Krooninen sairaus

tiivistelmä

MYC yli-ilmentyminen määritettynä molekyylien avulla on raportoitu suotuisa ennustetekijöiden biomarkkereiden in kolorektaalikarsinoomasta (CRC). Kuitenkin MYC ilmaus analyysi ei ole käytettävissä rutiini kliinisessä ympäristössä. Me tutkimme, immunohistokemia (IHC) myc-proteiinin käyttämällä uutta kaupallisesti saatavilla kani monoklonaalinen vasta [klooni Y69], joka on tällä hetkellä laajalti kliinisessä käytössä lymfooma diagnoosia voidaan käyttää ennustamaan lopputuloksen resektoidun CRC. Myc IHC suoritettiin kudoksen mikrosirulla (TMA), joka käsittää retrospektiivinen kohortti 1421 CRC potilaiden ja pisteytetään sokaissut kuin kaikkien kliinisten ja patologisten tietojen. IHC suoritettiin myös on subcohort kokonaisten jaksossa CRC arvioida värjäystä ominaisuuksia ja yhteensopivuutta TMA ilme. MYC yli-ilmentyminen havaittiin 980 (69%) CRC ja liittyi kasvaimen vaiheesta ja DNA mismatch korjaus /BRAF tila. Oli huomattavaa välisen TMA ja koko jakson myc IHC (kappa = 0,742, p 0,01). CRC kanssa MYC yli-ilmentyminen osoitettiin parannettu 5 vuoden pysyvyys (93,2% vs. 57,3%), minkä seurauksena merkittävästi moduloidaan hallitseva vaikutus kasvaimen vaiheen, ikä diagnoosin ja lymphovascular tilaa hyökkäys tilan säilymiseen. Olemme päätellä, että myc asema määräytyy IHC yksinään voidaan käyttää ennustamaan kokonaiselinaikaa potilaalla on CRC joille kirurginen resektio.

Citation: Toon CW, Chou A, Clarkson, DeSilva K, Houang M, Chan JCY , et ai. (2014) immunohistokemiaallisesti Myc ennustaa Survival in peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (2): e87456. doi: 10,1371 /journal.pone.0087456

Editor: Nathan A. Ellis, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 lokakuu 2013; Hyväksytty: 27 joulukuu 2013; Julkaistu 4 helmikuuta 2014

Copyright: © 2014 Toon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Pathology North henkilökunta Specialist Trust Fund. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. Christopher W. Toon työskentelee Histopath Pathology. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

häiriöstä MYC (HGNC: 7553) on varhainen seuraus aktivoivia mutaatioita APC (HGNC: 583), joka on keskeinen kuljettaja mutaatio adenooma-karsinooma-reitin kolorektaalisyövässä (CRC). Välittämä beeta-kateniinin kautta kanoninen Wnt-reitin poikkeava yli-ilmentyminen MYC ja sykliini D1 johtaa hallitsemattomaan soluproliferaatioon, annetaan kasvuetua syöpäsoluja [1], [2]. Rooli MYC yli-ilmentyminen ajo CRC kasvainten synnyssä on vahvistanut geeniekspressioprofilointi tutkimuksia [3], ja viimeksi CRC genominlaajuisia analyysin osana Cancer Genome Atlas Network aloitteen [4].

Mielenkiintoista MYC yli-ilmentyminen määritettynä Northern blot -analyysi raportoitu biomarkkerina hyvän lopputuloksen kolorektaalisyövässä jo vuonna 1996. [5] tällä hetkellä sen käyttöä ennustetyövälineenä biomarkkerina on vaikea perustella, koska rajallisesta saatavuudesta ja kustannuksella mukana molekyyli- testausta. Siksi testaus MYC yli-ilmentyminen CRC ei ole tällä hetkellä käytettävissä ja toteutettavissa tai aiheellinen rutiini kliinisessä ympäristössä.

