Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-integriini laminiinireseptori, tässä nimetty 37-kDa /67-kDa laminiinireseptori (LRP /LR), on mukana monissa fysiologisesti asiaan liittyvien prosessien, sekä lukuisia patologisia tiloja. Yli-ilmentyminen LRP /LR eri syöpäsolu linjojen näyttelee kriittistä roolia tuumorimetastaasissa ja angiogeneesiä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, onko LRP /LR on osallisena ylläpito solujen elinkelpoisuuden keuhkoissa ja kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Täällä osoittavat merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden edellä mainituissa solulinjoissa seurauksena siRNA-välitteinen downregulation LRP. Tämä vähennys solujen elinkelpoisuus on lisääntyneen apoptoottisen prosesseja, heijastuu menetys ydin- eheyden ja merkittävän kasvun kaspaasi-3. Nämä tulokset osoittavat, että LRP /LR on mukana ylläpitämiseksi solujen elinkelpoisuuden tuumorigeenisemmiksi keuhko- ja kohdunkaulan solujen kautta tukos apoptoosin. Knockdovvn LRP /LR siRNA voisi edustaa vaihtoehtoista terapeuttisen strategian Keuhkosyövän ja kohdunkaulan syöpä.

Citation: Moodley K, Weiss SFT (2013) alassäätely Non-integriini laminiinireseptori Vähentää Cellular elinkelpoisuutta aiheuttamaan apoptoosin Lung ja kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 8 (3): e57409. doi: 10,1371 /journal.pone.0057409

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Iso-Britannia

vastaanotettu: 21 marraskuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu 5 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Moodley, Weiss. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NRF, Etelä-Afrikka. MRC, Etelä-Afrikka. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

laminiineja kuuluvat suuri perhe soluväliaineen proteiineja, jotka mukana useita biologisesti merkittäviä prosesseja, kuten solun erilaistuminen, muuttoliike, tarttuvuus, kasvua ja signalointi [1]. Vaikutukset laminiinien usein välittyvät niiden vuorovaikutus integriinin ja ei-integriini-laminiini sitovia proteiineja, jotka toimivat reseptoreihin ja linkki laminiinin soluväliaineen solunsisäisen signa- [1].

suuri laminiininsitomiskykyä kumppani on monitoiminen proteiini, tässä 37-kDa /67-kDa laminiinireseptori (LRP /LR). 67 kDa: n laminiinireseptori muodostetaan 37-kDa laminiinireseptori esiaste [2], [3]. Tarkkaa mekanismia muuntaminen on tällä hetkellä vielä vaikeasti, mutta jotkut tutkimukset viittaavat siihen, että ei-glykosyloidun 37 kDa muoto tulee asyloidaan Ser2 toiminnan kautta rasvahappojen; ja tämä asylointi on kriittinen vaihe muuntaminen 37-kDa lomake 67-kDa: n muotoon [4], [5].

LRP /LR on ei-integriiniä solunpintareseptori joilla on korkea affiniteetti laminiini-1 [6], ja on todettu paikallistaa sytoplasmassa [7], [8], [9], solun pinnalla [10], [11], että perinuclear osastossa [7], [12], [13] ja tumassa [12], [13]. Kussakin näistä paikoista, LRP /LR on mukana lukuisissa fysiologisissa prosesseissa, mukaan lukien proteiinin synteesissä [8], kypsymisen ribosomaalisen 40S-alayksikön [8], joka toimii reseptorin solunulkoisen matriksin komponentteja esim. hiilihydraatteja ja elastiinin [14], vuorovaikutus solun prioniproteiinin [13], [15] ja yhdistysten kanssa histonien [12].

