhdetta CSC erilaistumista ennuste paksusuolisyövän, ja sen kliinis.

Methods

Metylointi asema Lgr5 promoottori havaittiin kanssa metylaatiospesifistä PCR kuudessa peräsuolen syövän solulinjoissa sekä 169 ensisijaisena peräsuolen kasvain kudosten. Erilaistuminen CSC tutkittiin immunofluoresenssilla ja immunosolukemiallinen. Down-regulation lgr5 saavutettiin geenispesifiseen siRNA. Liitot välinen lgr5 metylaation ja kliinis ominaisuuksia sekä potilaiden selviytymiseen analysoitiin tilastollisin menetelmin.

Tulokset

lgr5 promoottori metyloitiin eriasteisesti kuuden peräsuolen solulinjoissa tutkittiin, täysin metylaatio havaittiin HCT116-soluissa, joissa lgr5 ilmentyminen oli osittain talteen seuraavia DAC hoitoa. Varsi-solu pallo muodostumista HCT116 solujen mukana lisäämällä metylaation sisällä lgr5 promoottori ja vähentää ilmentymistä lgr5. Kaatamalla lgr5 siRNA myös johtanut kantasolun aloilla muodostumista. Niistä ensisijainen peräsuolen kasvaimia, 40% (67/169) oli positiivisia lgr5 metylaation, kun taas yksikään normaalin paksusuolen kudokset olivat positiivisia lgr5 metylaation. Lisäksi lgr5 metylaatio merkitsevästi yhteydessä korkeampi kasvaimen, ja negatiivinen etäpesäkkeiden (p 0,05), samoin kuin parempaa ennustetta (p = 0,001) potilailla, joilla peräsuolen syöpä.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että lgr5 metylaatio, säätelemällä lgr5 ilmaisun ja peräsuolen CSC erilaistumista, voi olla uusi prognostinen markkeri peräsuolen syövän potilaille.

Citation: Su S, Hong F, Liang Y, Zhou J, Liang Y, Chen K, et al. (2015) Lgr5 Metylointi in Cancer Stem Cell Differentiation ja prognoosi-Prediction in peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (11): e0143513. doi: 10,1371 /journal.pone.0143513

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2015 Julkaistu: 24 marraskuu 2015

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 julkisuuteen omistautumista

Data Saatavuus: Seuraavat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Hanke oli osittain tuettu National Natural Science Foundation of China (NSFC. NO. 81302156), Guangzhou Pilottihanke Kliinisen ja Translational tutkimuskeskus (varhainen ruoansulatuskanavan syöpien, No.7415696196402), Guangdongin maakunnan Bio-engineering Research Center for Gastroenterology sairaudet. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kumulatiivinen todisteet tukevat olettamusta, että pieni määrä eriytymättömän varsi tai varsi kaltaisia ​​soluja, niin sanottu syövän kantasolut (CSC), ovat vastuussa kasvaimen aloittamista, kehittäminen, ylläpito, levitys, uudistaminen ja terapeuttinen vastus . Myöhemmin, kun läsnä on CSC vahvistettiin eri kiinteiden syöpien, kuten rintasyövän [1, 2], glioblastoomat [3], maksasolukarsinoomat [4], ja niin edelleen, joka saavutettiin avulla, ja puolestaan ​​edistää tunnistaminen monien kasvainten-spesifisten solun pinnan antigeenejä, joka tunnetaan myös nimellä CSC markkereita. Paksusuolisyövän, useat CSC merkkiaineita on tunnistettu, mukaan lukien CD 133 [5, 6], EPCAM /CD44 /CD166 [7], CD24 /CD29 [8] ja lgr5 [9, 10]. Kuitenkin vähän tiedetään biologista merkitystä näitä markkereita, joilla voi olla voimakas vaikutuksia on multilineage erilaistumista kapasiteetin CSC [8].

joukossa peräsuolen CSC markkereita, lgr5, joka tunnetaan myös GPR49, on orpo G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (GPCR), joka kuuluu leusiinirikkaita repeat sisältäviä GPCR [11]. Äskettäin on raportoitu, että lgr5 on positiivinen kantasoluja ohutsuolen, paksusuolen ja karvatupen [9, 12, 13], mikä viittaa siihen, mahdollista merkitystä lgr5 kantasolujen biologiassa. Johdonmukaisesti, The lgr5 ilmentävien kantasolujen kykenivät rakennuksen organoidikappaleen rakenteiden in vitro, joka oli kokeellisesti osoitettu suolessa [14-16], vatsa [17] ja maksassa [18]. Lisäksi vastaanottaja hiiriä pinnallisesti vioittunut kaksoispisteillä siirrettiin yhdessä organoids peräisin yhdestä Lgr5

