Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-termisen ilmakehän paineessa plasmaa (NTAPP) on ionisoitu kaasu huoneen lämpötilassa ja sillä on potentiaalia uuden apoptoosin edistämiseksi syövän hoito, joka toimii tuottamalla reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). On kuitenkin välttämätöntä määrittää sen selektiivisyyden ja yhdenmukaistaa komponenttien ja kokoonpanon NTAPP. Täällä me suunnittelimme NTAPP tuottavan laitteen yhdistettynä Hän kaasun syöttöjärjestelmä ja osoitti korkea selektiivisyys p53-mutatoitunut syöpäsoluja. Ensin määritetään asianmukainen edellytykset NTAPP altistuminen selektiivisesti apoptoosin syöpäsoluissa. Apoptoottista vaikutusta NTAPP oli suurempi p53-mutatoituja syöpäsolujen; keinotekoinen p53 ilmentymistä p53-negatiivinen HT29 vähensi pro-apoptoottinen vaikutus NTAPP. Tutkimme myös ekstra- ja intrasellulaarisen ROS tasoilla NTAPP käsiteltyjä soluja päätellä mekanismi NTAPP toimintaa. Vaikka NTAPP välittämää nousua solunulkoisten typpioksidin (NO) ei vaikuttanut solujen elävyyden, solunsisäinen ROS lisääntynyt alle NTAPP altistuksen ja indusoi apoptoottista solukuolemaa. Tämä vaikutus oli annoksesta riippuen vähensi seuraava hoito ROS scavengers. NTAPP aiheuttaman apoptoosin jopa doksorubisiiniresistenttejä syöpäsolulinjoissa, osoittaa toteutettavuus NTAPP tehokkaana syövän hoidossa. Yhdessä nämä tulokset tukevat voimakkaasti potentiaalia NTAPP selektiivisenä syöpähoidon, erityisesti p53-mutatoitunut syöpäsoluja.

Citation: Ma Y, Ha CS, Hwang SW, Lee HJ, Kim GC, Lee KW, et ai. (2014) Ei-Thermal Ilmanpaine Plasma Edullisesti indusoi apoptoosia p53-mutaation Syöpäsolut aktivoimalla ROS Stress-Response Pathways. PLoS ONE 9 (4): e91947. doi: 10,1371 /journal.pone.0091947

Editor: Subrata Roy, University of Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 syyskuu 2013; Hyväksytty: 18 helmikuu 2014; Julkaistu 23. huhtikuuta 2014

Copyright: © 2014 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustus KRICT (SI-1304) ja ministeriön Knowledge Economy, Korea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Apoptoosi on tunnettu muoto ohjelmoidun solukuoleman, joka poistaa vaurioitunut ja ei-toivottuihin soluihin; se toimii ratkaiseva mekanismi puolustaa kudosten ja elinten erilaisista jännityksiä ja soluvaurioita [1]. Selektiivinen induktio apoptoosin syöpäsoluissa pidetään erinomainen lähestymistapa syövän hoitoon, ja monet syövän vastaisina aineina, joilla tämä mekanismi on kehitetty. Kuitenkin nykyiset menetelmät edelleen huomattavia haasteita voittaa, kuten lääkeresistenssin, alhainen terapeuttinen tehokkuus, ja syöpäsolun valikoivuus.

p53 tuumorisuppressoriproteiinia on välttämätöntä, jotta genomista vakauden nisäkkäillä. Kun soluja altistetaan eri genotoksisia ja solujen stressiä, kuten oksidatiivisen stressin, hypoksia, säteilyä tai kemoterapeuttiset lääkkeet, p53 aktivoituu, ja sen ubikitiinistä riippuvainen hajoamista on estetty, mikä johtaa kertyminen aktiivisen p53 transkriptiotekijän [1]. Aktivoitu p53 säätelee solusyklin pysähtymiseen, aktivointi antioksidantteja ja DNA: n korjaukseen, ja apoptoosin vaikuttamalla ilmaus sen kohdegeenien, kuten sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjä

p21 /WAF1

ja geenien solukuolema, kuten

BAX

,

PUMA

,

NOXA

, ja

Fas

[2], [3]. Kun solut altistetaan oksidatiivista stressiä, p53 myös aktivoi transkription sestrin, glutationiperoksidaasia (GPX), ja aldehydi (ALDH), jolloin niillä on hyvin keskeinen rooli ylläpitää redox tasapainossa ja genomin vakauteen oksidatiivisen stressin [4], [5 ]. Mutaatio p53-geenin tai häiriöitä polkuja, jotka johtavat p53: n aktivointi on usein havaittu useimpien ihmisen syövän [6].

