Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

poikkeavasti aktivoitu Wnt /β-kateniinin signalointi on tärkeää maksasolukarsinoomassa (HCC) kehittäminen. Alavirtaan geeniekspressioiden johon Wnt /β-kateniinin cascade tapahtua T-solu tekijä (TCF) proteiineja. Täällä näytämme kasvaimia synnyttävän potentiaalin ihmisen TCF-4 isoformia perustuu ilmaus yhden konservoituneen SxxSS motiivi.

Methods

tutkineet TCF-4J ja K-isoformin pari tyypillistä läsnäolo (K) tai ilman sitä (J) SxxSS motiivi. MRNA: n ekspression profiileja tutkittiin 47 paria ihmisen HCCs ja viereisen ei-syöpä maksakudoksissa RT-PCR: llä. Leviäminen, pallo määrityksiä ja immunoblot-analyysi tehtiin alla normoksia ja hypoksiaolosuhteisiin. Kyky HCC-solut yli-ilmentävät TCF-4J (J-solut) ja K (K-solut) ja kasvaa kiinteitä kasvaimia paljaissa hiirissä tutkittiin.

Tulokset

TCF-4J ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut HCC kasvaimissa verrattuna vastaaviin peritumor ja normaali maksan ja sen ilmentyy heikosti eriytetty HCCs. Sen sijaan, TCF-4K säädeltiin vähentävästi samoissa HCC kasvaimia. TCF-4J-yliekspressoivia HCC-solut (J-solut) paljasti selviytymisen etu hypoksisissa olosuhteissa, korkea leviämisen nopeus ja aggregaattien muodostumista /pallojen verrattuna yli-ilmentymisen TCF-4K (K-solut). Hypoksia J solut oli korkeat ekspressiotasot HIF-2α ja EGFR mahdollisimman keinoja edistää kasvaimien syntyyn. Lisääntynyt vakaus HIF-2α hypoksiaolosuhteissa J soluissa liittyi alentunut taso von Hippel-Lindaun (VHL) proteiini, tunnettu E3 ligaasia HIF-aS. Vuonna ksenograftimallia, J solut nopeasti kehittynyt kasvaimia verrattuna K soluihin. Tuumorikudoksista johdettu J soluista osoittivat korkeita ilmentymisen tasoja HIF-2α ja EGFR verrattuna hitaasti kehittyvä ja pieni K-soluista saatu kasvaimia.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että tietty TCF-4J isoformi, josta puuttuu sääntely SxxSS aihe, on vahva kasvaimen aloittamista mahdollisten hypoksisissa olosuhteissa.

Citation: Koga H, Tsedensodnom O, Tomimaru Y, Walker EJ, Lee HC, Kim KM, et ai. (2012) menettäminen SxxSS Motif ihmisen T-solujen Factor-4 Isoformi antaa Hypoksia kestävyys Maksasyöpä: onkogeenisessä Switch Wnt Signaling. PLoS ONE 7 (6): e39981. doi: 10,1371 /journal.pone.0039981

Editor: Vincenzo Coppola, Ohio State University Kattava Cancer Cente, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 tammikuu 2012; Hyväksytty: 30 toukokuu 2012; Julkaistu: 29 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Koga et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (CA-123544 ja JRW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnt /β-kateniinin signalointireitin on keskeinen rooli solujen kohtalon määrittämiseen ja kantasolujen uusiutumista aikuisilla kudoksessa [1], [2]. Geneettisiä ja /tai epigeneettisiä vapautuminen tämän reitin johtaa poikkeavaan ydin- kertymistä β-kateniinin, jossa se sitoutuu T-solujen factor-4 (TCF-4) muodostamaan transkription kompleksin [3]; tämä tapahtuma ohjaa geeniekspressiota kuten c

Myc

,

sykliini D1

, ja

EPCAM

[4], [5], [6], joka vaikuttaa pahanlaatuinen fenotyyppi.

maksasolusyövän (HCC) on kolmas yleinen syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa [7]. Poikkeavasti aktivoida Wnt /β-kateniinin signalointi johtuen yli-ilmentymisen ylävirran puolella tämän reitin kuten Frizzled (FZD) reseptorit ja Wnt-ligandien on yleinen varhainen tapahtuma molekyylitason patogeneesin tämän taudin [8], [9], [10] . Kuitenkin osallistuminen kanonisen Wnt TCF-4 efektoriproteiinit tässä prosessissa on vielä tutkittava.

