Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Proteomiikka odotetaan keskeinen rooli syövän biomarkkereiden löytö. Vaikka se on tullut mahdollista nopeasti analysoida proteiineja solujen raakauutteista käyttämällä massaspektrometriaa, monimutkainen näytteen koostumus estää tämän tyyppisellä mittauksella. Siksi tehokkaan proteomianalyysi, se tulee kriittinen rikastuttaa näytteitä pitoisuuksiin. Siitä huolimatta kolmasosa proteiinien eukaryoottisoluissa arvellaan fosforyloitu jossain vaiheessa elinkaarensa vain pieni osa solunsisäisten proteiinien fosforyloituu kulloinkin.

Menetelmät /Principal Havainnot

tässä työssä olemme käyttäneet kromatografisia Phosphopeptide rikastamiseen, joilla voidaan vähentää monimutkaisuutta ihmisen kliinisistä näytteistä. Uutta menetelmää korkean suoritustehon peptidi profilointi ihmisen tuumorin näytteissä käyttäen Parallel IMAC ja MALDI-TOF-MS, kuvataan. Olemme soveltaneet tätä menetelmää analysoida ihmisen normaalille ja syövän keuhkojen näytteet etsittäessä uusia biomarkkereita. Käyttämällä erittäin toistettava spektrin algoritmi tuottaa peptidin massan profiileja minimaalinen vaihtelu eri puolilla näytteet, viivamainen erotteluanalyysi-pohjainen ja päätös puiden perustuva luokitus malleja syntyy. Nämä mallit voivat erottaa normaali tuumorinäytteistä sekä erottamaan erilaisia ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä histologisia alatyyppejä.

Johtopäätökset /merkitys

A novel, optimoitu näytteen valmistusmenetelmä ja huolellinen data Yritysostostrategia kuvattu suurikapasiteettisten peptidi profilointi pieniä määriä ihmisen normaalia keuhko- ja keuhkosyövän näytteitä. Osoitamme, että sopiva yhdistelmä peptidin ilmentymisen arvojen pystyy erottamaan normaalin keuhkojen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä näytteet ja eri histologisia alatyyppejä. Tutkimuksemme ei korostavat suuret mahdollisuudet proteomiikka on molekulaarinen syöpä.

Citation: Gámez-Pozo A, Sánchez-Navarro I, Nistal M, Calvo E, Maderon R, Díaz E, et al. (2009) MALDI profilointi Human Lung Cancer alatyyppejä. PLoS ONE 4 (11): e7731. doi: 10,1371 /journal.pone.0007731

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2009; Hyväksytty: 08 lokakuu 2009; Julkaistu: 5. marraskuuta 2009

Copyright: © 2009 Gámez-Pozo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant tuki : FIS CP05 /00248, FIS PI050668 ja Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Cancer (RTICC, RD06-0020-1022) alkaen Fondo de Investigacion Sanitaria (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovacion, Espanja). Grant rahoittama Fundación Mutua Madrilena. A. Gamez-Pozo vastaanottajaa apurahan jonka Ministerio de Educacion, Espanja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

länsimaissa keuhkosyöpä edustaa suurin syy syöpään liittyvät kuolemat [1]. 5 vuoden eloonjäämisaste on 15% ja ei ole parantunut useiden vuosikymmenten ajan. Tämä johtuu pääasiassa siitä noin kaksi kolmasosaa keuhkosyöpätapauksista löydettiin myöhemmissä vaiheissa. Lisäksi jopa kesken alkuvaiheen potilaita, joita hoidetaan ensisijaisesti kirurgisesti kanssa parantava tarkoitus, 30-55% kehittää ja kuolevat etäpesäkkeiden toistumisen [2].

Nykyään keuhkosyöpä on luokiteltu histologisten kriteerien. Neljä tärkeintä alatyyppejä ovat: pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), levyepiteelisyöpä (SC), adenokarsinooma (AC), ja suuri karsinooma (LC). Kliinisesti, kolme viimeistä pidetään ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka on noin 85% kaikista keuhkosyövässä [3]. Tarkka diagnoosi ja luokittelu syövät ovat kriittisiä valittaessa hoitokeinojen. Kynnyksellä tehokas kohdennettu hoitojen keuhkosyöpä, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin salpaajat erlotinibin ja gefitinibin, sekä mahdollisuuksia kehittää uusia hoitomuotoja kehitettäessä, on korostanut tarkkaa diagnoosia [4].