p53-riippuvaisen apoptoosin induktio vasteena genotoksinen vahinkoa on tärkeä näkökohta kasvaimen suppression. Näin ollen menetys p53 ihmisen syövissä edistää tuumorien aggressiivisempaa käyttäytymistä ja edistää usein resistenssin syöpäsolujen säteilylle ja kemoterapeuttisten. Esimerkiksi hoidettaessa p53

+ /+ hiiri tymosyyttien säteilyllä johtaa apoptoosin, kun taas p53

– /- tymosyyttien ovat resistenttejä. Samoin p53

+ /+ hiiren alkion fibroblasteissa, joka on transformoitu adenoviruksen E1A-proteiinia ja Ha-ras-onkogeeni apoptoosiin vasteena y-säteilytys tai kemoterapia-aineiden, mutta p53

– /- fibroblasteja ovat kestäviä sekä hoitojen [7 ]. Lisäksi jotkut p53 mutaatiot syövissä tukahduttaa toiminta p73, joka indusoi apoptoosia p53-riippumaton mekanismi [8]. Täten yhteinen menetys p53-toiminto syöpäsoluissa muodostaa merkittävän rajoituksen syöpähoitoihin.

Plasma on kuvattu lähes neutraali seos varattujen hiukkasten ja radikaalit osittain ionisoidun kaasun. Viime aikoina monet tutkimukset ovat yrittäneet hyödyntää alhaisen lämpötilan ei-termisen ilmanpaine plasma (NTAPPs) biolääketieteen hakemusten nojalla hallittavuus plasman kemian ja kinetiikka [9] – [11]. On olemassa useita erilaisia ​​NTAPPs, kuten plasma neula, plasmasuihkujen, ja sähköeristeessä päästöt (DBDS) [11]. Kaasu komponentti ja lujuus ja pulssin kesto sähkökentän määrittää tarkan plasma koostumuksia. Tutkimus NTAPPs kliinisiin sovelluksiin on viime aikoina tullut hyvin aktiivinen tutkimuskohde; NTAPPs syntyy helposti ilmassa ja niitä voidaan käyttää ilman, että aiheutetaan lämmön vahinkoa soluille. Vaikutukset NTAPPs eläviin kudoksiin kuuluvat sterilointi, haavan paranemista, ja solumigraatio muutokset (katsauksia [10], [12]). Erilaisia ​​erilaisia ​​vaikutuksia plasman riippuu plasma annostus ja niiden monimutkainen kemiallinen koostumus.

Aikaisemmat tutkimukset koskien kliinistä soveltamista NTAPP nisäkässoluille ovat lähinnä sen vaikutus solujen kuolemaan [13], [14] . Useita mahdollisia mekanismeja, jotka liittyvät NTAPP-välitteisen solukuoleman raportoitu, mukaan lukien lasku soluadheesion [15], [16]. Erityisesti useat tutkimusryhmät osoittivat, että NTAPP indusoi apoptoosia joissakin syöpäsoluissa, ja sitä voidaan käyttää syövän hoidossa [17], [18]. On yhä enemmän todisteita viittaa siihen, että reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ovat tärkeimmät pelaajat NTAPP aiheuttaman apoptoosin

in vitro

[19] – [22].

ROS ovat kemiallisesti reaktiivisia radikaaleja, ioneja tai molekyylejä, jotka sisältävät vapaita happiradikaaleja ja sivutuotteena normaalin aineenvaihdunnan. Pohjapinta tasot ROS aktivoida lukuisia signa- edistää soluproliferaatiota normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa [23] – [25]. Kuitenkin liiallinen ROS tasoilla aiheuttaa oksidatiivista stressiä, ja sitä hyökätä DNA: ta, proteiinia, lipidejä ja muita solun komponentteja, lopulta edistää solun vanhenemista ja apoptoosia [26], [27].

Ensimmäinen askel kehittää NTAPP kuin mahdollinen syöpähoidon on arvioida sen valikoivaa tehoa kohti syöpäsoluja. Tässä osoitamme, että NTAPP indusoi apoptoosia p53-mutatoitu syöpäsolut, mutta ei primaarisia tai kantasoluja. Samalla osoitetaan, että NTAPP välittämää nousua solunsisäisen ROS indusoi apoptoottista solukuolemaa pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Edelleen arvioimaan mahdollisuuksia NTAPP syöpähoitoa, testasimme NTAPP in doksorubisiiniresistenttejä syöpäsoluja ja totesi, että se kykeni indusoimaan apoptoosin. Yhdessä nämä tulokset tukevat voimakkaasti potentiaalia NTAPP selektiivisenä syöpähoidon, erityisesti p53-mutatoitunut syöpien ja solut, jotka ovat resistenttejä olemassa olevien syöpälääkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja NTAPP hoito

solut tässä tutkimuksessa käytetyt ja niiden lähteet on esitetty taulukossa 1. HeLa ja Hep G2-soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia ( FBS) ja 10 ml /l penisilliiniä-streptomysiiniä. G361, HCT116, HCT116 p53