+ paksusuolen kantasolujen laajojen in vitro laajentamisen siten muodostunut itseuudistuvien crypts jotka olivat toiminnallisesti ja histologisesti normaalin [15]. Sitä vastoin lgr5-null hiiret osoittivat vastasyntyneiden kuolleisuutta johtuen ankyloglossia ja maha turvotus [19]. Ylös-säätely lgr5 on raportoitu monissa ihmisen kiinteiden kasvainten, kuten maksasolukarsinoomat [20, 21], paksusuolen [22], munasarjojen kasvaimia [22], tyvisolusyöpä [23] ja mahasyövän [24]. Toiminnallisesti, parannettu lgr5 ilmaisu edisti syöpäsolujen lisääntymistä ja tuumorigeenisyystesti [23], kun taas vaiennettaisi lgr5 vähensi solujen lisääntymisen, migraation ja pesäkkeiden muodostumista, tuumorigeenisuus [25] ja indusoi solujen apoptoosin [22]. Lgr5 on alavirrassa oleva kohde Wnt-β-kateniinin signalointireitin [26]. Vuonna ehjä eläimillä, lgr5 oli osa negatiivinen kierre hienosäätöä Wnt signalointia suoliston monogeneesin. Lgr5 puutos aiheuttama ennenaikainen erilaistuminen Paneth soluja, jotka on samanaikaisesti ylös–Wnt aktiivisuuden, mikä lgr5 on negatiivinen säätelijä Wnt signaloinnin kantasolujen kehittyvän suolen [27]. Lisäksi lgr5 homologeja on vapaaehtoista Wnt reseptorin osia, jotka välittävät Wnt signaalin laatua liukoinen R-spondin proteiinit [28].

Lisääntyvä todisteet viittaavat tärkeyttä lgr5, eri ilmaisulliset tasoilla, eri tautien ajattelutavat ja kehitysvaiheet. Kuitenkin taustalla mekanismeja ilmaisullisella asetukseksi lgr5 edelleen vaikeasti.

DNA: n metylaatio on osoitettu olevan tärkeä epigeneettiset mekanismi inaktivoimaan geenien aikana tuumorigeneesiä [29, 30]. Viime aikoina on yhä tutkimukset, jotka osoittavat, että metylaatio joidenkin geenien säätelevät kehitystä, eteneminen, ja toistumisen kasvaimia [31-33], ja josta ovat peräsuolen syöpä [34]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme metylaatiostatuksen CpG-saarekkeiden välittömässä promoottorialueen lgr5 geenin peräsuolen syövän solulinjoissa ja kasvainkudoksissa, ja analysoitiin sen yhdessä CSC erilaistumista, kliinis-, sekä ennuste potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja käsittely

Paksusuolisyöpä solulinjoissa (HCT116, SW480, HT29, LoVo, Colo205, SW620, SW1116) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Holly lehtiä, Peking, Kiina). Sillä demetylaation hoitoon, viljeltyjä soluja inkuboitiin 3 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC, Sigma, St. Louis, MO), 72 h keskipitkän vaihdetaan joka päivä. Mock lääkehoitojen tehtiin rinnakkain PBS (pH 7,4).

Ihmisen kudosnäytteitä ja potilastietoja

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Southern Medical University (Guangzhou, Kiina) ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. 169 potilasta (keski-ikä 57 ± 22,3 vuotta) oli diagnosoitu satunnaista ja peräsuolen syövän Dept. of Pathology (Nanfang Hospital, Southern Medical University) vuosina 1999 ja 2001. Kaikki diagnoosit perustettiin perustuu histologiset tutkimukset vakio HE leikkeitä mukaan WHO: n ohjearvon. Kasvaimet lavastettu perustuu Dukes lavastus järjestelmää. Nämä potilaat eivät saaneet neoadjuvant radio-kemoterapiaa eikä heillä complicattions muiden tunnettujen maligniteetit aikaan diagnoosin. Potilasta kuoli kuuden kuukauden kuluessa kirurgisen resektion jätettiin pois.