Proteomiikka on odotetaan olevan avainasemassa syövän biomarkkereiden löytö. Vaikka se on tullut mahdollista nopeasti analysoida proteiineja solujen raakauutteista käyttämällä massaspektrometriaa, näytteen monimutkaisuus vaikeuttaa näiden tutkimusten [5], [6]. Näin ollen, tehokkaan proteomianalyysi on välttämätöntä rikastuttaa näytteitä analyyttien [7]. Huolimatta siitä, että yksi kolmasosa proteiinien eukaryoottisoluissa arvellaan fosforyloitu jossain vaiheessa niiden elinkaaren ajan, vain pieni prosenttiosuus solunsisäisten proteiinien on fosforyloitu kulloinkin [8], [9]. Siten puhdistuksen tai rikastamiseen askel, joka eristää fosforyloitu lajit vähentäisi monimutkaisuutta ja kasvattaa herkkyyttä [10].

MALDI profilointi on yksi lupaavimmista joilla voidaan vähentää kuilua suuren suorituskyvyn proteomiikan ja klinikan [7] , [11]. MALDI MS voidaan käyttää suurikapasiteettisten menetelmä erinomaisen herkkyyden [6], jonka avulla tutkimukset vaarantamatta suuri joukko potilaita, ja on mahdollista mullistaa varhaisessa diagnosoinnissa monien sairauksien [12]. Tämä kapasiteetti on esimerkkinä MALDI proteiini profiloinnin kasvain näytteet, jotka on sallittu tunnistaminen markkereita, jotka voitaisiin korreloida histologisia arviointi ja hoitotuloksia kautta tilastollinen analyysi [13], [14]. Tässä työssä me sovellettu Phosphopeptide rikastamiseen tekniikoita pienten ihmisten kliinisistä näytteistä perustuu immobilisoidun Metal Affinity Chromatography (IMAC) vähentää näytteen monimutkaisuutta. Havaitsemaan uusia biomarkkereita, olemme määritelleet data-analyysi työnkulun soveltamalla lineal erotteluanalyysi-pohjainen ja päätös puiden luokituksessa analyysimenetelmien peptidi profiileja ihmisen normaalia ja syövän keuhkojen näytteitä massaspektrometrillä.

Methods

etiikka selvitys

Tuolloin alustavan diagnoosin, kaikki potilaat olivat antanut suostumuksensa siinä mielessä, että niiden kasvain näytteet voidaan käyttää tutkimustarkoituksiin. Institutionaaliset hyväksynnän meidän eettisen komitean saatiin varten tutkimuksen tekeminen (Comité Ético de Investigación Clínica, sairaala Universitario La Paz). Tiedot analysoitiin anonyymisti. Potilaat toimitti kirjallisen suostumuksen, jotta niiden näytteiden ja kliinisiä tietoja voitaisiin käyttää tutkimustarkoituksiin.

Näytteiden valinta

Pakastetut näytteet potilailta diagnosoitu keuhkosyöpä: (15 adenokarsinooma (AC), 15 Squamous cell carcinoma (SC) ja 14 suurta cell carcinoma (LC) näytettä) ja 15 normaali keuhko (NL) näytteet noudetaan Patologian osasto sairaalan Universitario La Paz (Madrid, Espanja). Histopatologisen ominaisuuksia kunkin näytteen tarkistettiin kokenut keuhkojen patologi vahvistaa diagnoosin ja kasvaimen sisältöä. Hyväksyttävät näytteissä oli oltava vähintään 50% syöpäsoluja.

Yhteensä proteiiniuutto, liukenemisen, ja ruoansulatus

Näytteet leikattiin Leica CM3050S, säädetty saaminen 10 osat 10 mikronia paksuus kukin. Kudos käsiteltiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carsbald, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Pelletit resuspendoitiin guanidiinihydrokloridia 6 M ja kuumennetaan 10 minuuttia 95 ° C: ssa sekoittaen. Sen jälkeen 950 ui 50 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 7-9) per näyte lisättiin. Proteiini näytteen konsentraatio mitattiin MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Trypsiini MS Grade Gold (Promega, Madison, WI, USA) lisättiin kuhunkin näytteeseen on 01:50 suhteessa. Digestio suoritettiin yön yli 37 ° C: ssa. Poltettu näyte jaettiin kahteen erään.