Sen lisäksi lukuisia fysiologisia rooleja, LRP on ollut mukana useissa patologisia prosesseja – se toimii reseptorina tarttuvan prionien [16], tietyt bakteerit [17], ja erilaiset virukset [18], [19], [20]. Merkittävintä on, useita syöpätyyppejä, kuten maha- [21], paksusuolen [22], peräsuolen [23], kohdunkaulan [24], rintojen [25], keuhkosyöpä [26], munasarjasyöpä [27], haiman [28] ja eturauhasen [29] syöpien, paljastaa yli-ilmentyminen 67-kDa: n LR niiden solun pinnalla, käytetään anti-LRP /LR spesifisiä vasta-aineita vähensi tarttuvuutta ja invaasion syöpäsolujen

in vitro

[6 ], [30], avaintekijät etäpesäke. Vahva korrelaatio on myös perustettu välillä LRP /LR ja syövän angiogeneesi, jossa tämän proteiinin ilmentymisen korreloivat lisääntynyt tuumoriangiogeneesissa [31]; Havaitsimme äskettäin, että, että LRP /LR spesifistä vasta-ainetta, W3, esti angiogeneesiä [32].

Koska kohdentaminen LRP /LR on syöpäsoluja on osoittautunut toimivaksi suhteen vähentämiseen tuumorimetastaasin [6], [30], roolia tämän reseptorin syövän solujen elinkykyä ja selviytyminen on tullut aihe suurta kiinnostusta. Tämä tutkimus siis pyrittiin arvioimaan vaikutuksen siRNA-välitteisen knockdovvn LRP elinkelpoisuuteen ja selviytymisen keuhkosyövän ja kohdunkaulan syöpäsolujen ja määrittää mahdollisen mekanistinen lähestymistavat havaittuja vaikutuksia. Keuhko- ja kohdunkaulan syövän solut valittiin tähän tutkimukseen, koska ne edustavat kaksi parasta diagnosoitu syöpä tyyppiä Etelä- Afrikkalainen miehiin ja naisiin. Olemme osoittaneet tässä tutkimuksessa, että siRNA-välitteinen knockdovvn LRP /LR A549 ja HeLa-soluissa aiheutti merkittävä väheneminen elinkelpoisuutta näiden solujen. Lisäksi osoitettiin, että tämä vähennys solujen elinkelpoisuus oli seurauksena solujen apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja ehdot

A549 ja HeLa-solut saatiin ATCC: stä, viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä ja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 95% ilmaa ja 5% CO

2.

virtaussytometria

Virtaussytometria suoritettiin määrittämään solun pinnan tasoa LRP A549 ja HeLa-solut. Lyhyesti, solut irrotettiin, pelletoitiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Sitten soluja inkuboitiin 30 ug /ml ensisijaisen LRP-spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​in Epics ™ Tuppi Fluid 1 tunti. Solut pestiin sitten Eepokset ™ suojanesteeseen ja inkuboitiin 30 ug /ml vuohen anti-kani IgG ihmisen mainoksia-FITC sekundaarinen vasta-aine (Beckman Coulter) in Eepokset ™ suojanesteeseen. Tämän jälkeen solut pestiin Eepokset ™ suojanesteeseen ja analysoidaan.

Western-blottaus

Western blotting käytettiin määrittämään kokonaismäärän ja vaimentua proteiinin tasot LRP (β-aktiini käytettiin latauskontrollina ) transfektion siRNA-LAMR1. Lyhyesti, solut hajotettiin, proteiinin tasot määrällisesti ja 5 ug raakaa solulysaattia eroteltiin 12% polyakryyliamidigeelillä. Proteiinit siirrettiin tämän jälkeen nitroselluloosakalvolle puolikuivalla elektro-blottaus 45 min. Membraani blokattiin 3% BSA: ta, inkuboitiin 1:10 000 liuokseen, LRP-spesifisen primaarisen vasta-aineen IgG1-iS18 ​​3% BSA: lla PBS-Tween 1 h ajan 4 ° C: ssa ravistellen. Kalvo pestiin sen jälkeen PBS-Tween, inkuboitiin edelleen 1:10 000 liuokseen, jossa anti-humaani-POD sekundaarisen vasta-aineen 3% BSA: lla PBS-Tween 1 h ajan 25 ° C: ssa ravistellen, pestään kuten edellä ja analysoitiin.

siRNA-välitteinen alassäätely LRP

A549 ja HeLa-solut transfektoitiin LRP pudotus siRNA ostettu Dharmacon, Cat # J-013303-08, valmistajan ohjeen mukaisesti käyttämällä DharmaFECT® 1 transfektion reagenssia. Ohjaus siRNA käytetyt – Cat # D-001810-01-05.