– /-, HCT15, MES-SA, H1299, HT29, DLD-1, LoVo, doksorubisiini-resistenttejä HCT15 /CL02 ja MES-SA /DX5-soluja kasvatettiin RPMI-1640, johon on lisätty 10% (v /v) FBS: ää ja 10 ml /l penisilliiniä-streptomysiiniä. IMR90 ja RKO-soluja kasvatettiin Minimum Essential Medium (MEM), johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää ja 10 ml /l penisilliiniä-streptomysiiniä. YD-9-soluja kasvatettiin DMEM:DMEM /F12 (01:01), johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää ja 10 ml /l penisilliiniä-streptomysiiniä. Ihonalainen rasvakudos saatiin aikana valittavia leikkauksia potilaan suostumuksella, hyväksymä Samsungin Hospital Institutional Review Board (IRB no. KBC11151). Rasva-kudos kantasoluja (ASC: tä) eristettiin kudoksesta [28], ja niitä kasvatettiin DMEM /Hamin F-12 (DMEM /F12), jota oli täydennetty 10% (v /v) FBS: ää ja 10 ml /l penisilliiniä-streptomysiiniä. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2.

Jotta altistaa solut NTAPP, 1 x 10

5-soluja siirrostettiin 35 -mm viljellyt levyille ja inkuboitiin 24 tuntia. Solut altistettiin osoitettuun annos (5-standardin L /min [SLM], 5 V) NTAPP 30 s ja 1 min joka kerta, joka h enintään 10 kertaa. Tarvittaessa NTAPP alttiin soluja inkuboitiin edelleen 15 tunnin ajan, ennen kuin muissa kokeissa.

Western blot-analyysi

NTAPP altistuneet solut kerättiin ja lyysattiin, kuten on kuvattu [29]. Histonit uutettiin 0,6 N HCl. Näytteet totaali-proteiinia (50 ug) tai histonien analysoitiin anti-kaspaasi-3 (Cell Signaling Technology), anti-poly ADP riboosi-polymeraasi (PARP, Cell Signaling Technology), anti-aktiini (Sigma-Aldrich) seerumia, ja anti- -phospho-H2AX (γ-H2AX) seerumia (Millipore), fosfori-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology), PUMA (Cell Signaling Technology) ja Bax (Santa Cruz Biotechnology). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-anti-kani-(Jackson Immuno Research), sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin, ja käsiteltiin kalvot visualisoitiin käyttäen ECL (Amersham Biosciences).

Solunsisäinen ROS havaitseminen

HeLa-soluja (1 x 10

5) ympättiin 35 mm: n malja lasipeitinlevyille ja toistuvasti altistetaan 5 V NTAPP 30 s välein h yhteensä seitsemän kertaa ennen solunsisäisten ROS tasot arvioitiin käyttämällä ROS havaitseminen (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Non-fluoresoiva karboksyyli-H

2DCFDA helposti läpäiseviksi eläviin soluihin ja hapetetaan solunsisäisten ROS lähettämään kirkkaan vihreä fluoresenssin signaalia. Tert-butyyli (TBHP), jonka tiedetään indusoivan solunsisäisen ROS, käytettiin positiivisena kontrollina. N-asetyylikysteiini (NAC) ja natriumpyruvaattia (SP) käytettiin solunsisäisen ja solunulkoisen ROS puhdistavien, vastaavasti.

Extracellular nitriitin havaitseminen

tuotanto solunulkoisen typpioksidin (NO) altistumisen jälkeen ja NTAPP määritettiin mittaamalla kertyminen nitriitin stabiili metaboliitti NO, erittyy viljelyväliaineeseen. Sen jälkeen, kun solut altistettiin NTAPP, 50 ui viljelyalustaa otettiin, sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa Griessin reagenssia (1% sulfaniiliamidia, 0,1% naftyylietyleenidiamiinidihydrokloridia, ja 2% fosforihappoa) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Absorbanssi mitattiin 540 nm: ssä mikrolevylukijalla (Softmax Pro 4.0, Molecular Devices) käyttäen kalibrointikäyrää vaihteluväli 0-100 uM pitoisuuksina NaNO

2. NO scavenger kokeessa soluja esikäsiteltiin 30, 50 tai 100 uM pitoisuuksilla karboksi-PTIO (Sigma-Aldrich), joka reagoi stökiömetrisesti NO ennen kuin ne altistettiin NTAPP.

transfektio pcDNA-p53 -HA

Lisäsimme 2 ug plasmidia pcDNA-p53-HA (ystävällisesti toimitti Dr. J. Song, Yonsei University, Seoul, Korea) 6 ul lineaarinen L-PEI (polyetyleeni-imiini), sekoitetaan 150 mM NaCl, ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan. Seos levitetään HT29 ennen inkuboitu yön yli.

