Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ruokatorven levyepiteelisyöpä (ESCC) osuus on noin 90% ruokatorven syöpä diagnosoidaan Aasian maissa, sen esiintyvyys on nousu. Cancer kantasolujen (CSC; tunnetaan myös kasvaimen aloittamista soluihin, TIC) on luonnostaan ​​vastustuskykyinen solunsalpaajille ja säteily ja osakkuusyritysten huonon ennusteen ja hoidon epäonnistuminen. Kohdistaminen terapiassa syövän kantasoluja on tullut potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa kehittää tehokkaita hoito. Kuitenkin sopiva CSC markkeri ESCC tunnistus- ja kohdentaminen on edelleen rajallista. Tässä tutkimuksessa olemme seulotaan uuden CSC kalvo proteiinimarkkereita käyttäen kahta erillistä stemness ominaisuuksista syöpäsolun riviä vertaileminen. Kun validointi RT-PCR, qPCR ja western blot-analyysit, adheesiomolekyylien 1 (ICAM1) tunnistettiin mahdollisen CSC merkkiaine ESCC. ICAM1 edistää syöpäsolujen muuttoliike, invaasiota sekä lisätä mesenkymaalisten merkki ilmaisun ja lieventävät epiteelin merkki ilme. Lisäksi ICAM1 myötävaikuttaa CSC ominaisuuksia, kuten pallo muodostumista, lääkeresistenssin ja tuumorigeneesiä hiiren ksenotransplantaatio mallissa. Perustuvat analyysiin ICAM1-säänneltyjen proteiinien, me arveltu, että ICAM1 säätelee CSC ominaisuudet osittain läpi ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1 reitin. Lisäksi havaitsimme, että ICAM1 ja CD44 voisi olla korvausta vaikutus säilyttää stemness ominaisuudet ESCC, mikä viittaa siihen, että yhdistelmä usean kohdistaminen hoitoja pitäisi olla alle vakavasti hankkia voimakkaampi terapeuttinen vaikutus CSC on ESCC.

Citation: Tsai ST, Wang PJ, Liou NJ, Lin PS, Chen CH, Chang WC (2015) ICAM1 on potentiaalinen syövän kantasolujen merkkiaine ruokatorven Okasolusyöpä. PLoS ONE 10 (11): e0142834. doi: 10,1371 /journal.pone.0142834

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 07 syyskuu 2015; Hyväksytty: 27 lokakuu 2015; Julkaistu: 16 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Tsai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat tiede- ja teknologia, Taiwan Apurahat NSC102-2320-B-039-050 ja MOST 102-2911-I-002 303. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on kahdeksas johtava syy pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti sen esiintyvyys on kasvussa [1]. Se edustaa 1% syövistä diagnosoidaan Yhdysvalloissa, oli arviolta 17500 uutta tapausta raportoitu vuonna 2012 [2]. Ruokatorven syöpä on patologisesti luokiteltu kaksi suurta alatyyppiä, ruokatorven adenokarsinooma (EAC) ja ruokatorven okasolusyöpä (ESCC). ESCC osuus on noin 90% ruokatorven syöpä diagnosoidaan Aasian maissa. Koska varhainen havaitseminen strategioita ei ole hyvin sovellettu kliininen näyttö nämä kasvaimet ovat usein diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa. Kun etäpesäke ilmenee, syöpään kuolleisuus kasvaa merkittävästi [3]. Yleinen 5 vuoden elossaolo jälkeen kirurgisen resektion on 70% ~ 92% potilailla, joilla ei solmukohtien osallistumista, mutta vain 18% ~ 47% potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke [4]. Puute olennaisen tietämyksen säteilyn ja kemoterapian resistenssin näissä kasvainsoluissa on ollut merkittävä kliininen este hankkia parempaan tulokseen. Rajallinen ymmärrys molekyylibiologian kasvainten on jättänyt meille empirismistä klinikalla.