Parallel IMAC (PIMAC) B

IMAC-Fe (III), joka suoritettiin yhtenä eränä pilkotun proteiinin PHOS-Select Iron Affinity Gel (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. IMAC-pohjainen Ga (III) suoritettiin muissa määräosa sulaneen proteiinin kanssa Phosphopeptide Isolation Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka.

Phosphopeptide analyysi massaspektrometrialla

Peptide seokset kuivattiin tyhjiössä ja liuotettiin liuokseen, joka sisälsi asetonitriiliä (30%) ja TFA: ta (0,1% ). Kylvyn jälkeen, sonikoimalla (3 min), peptidit olivat 01:01 sekoitettiin joko α-syaani-4-hydroksikanelihappo (CHCA) tai 2,5-dihydroksibentsoehappo (DHB), joita käytetään matriiseja. Tilavuus 0,5 ui talletettu MALDI levylle ja pidettiin huoneen lämpötilassa, kunnes kuivattiin. MALDI-MS-spektri (kaksi toistoa) mitattiin Bruker Ultraflex TOF /TOF MALDI massaspektrometriin (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, USA) [15] on positiivinen ioni heijastin tilassa. Proteiinin tunnistaminen, peptidi ionit kiinnostava sovellettiin MALDI-MS /MS-analyysi TOF /TOF-tilassa, ja vastaava MS /MS-spektrit siirrettiin kautta MS BioTools ohjelma (Bruker-Daltonics, Billerica, MA, USA) tuloina etsiä NCBInr tietokannassa MASCOT ohjelmistoa (Matrix Science, London, UK) [16].

Differential m /z huippujen valinta

ClinProTools (CPT) ohjelmisto 2.1 (Bruker-Daltonics , Billerica, MA, USA) käytetään valitsemaan ero m /z huippujen joukossa näytteitä alatyyppejä (NL, AC, SC ja LC). Spectra käsiteltiin seuraavasti:

normalisointi kaikkien spektrien niiden Total Ion Count,

Uudelleenkalibrointi spektrien toisiinsa käyttäen näkyvin m /z huippuja,

Perustaso vähennys- ja m /z huippuilmaisun.

kun standardoitu ja säätää, CPT valitsee massa valikoimia, joita pidettiin m /z huippuja, ja laskee piikkien pinta-alat kunkin spektrin [17]. Spectra jaettiin kaksi (Set 1 ja Set 2), jotka sisältävät eri paikan mittaus näytettä kohti. Jokainen setti jaettiin neljään spektrit ryhmään riippuen yhdistelmät MALDI matriisin IMAC metalli (Mx-Mt) käytettiin niiden saamiseen (DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe ja CHCA-Ga). Kukin näistä spektrien ryhmät olivat sittemmin jaettu histologinen alaryhmiin (NL, AC, SC ja LC) ja analysoitiin erikseen CPT. CPT asetukset olivat S /N 3 ja Savitzky-Golay tasoitus (1 sykli, m /z-alue = 5) [18]. Näiden luetteloiden avulla yhdistetty Mx-Mt m /z huippu lista. Sitten mukana kaikki spektrit yhden Mx-Mt yhdistelmän CPT mitata kaikkia m /z huiput kirjeenvaihtaja yhdistetyn Mx-Mt m /z huippu lista. Huiput Kruskal-Wallisin p-arvo 0,1 heitettiin pois. Yhteinen m /z piikit toisistaan ​​kaksi valittiin. Lopuksi, Pearson testi välinen alue arvot jokaisesta m /z huippu saavutetaan Set 1 ja Set 2 kaikille näytteille tehtiin ja m /z huiput r 0,4 suljettiin pois. Niinpä saadaan neljä lopullinen Mx-Mt luettelot m /z piikit: DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe ja CHCA-Ga luetteloita. Valittu m /z piikit pidettiin johdonmukaisesti huiput.

Diskriminanttianalyysi ja malli sukupolvi

Diskriminanttianalyysi kunkin lopullisen Mx-Mt m /z huippu luetteloita suoritettiin SPSS 9.0. m /z huippujen mukana jokaisessa diskriminantti mallissa sisällytettiin toisessa Stepwise Diskriminanttianalyysi, joka mahdollisti luominen maailmanlaajuisen syrjinnän malli, kuten m /z piikit kaikista Mx-Mt yhdistelmät.