Ihmisen TCF-4-geenin (

TCF7L2

) koostuu 17 eksonista ja on useita vaihtoehtoisen silmukoinnin sivustoja eksonit 13-17 ja eksonin 4 [11]. Vaihtoehtona silmukointipaikoista Keski domain TCF-4 voi myös tuottaa isomuotoja tai ilman konservoituneiden LVPQ ja SxxSS motiiveja sijaitsee lopussa eksonin 7 ja alusta eksonin 9, vastaavasti [11], [12]. Viime aikoina olemme tunnistaa ja kuvata 14 (joista 12 ovat ainutlaatuisia) TCF-4 isoformia peräisin ihmisen HCC solulinjoista [13]. Tällaisia ​​isoformit, kolme rakenteellisesti identtisestä (TCF-4J ja K; TCF-4A ja B, TCF-4G ja H) havaittiin, että erosivat vain läsnäolo (K, A, ja H) tai puuttumisen (J, B, ja G) on SxxSS motiivi. Tässä yhteydessä kaksi paria isoformia (TCF-4A ja B, ja TCF-4H ja G) ovat lyhyitä muotoja, kun taas TCF-4K ja J ovat pitkiä lomakkeita, koska sisällyttämistä C-terminaalisen hännän (eksoni 13-17 ) [13]. Aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että SxxSS motiivi voi moduloida transkriptionaalista aktiivisuutta TCF-4 [12]; kuitenkin sekä solu-pohjainen ja

in vivo

toiminnallisia seurauksia SxxSS motiivin ilmaisu sekä myöhempi geeniregulatiivista aktiivisuutta ei ole määritetty.

Kehittyvät todisteet osoittavat, että sekä alkion (ES) , aikuisten ja indusoituva pluripotentteihin varsi (iPS-solut) [14] mieluummin hypoksinen olosuhteet kasvua ja selviytymistä [15]. Hypoksia tuottaa monipuolisia solujen signaaleja vakauttamisen hypoksian indusoima tekijä (HIF-aS) kuten HIF-1α ja HIF-2α. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että HIF-aS vuorovaikutuksessa β-kateniinin, ja siksi voi säädellä TCF-4-driven geeniekspression paitsi varsi /progenitorisolujen vaan myös kasvainsolujen kokevat hypoksinen olosuhteet nopean kasvun aikana [16], [17]. Nämä havainnot merkitsevät sitä, että Wnt /β-kateniinin /TCF-4 signalointi voidaan suoraan säädellä ammatti happea tunnistava järjestelmä tumassa. Esimerkiksi stabiloitu HIF-2α, kumppani β-kateniinin ja usein esiintyy hypoksinen ydin kasvain, ylössäätelee ilmentyminen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja ne voivat edistää kasvaimen kasvua [18]. Ihmisen HCC, HIF-aS osallistuvat monivaiheinen prosessi kasvaimen erilaistamattomuuden kautta angiogeneesin edistäminen [19]. Niinpä määritimme jos erilaisia ​​toiminnallisia ominaisuuksia TCF-4 isoformia liittyvät HCC pahanlaatuinen fenotyyppi oli säännelty osana SxxSS motiivin-riippuvainen mekanismeja olosuhteissa hapen puutetta.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

koko eettinen hyväksyntä saatiin kaikille ihmisille näytekokoelmien joko Asan Medical Center eettisen komitean tai Kurume yliopiston eettisen komitean. Kaikki näytteet saatiin kirjallinen suostumus. Kaikki eläinkokeet tehtiin noudattaen NIH ohjeet Hoito ja käyttö Laboratory Animals ja hyväksyi ne Lifespan Animal Welfare komitean Rhode Island Hospital, Providence, RI (luvan numero A3922-01).

Detection of TCF-4-isoformien HCC Kasvaimet RT-PCR

valmisteet ihmisen TCF-4A, B, J ja K-myc-plasmideja on aikaisemmin kuvattu [13]. Kaksi itsenäistä RT-PCR-analyysit suoritettiin käyttäen 47 paria ihmisen HCCs (taulukot 1 ja 2), kuten aikaisemmin on kuvattu [13].

Cell Lines and Cultures

Ihmisen solulinjat Hep3B, Huh7, HepG2 ja HEK293 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). FOCUS solulinja saatiin tri sauvat (Maksa Research Center, Rhode Island Hospital, RI). HAK-1A ja HAK-1B-solut saatiin Dr. Yano (Kurume University School of Medicine, Japani). Immortalisoidut maksasolujen solulinjaa OUMS-29 oli ystävällinen lahjoitus Drs. Namba ja Kobayashi (Okayama University, Japani). Hep3B, Huh7, HepG2 ja FOCUS solulinjat ovat hepatiitti B-virus (HBV) liittyviä HCC-soluissa. HAK-1A ja HAK-1B solut ovat hepatiitti C -viruksen (HCV) liittyviä HCC solulinjat. Kaikki solut on kuvattu ja käytetty aiemmissa tutkimuksissa (Hep3B [20], Huh7 [21], HepG2 [20], HEK293 [22], FOCUS [23], ja HAK-1A ja HAK-1B [24]). Tavoitteena on tuottaa vakaa transfektantit, HAK-1A-solut transfektoitiin TCF-4 tai tyhjän vektorin plasmidilla käyttäen TransIT-LT1 Reagent (Mirus Bio Co., Madison, WI) ja valitaan G418.