Cancer kantasolu (CSC; myös kasvaimen aloittamista solu, TIC) määritellään osajoukko kasvainsolujen itseensä -renew kyky ja liittyy syövän taudin alkamisen ja etenemisen. CSC on myös erittäin vastustuskykyinen säteilyn ja kemoterapiaa ja vastaavat syövän uusiutumisen hoidon jälkeen [5]. Siksi CSC on nähty houkutteleva tavoite tuhoavasti poistamaan syöpäsoluja. On tärkeää tunnistaa mahdolliset CSC markkereita, joita voidaan käyttää eristämään CSCS ja karakterisoida niiden ominaisuudet voidaan terapeuttisesti kohdennettuja. Vaikka CSC on laajalti havaittu kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta-, paksusuoli-, gliooma, eturauhanen, maksa, ja melanooma [6-11], ja useita markkereita niiden tunnistamiseksi ovat käytettävissä, molekyylitason markkeri ruokatorven CSC on hyvin rajallinen.

epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on olennainen kehitysprosessiin aikana Mesodermi muodostumisen ja hermostoputken muodostumisen, jossa epiteelisolujen hankkia vaeltava mesenkymaaliset fenotyyppi [12]. Prosessit kasvaimen invaasion ja metastaasin on monia fenotyyppinen yhtäläisyyksiä EMT, mukaan lukien menetys solu-solu-adheesion ja lisäys solujen liikkuvuutta. Välinen yhteys CSC ja EMT on perustettu vuonna transformoiduissa rintaepiteelin [13], ja koetulokset osoittivat, että TGFli aiheuttama EMT liittyi hankintaan rintasyövän solujen CD44

+ /CD24

– /low kasvain-aloittamisen fenotyyppi, mesenkymaalisten piirteitä, ja lisääntynyt kyky muodostaa mammospheres. Hiljattain hankkinut näytön mukaan CSC on merkittäviä rooleja, että etäpesäkkeiden useita erilaisia ​​syöpä [14,15]. Siksi lisäämme yleinen käsitys molekyylibiologian CSC todennäköisesti paljastaa roolia CSC on etäpesäkkeitä syöpiä.

Useita integroituja analyyseja, kuten genomiikka, Epigenomics, transkriptomiikka, ja proteomiikka, on rekrytoitu tutkia biologiaan CSC. Joukossa, proteomiikka sillä on ainutlaatuinen asema tällä alalla. Esimerkiksi useita merkittäviä läpimurtoja CSC tutkimuksessa johtuivat proteiinien tunnistamiseksi käyttäen proteomic lähestymistapaa kuten pesäkkeitä stimuloivat tekijät [16] ja solupinnan CD molekyylit [17]. Sitä paitsi, proteomiikka on nousemassa tehokas keino tunnistaa signalointikompleksejaan jotka ohjaavat CSC erilaistumista ja säädellä CSC huolto reittejä [18]. Systemaattinen proteomic lähestymistapa luonnehtimaan CSC ominaisuudet uutta tietoa CSC biologian ja nopeuttaa kliinisiä sovelluksia ennustetta, diagnoosi ja hoito syövän [19].

Kalvoproteiineista, mukaan lukien entsyymit, reseptorit, ionikanavia, ja kuljettajat, pelata monia biologisia toimintoja. Dysregulaatio membraaniproteiineja on yhdistetty erilaisiin ihmisen syöpiin [20]. Siksi monet membraaniproteiineja on luonnehdittu markkereita diagnoosiin ja terapeuttisten tavoitteiden, noin 70% nykyisen lääke lääkkeen tavoitteet on kalvoproteiini [21]. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan mahdollisia pintamerkkiaineita ruokatorven CSC käyttää proteomic lähestymistapaa. ESCC solulinjoissa erilaisilla pallo muodostumista kyky käytettiin seulontaan sopivia pinta markkereita. CSC ominaisuudet mahdollisten merkki karakterisoitiin edelleen käyttämällä pesäkemuodostusta, lääkkeille vastustuskykyisten määritys, ja tuumorigeenisyystesti määritys immuuni hiirillä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

tässä tutkimuksessa ihmisen ruokatorven syöpä solulinjoja ostettiin Bioresource Collection ja tutkimuskeskus Elintarviketeollisuus tutkimuksen ja kehityksen instituutti (Hsinchu, Taiwan, https://www.bcrc.firdi.org.tw/). Solulinjat CE81T /VGH (CE81T; BCRC 60166) ja CE146T /VGH (CE146T; BCRC 60167) on saatu 57- ja 50-vuotias Taiwanin miehillä vastaavasti. Molemmat solulinjat viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen minimal essential (DMEM; Gibco BRL), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco BRL), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Gibco BRL), ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2/95,% ilma ilmakehässä.

kalvo proteiiniuutto ja geeli ruoansulatus

compartmental proteiiniuutto sarjat CNM (BioChain Institute) käytettiin membraaniproteiinien uuttamiseksi syöpäsoluja. CNM Pakkaus sisältää kaksi kemiallisesti uuttamalla vaiheet: (1) poisto sytoplasman ja nuk- proteiinien reaktio, joka sisälsi HEPES: tä, MgCl