Valvottu hierarkkinen klusterointi

Lyhyesti, vektori on kullekin pseudo-tuote, ja tämä vektori käytetään laskemaan etäisyydet tämän pseudo-kohteen ja kaikki jäljellä olevat kohdetta tai pseudo-eriä käyttäen samaa samankaltaisuutta metrinen, jota käytettiin laskettaessa alkuperäisen samankaltaisuus matriisi. Analyysit tehtiin BRB-ArrayTools v3.6.1 kehittänyt Dr. Richard Simon ja Amy Peng Lang.

Päätöksenteko puun ensemble algoritmi

Koska tavoitteena on valitsemalla huiput, jotka voisivat erottaa histologisia alatyyppejä keuhkosyövän näytteitä, rakensimme monen huippu luokitin käyttäen AdaBoost päätös puiden perustuva luokittelija ensemble [19], [20]. Kolme riippumatonta analyysit suoritettiin: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) ja SC vs. (AC + LC) käyttäen lopullinen DHB-Ga m /z huippu lista. Normalisoitu m /z piikin intensiteetin arvot set1 käytettiin opetusjoukolla. Normalisoitu m /z piikin intensiteetin arvot set2 käytettiin koe asetettu. 200 toistojen tehtiin kaikissa tapauksissa. Alla oleva alue ROC (vastaanottaminen käyttö Characteristic) käyrä (AUC) on sama kuin todennäköisyys oikein luokitella yksi pari näytteitä, kukin erillistä luokkaa, ja sitä käytetään mittana luokittelijan suorituskykyä (20). Tilastolliset analyysit tehtiin tutkimus- versio 2.4 kanssa Boost ohjelmistopaketin version 1,0-0 ja SPSS 9.0.

Tilastolliset analyysit tunnistettu huippuja

Kun proteiinin tunnistus MS /MS, ANOVA (jos mahdollista ) ja Kruskall-Wallis analyysit tehtiin arvioimaan eroja sellaisten proteiinien ekspressiota eri histologisia alatyyppejä. Mann-Whitneyn U sovellettiin tutkia erot kahden alaryhmää jälkeen Kruskall-Wallis analyysejä. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 9.0.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut kudosblokeista edustaja NSCLC diagnoosi, haettiin seuraavien rutiinien histopatologisten arvioinnin. Osiot prosessoitiin käyttäen Dako Autostaineriin universaali värjäyssysteemillä (Dako, Glostrup, Tanska). Tätä tutkimusta varten, 3,5 um: n leikkeitä immunovärjättiin monoklonaalinen vasta CK8 (1:100 laimennus; Novacastra, Newcastle upon Tyne, UK). Kaksi kudosta viipaletta Kustakin näytteestä arvioitiin.

Tulokset

ensisijaisena tavoitteena tässä tutkimuksessa oli testata, tryptiseen peptidi profiilit, saatu ihmisen normaalia ja kasvaimen keuhkojen näytteitä PIMAC ja MALDI- TOF MS-tekniikkaan, voivat syrjiä Normaali keuhko (NL) keuhkosyöpään, välillä sekä yleisin keuhkosyövän histologinen alatyyppi: adenokarsinooma (AC), Large Cell karsinooma (LC) ja okasolusyöpä (SC). Vain 49 59 näytteistä valittiin seuraava analyysi koska näytteet ilman vähimmäispitoisuus 50% kasvaimen solut heitettiin pois. Siten 15 NL, 14 AC, 9 LC ja 11 SC näytteet analysoitiin myöhemmin. Massaspektri generoidaan kunkin näytteen sisälsi tyypillisesti useita satoja huiput S /N 3 [5].