MTT-määritys

0,6 × 10

4 A549 ja 3 x 10

3 HeLa-soluja ympättiin vuonna kuoppiin 96-kuoppalevyllä. Sitten solut transfektoitiin siRNA-scr tai siRNA-LAMR1, kuten on kuvattu, ja annettiin inkuboitua kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 95% ilmaa ja 5% CO

2: ssa 72 tuntia. 10 ug MTT liuotettiin PBS: ään lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan sallitun inkuboitua 2 tuntia kuten edellä. Media heitettiin pois kustakin kuopasta ja violetti formatsaanikiteet liuotettiin 200 ui DMSO: ta. Absorbanssi kunkin kuopan mitattiin 570 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijalla.

Immunofluoresenssimikroskopia

4 x 10

5 A549 ja 3,5 × 10

5 HeLa-solut ympättiin päälle peitinlasit kuopissa 6-kuoppaiselle levylle. Solut transfektoitiin siRNA-scr ja siRNA-LAMR1, kuten on kuvattu, ja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 95% ilmaa ja 5% CO

2: ssa 72 tuntia. Peitinlasit poistettiin ja solut kiinnitettiin 1% paraformaldehydi, värjättiin Hoechst 33342 (1:10 000 PBS: ssä) ja analysoitiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa.

kaspaasi-3 Activation Pitoisuus

4 x 10

5 A549 ja 3,5 × 10

5 HeLa-soluja siirrostettiin kuoppiin 6-kuoppalevyllä. Solut transfektoitiin siRNA-scr ja siRNA-LAMR1, kuten on kuvattu, ja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 95% ilmaa ja 5% CO

2: ssa 72 tuntia. Toiminta kaspaasi-3 analysoitiin käyttämällä kaspaasi-3 Assay Kit (Sigma-Aldrich) mukaisesti valmistajan ohjeen.

Statistical Evaluation

Data analysoitiin tilastollisesti kanssa Dunnettin testillä käyttäen GraphPad InStat. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun p-arvo oli alle 0,05.

Tulokset

Lung ja kohdunkaulan syövän solut Näyttö korkea Cell Surface tasot LRP /LR ja Total tasot LRP

Koska yliekspressio LRP on havaittu lukuisissa syöpä- solulinjat, solun pinnan tasoa LRP /LR ja yhteensä tasoja LRP A549 ja HeLa-solut määritettiin virtaussytometria-analyysi ja western-blottauksella (kuvio 1). Virtaussytometria osoitti, että 83% ja 80% A549 ja HeLa-solut, vastaavasti ilmaistuna LRP /LR niiden solun pinnalla (kuvio 1A ja 1 B), nämä arvot ovat korkeita verrattuna LRP /LR solun pinnan taso (57%) ei-tuumorigeeninen solulinja, NIH 3T3, (tuloksia ei ole esitetty), ja vahvistaa saatujen tulosten aiemmissa tutkimuksissa [30]. LRP havaittiin ilmentyvän sekä solulinjojen western-blottauksella, lisäksi myöhemmin densitometrinen analyysi on saatu Western blot signaalit paljasti, että A549 ja HeLa-solut näyttää samalla tasolla tämän proteiinin (kuvio 1C).