Hypoksia induktio

Hypoxic olosuhteissa (1% happea) tuotettiin inkubaattoriin varustettu happipitoisuuden säädin järjestelmä (ASTEC, Fukuoka, Japani). Vaihtoehtoisesti solut altistettiin hypoksian matkia kemiallinen kobolttikloridia (CoCl

2, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) [25].

CLSM

Cells , kasvatettiin 35 mm: n halkaisija lasipohjalla Astiat (MatTek, Ashland, MA), kiinnitettiin kylmällä asetonilla /metanolia (01:01) 10 min ajan, ja pestiin sitten PBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween 20 (PBS-T). Epäspesifinen reaktiot peitettiin Protein Block Serum-Free (DAKO Pohjois-Amerikassa, Carpinteria, CA), ja inkuboitiin sitten hiiren anti-Myc-merkki-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai kanin anti-HIF-2α-vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK) 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen PBS-T: n, näytteet käsiteltiin Alexa Fluor vuohen anti-hiiri tai vuohen anti-kani-IgG (H + L) -vasta-ainetta (Molecular Probes, Eugene, OR), 40 minuutin ajan RT: ssä, ja sitten vastavärjätään Vectashield Mounting Medium 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Burlingame, CA). Zeiss LSM510 konfokaali laserskannaus Microscope (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY), jossa käyttöliittymän ohjelmisto Zen 2008 käytettiin havainnollistamaan immunofluoresenssivärjäystä Myc-tag tai HIF-2α ja ydinvoiman lokalisointi saatiin DAPI. Negatiivisista kontrolleista saatu inkuboimalla soluja ei-spesifisen hiiren IgG tai kaniinin IgG kuten edellä on kuvattu.

immunoblot-analyysi ja immunosaostus

Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat vastaan ​​ja Myc-tag, β- kateniinin, aktiini, γ-tubuliinin, Lamin A /C, HIF-1α, c-myc, ja ubikitiinipromoottori (Santa Cruz Bio, Santa Cruz, CA), TCF-4, EpCAM, ja von Hipple-Lindau (VHL) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), HIF-2α (Abcam, Cambridge, UK), ja keratiini-19 (K-19) (DAKO, Carpinteria, CA). TCF-4 kanista saatu mAb (Cell Signaling Technology, Cat # 2569) tunnistaa ympäröivä Leu330 ihmisen TCF-4 ja tunnistaa endogeeninen TCF-4-proteiineja mukaan lukien sekä lyhyellä että pitkällä isoformit. Immunosaostukseen, solu-uutteet valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Kokosolulysaattia tai tumauutteesta inkuboitiin vasta-aineiden HIF-1α, HIF-2α, ja VHL seurasi rekombinantti proteiini G agaroosi (Invitrogen, Carlsbad, CA). Immunoblotit seulottiin vasta-aineilla ubikitiinipromoottori, HIF-1α, HIF-2α, ja VHL ja detektoitiin HRP-leimatun anti-hiiren tai anti-kani-IgG: tä (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) käyttäen ECL Advanced (Amersham). Positiiviset signaalit vangiksi Image analysaattorin LAS-1000plus (Fujifilm, Tokio, Japani), ja bändi intensiteetti proteiinin määritettiin käyttäen Image Gauge versio 3,45 (Fujifilm).

proliferaatiomääritystä

Solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheytenä 2,5 x 10

3 /kuoppa. Kolorimetrinen määritys (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega, Madison, WI) suoritettiin päivinä 0, 1, 3, 5, ja 7, ja signaalit mitattiin käyttämällä Spectra Max M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Anchorage riippumaton Growth (Sphere määritys) B

yksisoluiset suspensiot pantiin Ultra Low Liite 6-kuoppaisille levyille (Corning, Lowell, MA). 27. päivän määrä solun aggregaattien /pallojen kuoppaa kohti kvantitoitiin ja valokuvattiin Zeiss Axiovert 200 M fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss MicroImaging). Pinta-ala soluaggregaatteja mitattiin käyttämällä MetaMorph 6.0 -ohjelmisto (Molecular Devices).

Evaluation of Protein vakaus-

Soluja altistettiin 5 ug /ml sykloheksimidiä (CHX; Sigma-Aldrich) 0 tai 60 minuuttia viimeisessä vaiheessa 48 h CoCl

2 hoitoa. Yhteensä solu lystes käytettiin immunoblottausanalyysillä arvioimiseksi HIF-1α ja HIF-2α ekspressiotasot jälkeen proteiinisynteesiä estyi CHX.