massa signaalin voimakkuudet trypsiinipeptidit peräisin monimutkaisia ​​proteiiniseoksia välittävät useat tekijät, nimittäin suhteellinen proteiinipitoisuus vaihdellen entsymaattinen ruuansulatuksen tehokkuutta, ja sekvenssi riippuva desorptio /ionisaatio tehokkuutta. Suoritimme erittäin toistettava spektri käsittelyä menettelyn avulla huippu profiilien korkea yhteneväinen näytteen sarjassa. Yhdenmukainen m /z piikit valittiin seuraavat nämä kriteerit: massa huiput täytyi olla läsnä sekä näytteessä täplät ja Pearsonin korrelaatiota intensiteettien jokaisen piikin saavutettu Set 1 ja Set 2 kaikille näytteille oli oltava 0,4. Mean Pearsonin korrelaatiokerroin oli 0,8 DHB huippuja ja 0,65 CHCA huippuja. Lisävaatimuksena (Kruskal-Wallis p-arvo 0,1) levitettiin lisäämällä siihen huiput erottelukykyä väliin näytteen alatyyppejä. Nämä kriteerit tarjonnut johdonmukainen ja toistettavissa menetelmiä, kuten on esitetty keskiarvona Pearsonin korrelaatiokerrointa valittujen massan huippuja.

Olemme tutkineet päällekkäisyyden huippujen valittujen kunkin Mx-Mt yhdistelmät (kuva S1). Kaiken kaikkiaan 97 johdonmukainen massa piikkiä tunnistettiin kaikkien neljän Mx-Mt yhdistelmiä. Mitä MALDI matriisit, 81 piikit mitattiin DHB ja 41 CHCA analyysejä. Vastakohtana 80 piikit mitattiin Ga-pohjainen iMac ja 42 Fe-pohjainen IMAC analyysit. Molemmissa tapauksissa, 25 päällekkäiset piikit havaittiin. Vain neljä huiput olivat jatkuvasti läsnä kaikissa Mx-Mt yhdistelmät.

Kun johdonmukainen huiput oli valittu, vaiheittaista Diskriminanttianalyysi suoritettiin kussakin lopullisessa Mx-Mt huippu lista. Siksi neljä erotteluanalyysi mallia rakennettiin ja massa signaaleja mukana jokaisessa mallissa on lueteltu taulukossa S1. Kaikki nämä diskriminantti mallit pystyivät luokitella näytteet neljään ryhmään, jotka vastaavat NL, AC, SC ja LC. Prosenttiosuudet luokiteltu oikein näytteiden kunkin mallin ja jättää-one-out ristivalidointi prosenttiosuudet luokiteltu oikein näytteiden näkyvät taulukossa S1. Toinen Vaiheittainen Diskriminanttianalyysi suoritettiin huiput mukana neljässä Mx-Mt Erotteluanalyysi mallit (22 piikit) välttää myös meluisa massa signaalien analyysiin. Global Model mukana 9 m /z huiput ja luokitellut oikein 98,0% näytteistä (48 49) on LOOCV.

Teimme Valvottu hierarkkinen Centroid Linkage Clustering käyttäen 9 huiput mukana Global Model. Kuten kuviossa 1 on esitetty, on olemassa kaksi pääasiallista klustereita, erottamalla normaali keuhko näytteitä useimmat tuumorinäytteessä. Kuitenkin, ei ole täydellinen erottaminen histologisia alatyyppejä. Kun tavoitteena on valitsemalla massa signaaleja, jotka voisivat luonnehtivat näytteitä yhdestä histologisen alatyypin verrattuna muihin alatyyppeihin NSCLC näytteiden AdaBoost päätös puiden perustuva luokittelija kokonaisuus suoritettiin. Kolme riippumatonta analyysit suoritettiin: AC vs. (SC + LC), LC vs. (AC + SC) ja SC vs. (AC + LC), käyttäen tietoja Set 1 koulutusta setti ja tietoja Set 2 kuten testi asettaa lopullinen DHB-Ga huippu lista. Alue käyrän alla (AUC) välillä ROC laskettiin jokaiselle vertailussa sekä koulutukseen ja Koepakettia. Suhteellinen vaikutus jokaisen piikin malli sukupolven saatiin. Alla oleva alue ROC-käyrän ja top huiput jokaisen vertailussa on esitetty taulukossa 1.

Heat Map of the Ohjattu Hierarkkinen Centroid Linkage Klusterointi normalisoitu m /z huippu alueilla, kahdessa ulottuvuudessa, että 49 näytettä ja 9 m /z huippujen mukana maailmanlaajuisessa erotteluanalyysi malli.