Virtaussytometria

jälkeen 10 toistuvat altistukset 5 V NTAPP jälkeen 15 h inkubaation jälkeen solut kerättiin trypsiini-EDTA: lla ja kiinnitettiin 70 % kylmällä etanolilla. Soluja käsiteltiin 100 ug /ml RNaasi 30 min 37 ° C: ssa ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitomispuskuriin (10 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2). Solut värjättiin 0,01 mg /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich), tai kahden-värjätty 5 ui FITC anneksiini V (BD Biosciences) ja 5 ui 7AAD (eBioscience) miljoonaa solua kohden havaita solujen apoptoottisen tila. Virtaussytometria suoritettiin FACScalibur (BD Biosciences) ja CellQuest ohjelmistoja.

Global malli analyysi plasman kemian

Koska se on vaikeaa kokeellisesti mitata jokaista lajia esiintyy NTAPP, plasman insinöörit kehittivät Yleinen malli [30], [31], joka laskee spatiaalisesti keskimäärin kemiallisia sekä varatut hiukkaset, ja tietyllä ajo kunnossa ulkoisten piirien avulla aikariippuvainen jatkuvuusyhtälö kullekin lajille. Simulaatio domain on jaettu kahteen alueeseen: plasma lähde alueen ja neutraalin kaasun verkkotunnuksen ilman plasmaa. Viimeksi mainitulla alueella koskettaa astian, joka sisältää solut. Tarkastellut kemialliset reaktiot ovat samat kuin taulukon 2 Sakiyama

et al.

[31], paitsi että lisäksi heliumin (He) lajeja, jotka käytettiin puskurina kaasun ja NTAPP laitetta, jota käytetään tätä koetta. Kokonaismäärä lajeja on 68, ja kokonaismäärä reaktioita on 826.

Yleinen malli Tässä tutkimuksessa käytetty ratkaistu jatkuvuusyhtälö raskaiden hiukkasten lajien ja energiatasapainon yhtälö elektronin lajeja. Koska lähes neutraalius plasma, elektroni tiheys voidaan laskea summattu kaikki positiiviset lajien tiheys ja vähentämällä kaikkien negatiivisten lajien tiheys. Yhtälöt ratkaistiin numeerisesti in house koodin neljännen asteen Runge-Kutta menetelmä.

Tilastollinen

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhettä (SEM) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Käytimme

t

-testaukset arvioida tilastollisesti merkitseviä eroja.

p

0,05 (*) ja

p

0,01 (**) tarkoittaa tilastollista merkittävyyttä verrattuna kontrolliryhmään.

Tulokset

Ominaisuudet on suunniteltu NTAPP laite

Suunnittelimme laite, joka tuottaa NTAPP altistaa elää soluihin. Tämä NTAPP laite on suunniteltu on sähkökentän kohtisuorassa kaasun virtauksen, jotta vähentää varautuneiden hiukkasten suihkun läpi. Siten syntyy ROS diffuusi laajalti, mutta varatut hiukkaset rajoittuvat plasma sukupolven aluetta. Pieni sivusuhde suihkun alueen plasman tilavuus johtaa myös pienempi määrä UV-fotonien laitteesta. Lisäksi pitkän etäisyyden laitteesta soluihin ja elatusaineet vähentää vaikutuksia UV fotonit absorboituvat tausta kaasuja ja nesteitä erittäin hyvin. Siksi odotamme tämä laite tarjoaa pääasiassa ROS plasmasta verrattuna suora plasmasuihkujen jotka tarjoavat varattuja hiukkasia suoraan tavoitteisiin. Kuvio 1 esittää kaavamaisen kuvan plasman generaattorin käytettiin tässä kokeessa. Laite on rengasmainen tyyppi sähköeristeessä (DBD) [32] määritelty NTAPP sukupolven alle ilmaa tai muita kaasuja korkean jännitteen siniaallon muodossa tai lyhytkestoisia pulsseja sovelletaan kahden elektrodin väliin, ainakin yksi, joka on eristetty. Eriste estää nykyisen build-up elektrodien välillä, luomalla sähköisesti turvallinen plasmassa ilman merkittävää kaasun lämmitin.