Äskettäin uudenlainen erittäin herkkä ja spesifinen kanin monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu myc-proteiinia (klooni Y69) on tullut käytettävissä. Tämä vasta-aine on validoitu rutiini hoitopaikassa formaliiniin parafiiniin upotettu kudokseen, jossa myc immunohistochemsitry yhdistettynä Bcl2 Immunohistokemian on käytetty tunnistamaan huono ennustetekijöiden alaryhmä non-Hodgkin-lymfooman kutsutaan Tuplaosuma lymfooma ”. [6], [7] Itse MYC ja BCL2 ilmaisun määritettynä immunohistochemsitry formaliiniin parafiiniin upotettuja kudos on nopeasti tullut osa rutiinidiagnoosimenetelmää arviointiin potilailla, joilla on korkea laatu B-solulymfooma. [8].

pyrki uudelleen käyttöön MYC ilmaisun biomarkkerina CRC korreloimalla lopputuloksesta MYC ilme kuin tässä laajasti saatavilla kani monoklonaalinen vasta-aine.

Materiaalit ja menetelmät

CRC kohortti on kuvattu aiemmin. [9] Lyhyesti, retrospektiivinen CRC tapausta rekrytoitiin etsimällä patologia tietokannasta Department of Anatomical Patologian, Royal North Shore Hospital, Sydney potilaille, joilla oli lopullinen toimintojen CRC vuosien 2004 ja 2009. Tänä aikana tämä keskus suorittaa keskitetyn patologinen testaus kaksi kvaternääristä asian sairaaloissa omistettu peräsuolen leikkauksen yksiköitä ja 4 yhteisön sairaaloissa. Siksi tämä potilas kohortin edustaa todellista tilannekuvan CRC tapauksissa kohdatuista Australian yhteisöä kokonaisuutena.

Poissulkukriteerit olivat kasvaimet ulkopuolisten paksusuolen ja appendiceal sijainti, kasvaimet käsitellään pelkästään endoluminally ja histologisia tyyppejä muita kuin adenokarsinooma määritelty WHO 2010 järjestelmään. [10].

Kasvaimet itsenäisesti uudelleen kolmella patologit (CT, KDS ja AG) diagnoosin varmistamiseksi ja restage kasvainten mukaan 7

painos 2009 AJCC /TNM. [11] asemointia mukana synkroninen kasvaimia, kasvain korkein pathologic vaiheessa valittiin ja selityksin. Kudossiruina (TMA), joka sisälsi kahtena 1 mm ytimet sitten rakennettiin saatavilla kasvainkudoksen lohkot.

Immunohistokemia suoritettiin TMA käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa kanin anti-myc-vasta-ainetta (klooni Y69, kissa: ab32072, Abcam, Burlingame CA USA) käyttäen Leica BondIII Autostaineriin (Leica, Mount Waverley, Victoria, Australia) mukaan valmistajan protokollaa. Objektilasit poistettiin vaha Bond vahan liuokseen (AR9222, Leica) ja hydratoidaan Bond pesuliuosta (AR9590, Leica Microsystems). Heat epitooppisup- haku suoritettiin 60 minuuttia valmistajan emäksinen hakea ratkaisua ER2 (VBS osa no: AR9640, Leica Microsystems). Sitten aluslaseja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen laimennoksena 1: 100 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Vasta-aine havaitseminen suoritettiin käyttäen biotiini vapaa Bond Polymer Defined Detection System (DS9713 Leica Microsystems) mukaan valmistajan protokollaa. Objektilasit sitten vastavärjättiin hematoksyliinillä.

MYC yli-ilmentyminen arvioitiin myc IHC, pisteytetty kaksiportainen visuaalinen järjestelmä, jota harjoitellaan kirurgisen patologi (CT) sokeita kaikki kliinisiä, patologisia ja lopputulos tiedot. Tumavärjäystä tahansa intensiteetti on suurempi kuin 10% neoplastisten solujen positiiviseksi, (yli-ilmentynyt). Kaikki muut kuviot värjäytymisen pisteytettiin negatiivisiksi. Ulkoinen ohjaus (MYC monistettu lymfooma) ajettiin jokaisen erän dioja.

DNA mismatch korjaus (MMR) ja BRAF IHC tila määritettiin immunohistokemiallisesti aikaisemmin kuvatulla [9], [12].

jotta voidaan tutkia tarkkuutta TMA IHC tulkinnan, Myc IHC suoritettiin kokonaisia ​​CRC on subcohort 98 peräkkäisen CRC 2004, tulkitsee saman arvioijan on TMA (CT) sokeita kaikki kliinisiä, patologisia ja TMA tiedot.