Western blotting -analyysi

25 ug kokonaisproteiinia inkuboitiin denaturoivissa puskuria (0,3 M Tris, pH 6,8, 10% 2-merkaptoetanolia, 40% glyserolia, 20% SDS, 0,02% bromifenolisinistä) 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa, ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä elektroforeesia, siirrettiin PVDF-kalvoja, estetty 5% rasvatonta maitoa /TBS-Tween 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen lgr5 (1: 500, Abcam, Cambridge, MA), tai hiiren alfa-tubuliinin vasta-ainetta (sisäinen kontrolli, 1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA). Sitten kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Immunoreaktiivisuus havaittiin kemiluminesenssin (Pierce, Rockford, IL).

RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 2 ug kokonais-RNA: ta altistettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi (Fermentas, Ontario, Kanada) mukaan manufacturer`s ohjeita. Alukesekvenssit RT-PCR lueteltu taulukossa 1, jossa GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina.

DNA: n eristämiseksi, metylaatiospesifistä PCR (MSP) ja bisulfiitin sekvensointi PCR (BSP) B

Genominen DNA uutettiin solulinjoista tai primaarisia kasvaimia jälkeen standardi fenoli-kloroformi-uutolla menetelmällä (Qiagen, Valencia, CA). Bisulfiittimodifikaatio genomista DNA: ta suoritettiin käyttäen EZ DNA metylaatio Kit (Zymo Research, Orange, CA). Mety- on CpG-saarekkeiden sisällä lgr5 promoottori määritettiin MSP käyttämällä ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta templaattina ja MSP-alukkeet on lueteltu taulukossa 1. MSP-alukkeet suunniteltiin periaatetta noudattaen, kuten aiemmin on kuvattu [35], ja testattiin ei vahvistamiseksi ei- bisulfited DNA. MSP suoritettiin 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 38 sykliä 94 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s, sitten 5 min pidentäminen 72 ° C: ssa. MSP tuotteet eroteltiin sitten 1,5% agaroosigeeleillä värjättiin ethiium bromidia ja näkyviksi UV-spektrofotometri. Vettä aihioita käytettiin negatiivisena kontrollina.

bisulfiitti sekvensointi, BSP alukkeet (taulukko 1) käytettiin monistamaan 428 bp: n fragmentti, joka kattaa promoottori-eksonin 1 (-362-96) alueelle lgr5 geenin. BSP alukkeet suunniteltiin ei kata mitään CpG sivustoja. PCR-tuotteet subkloonattiin sitten pCR2.1-TOPO (Invitrogen) plasmidit ja plasmidi-DNA viidestä bakteeri- kloonit valittiin DNA-sekvensoinnilla mukaisesti edellinen on kuvattu [36].

Kantasolujen alalla muodostumista ja erilaistumista

tarkastella kantasolujen pallo muodostumista, 5 x 10

5 HCT116-soluja viljeltiin 60 mm viljelyastia suspensiossa seerumittomassa DMEM /F12 (Gibco, Carlsbad, CA), jota on täydennetty B27 ( 1:50, Invitrogen), 40 ng /ml EGF: ää (Sigma) ja 20 ng /ml FGF-2 (Chemicon, Billerica, MA), 100 U /ml penisilliini G, 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco, Australia). CSC aloilla alkoi muodostua noin kaksi viikkoa myöhemmin. Indusoimaan CSC erilaistumista, CSC: n palloja pestiin PBS: llä kolme kertaa ja sitten niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliini G, 100 ug /ml streptomysiiniä. Nuclear happoa ja proteiini uutettiin näistä soluista päivänä 0, 1, 3 ja 7, vastaavasti, kuten on kuvattu [37-39]. Kaikki solut viljeltiin 37 0C kosteudessa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO2.

Immunofluoresenssitesti (IF) ja immunohistokemia (IHC) B

IF CSC palloja fiksoitiin 4% formaldehydiä PBS 10 min huoneenlämpötilassa ja sitten läpäiseviksi PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Triton X-100. Kun oli salvattu 1% naudan seerumin albumiinia 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, CSC: n palloja inkuboitiin ensisijaisen hiiren monoklonaalinen vasta-aine CK20 (1: 300, Santa Cruz, CA), 4 ° C: ssa yön yli ja sitten FITC-konjugoidulla anti-kani- lgG (Santa Cruz).