(A) Kaavamainen kuvaus NTAPP-tuottava laite käyttää hoitoon eläviä soluja. Dielektrinen materiaali on Teflon (polytetrafluoroethyle), ja elektrodi on tehty kuparista. (B) NTAPP syntyvät laitteesta. Plasman tiheys on suuruusluokkaa 10

12 /cm

3, ja kokonaisteho kulutetusta plasmassa on 1,11 W varten huipusta huippuun jännite 7 kV tulo DC jännite 5 V. määrät lasketaan ROS lajeista on esitetty kuvassa S1.

Kuten kuviossa 1, laite yhdistetään Hän kaasun syöttöjärjestelmä, verkkovirtaan toimittaja, ja DBD laite peitetty muovilla tapauksissa vähentää ROS diffuusion. Hän kaasu virtaa sisääntulon laitteen nopeudella 1-5 standardin litraa minuutissa (SLM), jota ohjataan massavirtaussäätimen (MKP, MPR-2000). AC-jännite kohdistetaan sisemmän elektrodin DBD laitteen taajuudella 11,4 kHz ja soveltaa huipusta huippuun jännite 7-20 kV, joka on muodostettu käyttäen muuntaja piiri koostuu tasasuuntausdiodien ja kaksisuuntaisen tehotransistoreja (Ramsey Electronics, PG13 plasma generaattori kit). DC-tulon jännite vaihtelee 5-12 V, joka on nimetty kontrolliparametrina muuttaa sovellettu jännite DBD laitteeseen. Esimerkiksi syöttöjännitteitä 5, 6, ja 12 V vastaa peak-to-peak ulostulojännitteet 7,5, 8,9, ja 18,8 kV, vastaavasti. Kokonaisteho kulutetusta plasmassa on 14,11 W huipusta huippuun jännite 7 kV tulo DC 5 V, joka on edellytys useimpien kokeellisten mittauksen.

tietoja plasma komponentteja ja kokoonpano on välttämätöntä toistettavuus ja mekanismi NTAPP toimintaa. On kuitenkin haastavaa mitata kunkin elementin syntyy plasmasta laitteen, erityisesti ilmakehän paineessa, koska monet ROS eivät emittoi valoa, joka voidaan havaita optisen emissiospektroskopia, ja massaspektroskopia on myös vaikea käyttää tätä painetta. Global mallintamista käytetään yleensä analysointiin NTAPP reaktion kinetiikkaa ja plasma kemian annetuissa käyttöolosuhteissa [30], [31]. Näin ollen, jotta voidaan analysoida komponenttien ja koostumus meidän NTAPP laitteen, käytimme globaali mallinnus, joka on hyvin samanlainen kuin Sakiyama et al. [31], paitsi että lisäämällä hän liittyviä reaktioita. Tulokset globaalin mallinnuksen vaihtelu Hän mooliosuus, samoin kuin kosteus, kiinteällä teho on 80 W on esitetty kuviossa S1.

kuivaa ilmaa nolla kosteus, reaktiot, jotka liittyvät veteen ei oteta huomioon, ja siten lajien määrä ja kokonaismäärät reaktiot vähenevät 43 ja 454, tässä järjestyksessä. Kuten Sakiyama et ai. [31] havaittiin kaksi eri simulointi alueiden vastuuvapauden kerroksen ja neutraalia kaasua toimialallaan simulointi domeenit vastuuvapauden alueen ja neutraalin kaasun alue tarkasteltiin erikseen. Kuva S1A ja S1B ovat tulokset vastuuvapauden alueella, ja kuvio S1C ja S1D ovat neutraali kaasu alueen yhteyttä ruokia. Kuvassa S1A esitetty ROS tiheys sisäpuolella plasman laitteen eri Hän kaasu jakeet, jota voidaan ohjata muuttamalla kaasun virtausnopeutta. Koska kynnys energioita vuorovaikutuksesta ROS ovat alhaisemmat kuin ne, joilla hän, ROS tiheydet määräytyvät pääasiassa ilman määrää, ja kaikkein hallitseva laji sisällä tapahtuvaa poistoa alue on atomi happea johtuu elektronitörmäyksellä dissosiaatiotapahtuman O

2 ja O

3 [30]. Runsain lajit ovat happiatomeja, typpioksidi, ja otsonin kun sekoitettu ilma osa on suurempi kuin 1%. Kuvassa S1B esittää vaikutuksen Kosteuden ROS tiheys seoksen 99% He ja 1% ilmassa. Tarkasteltavan mooliosuus vesihöyryn on 1%, mikä vastaa 30%: n suhteellisessa kosteudessa huoneenlämpötilassa. Muutos ROS tiheys ei ole merkittävä, kun mukaan vaikutus kosteuden lukuun ottamatta ylimääräisiä olemassaolon OH, H, H