A) 83% A549 ja B) 80% HeLa soluilla LRP /LR pinnallaan (vasen ja oikea huiput edustavat ei-leimattuja soluja ja soluja inkuboidaan aluksi anti-LRP IgG1-iS18 ​​vasta-ainetta ja myöhemmin kanssa vuohen anti -rabbit IgG ihmisen mainoksia-FITC sekundaarinen vasta-aine, tässä järjestyksessä). C) A549 (kaistat 1-3) ja HeLa (kaistat 4-6) solut ilmentävät LRP ja densitometrinen analyysi paljasti ei-merkitsevä (p 0,05) erot yhteensä LRP tasojen kahdessa solulinjassa.

määrittäminen siRNA-välitteinen alassäätely LRP Expression Lung ja kohdunkaulan syövän solut

taso LRP ilmaisun A549 ja HeLa-solujen transfektion siRNA-LAMR1 määritettiin käyttäen western blotting ja määrällisesti densitometrillä (kuvio 2). Densitometrinen analyysi on saatu Western blot signaalit paljasti, että A549 (kuvio 2A) ja HeLa (kuvio 2B), jotka on transfektoitu siRNA-LAMR1 ilmaistuna 80% ja 60% vähemmän LRP, vastaavasti, verrattuna ei-transfektoituja säätimiä asetettiin 100% .

ilmaisu taso LRP A549 ja HeLa-soluissa tutkittiin 72 tuntia transfektion siRNA-LAMR1. Densitomet- analyysi western blot signaaleja paljasti huomattavan (** p 0,01) 83% ja 60% vähennys LRP proteiinin ilmentymistä) A549 ja B) HeLa-soluissa, vastaavasti, verrattuna ohjaamaan muita kuin transfektoiduissa soluissa (asetettu 100% ).

siRNA-välitteinen knockdovvn LRP Expression aiheuttaa merkittävän vähentäminen elinkelpoisuus Lung ja kohdunkaulan syövän solut

vaikutus siRNA-välitteinen downregulation LRP proteiinin ilmentymisen solu- elinkelpoisuutta A549 ja HeLa-soluissa määritettiin käyttämällä MTT-määritys. Soluja inkuboitiin 8 mM (PCA yhdistettä, jonka tiedetään laskevan solujen elinkelpoisuus läpi apoptoosin [33]), positiivisena kontrollina, ja transfektoitu ei-suunnattu siRNA (siRNA-scr) negatiivisena kontrollina. 8mM PCA ja siRNA-LAMR1 verrattiin siRNA-scr arvoja, jotka oli asetettu 100%. Tulokset Tämän määrityksen osoittavat, että merkittävä (* p 0,05, ** p 0,01) vähenee elinkelpoisuuden A549 ja HeLa-solujen (13% ja 18%, vastaavasti) on seurauksena alennettu tämän proteiinin ilmentymisen (kuvio 3).

elinkelpoisuus A549 ja HeLa-solut analysoitiin 72 tuntia transfektion jälkeen käyttäen MTT-määritystä. A) A549 ja B) HeLa-solut transfektoitiin siRNA-LAMR1 paljasti huomattavan (* p 0,05, ** p 0,01), 13% ja 18%: n lasku solujen elinkelpoisuus, vastaavasti, verrattuna siRNA-scr, joka oli asetettu 100% (8 mM PCA käytettiin positiivisena kontrollina).

siRNA-välitteinen alassäätely LRP Expression alenee ydin- Morfologia Lung ja kohdunkaulan syövän solut