Vieraslajisiirteen Kasvainmalli nude-hiirissä

HAK-1A-johdettu stabiileja klooneja käytettiin; vanhempien HAK-1A-solut eivät muodosta kasvaimia nude-hiirissä, ja soveltuvat siten arvioida pahanlaatuisen muutoksen seuraavien vakaa transfektion TCF-4 isoformia [24]. -Soluja (1 x 10

6) oli ihonalaisesti ruiskutetaan takaisin 5 viikon ikäisiä, koiraspuolisia BALB /c-nude-hiiriin (n = 12) (Taconic Farms, Cranbury, NJ). Kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa ja tuumorin tilavuus (mm

3) arvioitiin käyttämällä yhtälöä pituus x (leveys)

2 x 0,5. Kun pidempi halkaisija oli 10 mm, hiiret tapettiin ja tuumorit valmistettiin myöhempää analysointia varten.

immunohistokemialla ksenograftikasvaimissa

Parafiini-kudosleikkeet poistettiin parafiini ja kuumennettiin 10 mM sitraatti puskuri 120 ° C: ssa 5 min antigeenin haku. Leikkeet ennalta estetty Protein Block Serum-Free (DAKO), ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja HIF-2α (Abcam) ja EGFR (D38B1 XP ™) (Cell Signaling Technology). Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin EnVision sekundaarisia vasta-aineita on leimattu HRP-kompleksit (DAKO), ja visualisoitiin 0,1% 3-3 ’- diamino-bentsidiini-tetrahydrochloride. Solutumien vastavärjättiin hematoksyliinillä. Näytteen inkuboitiin hiiren tai kanin IgG asetettiin negatiivisessa kontrollissa.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkittävyys suorittaa U-testi käyttäen GraphPad Prism 4.0 ohjelmisto (San Diego, CA) .

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Pearsonin korrelaatiokertoimen avulla laskettiin korrelaatio ilmaisu TCF-4J ja K.

Tulokset

Differential Expression profiili TCF-4J ja TCF-4K Human HCC kudokset

Expression TCF-4 isomuotoja tai ilman SxxSS motiivi voi vaikuttaa niiden transkriptioaktiviteettia [12], [13], [27]. Niinpä määritettiin jos kolme paria isoformia (TCF-4A ja B, TCF-4G ja H; ja TCF-4J ja K) näytteillä eri ekspressioprofiileja viittaavia SxxSS riippuvaa sääntelyn ihmisen HCC kasvaimissa. Suhteellinen mRNA-tasot näiden TCF-4 isoformia 27 paria HCC kasvaimia ja vastaavien viereisten maksakudosta saatu kroonista HBV-liittyvä (26/27) sairaus mitattiin. Vertailut tehtiin kolme normaalia maksan näytteistä semikvantitatiivisella RT-PCR: llä (Fig. 1A, kuviossa. S1A ja C, ja taulukko 1), kuten aiemmin on kuvattu [13]. TCF-4J ilmentyminen oli merkittävästi yläreguloituja HCC kasvaimissa verrattuna peritumor kudokseen ja normaali maksan. Niistä 27-pariksi näytteistä 85% oli lisääntynyt TCF-4J ilmentymistä HCC verrattuna sovitetun peritumor kudosta. Sen sijaan, TCF-4K oli merkittävästi vaimentua tuumoreissa verrattuna normaaleihin maksan ja peritumor kudoksen (Fig. 1A). Lisäksi vastaava ilmaisu profiilin näistä TCF-4 isoformia havaittiin toisessa kohortissa HCC-vierekkäisten uninvolved kudosta paria yksilöistä jossa 85% (17/20) ja kasvaimia, jotka liittyvät krooniseen HCV-infektio (Fig. 1 B, taulukko 2). Kuitenkin, tämä ero ilmentymiskuvio ei havaittu kahta muuta paria lyhyitä isoformien (TCF-4A ja B, G ja H) (Fig. S1). TCF-4A, lyhyt muoto K oli merkittävästi vaimentua HBV liittyvien HCC kasvain verrattuna normaaliin maksan sekä peritumor kudosta. Lisäksi ekspressiotason TCF-4B, ​​lyhyt muoto J, havaittiin olevan samankaltainen normaali, kasvain, ja peritumor kudoksissa (kuvio. S1A). Lisäksi muut pari TCF-4 isoformia (G ja H) myös paljastaneet mitään eroja niiden ilmentymisen tasot normaali, HCC kasvain, ja peri-tuumorikudoksia (Fig. S1C). HCV-liittyvä HCC kudoksissa, mutta kaikki neljä isoformeja (TCF-4A ja B, G ja H) olivat merkittävästi vaimentua sekä peritumor ja kasvaimen kudokset verrattuna normaaliin maksan; Lisäksi mitään eroa välillä havaittiin kasvaimen ja peritumor näytettä (Fig. S1B ja D). Nämä tulokset osoittivat, että vaikutus SxxSS motiivi on sukupolven HCC pahanlaatuinen fenotyyppi voi liittyä pitkään (TCF-4J ja K), ei lyhyt isoformeja (TCF-4A ja B, G ja H).