2O

2, HNO

2, HNO

3, HO

2, ja H

2. ROS syntyy plasman laitteessa diffundoitua ilmaan, ja ne esitetään graafisesti kuvassa S1C jälkeen diffuusio ajankohtana 0,1 ms, joka arvioitiin saapumisaika lajin plasmasta suutin lautasen. Kun diffuusio prosessin ROS koko ilma, kaikkein hallitseva laji on otsoni sijasta atomi happea, ja se on helppo kiinnittää O

2 tuottaa O

3. Lopuksi, kuvio S1D on Mole määrä ROS saapuu lautasen pinta-alayksikköä kohti ja aikayksikköä. Kokonaismäärä mooli määrä voidaan arvioida kertomalla pinta-ala lautasen ja kokonaismäärä vuorovaikutuksen aikaa. Esimerkiksi lautasantennin halkaisija on 3,5 cm ja toiminta-aikoja 30 sekuntia, yhteensä kerroin on 289. Näin ollen suurin mooli määrän otsonia toimitettu media on noin 30 mmol. Kuljettaminen ROS sisällä nestemäisten ei ymmärretä hyvin ja on erittäin vaikea laskea, mutta on joitakin viitteitä reaktiolle hinnat sammutettua elektronien ja hydroksyyliradikaaleja sekä liikenteen protoni hyppii vesiliuoksena [31]. Jos oletetaan, että 10-30% kaasumaisten ROS toimitetaan nesteeksi median, koko mooli numero sisällä nesteen vaihtelee 3-9 mmol.

Differential vaikutukset NTAPP erityyppisiin ihmissolujen

määrittelee optimaalisen valotuksen edellytykset NTAPP estävän syöpäsolun lisääntymistä, alkuperäisessä kokeessa arvioitiin vaikutuksia eri NTAPP intensiteetin solun elinkelpoisuuden normaaleissa ja syöpäsoluja. Aluksi käytimme NTAPP vaihteluväli tulojännite (5-10 V) kerran syövän HepG2, normaali alkion keuhkojen fibroblastisolulinjan WI38-, ja ASC: tä 1 minuutin ajan, sitten soluja inkuboitiin 24 tuntia ennen me määrällisesti solujen elinkelpoisuus käyttäen MTT määrityksiä. MTT-määritystä on arvioitaessa solujen elinkelpoisuus, joka heijastaa elävien solujen lukumäärään läsnä. Lisääntynyt elinkelpoisuuden ehdottaa, että käsiteltyjen solujen lisääntyvät nopeammin kuin kontrollisolut. Väheni elinkelpoisuuden tarkoittaa, että käsiteltyjen solujen lisääntyvät hitaammin kuin kontrolli tai jotkut käsitellyistä soluista tehdään solukuolemaa. Tässä kokeessa etäisyys (3 cm) välillä NTAPP laitteen ja solut ja kaasun virtausta (5 SLM) on vahvistettu.

Kuten kuviossa S2, kun taas eroja elinkelpoisuus ei havaittu käsiteltyjen ja hoitamaton HepG2-soluissa, numerot WI38–VA13: n ja ASC-soluja hieman kasvoi kuin käsittelemätön kontrolli solut. Nämä tulokset viittaavat siihen, että NTAPP altistuminen voi aiheuttaa erilaisia ​​fysiologisia vasteita ei-syöpäsoluja ja syöpäsoluja. Meillä on myös vahvistanut, että muutoksia solujen elinkelpoisuus johtuu NTAPP altistusta eikä siis hän kaasua käytetään tuottaa NTAPP (kuva S3).

vieressä yrittäneet päätellä asianmukaisen NTAPP olosuhteissa estää proliferaatiota syöpäsoluja mutta ei normaaleissa soluissa. Kun HeLa-solut altistettiin 5 V NTAPP 30 s välein h enintään 9 h (10 toistuvat NTAPP altistus), kuten kuviossa 2A on esitetty, suhteellisen elinkelpoisten solujen prosentuaalinen oli hieman vähemmän lisääntynyt altistetuissa soluissa (134%) verrattuna että valottamattomat ohjaus soluja (145%). Lisäksi ero suhteessa elävien solujen välillä NTAPP-käsitellyn ja käsittelemättömän HeLa-solut voimistuivat, kun soluja inkuboitiin edelleen 15 tunnin kuluttua 10 NTAPP altistus: suhteellinen elinkelpoisten solujen prosentuaalinen oli vain 106% soluista altistettiin 10 toistuvia NTAPP 15 h lisäinkubaatio, verrattuna 200% käsittelemättömään kontrolliin (kuvio 2A). Mielenkiintoista on, että kun käytetään samoissa NTAPP pääasiallinen fibroblastien IMR90-soluja ja ASC: tä, suhteellinen solujen lukumäärä oli vahvistunut NTAPP-altistetuissa soluissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (kuvio 2C ja E). Suhteellisten osuuksien elinkelpoisten solujen ASC ja IMR90-soluja, jotka olivat altistuneet NTAPP 10 kertaa ja inkuboitiin edelleen 15 h olivat 178% ja 168%, vastaavasti, kun taas käsittelemättömän solut oli noin 150% (kuvio 2C ja E). Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että käytimme oikea NTAPP altistumisolosuhteista (toistuva altistuminen 5 V tulo NTAPP kanssa lisäinkubaatioon) estää selektiivisesti HeLa solujen lisääntymisen ja aktivoi leviämisen IMR90 soluissa ja ASC-nosturin.