tutkimiseksi mahdollinen mekanismi havaitun kuoleman solujen elinkelpoisuutta vastauksena LRP knockdown A549 ja HeLa-solut, ydinvoima morfologia edellä mainittujen solujen arvioitiin. A549 ja HeLa-solut transfektoitiin siRNA-LAMR1, inkuboitiin 8 mM PCA (tunnettu apoptoosin indusoija [33]) positiivisena kontrollina ja transfektoitiin siRNA-scr (negatiivinen kontrolli). Sitten solut värjättiin fluoresoivalla ydin- väriainetta Hoechst 33324 ja katsellaan immunofluoresenssilla mikroskoopilla. Ydin- kuvat saatu siRNA-LAMR1 verrattiin siRNA-scr – ytimet näkyvät ahdas ja varmaa vahinkoa ydin- morfologia ja eheyden havaitaan (kuva 4-valkoisilla nuolilla). Lisäksi solujen prosenttiosuus näytetään morfologisia muutoksia määritettiin laskemalla solujen lukumäärä ja ilman ydin- morfologisia muutoksia 3 micrographs. 56% A549-solujen ja 91% HeLa-solujen näytteillä ydin- morfologisia muutoksia vastauksena siRNA-LAMR1 hoito (7% ja 8% siRNA-scr käsiteltyjen A549-solut ja HeLa-solut, vastaavasti, osoittivat ydin- morfologisia muutoksia).

72 h transfektion, A549 ja HeLa-solut värjättiin Hoechst 33342 ja katsella immunofluoresenssimikroskoopilla. Solut transfektoidaan siRNA-LAMR1 näytteille laski ydinaseiden eheys – merkitty valkoisilla nuolilla (8 mM PCA käytettiin positiivisena kontrollina).

siRNA-välitteisen knockdovvn LRP aiheutti merkittävän kasvun kaspaasi-3 Activity Lung ja kohdunkaulan syövän soluja

aktiivisuus apoptoosin liittyvän efektoriproteiinia, kaspaasi-3, vastauksena siRNA-välitteinen downregulation LRP ilmentymisen A549 ja HeLa-soluissa arvioitiin käyttämällä kaspaasi-3 aktivaation määritys. A549 ja HeLa-solut transfektoitiin siRNA-LAMR1, inkuboitiin 8 mM PCA (apoptoosin indusoija [33] – positiivinen kontrolli) ja transfektoitiin siRNA-scr (negatiivinen kontrolli). Aktiivisuus kaspaasi-3: transfektoitujen solujen siRNA-LAMR1 verrattiin niihin, jotka oli transfektoitu siRNA-scr (joka oli asetettu 100%); nämä tulokset osoittavat merkittävää (** p 0,01, *** p 0,001) nousu kaspaasi-3-aktiivisuus A549 ja HeLa-solut transfektoitiin siRNA-LAMR1 (9% ja 83%, vastaavasti) (kuvio 5).

aktiivisuus apoptoosin liittyvä proteiini, kaspaasi-3, A549 ja HeLa-solut analysoitiin 72 h transfektion jälkeen. A) A549 ja B) HeLa-solut transfektoitiin siRNA-LAMR1 ilmi merkittäviä (* p 0,05, ** p 0,001), 9% ja 83%: n nousu kaspaasi-3: n aktiivisuuden, vastaavasti, verrattuna siRNA-scr, joka on asetettu 100% (8 mM PCA käytettiin positiivisena kontrollina).

keskustelu

roolia laminiinireseptori syövän etenemisen on ollut aihe suurta hyötyä monille vuotta ja on sen vuoksi tutkittu laajasti. Lukuisat tutkimukset ovat osallisina solun pinnalla LRP /LR etenemisen syövän – tämän reseptorin on yli-ilmentynyt pinnalla useiden syöpä- solulinjat, antaen heille mahdollisuuden etäpesäkkeitä ja hyökätä ympäröivien kudosten [6], [30]. Koska LRP /LR on mukana useissa solun prosesseja ja sitä löytyy monista solu- paikoissa (solun pinnalla, sytoplasmaan, The perinuclear lokero ja ydin), lisätehtäviä tämän reseptorin syövän etenemistä on ehdotettu.