(A) Vertaileva TCF-4J ja K-mRNA: n ekspressiotasot 27 HBV: hen liittyvään HCC kasvaimia (T) vieressä peritumor kudoksen (pT) ja histologisia normaali maksan (N) RT-PCR: llä. Arvot on normalisoitu GAPDH. Punainen suorakaide merkitsevät huonosti eriytetty (PD) HCC. WD, hyvin eriytetty; MD, kohtalaisen eriytetty. Tilastolliset tulokset kaikista kudoksista tai PD HCC ilmaistaan ​​keskiarvona + SD (oikea paneeli). (B) Toinen 20 HCC kasvaimet mukaan lukien viisi WD HCCs toisesta kliininen sivusto. Seitsemäntoista yksilöt oli HCV-liittyvä krooninen maksasairaus, ja loput oli krooninen HBV-infektio. Katso myös taulukoissa 1 ja 2 (C) Expression tasot TCF-4J ja K-mRNA: n ihmisen solulinjoissa HepG2 (G2), Hep3B (3B), Huh-7 (H7), FOCUS (FO), HAK-1A (1A ), HAK-1B (1B), OUMS-29 (OU), ja HEK293 (293). (D) käänteinen korrelaatio TCF-4J ja K ilmentymistä kaikissa HCC (vasen paneeli) ja PD HCC (oikea paneeli). Huomaa heikko käänteinen korrelaatio kaikissa tapauksissa (

r

= 0,297), kun taas lisääntynyt käänteinen korrelaatio PD HCC (

r

= 0,437). *

p

0,01; **

p

0,05.

Seuraavaksi analysoimme korrelaation kliinis ja ilmentymistä näiden TCF-4 isoformia (taulukko 3, taulukko S1). Tulokset viittaavat siihen, että vain aste (t) kasvaimen erilaistumiseen korreloi merkitsevästi TCF-4J ja K ekspressiotasot (taulukko 3). Todellakin, TCF-4K tason oli merkittävästi vähentynyt huonosti eriytetty (PD) HCC kasvaimia, joka oli toisin kuin korkea TCF-4J löytyy samat HCC kasvaimia (Fig. 1A ja B, taulukko 3). Tällaiset tutkimukset viittaavat siihen, että ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymistä TCF-4J voi olla yhteinen piirre PD HCC. Tämän tueksi hypoteesia, TCF-4J oli hyvin ilmaistu sekä HBV liittyvissä (HepG2, Hep3B, Huh7, ja FOCUS) ja HCV-liittyvä (HAK-1A ja HAK-1B) solulinjat (Fig. 1 C). Tämä isoformin myös ilmaistu OUMS-29 ja HEK293. Sen sijaan, TCF-4K-ilmentymisen määrä oli hyvin alhainen PD HCC-kasvaimia ja solulinjoissa lukuun ottamatta HAK-1B ja HEK293 (Fig. 1A, B ja C). Sen sijaan kaksi paria lyhyitä isoformien (TCF-4A ja B, tai G ja H), ei osoittanut tällaista korrelaatiota kliinis ja niiden ilmentyminen SxxSS motiivin (taulukko S1).

Tarkempi analyysi osoitti, että TCF-4J ilmentyminen HCC merkittävästi korreloi käänteisesti TCF-4K (Fig. 1 D, vasen paneeli;

p

= 0,0031, korrelaatiokerroin

r

= 0,297). Käänteistä korrelaatiota TCF-4J ja K ekspressiotasot oli selvempää PD HCC (Fig. 1 D, oikea paneeli;

p

= 0,0077,

r

= 0,437). Siten menetys SxxSS motiivin pitkällä isoformeja TCF-4 vuoksi liittämiseen tapahtumaan liittyi PD HCC fenotyypin.

solunosasijaintia TCF-4J ja K-isoformien HAK-1A HCC Cell line

ymmärtämään paremmin, miten ilmaus SxxSS motiivi voi edistää pahanlaatuinen fenotyyppi HCC

in vitro

, ensin tutkinut lokalisaatio TCF-4J ja K HAK-1A HCC solulinjoja jälkeen ohimenevän transfektion. Kuten on esitetty kuviossa. 2, solu ilmentymistä todettu pääasiassa tumassa arvioituna konfokaalimikroskopiaa ja ydin- /sytoplasman fraktiointi tutkimuksissa, mikä viittaa siihen, että eksogeeninen ilmentyminen TCF-4J ja K proteiinit paikallistaa tumaan osastoon.

(A) Organization ja ”lyhyt” (A, B) ja ”pitkä” (J, K) isoformit; TCF-4B ja J puuttuu SxxSS motiivi. (B) konfokaali laser-skannaus mikroskoopilla osoittaa tumaanohjaussignaali TCF-4J ja TCF-4K (vihreä). Ytimet vastavärjätään mukaan DAPI. (C) Nuclear (Nuc) /soluliman (Cyto) fraktiointi sen jälkeen immunoblot analyysi vahvistaa ydinvoiman lokalisointi TCF-4J ja K-isoformit. Lamin (Lamin A /C) ja γ-tubuliinin käytettiin ydin- ja sytoplasman markkereita, vastaavasti.