2, KCI, sakkaroosi, glyseroli, ja natriumortovanadaattia; (2) uuttamalla kalvon proteiinien NP40 ja natriumdeoksikolaatista. Ennen massaspektrometrianalyysin, kalvon proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja jaetaan kymmeneen geeli jakeet, jotka sitten leikattiin pieniksi geelipalat ( 1 mm

3) ja alistettiin geelissä ruoansulatusta, erikseen. In-geeliä ruuansulatuksen menettely sisältää Coomassie-sinistä värinpoistoliuos, disulfidisidoksen vähentäminen, acrylation jodoasetamidilla, ja trypsiinihajotuksen, jonka jälkeen meidän aiemmin kuvattu menetelmä [22].

matrigeelin invaasio ja haavan paranemista määritys

In vitro

hyökkäystä analysoitiin Matrigel päällystettyä (1 mg /ml; BD Biosciences) PET-kalvo transwell aseta (BD Biosciences) on 24-kuoppalevylle. Syöpäsolut (1,5 x 10

5 solua 200 ui) suspendoitiin DMEM väliaineessa ja lisätään ylemmän puoliskon insertin kammion. DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää lisättiin kemoattraktantti alempaan puoli. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, syöpäsolut läpi insertin kiinnitettiin 3,7% formaliinilla (Sigma-Aldrich), ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla (Sigma-Aldrich).

In vitro

muuttoliike analysoitiin ibidi Culture-Insert (ibidi). Syöpäsolut (70μl; pitoisuus: 7×10

5 solua /ml) lisättiin Culture-Insert hyvin ja viljeltiin 24 tunnin ajan. Poistamisen jälkeen Culture-Insert, syövän soluja viljeltiin 16 tunnin ajan. Vaellusetäisyydet syöpäsolujen tallennettiin ja mitattiin käyttämällä ohjelmistoa image J.

Sphere muodostumisen määritys

Sphere muodostumisen määritys suoritettiin 6 cm viljelymaljalle päällystettiin 1% agaroosilla. Syöpäsolut suspendoitiin seerumivapaassa väliaineessa ympättiin tiheydellä 5000 solua /malja ja inkuboitiin 7 päivää. Lukumäärät ensisijainen pallo laskettiin manuaalisesti 7. päivänä mikroskoopilla. Sekundaariseen piiriin määritystä, pallojen primäärisestä viljelmästä kerättiin talteen ja inkuboitiin trypsiini huoneenlämpötilassa 10 min. Trypsinoitiin soluja aloilla vietiin läpi 26 G neula kolme kertaa. Erottaa solut yksitellen maljattiin 5000 solua /malja tiheys 6cm viljelymaljalle 7 päivää. Numerot toissijainen pallo laskettiin 7. päivänä.

tuumorigeenisyystesti määritystä immuuni puutteellinen hiirimallissa

Eläinten menettely (102-97-N) hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea (IACUC) China Medical University Hospital (Taichung, Taiwan). Erilaisten annosten CE146T soluja (10

2, 10

3, ja 10

4) injektoitiin ihonalaisesti molempiin kylkiin 5 viikon ikäisiä urospuolisia NOD-SCID-hiirissä tuottaa kasvaimia. Vasen kylki ruiskutettiin kontrolliryhmään syöpäsolujen, ja oikea kylki sai injektiona koeryhmään. Kasvaimen koko mitattiin mittaamalla tulkilla viikoittain, kun kasvainten tuli näkyviin, ja havainnoinnin kesto oli kahdeksan viikkoa. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: (pituus x leveys

2) /2.

massaspektrometrianalyysin

Massaspektrometriparametrit analyysi suoritettiin käyttäen lineaarista ioniloukku-Fourier-ioni syklotronista resonanssi massaspektrometriä (LTQ-FTICR MS; Thermo Fisher) varustettu nano-sähkösumutus ionilähteen (Uusi tavoite) ja nano-HPLC-järjestelmällä. Nano-HPLC erotus käyttää käännetyn nano-pylväs (75 pm ID x 200 mm) pakattu Magic C18AQ hartsin (partikkelikoko 5 um, huokoskoko 200 A °; Michrom Bioresources) ja Agilent 1100 sarjan binääristä HPLC pumppu (Agilent Technologies) . Analyyttinen ohjelma asetettiin lineaarinen gradientti 10%: sta 50% ACN, jossa on 60 min käynnissä ajan. Tutkimus skannaus MS-analyysiä (