IHC kuvattu edellisessä menetelmillä [40] formaliinikiinnitetyt parafinoidut kudosleikkeiden poistettiin vaha ksyleenissä ja nesteytyksestä on tislattua vettä., ja suoritettiin lämmön välittämä antigeenin haun kanssa sitraattipuskuria pH 6,0 ja lohko 3% BSA. Objektilasit jälkeen inkuboitiin lgr5 vasta-aineella (1: 300, # 137484, Abcam) 4 ° C: ssa yön yli, jossa signaali vahvistetaan ja kehitettiin käyttämällä ABC-järjestelmän ja DAB-substraatti kromogeeni (Maixin Bio, Kiina), vastaavasti, seuraavat mukaan hematoksyliiniä counterstaining. Expression pidettiin ”positiivinen”, kun 10% tai enemmän syövän solut värjättiin.

transfektio pieniä häiritseviä RNA: n (siRNA) B

kohdistaminen sekvenssi lgr5-spesifisten siRNA nukleotidin oli 5 ’ -GATCTGTCTTACAACCTAT-3 ’ja sekoitetun siRNA-sekvenssin 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’ käytettiin kontrollina. Molemmat siRNA dupleksit syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine-transfektioreagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Tilastollinen analyysi

arvioimiseksi riippumaton korrelaatio lgr5 metylaation muiden muuttujien, monimuuttuja logistinen regressio analyysi. Hengissä analyysi, Kaplan-Meier menetelmää käytettiin arvioimaan elinaika jakelu suhteessa lgr5 metylaatio.

p

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Lgr5 oli differentiaalisesti metyloitu kolorektaalisyövässä solulinjoissa

potentiaalin testaamiseksi DNA: n metylaatio säätelyssä lgr5 ilmaisun, ensin tarkasteltiin ilmentymisen lgr5 seitsemässä peräsuolen syövän solulinjoissa ja sen muutos vastauksena 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC), klassisen metylointi estäjä. Kuten kuviossa 1A ja 1B, ja HCT116, SW480 ja SW620-soluissa, lgr5 ilme sekä vakaan tilan mRNA ja proteiini taso oli säädellään ylöspäin vasteena DAC hoitoon, mikä viittaa lgr5 ilmaisu saattaa estyä näissä soluissa kautta DNA: n metylaatio. Sitä vastoin ilmaisu on SW1116, LoVo, HT29 ja Colo205-soluja ei muuttanut dramaattisesti seuraavia DAC hoidon, mikä merkityksettömäksi ja metylointi-mukana mekanismeja. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, havaitsimme täydellinen metylointi promoottorialueen CpG saaria HCT116-soluissa, osittainen metylaation SW480 ja SW620-solujen eikä metylaatio HT29, Colo205, SW1116 tai LoVo soluja (kuvio 1 C) MSP-analyysi. Tarkkuus MSP määritys vahvistettiin edelleen bisulfiitin kanssa sekvensointi (kuvio 1 D). Näin ollen ilmaus lgr5 näiden syöpäsolulinjoissa hyvin korreloi metylaatiostatuksen promoottorin CpG-saarekkeiden, joka tukee DNA: n metylaatio, kuten säätelevä mekanismi lgr5 tasolla.

. Kokonais-RNA uutettiin osoitettu soluista ilman (-) tai (+) DAC käsittely ja RT-PCR suoritettiin tutkimaan lgr5 vakaan tilan mRNA tasolla, GAPDH sisäisenä kontrollina. B. Proteiini taso lgr5 mitattiin kaikissa seitsemässä peräsuolen syöpäsoluja käsitellään kuten A western blot-analyysi. α-tubuliinin käytettiin sisäisenä kontrollina. C. DNA: n metylaatio tilan CpG-saarekkeen sisällä proksimaalisen promoottorialueen lgr5 geenin määritettiin MSP-analyysi. M, metylointi signaali; U, unmethylation signaali.

dd

H2O, vesi, joka ei sisällä genomista DNA: ta. D. Metylointi tiheys proksimaalisen promoottorialueen lgr5 geenin seitsemän peräsuolen syövän solulinjoissa määritettiin BSP analyysi. Ylempi paneeli, kaavio jakelu CpG sivustojen 5 ’UTR: lgr5 geenin. Jokainen pystypalkki edusti CpG sivusto. Alempi paneeli, BSP 14 CpG sivustojen -150-+42 alueelle suhteessa transkription tähti sivusto (TSS) seitsemässä peräsuolen syövän solulinjoissa. Kukin rivi edustaa yksittäistä kloonattu alleeli, joka sekvensoitiin seuraavat bisulfiitti DNA muutos. Ympyrät edustavat CpG sivustot ja niiden välit kuvaa tarkasti CpG tiheys alueella. Musta ympyrä, metyloitu CpG sivusto; valkoinen ympyrä, metyloimattoman CpG päällä.