Korrelaatio MYC yli-ilmentyminen ja CRC potilaan kliinispatologiset muuttujia tutkittiin 2 x 2 contingengy pöydät kategorisen muuttujia tai käyttämällä Mann-Whitneyn testi ikä (taulukko 1). Muuttujat, jotka osoittivat merkitys p 0,10 sisällytettiin binary logistiikkaregressiomallin tutkia edelleen suhdetta MYC yli-ilmentyminen ja DNA mismatch korjaus (MMR) /BRAF tila IHC fenotyyppiä (taulukko 2).

seuranta saatiin tutkittaessa sairaalan potilastiedot, jotka tulevat kirurgien kabinettia ja arkistointia julkisten kuolinilmoitusten ja muistokirjoituksia osavaltiossa New South Wales, Australia. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin kestoa elossa aika lopullisen leikkauksen. Potilaita seurattiin, kunnes kuolema tai niiden viimeinen seurannan enintään 7 vuotta leikkauksella.

Kaplan Meier-analyysi käytettiin raportoida 5 vuoden yleinen eloonjääneiden varten CRC ja ilman MYC yliekspressio , sillä erolla, arvioi Log Rank Test. Monimuuttujalähettimet Coxin käytettiin tutkimaan yhdistyksen välillä oikaistu vaikutus MYC yli-ilmentyminen eloonjäämiseen, joka täydellinen malli, joka sisältyi ikä diagnoosin, sukupuoli, anatominen Kasvainimplan-, kasvaimen vaiheessa yhdistetään yhteensopimattomuuden korjauksen puute ja BRAF IHC tila, kasvaimen kokoa, histologinen, läsnäolo tai puuttuminen lymphovascular tilaa hyökkäyksen ja peritumoraalista lymfosyyttivasteesta tila.

p 0,05 otettiin merkittävä, paitsi alkuperäisen mallinnuksen avulla binary logistista regressiota (mainittu edellä). Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen IBM SPSS Statistics v21 OSX.

Tulokset

Yhteensä 1421 CRC arvioitiin TMA. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet on koottu taulukkoon 1. Lyhyesti, oli suunnilleen yhtä sukupuolijakauma, joiden keski-ikä diagnoosin 74 vuotta (vaihteluväli 17-100 vuotta). 5 vuoden eloonjäämiseen varten kohortissa oli 66,3%, ja keskiarvo oli 52,9% (95% CI = 5,14-5,44).

Myc IHC osoittivat johdonmukaisesti ydinvoiman immuno-lokalisointi, ja siellä oli näkyvä ero tapausten välillä, joka oli negatiivinen (pisteytetään negatiiviseksi yli-ilmentyminen), ja ne, jotka osoittivat heikko vahva värjäytyminen 10% tai enemmän neoplastisten solujen (pisteytettiin positiivisiksi yli-ilmentyminen). Esimerkkejä myc IHC värjäyksen ominaisuuksista on esitetty kuviossa 1. yleisyys MYC yli-ilmentyminen CRC oli 69%.

kliinisiä ja patologisia piirteitä myc IHC negatiivinen (n = 441, 31,0% ) ja myc IHC positiivinen (mYC yliekspressoitujen, n = 980, 69,0%) CRC on koottu taulukkoon 1. mYC yli-ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä kasvaimen vaiheen ja MMR /BRAF IHC fenotyyppiä, mutta ei sukupuolta, anatominen sijainti, histologiset luokalla, läsnäolo tai puuttuminen lymphovascular tilaa hyökkäyksen, eikä peritumoraalista lymfosyyttireaktion tila. Suhde MYC yli-ilmentyminen ja ikä diagnoosin yleensä merkitystä (p = 0,07).

Taulukko 2 osoittaa oikaistu vaikutus MMR /BRAF IHC fenotyypin myc IHC asemasta. MYC yli-ilmentyminen oli vahvasti liittyy MMRd /BRAFV600E IHC fenotyyppi [odds ratio = 2,17 (95% CI = 1,45-3,24), p 0,01].