vahvista ilmentymisen LRP /LR A549 ja HeLa-solut, solun pinnan ja yhteensä tasoa tämän proteiinin tutkittiin käyttäen virtaussytometria ja western blotting, vastaavasti (kuvio 1). Kasvaimia keuhkoissa ja kohdunkaulan syöpäsolut sekä näyttöön LRP /LR pinnallaan, ja taso tämän proteiinin pinnalla näiden solujen todettiin olevan korkeampi kuin havaittu ei-tuumorigeenisen solulinjan NIH 3T3 (hiiren alkion fibroblasti ). Tämä havainto vahvistaa edellisen tutkimuksen, ja ehdottaa tämän reseptorin roolin etenemisessä solujen tavanomaiseksi tulossa syöpä. Lisäksi kasvaimia keuhkoissa ja kohdunkaulan syöpäsolut sekä ilmaista LRP sisäisesti, ja ero sisäisesti tämän proteiinin näissä solulinjoissa on merkityksetön.

roolin tutkimiseksi LRP /LR syöpään liittyvissä /sytotoksista prosesseja, sen ilmentyminen väheni huomattavasti vuonna kasvaimia keuhkoissa ja kohdunkaulan syöpäsoluja. vastaan ​​suunnattu siRNA LRP mRNA transfektoitiin edellä mainitut solut ja prosenttiosuus LRP downregulation arvioitiin densitometrisellä analyysi saatiin Western blot-signaalit (kuvio 2). Taso LRP ilmentymisen väheni 83% ja 60% A549 ja HeLa-soluissa, vastaavasti, mikä osoittaa tehokkuuden siRNA käyttää.

vaikutus knockdovvn LRP ilmaisua elinkelpoisuuden syöpäsolujen , joka on tärkeä ominaisuus taudin, tutkittiin. LRP downregulation havaittiin korreloivan vähentää merkittävästi elinkelpoisuuden A549 ja HeLa-solut (kuvio 3), mikä osoittaa keskeinen rooli LRP tässä prosessissa. Koska ylläpito solujen elinkelpoisuus on välttämätöntä leviämistä syöpäsoluja, ehdotus, että LRP on mukana ylläpitoon tässä prosessissa edelleen syytöksiä tätä proteiinia tauti.

pieneneminen solujen elinkykyisyys kuitenkin myös huomannut välillä ei-transfek- ja siRNA-scr näytteet HeLa-soluissa (tuloksia ei ole esitetty) ja DharmaFECT® 1 transfektioreagenssi osoitettiin olevan aiheuttajaa tässä vähennys (ks täydentävä data – Kuva S1).

sen tutkimiseksi, jos apoptoosin (muoto ohjelmoidun solukuoleman) aiheutettiin tuumorigeenisemmiksi keuhko- ja kohdunkaulan syöpäsolujen seurauksena LRP knockdown, ja siten olisi vastuussa havaittu väheneminen solujen elinkelpoisuuden, arvioimme mahdolliset muutokset ydin- morfologian solu ja toiminnan taso on apoptoosin liittyvän efektoriproteiini – kaspaasi-3 (avainprosessien osoittaa apoptoosin induktion [34], [35], [36], [37], [38]). Läsnäolo apoptoottisten A549 ja HeLa-solujen transfektion kanssa siRNA-LAMR1 tunnistettiin näkyviä häiriöitä ydinvoima morfologian (kuvio 4) sekä merkittävä kasvu aktiivisuus kaspaasi-3 (kuvio 5).

rooli LRP ylläpito solujen elinkelpoisuus on raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa [7], lisäksi, apoptoosin syöpäsoluissa vasteena LRP downregulation on myös osoitettu [39]. Tämä tutkimus on vahvistanut roolia LRP ylläpito solujen elinkelpoisuuden sekä apoptoosin induktion jälkeen ja pudotus tämän proteiinin. Lisäksi tämä tutkimus on osoittanut, että apoptoosin induktio välittyy sekä menetys ydin- eheys ja merkittävästi lisääntynyt kaspaasi-3 näissä soluissa.