Lgr5 metylaatio korreloivat CSC- erilaistumista in vitro

Kuten raportoitu aiemmin, lgr5 ilme oli suurempi eriytymättömissä soluissa verrattuna erilaistuneita soluja kolorektaalisyövässä [9]. Tutkia osallistuminen lgr5 DNA: n metylaation CSC erilaistumiseen, me johdettu syövän kantasoluja tai varsi kaltaisia ​​soluja HCT116 solulinjasta jälkeen aloilla kuten on kuvattu [41], jossa rintasyövän kantasoluja rikastuneet viljelemällä suspensiona tarttumaton aloilla. Kaksi viikkoa viljelyn jälkeen seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi EGF: ää ja FGF-2, saimme CSC pallojen HCT116-solulinjassa (kuvio 2A, ensimmäinen paneeli). Ei ilmaus sytokeratiini 20 (CK20), merkkiaine epiteelisoluerilaistumiselle, oli havaittavissa CSC aloilla IF (kuvio 2B, ensimmäinen paneeli). Sitten nämä CSC pallojen saattaa kasvaa jousitus kunnossa, ja vähitellen tiukka ja yhdistyivät (kuvio 2, yläpaneeli). Mutta näillä aloilla inkuboitiin seerumia sisältävässä väliaineessa, jossa ne vähitellen kiinni pintaan kulttuurin levy, joka oli ominaista differenation cellsby dissosiaatio solujen pallojen (kuvio 2A, alas paneeli), ja ajan asetuksen CK20 (kuvio 2B) päivästä 0 päivään 7. samanaikainen kanssa erilaistumisprosessia, lgr5 ilmentyminen pienensi myös qPCR ja western blot (kuvio 2C ja 2D). Alas-säätely lgr5 ilmaisun myös hyvin korreloi merkittävän kasvun tiheys promoottorin metylaation (kuvio 2E).

. CSC pallojen HCT116 solulinjoista kasvoi CSC keskipitkällä ilman seerumia (ylempi paneeli); Tai, CSC pallot muuttui normaaliksi väliaineessa 10% FBS (alas paneeli). Havainnointi ajankohtana: 1 päivä, 3 päivää. Ja 7 päivää ja valokuvattiin valomikroskoopilla. B. Immunofluoresoivat värjäytymistä CK20 CSC aloilla; Green osoitti CK20 värjäystä. C. RNA kerättiin eri ajankohtana ja analysoitiin qPCR väliaineessa 10% FBS ryhmä. D. Proteiini kerättiin eri ajankohtana alustassa 10% FBS ryhmä, lgr5 havaittiin Länsi blot.westernblot α-tubuliinin käytettiin sisäisenä kontrollina. E. BSP analyysi lgr5 promoottorin metylaation tiheys CSC aloilla ja ajanhetkellä alustassa 10% FBS ryhmä. Musta ympyrä, metyloitu CpG sivusto; valkoinen ympyrä, metyloimattoman CpG päällä.

kaatamalla lgr5 aiheuttama erilaistumista CSC pallojen

Tutkia välisen syy laski lgr5 ilmaisun ja erilaistumista CSC palloja, me transfektoitu CSC aloilla kanssa lgr5-spesifisiä siRNA. Verrattuna salattu ohjaus siRNA, lgr5-spesifinen siRNA vähensi merkittävästi lgr5 ilmentymistä (kuvio 3A, p 0,001). SiRNA käsittely johti myös säätely ylöspäin CK20 sekä dissosiaatio CSC pallojen (kuvio 3B). Tämä on sopusoinnussa liittyvien fenotyyppien CSC erilaistumiseen, mikä viittaa siihen, että alas-säätely lgr5 riitti indusoimaan erilaistumista CSC aloilla.