5 vuoden pysyvyys varten CRC kanssa MYC yli -ilmaisu oli 93,2% (yleinen 50

th sentiili selviytymisen 3,06 vuotta, kvartiiliväli ,56-+5,22), verrattuna myc negatiivinen CRC 57,3% (yleinen 50

th sentiili selviytymisen 2,32 vuotta, kvartiiliväli 0,31-4,26) .

vaikutus myc tilan CRC eloonjäämiseen näkyy kuvassa 1. CRC kanssa mYC yli-ilmentyminen verrokkeja paremmin selviytymisen verrattuna myc negatiivisten tapausten (log rank testi p 0,01), jossa on raakaa vaikutus (univariable malli) riskisuhde 0,67 [(95% CI = 0,54-0,83), p 0,01]. Tämä raaka vaikutus eloonjäämiseen pysynyt merkittävänä, vaikka ositettu MMR /BRAF IHC fenotyyppi [riskisuhde = 0,68 (96% CI = 0,54-0,84), p 0,01].

Täydessä monimuuttuja malli, oikaistu vaikutus MYC yli-ilmentyminen eloonjäämiseen tuli merkityksetön [riskisuhde = 0,91 (95% CI = 0,69-1,20), p = 0,52], koska hallitseva vaikutus ikä diagnoosin, kasvaimen vaiheen ja lymphovascular tilaa hyökkäys tila ja MMR puutteellinen /BRAFV600E mutantti IHC fenotyyppi eloonjäämiseen (taulukko 3). Taulukko 4 näyttää koko mallin keskinäinen vuorovaikutus myc IHC ja MMR /BRAF tilan.

oli huomattavaa välisen TMA ja koko jakson myc IHC tulokset (kappa = 0,742, p 0,01) . Kaikki positiiviset TMA tapaukset olivat positiivisia kokonaisia. Oli 11 ristiriitainen tapausta (negatiivisia TMA, positiivinen koko jakso), kaikki johtuu hajanaisia ​​värjäystä. Univariable Cox regressio suoritettiin myös kokonaisia, mikä vahvistaa parantaa eloonjäämisaste CRC osoittaa MYC yli-ilmentyminen (kuva 2).

Paneeli A: Kaplan Meier käyrät osoittavat ylivoimainen eloonjäämisaste CRC kanssa MYC yli-ilmentyminen verrattuna myc negatiivinen CRC (Log Rank testi p 0,01); Paneeli B: Univariable Coxin regressioanalyysiä osoittaa MYC yli-ilmentyminen korreloi merkitsevästi parempi kokonaiseloonjääminen [riskisuhde = 0,30 (95% CI = 0,15-0,60), p 0,01].

Keskustelu

Aikaisemmat tutkimukset MYC ilmaisun CRC ovat olleet ristiriitaisia ​​ja ristiriitaisia ​​johtuu oletettavasti käyttää pieniä kohortteja (n vaihtelee 38-310) ja käyttää erilaisia ​​havaitsemismenetelmiä sisältäen IHC, fluoresoiva in situ -hybridisaatio ( FISH), RNA-analyysi ja DNA kopioluvun. [5], [13] – [17]. Vanhemmat tutkimukset käyttäen IHC ovat rajoittuneet käyttämällä vasta-aineita, jotka osoittivat poikkeavaa (sytoplasminen) immunologiseen lokalisointi oletettavasti huonon spesifisyyden. [18].

kehittäminen ja validointi erittäin spesifinen kanin monoklonaalista vasta-ainetta myc on tehnyt suuri vaikutus lymfooman diagnoosi jonka yhdistäminen MYC ja BCL2 yliekspressio määritettynä immunohistokemiallisesti yksinään on käytetty määrittämään huonon ennusteen ryhmä B-solu non Hodgkin lymfooma tunnetaan Tuplaosuma lymfoomat. [6], [7] Mielenkiintoista on, että nämä lymfooma tutkimuksissa, joissa myc IHC ja FISH arviointi ovat johtaneet ristiriitaisia ​​tuloksia, MYC ilmaisu määritettynä IHC on ollut tarkemman ennusteen lopputulokseen kuin edellisen kultakantaan FISH. Oletettavasti tämä johtuu siitä, MYC yli-ilmentyminen voi johtua erilaisia ​​soluprosesseja pikemminkin kuin vain yksinkertainen vahvistusta.