m /z

320-2,000) suoritettiin LTQ-FTICR MS jonka massa resoluutio 100000 osoitteessa

m /z

400. Kymmenen eniten runsas moninkertaistuvat varautuneet ionit olivat peräkkäin eristettiin MS /MS LTQ. Saatu data levitettiin MaxQuant ohjelmiston [23] proteiinin tunnistamiseen. Tarkka label-vapaa kvantitointi suoritettiin käyttäen MaxLFQ ohjelman normalisointi ja maksimaalinen peptidin suhde uuttamismenetelmiä [24]. Merkitys kynnys tunnistus- asetettiin

P

0,01.

Tilastot

Data ilmaistiin keskiarvoina ± SD. Merkitys ero tutkittiin Studentin

t

-testi (kaksisuuntainen).

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

CE146T on enemmän metastaattista potentiaalia ja stemness ominaisuudet kuin CE81T

Voit valita sopiva kohdesolun tunnistamisessa uusia CSC markkereita, ensin ominaista metastaattisen ominaisuudet, kuten muuttoliikkeen ja hyökkäyksen ja pallo muodostumista kyky ruokatorven squamous syöpäsolulinjoista CE81T ja CE146T. Tulokset osoittivat, että CE146T on huomattavasti korkeampi maahanmuutto- ja invaasion kykyjä kuin CE81T (kuvio 1A ja 1B), joka tunnistettiin hyvin eriytetty syöpäsolun. Lisäksi, CE146T on myös suurempi pallo muodostumista kyky kuin CE81T (kuvio 1C). Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että CSC on ESCC ilmentää korkeita CD44 [25,26]. Näin ollen, käytimme virtaussytometrialla ekspression analysoimiseksi CD44 in CE146T ja CE81T. Tulos osoitti, että CE146T on korkeampi CD44 kuin CE81T (kuvio 1 D). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että CE146T on enemmän CSC väestö ja osoittaa enemmän CSC ominaisuuksia kuin CE81T, mikä tarkoittaa, että voimme tunnistaa CSC markkereita vertaamalla proteomic muutoksia CE146T ja CE81T.

(A) Wound- parantavaa määritys. CE81T ja CE146T viljeltiin ibidi Culture-Insert hyvin, ja siirtyminen kuvia syöpäsolujen kirjattiin 0hr (poisto Culture-Insert) ja 16 tunnin ajan. Migration etäisyys mitattiin käyttämällä ohjelmistoa kuva J. (B) Matrigel invaasiomääritys. Edustavia valokuvia sisältävät tunkeutuneet peruuttaa solut, jotka värjättiin kristalli- violetilla. (C) Sphere muodostumista määrityksessä. Erikokoisia pallojen CE81T ja CE146T laskettiin päivänä 7. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (keskiarvo ± SD). (D) CD44 ekspressio CE81T ja CE146T mitattiin käyttäen virtaussytometriaa.

tunnistaminen CSC markkereita käyttäen vertailevaa kalvo proteomic lähestymistapa

kalvo proteiinin etuna on diagnostisia ja terapeuttisia sovelluksen . Siten, käytettiin vertailevan kalvo proteomiikka-analyysi tunnistaa uusia CSC markkeria CE146T ja CE81T. Vaikka CE146T ja CE81T eivät isogeenisiin, CE146T voi ilmaista korkeampi liittyvien proteiinien CSC ominaisuudet kuin CE81T perustuu edellä huomautuksia. MS-analyysi, kaksi teknistä rinnakkaista tehtiin kullekin näytteelle. Proteiini tunnistaminen ja etiketti-vapaata kvantifiointiin massan signaalit analysoitiin käyttämällä MaxQuant ohjelmistoa [23]. Tässä analyysissä yhteensä 652 membraaniproteiineja tunnistettiin, jotka sisälsivät 266 solukalvon proteiineihin perustuvat Gene ontologia määritelmästä. Niistä kalvon proteiineja, yhteensä 13-proteiinit osoittivat ekspressiota tai yli 50-kertainen ekspression CE146T verrattuna CE81T (taulukko 1).