. B.Expression of lgr5 mRNA ja proteiini CSC aloilla transfektoitiin joko ryntäily tai lgr5 erityisiä siRNAwas tutkinut qPCR ja western blot (ylempi kuva) C. Immunofluoresoivat värjäys CK20 (vihreä) CSC aloilla transfektoiduissa kuten A. Blue: DAPI tumaväriä.

lgr5 metylaatio oli havaittavissa kolorektaalisyövissä mutta ei normaalia paksusuolen kudoksiin

Seuraavaksi tutkimme promoottori metyloinnin lgr5 geenin normaalissa paksusuolessa kudoksissa verrattuna peräsuolen syöpä kudoksiin. Kuten on esitetty kuviossa 4A ja 4B, positiivinen metylaatio oli havaittavissa vain paksusuolen syövän kudoksissa, mutta ei normaalissa paksusuolen kudoksiin. MSP-analyysi yhteensä 169 paksusuolen ja peräsuolen syöpiä paljasti, että 67 näytettä (40%) olivat positiivisia lgr5 promoottorin metylaation. Lisäksi olemme myös tutkinut lgr5 ilmentyminen IHC.Lgr5 negatiivinen ilmaus liittyi lgr5 metylaation samassa syöpäpotilaiden kudosta MSP. Ja alhainen metylaatio tai unmethlation lgr5 ilme oli ilmeisesti suurempi matalan metylaatio tai unmethlation ryhmän MSP (kuvio 4C). Siellä tiedot osoittivat, että lgr5 metylaatio oli suljettu sen ilmaisua.

. MSP suoritettiin normaali paksusuolen kudoksiin (A) tai ensisijainen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. M, metylointi signaali; U, unmethylation signaali. B. Lgr5 ilmentyminen oli normaalissa kudoksessa ja syöpä kudoksiin, tumma nuolet edusti lgr5 positiivinen solu mukaan immunohistokemiallinen värjäys. N1 edusti yksi normaalin paksusuolen kudokset; T5 ja T22 vastaavasti edustaa paksusuolen syöpäpotilaiden.

Lgr5 metylaatio korreloi negatiivisesti kasvaimen, kasvaimen etäpesäke ja positiivisesti hyvä ennusteeseen paksusuolisyövän

arvioimiseksi kliinistä merkitystä lgr5 metylaatio, olemme analysoineet yhdistyksen välillä lgr5 promoottorin metylaation asema, määritettynä MSP, erilaisia ​​kliinis-potilaita, joilla on peräsuolen syöpä (taulukko 2). Olemme tunnistaneet merkittävä käänteinen korrelaatio positiivisen lgr5 metylaatio ja korkeampi kasvaimen (p 0,001), positiivinen solmukohtien osallistuminen (p = 0,04) ja positiivinen kaukaisia ​​etäpesäkkeitä (p = 0,024), Emme kuitenkaan tunnistaa ole muita ominaisuuksia, kuten potilaan ikä , sukupuoli, kasvaimen sijainti tai Dukes lavastus. Päinvastainen korrelaatiot ehdotti, että lgr5 metylaatio liittyi syövän vähemmän invasiivisia fenotyyppi,

i

.

e

., Korkeampi kasvaimen, negatiivinen imusolmuke ja etäinen etäpesäke, jota tukee lisäksi Kaplan-Meierin eloonjääminen analyysi (kuvio 5). Niistä 169 potilasta analysoitu, 100 kuukauden eloonjääminen oli merkitsevästi korkeampi tapauksissa lgr5 metyloinnin kuin unmethylation (

p =

0,001). Nämä tulokset osoittivat, että lgr5 metylaatio oli itsenäinen ennustava biomarkkereiden hyvää ennustetta kolorektaalisyövän.

Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrissä potilaiden ryhmitelty perustuu lgr5 metylaatiostatuksen. Yhtenäinen viiva: peräsuolen syöpään positiivinen lgr5 metylaation, n = 67; Pisteviiva: peräsuolen syöpään negatiivisia lgr5 metylaation, n = 102. HR: riskisuhde; 95% CI: 95%: n luottamusväli.