Tässä yhteydessä Tutkimuksemme, joka perustuu erittäin suuri ja valitsemattomat kohortti on 1421 CRC ryhminä käyttämällä tätä seuraavan sukupolven kanin spesifisten monoklonaalinen vasta-aine, osoittaa korkea esiintyvyys mYC yli-ilmentyminen CRC, ja mikä tärkeintä, mahdollinen rooli myc voimakkaana ennustetekijöiden biomarkkereiden in CRC. Se, että MYC yli-ilmentyminen liittyy merkittävästi parempi yleinen eloonjääminen univariable analyysi on ehkä yllättävää, koska nykyinen käsitys Tuumorigeenisuustutkimuksissa MYC säätelyhäiriötä [1] – [4]. Vain yksi aiempi tutkimus on osoittanut tätä CRC [5]. Vaikka on riittävästi tietoa olettamus siitä taustalla olevan mekanismin, korrelaatio Tuumorigeenisuustutkimuksissa (onkogeneesiin) ja selviytymistä, ainakin MYC, on olla monimutkaisempia kuin alun perin ajateltiin.

Tässä tutkimuksessa olemme päättäneet tutkia MYC yli-ilmentyminen yhteydessä CRC ryhmitelty niiden MMR ja BRAF tilan sijasta MMR ja BRAF tila yksilöllisesti. Se on nyt hyvin vakiintunut, että MMR ja BRAF vuorovaikutuksessa monimutkaisilla tavoilla suhteessa niiden vaikutusta eloonjäämiseen. Esimerkiksi MMR taitavia CRC, läsnäolo BRAFV600E mutaation annetaan elinajan, kun taas MMR puutteellinen CRC, BRAFV600E on merkkiaine methylator fenotyypin, ryhmä CRC jotka osoittavat erinomaisia ​​ennuste [12], [19].

Mielenkiintoista, vaikka MYC yli-ilmentyminen oli vahvasti liittyy MMRd /BRAFV66E fenotyyppi, niiden puute vuorovaikutusta koko monimuuttuja malli osoittaa, että MYC: n vaikutusta eloonjäämiseen ei voida selittää kokonaan vain sen yhdessä MMR /BRAF tila . Tämä viittaa siihen, että ennustava vaikutus MYC yli-ilmentyminen eloonjäämiseen välittyy osittain mekanismeista riippumaton MMR /BRAF-tila.

Yksi suurimmista haitoista Tutkimuksemme on yliyksinkertaistamista jonka MYC yli -ilmaisu on määritetty. Puoliksi kvantitatiivinen luonne IHC on sellainen, että muutokset IHC voimakkuuden täytyy olla suuria (logaritminen asteikko, joka tunnetaan myös Weber-Fechner laki), jotta ihmissilmä osata arvostaa muutosta. Tämä menetelmä IHC pisteytys ei kuitenkaan sovellu suoraviivaisempi kiinnekohta analyysi kuten binary logistinen regressio, ja on hallitseva menettelyistä, joita suurin osa IHC pisteytetään diagnostisen kliinisessä ympäristössä. On merkittävää, vaikka tämä epäkohta pystyimme osoittamaan merkittäviä kokonaiselossaoloaikaa eroja univariable analyysiin myc IHC tila.

Toinen merkittävä haitta on puute tautikohtaisten tulosten ja syövän aiheuttamaa kuolleisuutta tutkimuksessamme kohortissa. Jatkotutkimuksissa käyttävät näitä vaikutuksia saadaan tärkeää tietoa, joka voi merkittävästi ilmoittaa kliiniseen käytäntöön.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että myc tila, määritettynä IHC käyttämällä yksinkertaista puolikvantitatiivinen pisteytys menetelmää helposti käyttöön kliinisessä asetusta voidaan käyttää ennustajana ennusteen CRC. Hiomiseen Tämän ennustavan apuohjelma odottaa edelleen selventämiseksi kohortit kanssa tautikohtaisia ​​tuloksia.