(A-F) (A, B) HeLa, (C, D) rasvakudos-kantasoluja (ASC: tä), ja (E, F) IMR90 solut altistettiin 5 V tulo NTAPP 30 s välein h 10 kertaa, ja solujen elinkelpoisuus oli arvioidaan jokaisen merkitty altistuksen taajuutta. Inkubointiaika ilmaisee ajan kuluttua alkualtistusta NTAPP. 24 tunnin inkuboinnin näyte valmistettiin 10 toistuvia NTAPP vastuita minkä jälkeen inkuboitiin edelleen 15 tuntia. (A, C, E) suhteellinen prosenttiosuudet elävien solujen on esitetty verrattaessa alkuperäistä solujen määrä ennen altistumista ja inkubointia 100%. Elävät solut kvantifioitiin MTT määrityksissä, ja tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

p

0,05 (*) ja

p

0,01 (**) osoittavat merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna kunnossa. (B, D, F) Samasta NTAPP-alttiina näytteet (A), (C), (E), vastaavasti, γ-H2AX, kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3, PARP, ja pilkotaan PARP arvioitiin western blot-analyysit. Aktiini on esitetty latauskontrollina.

jälkeen tutkittiin laski HeLa-solujen lisääntymisen jälkeen, toistuvaa NTAPP altistus oli apoptoosin vuoksi seuraamalla pilkkomalla kaspaasi-3 ja sen alavirtavaikuttajainhibiittorit PARP, jotka molemmat aktivoituvat apoptoosin. Kun se altistetaan 10 toistuvaa 5 V NTAPP 30 sekuntia kutakin, pilkottiin kaspaasi-3 ja PARP havaittiin HeLa-soluissa, mutta ei IMR90 tai ASC-soluja (kuvio 2B). Yhdenmukainen suhteellinen solujen määrä kuvassa (kuva 2A, C, ja E), pilkotaan kaspaasi-3 ja PARP kasvatti merkittävästi ylimääräiset 15 tunnin inkuboinnin HeLa-soluissa, mutta ei havaittu ASC: hen tai IMR90 soluja (kuvio 2B, D, ja F). Nämä tulokset osoittavat, että NTAPP hoito indusoi apoptoosia HeLa-soluissa, mutta ei normaaleissa ASC tai IMR90-soluja. Meillä on myös vahvistanut, että toistuvaa NTAPP altistus indusoi apoptoosia HeLa-soluissa käyttämällä virtaussytometriaa, jossa anneksiini-V /7AAD värjäytymistä (kuvio S4).

Ottaen huomioon, että genomin epästabiilisuuden vuoksi DNA-vaurioita on suurin syy apoptoosin, tutkimme onko NTAPP altistus indusoi DNA-vaurioita apoptoottisia HeLa-soluissa. Fosforylaatio histoni H2AX on yksi varhaisimmista solun tapahtumien vastauksena DNA double-katkeaminen [7]. Vaikka syöpäsolut, kuten HeLa, yleensä alhaista pohjapinta γ-H2AX ilmaisun ilman stressiä, se lisääntyi merkitsevästi NTAPP-alttiina HeLa-soluissa (kuvio 2B). Ei ole yllättävää, ei γ-H2AX ekspressiota havaittiin ASC: hen tai ensisijainen IMR90-soluja (kuvio 2D ja F). Tämä havainto osoittaa, että NTAPP altistus indusoi DNA-vaurion, joka johtaa HeLa apoptoosin.