TCF-4J-yliekspressoivia HCC solut ovat Proliferative Advantage Hypoksisissa olosuhteet

aikana monivaiheinen prosessi hepatokarsinogeneesin, vähemmän eriytetty HCC-solut syntyvät keskustasta HCC kasvaimen kyhmyjä paljastaen ”kyhmy-in-kyhmy” histologinen ulkonäkö patologinen tutkimus kudosleikkeiden [28]. Keskeinen kasvaimen alueella luo hypoksinen stressi kasvainsoluihin ja edistää apoptoosin [18], [29]. Kuitenkin voi olla hypoksiaa kestävä populaatio HCC-solut, jotka selviävät näissä ankarissa olosuhteissa edistää kasvaimen kasvua kiihtyi angiogeneesiä ja verisuonten invaasio. Nämä kaksi ilmiötä säätelee HIF-1α ja HIF-2α [30], [31]. Siksi me arveltu, että korkea ekspressio TCF-4J PD HCC oli mahdollista heijastaa indusoidun hypoksia-resistenttejä HCC fenotyypin. Testata tätä ajatusta, vakaa solun klooneja yliekspressoivia TCF-4J (J-solut) ja TCF-4K (K-solut) perustettiin, ja vertailut tehtiin tyhjän vektorin-transfektoitujen solukloonien (EV-solut), sekä vanhempien HAK -1-soluja. Under faasikontrastimikroskoopilla, morfologisia ulkonäkö näistä klooneista oli samanlainen ja verrattavissa emosoluista (Fig. 3A), joka oli toisin kuin HAK-1A-johdettu dedifferentoituneiden solukloonin HAK-1B [24].

(A) faasikontrastimikroskopiaan vanhempien HAK-1A (1A) ja 1A johdettuja stabiilien kloonien, kuten tyhjän vektorin-transfektoiduissa klooni (EV2), TCF-4J-transfektoidut kloonit (J1 ja J15), ja TCF-4K-transfektoidut kloonit (K2 ja K5). Morfologisia ulkonäkö erittäin pahanlaatuisten HAK-1B (1B) solulinja, joka on kloonaamalla dedifferentoituneiden solutyypin 1A, on myös esitetty vertailun vuoksi. Bar = 50 pm. (B) immunoblot-analyysi vakaa solun klooneja. Positiiviset signaalit Myc-tag näkyvät J1, J15, K2, ja K5. HepG2 solut (G2) tiedetään ilmentävän sekä täyspitkän (92 kDa) ja katkaistu β-kateniinin (75 kDa), osoitti alemman kaistan varten β-kateniinin (β-Cat) HepG2 käytettiin myös positiivisena kontrollina EpCAM ja K-19 ilme. HEK293 käytettiin negatiivisena kontrollina K-19. (C) Cell kasvuvauhdin stabiilien kloonien mukaisesti hypoksisissa olosuhteissa tuottamat CoCl

2 (150 uM) 7 päivän ajan. Kasvuvauhti on edustettuina taitettavan lisäystä verrattuna päivään 0. (D) Cell kasvu vakaata kloonien normoksia (20% O

2) tai hypoksinen olosuhteet (1% O

2) Soluja altistettiin joko 20%: n tai 1% happea 5 päivää. Huomaa, että vähentäminen solujen kasvua hypoksinen contidions oli vähemmän J soluissa (13%) verrattuna EV (22%) ja K (27%) soluja. (E) ankkurointi riippumattoman kasvun määrityksessä (pallo määritys). Phase-kontrasti mikroskooppinen näkemyksiä edustavista soluaggregaatteja näytetään 0, 75, ja 150 uM CoCI

2. Bar = 300 pm. Huomautus silmiinpistävä ero pesäkkeiden kasvu ja ulkonäkö 150 uM CoCI

2. *

p

0,05; **

p

0,01.

Wnt /β-kateniinin signalointi usein korreloi kantasolun kaltainen molekyyli muutoksiin [32], [33]. Tässä suhteessa ilmentämiseen EpCAM, oletetun maksasyöpä kantasolujen (CSC) markkerin ja β-kateniinin /TCF-4 loppupään kohdegeenituote [6], ei upregulated näissä soluissa. Ilmaisulla K-19, joka on sapen linjaa markkeri aggressiivinen HCC fenotyyppi [34], on lisääntynyt J soluissa, mutta ei K, EV, tai emo HAK-1A-solut (Fig. 3B).

yhdenmukainen edellisessä raportissa Huh7 soluissa [13], J solut oli lisääntynyt tyvi kasvunopeus verrattuna K ja EV valvonta soluja. J-solut olivat resistenttejä alle kemiallisesti aiheuttama, vaikeita hypoksinen olosuhteet (150 uM CoCl