MS /MS määriteltiin joitakin m /z piikit valitaan erotteluanalyysi ja AdaBoost analyysit suoritettiin MALDI-TOF /TOF ( Taulukko S2). Jotta voitaisiin arvioida eroja identifioitu peptidi signaalien joukossa histologinen alatyyppi, ANOVA ja Kruskal-Wallis-analyysit suoritettiin. p-globiini massa signaaleja osoitti merkittävästi vähentynyt intensiteetti Tuumorinäytteissä verrattuna normaaliin keuhko ne kuitenkin GAPDH ja β-aktiini huiput oli kohonnut intensiteetti Tuumorinäytteissä. CK8 piikin intensiteetti laski suurissa solukarsinoomat verrattuna adenokarsinooma ja okasolusyöpä näytteitä.

Rakenteessa ilmentymisen immunohistokemiallinen (IHC) Joidenkin näiden merkkiaineiden analysoitiin. Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) [21] osoittaa ilmentymisen ja lokalisaation proteiinien monenlaisia ​​ihmisen normaalia ja syövän kudoksissa sekä solulinjat tuella IHC. IHC ilmaisun profiilit β-aktiinin ja GAPDH arvioitiin tässä hyödyllinen tietokantaan. On lisääntyneen ekspression β-aktiini joissakin keuhkosyöpä näytteitä verrattuna terveisiin. Kuitenkin GAPDH ilmentyminen keuhkosyöpä on erittäin vaihteleva. Lisäksi teimme IHC analyysi CK8 ilmaisun viidessä AC, LC ja SC näytteitä. Positiivinen soluja CK8 immuunivärjäystä havaittiin kaikissa LC ja AC näytteitä. Sen sijaan vain kolme viidestä SC näytteessä oli positiivista värjäytymistä. Positiivisesti värjäytyneet näytteet osoittivat keskimäärin 20-70% värjättyjen solujen (kuva 2).

CK8 immuunivärjäysmenetelmällä (suurennus x 40). Nuolet osoittavat kasvainsolujen. (A) Okasolusyöpä keuhkojen osoittaa negatiivisen värjättiin kasvainsoluja. Lung epiteelin osoittaa positiivista värjäytymistä. (B) Okasolusyöpä keuhkojen värjäytyivät positiivisesti. (C, D) suuri solu keuhkon osoittavat eriasteista positiivista värjäytymistä. (E, F) Adenokarsinooma keuhkot osoittivat eriasteista positiivista värjäytymistä.

Keskustelu

Global geenien ilmentymisen profilointi on parantanut ymmärrystämme histologista heterogeenisyys ei-pienisoluisen keuhkosyöpä ja on havainnut mahdollisia biomarkkereita ja geeni allekirjoitukset luokituksessa potilailla, joilla on merkittävästi erilaiset selviytymisen tuloksiin [22]. Kattava käsitys taustalla olevia mekanismeja syövän synnyn, kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden vaatii perusteellista analyysiä paitsi genomin, mutta myös proteomiin [23]. Analyysit on geeni tasolla ei havaitse biologinen vivahteet ujutetaan translaation jälkeiset modifikaatiot proteiinien ja siten vaatii proteomic lähestymistapaa [5], [24].

toistettavuus on osoitettu kompromisseja Proteiiniprofilointi kaikissa vaiheissa, peptidi eristäminen menetelmiä näytespektriä hankinta ja käsittely [5], [11], [25], [26]. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet Phosphopeptide rikastamiseen kromatografiatekniikoilla vähentää monimutkaisuutta ihmisen keuhkosyövän näytteitä ja analysoidaan eristettiin peptidien MALDI-TOF MS. Kuvaamme massa huippu menetelmillä, jotka saadaan toistettavissa peptidi profiilin MALDI MS kokeiden avulla ClinProTools. Groseclose et ai. kuvattu yksi rajoitus käyttää CPT on, että huiput, jotka saattavat olla merkittäviä joukossa pienessä määrässä spektrien ryhmässä, saattaa tulla merkityksettömiä keskimäärin muiden spektrien että ryhmä [5]. Jotta voitaisiin arvioida niin monta huiput kuin mahdollista, teimme edellisessä vaiheessa huippu valinnassa avulla CPT. Kussakin Mx-Mt analyysi, kaikki spektriä yhdestä näytteestä alatyypin otettiin käyttöön CPT, saada alatyypin tunnusomainen huippu lista. Kun kaikki alatyyppi luettelot saatiin uusi lista tuotettiin yhdistelmä, mukaan lukien kaikki huiput läsnä näissä alatyypin luetteloihin. Jälkeenpäin spektriä kaikilta näytteestä alatyypeistä sisällytettiin CPT, ja kaikki piikit tässä yhdistelmässä mitattiin. Olemme vahvistaneet, että jotkut diskriminantti huippuja jätettiin kun spektriä kaikki näytteestä alatyypeistä sisältyvät suoraan CPT ja tavallinen analyysi suoritetaan.