validoimiseksi MS tuloksia, käytimme RT-PCR, kvantitatiivinen PCR (qPCR), ja western blot tutkia geenin ja proteiinin ekspressiotasot ehdokas proteiinien kahta lukuun ottamatta histokompatibiliteettiantigeeneihin. RT-PCR ja qPCR Tulokset osoittivat, että solujen välinen adheesiomolekyyli 1 (ICAM1) ja prominin-2 (PROM2) on korkeampi geeniekspression CE146T kuin CE81T, joka on sopusoinnussa proteomic havainnon (kuvio 2A ja 2B). Western blot osoitti, että ICAM1 on voimakasta ilmentymistä CE146T, mutta ei PROM2 (kuvio 2C). Näin ollen meidän arvioidaan edelleen luonteeltaan ICAM1 CSC ominaisuuksiin ESCC.

(A) mRNA-tasot kohde- proteiinit analysoitiin käyttäen RT-PCR-määritystä. GAPDH toimi kontrollina. (B) mRNA-tasot kohde- proteiinit analysoitiin käyttäen qPCR. (C) proteiini tasot molempien PROM2 ja ICAM1 analysoitiin western blot-määritystä. β-aktiini toimi latauskontrollina.

ICAM1 lisää metastaattisen potentiaalin syöpäsolujen

arvioimiseksi tehtävät ICAM1 CSC ominaisuuksista, käytimme lentivirusvektorilla ilmentävät ICAM1 sidottu lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) kaataa ICAM1 ilme. Kaksi erilaista ICAM1 shRNA transfektoitiin CE146T (merkitty shICAM1 # 1 ja shICAM1 # 2), sekä transfektoidut solut osoittivat selvää knockdovvn ICAM1 Länsi blot määrityksessä (kuvio 3A). ICAM1 Knockdown ei vaikuttanut solujen kasvuun CE146T (kuvio 3B), mutta se vähensi solujen vaeltamiseen ja invaasiota kyvyt CE146T haavan paranemista ja siirtokuoppaan määrityksissä, vastaavasti (kuvio 3C ja 3D). Lisäksi kaksi farmakologinen ICAM1 estäjät, silibinin [27] ja 18 beta-glykyrretiinihappoa (18β-GA) [28], näytetään samanlainen vaikutus vähentää maahanmuuttoa ja hyökkäys kyvyt CE146T (kuvio 3C ja 3D). Tulokset osoittivat, että ICAM1 myötävaikuttaa CE146T metastaattisen ominaisuudet

in vitro

. Näin ollen, olemme edelleen määritetty, onko ICAM1 pudotus vaikuttaa ekspressiotasot EMT markkereita. Western blot tulos osoitti, että sekä shRNA ja farmakologinen esto voi korottaa epiteelin markkerin, kuten ZO-1 ja vaimentaa tasot mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin ja fibronektiiniä (kuvio 3E).

(A) ICAM1 ilmentyminen pudotettiin käyttämällä kahdenlaisia ​​shRNA, shRNA # 1 kohdesekvenssi on: GCCCGAGCTCAAGTGTCTAAA, ja shRNA # 2 kohdesekvenssi on: CCTCAGCACGTACCTCTATAA. (B) Solujen kasvua CE146T analysoitiin käyttäen MTT-määritystä. ICAM1 Knockdown ei vaikuttanut merkitsevästi kasvuun CE146T soluja. CE146T-shGFP toimi kontrollina. Vaikutukset ICAM1 Knockdown solun muuttoliikettä ja invaasiota kyvyt analysoitiin käyttämällä (C) haavan paranemista ja (D) matrigeeliä invaasio määrityksissä, vastaavasti. Molemmat kokeet suoritettiin kolmena kappaleena (keskiarvo ± SD). (E) ilmentymistä EMT merkkiaineiden määritettiin käyttämällä western blot -määritys. CE146T käsiteltiin ICAM1 estäjän silibinin (2 uM) tai 18β-GA (10gM) 24 h ajan. Ilmaisut epiteelin marker ZO-1 ja mesenkymaalisten merkkiaineita N-kadheriinin ja fibronektiiniä tutkittiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita. β-aktiini toimi latauskontrollina.