Keskustelu

Tissue itseuudistumisen ylläpitää kantasolujen markkinaraon. Metylointi kuvio sisällä markkinaraon säätelee kantasolu liikevaihdon, jotka vaikuttavat solun kohtaloon, heterogeenisyys, ja niin edelleen. Kun tasapaino tätä mallia on levoton, kantasolut kanssa fenotyyppiset ja geneettiset muutokset voivat läpikäydä kasvaimien syntyyn. Suuri määrä todisteita on osoittanut, että epigeneettiset muutokset, kuten hypermetylaatiota CpG saarten promoottorialueille eri geenien, todennäköisesti merkittäviä tukijoita tuumorigeneesiä monenlaisia ​​syöpiä [42] ja CpG-saarekkeen rantojen jaksoissa jopa 2 kb kaukainen oli voimakkaasti yhteydessä geeniekspressio paksusuolensyöpä [43]. Lisäksi useat syövän kantasoluja solunpintamarkkereiden myös säätelee geenin metylaatio. Furhtermore, hypermetylaation tila liittyi vähän tai ei ilmaisun ja solujen erilaistumista, esimerkiksi CD133 kolorektaalisyövässä ja gliooma [44, 45], ja EPCAM rintasyövässä [36]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme arveltu, että äänieristys tai vähentää lgr5 ilmentyminen liittyy CpG-saarekkeen metylaation. Tämän tueksi hypoteesia, hoito 5-atsa-2′-deoksisytidiini palautettu lgr5 ilmaisun pari peräsuolen kasvainsolulinjojen dramaattisin ylössäätöä in HCT116-soluissa, jotka sisältävät täysin metyloitu lgr5, ja keski tai ei säätelyyn ylöspäin toisessa solussa riviä joissa osittain tai tuskin metyloitu lgr5. Lisäksi hoito DAC ei muuttanut lgr5 ilmaisua Melo julkaistussa tutkimuksessa [34] in SW620 solulinjassa, mutta hieman lisäystä nykyiseen tutkimuksessa. Analysoimme lgr5 metylaatio noin ~ 1 kb edistäjä lgr5, ja se saattaa olla joitakin CpG saarilla muissa 1KB fragmentti. Joten me `t tunnistaa lgr5 metylaation SW620 solulinjassa, mutta lgr5 ilme oli hieman lisäystä jälkeen DAC hoidon tai muun epäselvä syy. Nämä tiedot osoittivat, että DNA: n metylaatio oli tärkeä rooli säätelyssä lgr5 ilme.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että lgr5 ollut keskeinen rooli ylläpitämisessä ominaisuuksien suoliston ja paksusuolen kantasoluja. Vähän tai ei lainkaan lgr5 ekspressiota havaittiin erilaistuneita soluja. Sen sijaan korkea ilmaus CK20, eriytetty solumerkille, todettiin myös eri syöpiä [38, 46]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, tuloksemme osoittivat, että lgr5 ilmaisu oli korkea peräsuolen CSC, ja vähentää erilaistumista, joka oli mukana parannettu DNA: n metylaation ja CK20 säätelyä ylöspäin. Lisäksi kaatamalla lgr5 CSC aloilla aiheuttama CSC erilaistumista. Nämä tulokset viittaavat siihen, alas-säätely lgr5, mikä johtui DNA: n metylaatio, vastasi eriytetyn fenotyypin CSC.

Tutkimme lisäksi kliinistä merkitystä lgr5 metylaation satunnaisissa peräsuolen syöpä. Huomasimme, että tämä ei ollut ensimmäinen tutkimus tutkii epigeneettisellä muuttaminen CSC markkereita. On raportoitu, että hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden sijaitsee promoottorialueen varren /esiaste solumerkille CD44, yksi peräsuolen ja muiden syövän kantasoluja solupinnan, voi ennustaa biokemiallisten uusiutumisen eturauhassyövän potilailla, joille tehdään eturauhasen [47] . Hypometylaatio CpG sivustoja kolmessa proksimaalisessa promoottorit määritelty CD133 ilmentyminen glioblastomas [42, 48] (DELET: ja hypermetylaatiota CD133 vuonna HCT116 johti ksenograftin kasvainten muodostumista nude-hiirissä verrattuna soluihin ilman CD133 metylaatio). Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu, että lgr5 oli useammin metyloitu kolorektaalisyövässä kaksoispisteet kuin normaalissa kaksoispisteet ja että lgr5 ilmentyminen tiukasti säännelty metylaatio. Kliinis analyysi purkaa käänteinen yhdistys positiivisten lgr5 metylaation korkeammat kasvaimen ja invasiivisuus, kanssa ajatus, että yli-ilmentyminen lgr5 liittyi enemmän pahanlaatuisia ja invasiivisia syöpiä. Lisäksi olemme myös havainneet, että lgr5 metylaatio oli merkitsevästi yhteydessä hyvään ennusteeseen joukossa peräsuolen syöpäpotilailla.