On huomattava, että käytettäessä DHB kuin MALDI matriksin suurempi määrä massan huiput verrattuna CHCA. Samoin, Ga-pohjainen IMAC lähestymistapa tuottaa enemmän massaa signaaleja verrattuna Fe-pohjainen määritys. Lisäksi, huippu luettelot peräisin DHB-spektri osoitti suurempaa keskimääräistä korrelaatiota aineistoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että MALDI analyyseistä Ga-pohjainen iMac ja DHB kuten MALDI matriisi ovat toistettavissa ja antaa suuremman määrän massa signaaleja. Huiput tunnistettu peräisin erittäin ilmaisi proteiineista ja loput erotteleva peptidejä ei voitu tunnistaa MALDI MS. Vaihtoehtoiset tunnistamisen strategioita olisi testattava, jotta voidaan lisätä tunnistamista matalan intensiteetin signaalit MALDI MS-tutkimuksilla.

Erotteluanalyysi analyysien antoi meille mahdollisuuden erottua normaalin keuhkojen ja NSCLC näytteet ja tunnistamaan peptidejä, jotka parhaiten syrji normaalin ja sairaan kudoksia, kuten on esitetty ryhmittelemällä analyysi (kuvio 1). Tämä tehtävä ei ole yleensä ongelmallista johtuen merkittäviä eroja normaalin ja syövän kudoksissa. Mikä todistaa hankalampaa on löytää eroja erillisten histologisten alatyyppien. Kuten kävi ilmi, kuviossa 1, on olemassa kaksi pääasiallista klustereita keuhkosyöpään näytteet, mukaan lukien adenokarsinoomat ja suuri solu karsinoomat erikseen, mutta okasolusyöpä näytteitä halkaistu näiden klustereita.

On kuvattu, että kokonaisuus luokittelijoiden parempia yhden päätös puita luokittelija saamalla suurempia tarkkuuksia ja pienempiä ennustevirheet sovellettuna proteomiikka aineistoja [27]. Niinpä testasimme jos AdaBoost analysoi voisi luokitella eri NSCLC näytteiden oikein. Tuloksemme viittaavat siihen, että AdaBoost pystyy erottamaan näytteitä yhden keuhkosyöpä histologinen alatyyppi kaksi muuta. Käytettyihin teknisiin rinnakkaisnäytteiden kuin Koepakettia pystyimme arvioimaan luotettavuutta menetelmistä.

Tuloksemme viittaavat siihen, että sekä GAPDH ja β-aktiini on merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen keuhkosyövässä näytteissä. Yliekspressio GAPDH ihmisen keuhkosyöpä oli kuvattu aikaisemmin Tokunaga et al [28], ja on olemassa monia julkaisuja osoittavat lisääntyneen ilmentymisen GAPDH rintasyövän [29], haiman [30] ja kohdunkaulan [31], [32] ihmisen syövissä. Toisaalta useat tutkimukset osoittivat, että β-aktiini ekspressoituu differentiaalisesti ihmisen syövässä (tarkistetaan 28). Molemmat proteiinit osoitti kohonneita rotalla hepatooma [33]. Lisäksi IHC ilmaisun profiilit β-aktiinin ja GAPDH, arvioidaan Human Protein Atlas, vaihtelivat suuresti keuhkosyövässä näytteissä. Nämä tulokset kysymys niiden käyttöä proteiinien siivous tuotteiden proteomic analyyseissä syövän näytteitä.