ICAM1 kasvattaa pallo muodostumista ja lääkeresistensseihin

CSC on tiedetty lisäävän kykyä pallon muodostumista ja ilmaista kestävät hyvin säteilyä ja kemoterapiaa. Merkin toiminnot ICAM1 on pallo muodostumista, vertasimme kyky pallon muodostuminen shICAM1 # 1 ja shICAM1 # 2 ja kontrolliryhmä shGFP of CE146T. Tulos osoitti, että ICAM1 Knockdown vähentää merkittävästi alalla muodostumista kykyä CE146Y, olipa-alalla useissa tai alalla koko (kuvio 4A). Lisäksi se vähensi merkitsevästi myös toissijaisen alalla muodostumista CE146T (kuvio 4B).

määrityksissä (A) ensisijainen pallo muodostumista ja (B) toissijainen pallo muodostuminen suoritettiin CE146T tai ilman ICAM1 knockdown. Sphere määrä ja koko havaittiin ja laskettiin ensisijaisen 7th päivä kulttuuriin. (C) Lääkeaineresistenssi analyysi. CE146T-shGFP ja ICAM1-shICAM1 # 1 käsiteltiin erilaisilla annoksilla sisplatiinia 24 h, ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena (keskiarvo ± SD).

Sisplatiini on yleisesti käytetty sytotoksisen aineen kemoterapiassa ruokatorven syöpään, kun taas sisplatiini on myös kliinisesti merkittävä radio-herkistävää vaikutusta, joka tekee yhdistelmähoito käytännössä [29]. Arvioidaan toimintoja ICAM1 sisplatiinilla vastus, käsittelimme CE146T eri annoksilla sisplatiinin ja määritettiin solujen elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä. Tulos osoitti, että ICAM1 Knockdown vähentää kykyä Sisplatiinin vastus CE146T, ja IC

50 CE146T kontrolliryhmässä (shGFP) ja ICAM1 taintumisen ryhmä (shICA1 # 1) on 5 uM ja 3,5 uM sisplatiinin, vastaavasti ( Kuva 4C).

ICAM1 edistää tuumorigeneesiä immuuni hiirissä

tutkia toimintoja ICAM1 on tumorigeneesin

in vivo

, me ihonalaisesti molempiin kylkiin NOD-SCID hiiriä 10

2, 10

3, tai 10

4 CE146T soluja. Vasen kylki ruiskutettiin kontrolliryhmää CE146T (shGFP), ja oikea kylki ruiskutettiin koeryhmän of CE146T (shICAM1 # 1) (kuvio 5A). Tulokset osoittivat, että jopa pieni annos CE146T solujen (10

2) ilman subpopulaatio rikastamiseen pystyy aiheuttamaan tuumorigeneesiä NOD-SCID-hiirissä, mikä viittaa siihen, että CE146T todellakin on korkea väestö CSC (kuvio 5B ja 5C). Lisäksi, suurempi annos ICAM1 taintumisen CE146T soluja (10

4) tarvitaan kasvaimen muodostumisen indusoimiseksi, paljastaen että ICAM1 pudotus vähentää

in vivo

Tuumorigeenisuustutkimuksissa, yksi tärkeimmistä ominaisuuksista CSC (kuvio 5B ja 5C).

(A) Eri annoksia CE146T soluja, 1×10

2, 1×10

3, ja 1×10

4, injektoitiin ihonalaisesti molempiin kylkiin 5 viikon ikäisten uros NOD-SCID-hiirten (

N

= 4). Edustavia ihonalainen kasvaimia peräisin CE146T-shGPF in vasen sivusta ja CE146T-shICAM1 # 1 in oikeaan kylkeen. (B) määrä kasvaimen muodostumisen kussakin ryhmässä kirjattiin ja tiivistää. (C) Kasvaimen koon kirjattiin viikoittain ja kasvaimen keskimääräinen tilavuus kukin ryhmä piirretään. Havainto jatkettiin kahdeksan viikon ajan ymppäyksen jälkeen.