Anti-proliferatiivinen vaikutus NTAPP melanooman ja suun karsinoomasoluja

Koska altistuminen NTAPP indusoi apoptoosin HeLa-soluja mutta ei ensisijainen IMR90 tai ASC: tä, tutkimme sen vaikutus muiden syöpien soluja, mukaan lukien melanooma G361 ja suun squamous kohdunkaulan YD-9-solut, jotka ovat peräisin syövistä löytyy kehon pinnan, jossa plasma hoito voisi olla helposti sovellettavissa. Kuten kuviossa 3A ja C, 10 toistuvat altistukset 5 V NTAPP seurasi 15 tunnin inkuboinnin oli antiproliferatiivinen vaikutus G-361 ja YD-9 solua verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluihin. NTAPP altistus indusoi myös γ-H2AX ilmentyminen DNA-vaurioita ja apoptoosin G-361 ja YD-9-soluja (kuvio 3B ja D). Nämä tulokset osoittavat, että, kuten HeLa-soluissa, NTAPP altistuminen aiheuttaa huomattavia apoptoottisen solukuoleman melanooman ja suun squamous karsinoomasoluja, mikä viittaa mahdollisen plasman sovelluksen ihon ja suun syöpiin.

(A-D) (A , B) Suun kautta squamous carcinoma YD-9 ja (C, D) melanooma G361 soluja altistettiin 5 V tulo NTAPP 30 s välein h 10 kertaa, ja solujen elinkyky arvioitiin kussakin osoitti altistumisen taajuus. Inkubointiaika ilmaisee ajan kuluttua alkualtistusta NTAPP. 24 tunnin inkuboinnin näyte valmistettiin 10 toistuvia NTAPP vastuita minkä jälkeen inkuboitiin edelleen 15 tuntia. (A, C) suhteellinen prosenttiosuudet elävien solujen on esitetty verrattaessa alkuperäistä solujen määrä ennen altistumista ja inkubointia 100%. Elävät solut kvantifioitiin MTT määrityksissä, ja tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

p

0,05 (*) ja

p

0,01 (**) osoittavat merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna kunnossa. (B, D) Samasta NTAPP-alttiina näytteet (A) ja (C), vastaavasti γ-H2AX, kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3, PARP, ja pilkotaan PARP arvioitiin western blot-analyysit. Aktiini on esitetty latauskontrollina.

Erittäin etuoikeutetut anti-proliferatiivista vaikutusta NTAPP p53-vajaiden syöpäsolujen

Samoissa NTAPP olosuhteissa, sen anti-proliferatiivinen vaikutus oli suurempi HeLa-soluissa kuin G-361 ja YD-9-soluja (kuvio 2A ja 3), vaikka kaikissa solutyypeissä lopulta tehtiin apoptoosin. γ-H2AX fosforylaation ja apoptoosia ei havaittu HeLa-soluissa, kun 10 toistuvaa NaTPP kiihokkeet sovellettu, mutta tämä havaittiin vain G-361 ja YD-9-soluja, kun soluja inkuboitiin edelleen 15 tunnin kuluttua NTAPP altistuksen. HeLa, G-361, ja YD-9 ovat syöpäsoluja, mutta vain HeLa-soluista puuttuu toimiva p53 [33] – [35]. Ottaen huomioon, että NTAPP indusoi apoptoosia DNA-vaurioita, ja että p53 on keskeinen tuumorisuppressori vastauksena genotoksinen korostaa, me oletettujen onko läsnäolo tai puuttuminen on toimiva p53, HeLa, YD-9, ja G361-soluja tekee eron anti-proliferatiivinen vaikutus NTAPP.

jotta voidaan osoittaa, välistä suhdetta p53 ja herkkyys syöpäsolujen NTAPP, vertasimme anti-proliferatiivista vaikutusta NTAPP kolorektaalisyövässä solulinjoissa HCT116 (p53

+ /+) ja HCT116-E6 (p53

– /-), jotka molemmat on täsmälleen sama geneettinen tausta, lukuun ottamatta toiminnallisen p53. Kun HCT116 (p53

+ /+) ja HCT116-E6 (p53

– /-) sai 10 toistuvia 5 V NTAPP ärsykkeet jälkeen 15 h lisäinkubaatio, samassa kunnossa käytetty edellisessä NTAPP hoito, suhteellinen elinkelpoisten solujen prosentuaalinen määrä väheni sekä HCT116 (p53

+ /+) ja HCT116-E6 (p53

– /-) verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja (kuvio 4A ja B). Mielenkiintoista, HCT116-E6 (p53

– /-) solut osoittivat yliherkkyys NTAPP verrattuna HCT116 (p53

+ /+); suhteellinen prosenttiosuus eläviä soluja oli vain 80% in HCT116-E6, ja 140%: in HCT116, verrattuna 180% sekä käsittelemätön kontrolli ryhmissä (kuvio 4A ja B). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​vaikutuksen NTAPP havaittu HeLa, YD-9, ja G361-soluja, ja viittaavat vahvasti siihen, että syöpäsolut ilman toimiva p53 ovat merkittävästi herkempiä NTAPP kuin solut, jotka joilla on toimiva p53.

(A