sytokeratiinivasta 8 (CK8) on tyypin II välituote hehkulampun proteiini, joka on jatkuvasti ilmaistu useimmissa epiteelin maligniteettien [34], mukaan lukien kaikki NSCLC alatyyppejä [35]. Kohonneeseen CK8 seerumista on yhdistetty kasvaimen etenemiseen ja laski eloonjäämisen potilailla, joilla on NSCLC [36]. Toisin kuin nämä raportit, emme tarkkailla voimistunutta ilmentymistä CK8 Tuumorinäytteissä MALDI-MS-analyysit. Olemme kuitenkin havainneet, että CK8 tasot laskivat storcell karsinoomanäytteistä verrattuna normaaliin keuhko.

arvioimiseksi hyödyllisyyttä CK8 ilmaisun biomarkkerina suurten solukarsinoomat teimme IHC analyyseihin CK8 ilmaisun 15 keuhkosyöpä näytettä (viisi AC, viisi LC ja viisi SC). Mielestämme ei johtopäätös voitaisiin tehdä suhteesta IHC ja peptidin ilmentymisen profilointi meidän tiedot. Tämä ero tekniikoita voisi johtua Phosphopeptide rikastamiseen ennen näytteen analyysiä tai saattaa merkitä sitä, että MS lähestymistavat ovat herkempiä kuin IHC. Peptidi tunnistetaan MALDI MS /MS (DVDEAYMNKVELES) sisältää mahdollisia fosforylaation sivustosta osoitteessa Tyr204, jotka liittyvät fosforylaatio onkogeeninen kinaasien [37]. Aiemmat tutkimukset arvioidaan hyödyllisyys CK8 biomarkkerina in keuhkosyöpä ei sisältynyt suuri karsinooma [35], [36].

Tutkimus on joitakin rajoituksia. Siten on rajallinen kyky tunnistaa pieniä massaan piikit perustuu MS /MS-analyysi suhteellisen monimutkaisia ​​peptidin seoksia. Kuitenkin, MALDI MS on joitakin etuja biomarkkereiden löytö:-proteiinin ilmentymisen ja suhteellinen kvantifiointi tietoja voidaan saada useita potilaan kudosnäytteiden yhdessä kokeessa. Toisaalta vertailu IHC ja peptidin profilointi ilmaisun arvot suhteen pitäisi tehdä huolellisesti, koska näyttää siltä, ​​että ennen affiniteettirikastusmenetelmällä näytteitä voitaisiin ottaa käyttöön jonkin verran vaikutusta.

Kuitenkin meidän tutkimus ei korostavat suuret mahdollisuudet proteomiikka että molekulaarinen syöpä. Tunnistaminen ilmentyvät eri proteiinien PIMAC ja MALDI-TOF /TOF MS suoritettiin fraktioitu tryptiselle liuottamaa johdettu pieniä määriä kudosten normaaleista keuhkojen ja NSCLC näytteitä. Käyttämällä optimoitu näytteen valmistusmenetelmä ja huolellisen tiedonkeruu Strategiamme voitti suuri haaste toistettavuus MALDI MS-pohjainen peptidi profilointi. Riippumatta siitä, millaisia ​​peptidien tunnistaa MS /MS, sopiva yhdistelmä peptidin ilmentymisen arvojen pystyy erottamaan normaalin keuhkojen peräisin NSCLC näytteistä ja eri NSCLC histologisia alatyyppejä. Jatkotutkimuksissa pyritään säilyttämään peptidi profilointi hyödyllinen väline löytö uusien biomarkkereiden potentiaalisten diagnostisia tai theragnostic merkitystä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Venn kaavakuvia m /z huippujen päällekkäisyyden lopullinen m /z huippu luetteloita: (A) neljä erilaista Mx-Mt yhdistelmät, (B) IMAC-hartsit, ja (C) MALDI matriiseja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0007731.s001

(0,04 MB PPT) B Taulukko S1.

Prosenttiosuudet luokiteltu oikein näytteiden, jätä-yksi ristivalidointi prosenttiosuudet luokiteltu oikein näytteiden ja m /z piikit Jokaisessa Mx-Mt yhdistelmä diskriminantti malli. Peaks Lihavoidut sisältyvät myös 9 m /z huippujen globaali syrjintää malli.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0007731.s002

(0,03 MB DOC) B Taulukko S2.

Differentially ilmaisi peptidin massat päässä CHCA-MALDI spektrit tunnistaa MALDI-TOF /TOF ja MASCOT hakukoneen. Yksittäiset MASCOT ioneja tulokset ovat merkittäviä (p 0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0007731.s003

(0,03 MB DOC) B