ICAM1 säätelee ruokatorven CSC ominaisuudet osittain p53-riippuvaisen reitin

potentiaalin mekanismi ICAM1 säätelyssä CSC ominaisuudet, suoritimme vertaileva proteomiikka analyysin tutkia proteiinin muutos välillä shGFP ryhmä ja shICAM1 ryhmä CE146T. Niistä tunnistettu listan (S1 taulukko), huomasimme p53 liittyvä alaryhmä merkittävästi alas-ilmaisi yhdessä ICAM1 taintumisen (taulukko 2). P53 on hyvin tutkittu tuumorisuppressoriproteiinia syövän biologian. Viimeaikaiset tutkimukset kantasolujen alalla ovat korostaneet syvällinen merkitys p53 kuin este syövän kantasolujen muodostumista [30,31]. Siksi tutkimme p53-proteiinin tasot CE146T vuonna shGFP valvonnassa ja tämän hoitoon shRNA tai farmakologisen ICAM1 estäjä kunnossa. Western blot paljasti, että ICAM1 Knockdown ja farmakologiset inhibiittorit voivat lisätä p53 tasoja CE146T (kuvio 6A), mikä tarkoittaa, että ICAM1 voi säädellä ruokatorven CSC merkkiä, ainakin osittain, alentamalla p53 tasoa ja siihen liittyvät signalointireitteihin. Olemme edelleen validoitu p53 liittyvät alaryhmä proteomic havainto käyttäen RT-PCR. Tulos osoitti, että mRNA-tasot aivolisäkkeen kasvaimen muuttaa geenin 1 proteiini-vuorovaikutuksessa proteiini (PTTG1IP) ja DNA (sytosiini-5) -methyltransferase 1 (DNMT1) ovat selvästi alennettu ICAM1 pudotus ehto, joka on sopusoinnussa proteomic tulos (kuvio 6B).

(A) p53 tasot CE146T vuonna shGFP ohjaus ja alle shRNA knockdown tai ICAM1 estäjä olosuhteita analysoitiin western blot-määritystä. Suhteellinen suhde p53-tasojen normalisoitu kanssa β-aktiini tasot. (B) mRNA-tasot p53-sukuiset proteiinit PTTG1IP ja DNMT1 analysoitiin käyttäen RT-PCR-määritystä. GAPDH toimi kontrollina.

ICAM1 ja CD44 voisivat hyödyntää korvausjärjestelmän säilyttää ruokatorven CSC ominaisuudet

ksenotransplantaatioon kokeessa ICAM1 knockdown menettää sen estäminen virta tumorigeneesin korkeassa solujen määrä (10

4) injektiota tilassa (kuvio 5B). Mietimme, onko rajat sääntelyä olemassa molekyylejä, jotka vaikuttavat CSC ominaisuuksiin, esimerkiksi ICAM1 ja CD44. Todistaa tämän spekulaatiota, me vastavuoroisesti pudotettiin ICAM1 ja CD44 ja määritettiin niiden ICAM1 ja CD44 ilmaisun käyttämällä western blot. Tulos osoitti, että ICAM1 pudotus käyttäen sekä shRNA ja farmakologinen esto vähentää tehokkaasti ICAM1 ilmaisun ja samanaikaisesti lisää CD44 ilmentymisen käänteinen korrelaatio tavalla (kuvio 7A). Lisäksi CD44 pudotus on myös mahdollisuus lisätä ICAM1 käänteisfaasi korrelaation samalla tavalla (kuvio 7B). Tämä havainto osoitti potentiaalinen mekanismi, joka syöpäsolujen voisi käyttää korvausjärjestelmän säilyttää CSC ominaisuuksia.

ICAM1 ja CD44 ilmaisun analysoitiin western blot-määritystä. (A) Sekä shRNA ja farmakologinen estäminen vähentää ICAM1 ilme ja samalla lisätä CD44 ilme. (B) CD44 pudotus johtaa lisätä ICAM1 tasot compensative tavalla. CD44 ilmentyminen pudotettiin käyttäen kolmea erilaista shRNA, shRNA # 1 kohdesekvenssi on: CGCTATGTCCAGAAAGGAGAA, shRNA # 2 kohdesekvenssi on: ATGGACTCCAGTCATAGTATA, ja shRNA # 3 kohdesekvenssi on: GGACCAATTACCATAACTATT. β-aktiini toimi latauskontrollina.

Keskustelu

adheesiomolekyyli 1 (ICAM1, CD54) on 90 kDa: n glykosyloitu transmembraaniproteiini immunoglobuliinien superperheen. ICAM1 on tärkeä rooli immunologisten synapsi muodostumista, T-solujen aktivaation, leukosyyttien, ja lukuisia immuunivasteita [32]. Aiemmat tutkimukset havaittu, että ICAM1 erittäin ilmaisee eri mesenkyymikantasoluista kuten luuydin, istukka, rasva, säikeet, ja Wharton hyytelö [33-36]. Äskettäin ICAM1 tunnistettiin toimia markkerina Maksasolusyövän kantasolujen [37]. Tässä tutkimuksessa ICAM1 tunnistettiin ilmaista korkeampi stemness ominaisuuksien ruokatorven syöpä CE146T soluista käyttäen vertailevaa proteomic lähestymistapaa. Meidän tutkimus osoitti läsnäolon ICAM1 vaikuttaa syöpäsolun pallo muodostumista, lääkeresistenssin ja tuumorigeneesiä hiiren ksenotransplantaatioon mallissa, mikä osoittaa, että ICAM1 voidaan käyttää mahdollisena CSC markkeri ESCC ja sen vuoksi toimia terapeuttisena kohteena lääkkeiden kehittämisen ja kehittämiseen.