2), lisääntyneet huomattavasti nopeammin kuin K tai EV-soluissa (kuvio. 3C). Tämä havainto on edelleen tuettu, kun solut altistettiin 1% happea 5 päivää (Fig. 3d). Solukasvua hypoksian (1% happea) väheni EV ja K soluja verrattuna soluproliferaatiota normoksia (20% happea) 22 ja 27%: lla, kun taas J solut demostrated vain 13% vähennys solujen kasvua. Lisäksi vankka vastustuskykyä vakavia hypoksia J soluissa oli myös esillä pallo määrityksessä. Tässä yhteydessä J solut muodostivat suurimman solun aggregaatit kaikki CoCl

2 pitoisuuksina. J-solut ”potentiaalia ankkurista riippumaton kasvu oli ilmeisintä Vaikeaa hypoksian indusoima 150 uM CoCl

2 (Fig. 3E).

Menetys SxxSS Motif Auttaa ekspressiotasoja HIF- aS

Perustuu hypoksia kestävä ominaisuuksia näytteillä J soluja, päätimme jos nämä solut ilmaisivat HIF-aS hypoksiaolosuhteissa. Sekä HIF-1α ja HIF-2α ilmentymisen J ja K-soluja tutkittiin, koska HIF-2α on äskettäin osoitettu olevan keskeinen molekyyli, joka edistää eloonjäämistä CSCS hypoksisissa olosuhteissa [35], [36], [37]. Kuten odotettua, HIF-1α ja HIF-2α ilmentyminen indusoitiin kohtalainen hypoksia (75 uM CoCl

2) EV, J ja K-solut; kuitenkin, ankarissa hypoksisissa olosuhteissa (150 uM CoCl

2), vain J soluja ylläpidetään näitä proteiinipitoista tasot (Fig. 4A). Stabiloidut HIF-2α, havaitaan usein hypoksinen ydin kasvain, upregulated ilmentyminen EGFR, jotka voivat edistää kasvaimen kasvua [18], ja aktivointi EGFR-signalointireitin liittyi kehittämistä K-19-positiivisia HCC [ ,,,0],38]. J soluissa, ilmentyminen EGFR ja K-19 liittyi tehostettuun HIF-2α (Fig. 4A). Johdonmukainen HIF vaste havaittiin myös 1% happea alttiina J soluja (Fig. 4B). Lisäksi 150 uM CoCl

2-indusoidun HIF-2α ekspressio paikallistettiin ytimet J soluja arvioitiin immunofluoresenssivärjäyksen (Fig. 4C).

(A ja B), immunoblot-analyysi tyhjä vektori-transfektoidut (EV), TCF-4J yli-ilmentäviä (J), ja TCF-4K yli-ilmentäviä soluja (K). Soluja käsiteltiin 0 ja 150 uM CoCl

2 (A) tai viljellään 1% happea kireys 48 tuntia (B). Solulysaatit altistettiin havaita HIF-aS ja Myc-tag TCF-4 isoformi proteiinin ilmentymisen. Ekspressiotasoja esitettiin graafisesti suhteessa aktiinin (oikea paneeli). (C) Konfokaalimikroskopia ydinvoiman lokalisoinnin HIF-2α-proteiinia. Soluja käsiteltiin 0 uM (normoksia) tai 150 uM (Hypoksia) CoCl

2 ja värjättiin anti-HIF-2α-ainetta (vihreä). DAPI ryhdyttiin käyttämään tumavärjäystä. (D) Immunoblot-analyysi kokosoluliuotteista soluista käsiteltiin 0 tai 150 uM CoCl

2 48 tuntia. A ja B edustavat HAK-1A solut yli-ilmentävät TCF-4A ( ”lyhyt muoto” TCF-4K) ja TCF-4B ( ”lyhyt muoto” TCF-4J), vastaavasti (katso kuvio 2A). Huomaa vankka kasvu ilmauksia HIF-1α ja HIF-2α B-soluissa.

Havaitsimme myös, jos HIF-aS säätelyä ankarissa hypoksia J soluissa liittyi menetys SxxSS motiivi. Jos näin olisi, samanlainen tulos olisi löydetty TCF-4B yli-ilmentäviä soluja (B-solut), niin sanottu ”lyhyt isoformi” TCF-4J (Fig. 2A). Tässä suhteessa, kokosoluliuotteista alistettiin immunoblot-analyysiin verrata B A-soluja, jossa TCF-4A on yli-ilmentynyt, koska ”lyhyt muoto” vastine TCF-4K (Fig. 2A). On tärkeää huomata, että kasvu kokosolulysaattia HIF-α ilmentyminen oli ilmeistä B-soluissa (kuvio. 4D) ja ehdottaa, että SxxSS motiivi voi olla säätelevä rooli moduloimaan HIF-aS ilmentymisen ankarissa hypoksisissa olosuhteissa syntyy 150 uM CoCl

2 kahdet TCF-4 isoformia.