Koska laminiinireseptori on fysiologisesti toiminnallinen perinuclear osastossa [ ,,,0],7], [12], [13] ja ydin [12], [13], ei ollut yllättävää, että pudotus tämän reseptorin vaikuttaisi eheys ydin. Sekä häiriöitä ydin- morfologia ja lisääntynyt aktiivisuus apoptoosin liittyvä proteiini, kaspaasi-3, ovat ohjeellisia apoptoosin, mikä viittaa keskeinen rooli LRP /LR on tukos tämän solukuoleman muotoa. Kuitenkin kvantifiointi osoitti, että 91% siRNA-LAMR1 käsiteltyjen HeLa-soluissa, mutta ainoastaan ​​56% siRNA-LAMR1 käsiteltyjen A549-solut paljasti ydin- morfologisia muutoksia (7% ja 8% siRNA-scr käsiteltyjen A549 ja Hela-soluissa, vastaavasti, paljasti ydin- morfologiset muutokset). Koska knockdovvn LRP HeLa-soluissa (60%) oli alhaisempi kuin A549-soluja (83%) ehdotamme, että LRP /LR vaikeuttaa apoptoosin suuremmassa määrin kohdunkaulan syöpäsolujen verrattuna keuhkojen syöpäsoluja. Koska 83% HeLa soluissa, mutta vain 9% A549-solut paljasti kasvoi kaspaasi-3: n aktiivisuuden seuraavat siRNA-LAMR1 hoito, olemme edelleen viittaavat siihen, että apoptoosin keuhkosyövän solut voivat esiintyä pääasiassa kautta kaspaasi-3 riippumattomien mekanismien kuten EndoG ja /tai AIF välittämien prosessien.

toiminnot LRP /LR syövän etenemisen lukuisia: lisääntynyt hyökkäys [6], [30], etäpesäke [6], [30] ja soluproliferaatiota [7] vähenemisestä sekä solujen elinkelpoisuus [7] ja apoptoosin [39] välittävät tätä proteiinia. Kohdistaminen LRP /LR voidaan siis kehitetty strategia haittaavat edellä mainitut prosessit osallisina syövän etenemiseen. Lisäksi kohdistaminen LRP /LR mahdolliseen hoitoon nämä prosessit on saavutettu useissa syöpä solulinjoja. Tämän vuoksi ehdotetaan, että LRP /LR liittyvä terapia voi mahdollisesti käyttää hoidettaessa lukuisia erillisiä syöpiä. On kuitenkin korostettava, että tämä reseptori on mukana monissa fysiologisissa prosesseissa normaaleissa soluissa, kuten solun kasvussa, erilaistumiseen, liikettä ja kiinnitys [9], [11], ja knockdovvn LRP näissä soluissa johtaisi toivottuja homeostatic häiriöitä. Kohdentaa LRP pelkästään syöpäsoluja on siis ehdottomasti sen käyttöä terapeuttisena vaihtoehtona.

tukeminen Information

Kuva S1.

vaikutus siRNA-scr ja DharmaFECT® 1 reagenssia solujen elinkelpoisuuden. Soluja inkuboitiin siRNA-scr, DharmaFECT® 1 reagenssin tai molempia, ja 72 tuntia myöhemmin, solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Solut, jotka on transfektoitu siRNA-scr on samankaltaisia ​​elinkelpoisuutta, kun taas DharmaFECT® 1 ja siRNA-scr + DharmaFECT® 1 käsitellyissä soluissa näyttää 8% ja 9%: n lasku solujen elinkelpoisuuden, vastaavasti, verrattuna kontrollisoluihin (inkuboitiin 72 h DMEM: ssä, joka sisälsi 10% (v /v) FCS).

doi: 10,1371 /journal.pone.0057409.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Uwe Reusch, Stefan Knackmuss ja Melvyn vähän apua tuottamiseen IgG1-iS18. Kiitämme Dr Clement Penny apua immunofluoresenssimikroskoopilla.