Systemaattinen meta-analyysi toi esiin positiivisia p53 edustaa suotuisa prognoosi- ominaisuus ja on johdonmukaisesti liittyy eloonjäämisaste ESCC [38]. Tutkimuksemme havaittu, että ilmaus ICAM1 käänteisesti korreloi p53 tasolla, mikä viittaa siihen, että korkea ilmentyminen ICAM1 voi johtaa syöpään maligniteetti. Lisäksi verrattuna proteomic muutos CE146T ja ilman ICAM1 knockdown tunnistimme alaryhmä proteiinien ilmentämiseen liittyvän ja toiminnot p53. Yhdenmukainen proteomic havainnon, sekä PTTG1IP ja DNMT1 pienentää niiden mRNA-tasoja sekä ICAM1 knockdown. PTTG1IP voi edistää kasvaimen kasvua ja invaasiota kyky, ja sen korkea ilmentyminen itsenäisesti liittyy huonoon ennusteeseen ja alemman tautikohtaista selviytyminen [39]. Tuore tutkimus osoitti, että PTTG1IP on pystynyt vähentämään p53 vakautta lisäämällä ubikitinaation, joka riippuu E3 ligaasin aktiivisuuden MDM2 [40]. Tämä tulos antaa selitystä Tutkimuksemme että ICAM1 Knockdown vähenee PTTG1IP johtavilla tasoilla vakauttamiseksi p53, ja siten lisätä p53 tasoja. DNMT1 on merkittävä entsyymi mukana perustamassa genomista metylaation. DNMT1 yli-ilmentyminen havaittiin erilaisissa syövissä ja se saattaa aiheuttaa epigeneettiset muuttamiseen monituumorisuppressori geenejä ja lopulta johtaa kasvaimien syntyyn ja huonon ennusteen [41-46]. Lisäksi DNMT1 yliekspressio osoitettiin liittyvän menetyksen tukahduttaminen p53 solu- ja kliinisellä tasolla [46]. Yhteenvetona havaintomme ja siihen liittyvät tiedot viittaavat siihen mahdollinen mekanismi, joka ICAM1 voi säädellä CSC ominaisuuksia jota ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1 reitin. Kuitenkin tämä ehdotti polku jää todistaa yksityiskohtainen kokeita.

signalointireitin cross-talk, esimerkiksi mTOR /S6K1 ja Hedgehog reittejä [47] tai EGFR ja VEGF reittejä [48], on hyvin tunnustettu tarjoamaan monimutkainen vuorovaikutus ja laaja viestintää vasteena solujen stimulaation, ja lukemiin synergistisiä tai antagonistisia vaikutuksia ja lopulta toivottavaa biologiset vaikutukset [49]. Olipa syövän kantasoluja käyttävät samaa mekanismia, molekyyli- cross-talk, säilyttää CSC ominaisuuksien edelleen heikko. Nykyisissä tutkimuksessa havaitsimme korvaus ilmiö välillä ICAM1 ja CD44 ekspressiotasoja, joka kuitenkin herättää myös useita kriittisiä kysymyksiä. Do ICAM1 ja CD44 yhteisiä signalointi verkkojen ylläpitämiseksi kasvain stemness? Mikä on stökiömetrisenä suhde ICAM1 ja CD44 säätelyssä CSC väestön ja ominaisuudet? Laajan tutkimuksen auttavat paljastamaan taustalla olevien mekanismien mukana ylläpitoon ICAM1 ja CD44 CSC of ESCC. Perustuen tällaisia ​​korvausjärjestelmästä, meidän tutkimus osoittaa yhdistelmän useiden kohdistusstrategioihin olisi harkitaan hankkimalla voimakkaampi terapeuttinen vaikutus CSC on ESCC.

tukeminen Information

S1 Taulukko.

doi: 10,1371 /journal.pone.0142834.s001

(PDF) B

Kiitokset

Tätä työtä tukivat tiede- ja teknologia, Taiwan Apurahat NSC102-2320- B-039-050 ja MOST 102-2911-I-002-303.