Se oli aiemmin raportoitu, että menetys lgr5 ilmaisun on nähtävissä noin 40% peräsuolen syöpä [22]. Tutkimuksessamme olemme myös havaittu positiivisia lgr5 promoottori metylaatio noin 40% peräsuolen syöpiä, ja varmisti, että negatiiviset lgr5 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä promoottori DNA metylaatio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että lgr5 tarjoaa tasapainon syövän solujen lisääntymisen ja CSC erilaistumista. Siksi vapautettu lgr5 ilmentyminen voi muuttaa tasapainoa kohti entistä muunnetaan ja onkogeeniset fenotyypin, kuten havaittu toisessa kantasolujen markkeri, Oct4 [49] .Similarly, lgr5 puute normaalissa ohutsuoleen johtaa ennenaikaiseen Paneth solujen erilaistumista ohutsuolessa [ ,,,0],27]. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet uuden mekanismin ohjata ilmentymistä lgr5,

i

.

e

. kautta promoottori metylaatio. Olemme osoittaneet, että down-regulation of lgr5, seurauksena joko siRNA hoidon tai promoottorin metylaation, oli riittävä indusoimaan CSC erilaistumista. Samanlaisia ​​määräyksiä on havaittu muissa kantasolujen merkkiaineita, kuten Oct4 [49]. On ehdotettu, että tehokkaan DNA: n metylaatio on paikallaan varmistaa vaiennettu tämän voimakas syövän geeni kehityksen aikana. Hypermetylaatiota lgr5 tuloksia syövän kantasolujen erilaistumista. Kuten tiedämme, erilaistuneet solut eivät kykene voimakkaita itseuudistumisen ja aresensitive perinteisiin kemoterapiaa huumeiden, joten lgr5 metylaatio saattaa parantaa kemoterapia joka on herkkä peräsuolen syöpäsolun. On kuitenkin huomionarvoista, että DNA: n metylaatio ei ole ainoa molekyylimekanismin säätö- syövän kantasoluja heterogeenisyys. Muut mekanismit, kuten histonimodifikaation, microRNA, chromatin remodelers ja niin edelleen [50], voi myös toimia aikana Karsinogeneesin jotka eivät kuulu tämän tutkimuksen. Mitä enemmän on, että DNA: n metylaatio saattaa olla ylikuulumisen muiden signaalinvälitysreittien tai asetuksen muiden geenien ilmentymisen. Melo [34]

et al

. raportoitu, että promoottori metylaatio Wnt kohdegeenien on vahva ennustaja toistumisen peräsuolen syöpä, ja että erittäin mahdollinen mekanismi on, että esto näistä geeneistä johtui metylaatio saattaa asiallisesti parantaa Wnt aktiivisuuden tasoa ja johtaa taudin etenemisen ja uusiutumisen aktivoimalla vielä tuntemattomien positiivinen tavoitteita. Toisaalta Lgr5 korkea ilmentyminen liittyi huonon ennusteen paksusuolensyöpä [51, 52]. Hiljentäminen lgr5 ilmaus voisi edistää paksusuolen syövän solujen apoptoosin ja vähensi etäpesäkkeiden [22]. Metyloinnin promoottorin vähensi lgr5 ilmentymistä ihmisen paksusuolisyöpäkudoksessa ja solulinjoissa Melo et ai. raportoida ja tutkimuksessamme. Näytti siltä, ​​että lgr5 metylaatio osoitti hyvää ennustetta ja vähemmän invaasio, ja tuloksemme oli samanlainen. Oli hieman erilainen Melo et al. tulokset, se voi olla bias näytteitä. Etäpesäke Näytteet on 31 (vain 18,3%, 31/169) tutkimuksessamme, mutta näytteet melkein oli vaiheen II Melo`s artikkelissa.

Kaiken Tutkimuksemme osoitti, että lgr5 metylaatio isresponsible varten lgr5 geenien ja syövän kantasolujen erilaistumista peräsuolen syöpä. Lisäksi lgr5 metylaatio myös käänteisesti liittyy korkea kasvaimen ja positiivinen kaukainen etäpesäke. Lisäksi se voi toimia markkerina ennustaa paremmin selviytymisen keskuudessa primaarisessa peräsuolen syöpä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että silencingof lgr5 geenin kautta CpG-saarekkeen metylaation saattaa olla mukana etenemistä CRC ja saattavat toimia terapeuttisena kohteena (täydentävän perinteisen kemoterapian peräsuolen syövän). Lisätutkimukset ovat tarpeen selvittämiseksi yksityiskohtaiset sääntelymekanismeja in vivo.

tukeminen Information

S1 Data. Tiedot selviytyminen analyysi (laajennettu kuvio 5).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0143513.s001

(XLSX) B

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Shunhua Jin (Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University) MSP teknistä tukea.