Nopeutettu Ubiquitin riippuva hajoaminen HIF-aS K Solut

Koska HIF-aS proteiinit ovat erittäin hajottaa ubikitiinipromoottori -riippuvaista proteasomaalisten polku, oletettiin, että ero HIF-aS hajoamisen mekanismi saattaa olla ankarissa hypoksia J ja K soluja. Tasot HIF-1α ja HIF-2α lisättiin huomattavasti K soluissa käsitelty proteasomaalisten estäjän (MG-132) verrattuna ei-käsiteltyjen K-solut; toisin havaitsimme vähemmän kasvua näiden proteiinien EV ja J-solut (Fig. 5A). Kertyminen HIF-aS in MG-132-käsiteltyjen K soluissa viittaa vahvasti siihen, että SxxSS motiivi-kätkeminen K solut voivat hajota HIF-aS hypoksisissa olosuhteissa proteasomaalisten riippuvaisesti. Todellakin, proteiinin stabiilisuutta HIF-aS havaittiin vähentynyt K-soluissa (kuvio. 5B). Huomasimme, että taso VHL proteiini, tunnettu E3 ligaasia HIF-aS, K soluissa suurempi kuin J solujen tumassa, mutta ei sytoplasmaan, kun samaan aikaan voimakas ydinaseiden kertymistä HIF-1α ja HIF-2α in J solut hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 5C). Olemme edelleen tutki vuorovaikutusta HIF-2α ja VHL ydin- tiivisteet ja havaitsi, että ydinvoima VHL K soluissa voimakkaasti vuorovaikutuksessa HIF-2α verrattuna J soluihin edistämiseksi HIF-2α ubikinaa- tumassa (kuvio. 5D). Lisäksi K-solut paljasti poly-ubikinaa- HIF-2α verrattuna J soluihin, joka tukee käsite nopeutetun hajoamisen HIF-α K soluissa (Kuva. 5E). Tämä havainto merkitsee mahdollista roolia ydinvoiman VHL säätelyssä vakauden HIF-aS TCF-4 isoentsyymiselektiivisiä yliekspressoivia soluja.

(A) Soluja käsiteltiin 150 uM CoCl

2 36 tuntia seurasi inkuboimalla kanssa tai ilman MG-132 (10 uM) 2 tunnin ajan. Kokosoluliuotteista oli käytetty immunoblot-analyysillä. Suhteellinen ilmentyminen HIF-aS normalisoitiin aktiini. (B) Proteiinin stabiilisuus HIF-aS arvioitiin immunoblot-analyysillä, jossa solut altistettiin 5 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) inhiboimaan proteiinisynteesiä 0 tai 60 minuuttia viimeisen vaiheen 48 tunnin CoCl

2 hoitojakson aikana. (C) Expression of VHL TCF-4J ja K soluja. Soluja käsiteltiin 0 tai 150 uM CoCl

2 ja ydin- ja cytoplamic jakeet valmistettiin immunoblot-analyysillä. Ilmentymistaso HIF-2α ja VHL normalisoitiin Lamin (pohjapaneeli); VHL-C, sytoplasmisen VHL. (D) Vuorovaikutus VHL ja HIF-2α nucleus TCF-4J ja K soluja. (E) Polyubiquitination HIF-2α sytoplasman ja ydin- jakeet TCF-4J ja K soluja. Immunosaostuksella (IP) /immunoblot (IB) analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita HIF-2α ja ubikitiinipromoottori (Ub); *, IgG raskaan ketjun. Huomaa laski ubikinaa- HIF-2α ja heikko VHL-HIF-2α vuorovaikutuksen J soluja, jotka oli toisin kuin havainnot K soluissa.

TCF-4J Isoformi Expression antaa kasvaimia fenotyyppi HCC solut

Tuumorigeenisuustutkimuksissa EV, J, ja K-solut arvioitiin nude-hiirissä. Kuten voidaan ennustaa

in vitro

havaintojen J solut olivat erittäin tuumorigeenisiä. Vaikka K-soluissa syntyy pieniä kasvaimia, ne näyttivät myöhemmin (noin 40 päivää) tuumorisoluinjektion jälkeen ja kasvoivat hyvin hitaasti (Fig. 6A). Ohjaus (EV) solut eivät tuottaneet kasvaimia kuten raportoitu aiemmin [24].

(A) edustaja koe osoittaa, ksenografti kasvainten kehittymiseen ja kasvunopeuteen. EV2, valvonta; J1, J solu; K2 ja K5, K solun klooneja. (B) Proteiinin ilmentymistä ilmoitettu molekyylien J1 kasvaimet (1-5) ja K2 kasvaimet (13-17) immunoblot-analyysillä.