Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) on selvä fenotyypin liittyvä mikrosatelliitti epävakaus (MSI) ja

BRAF

mutaatio paksusuolensyöpä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat valittu 5 promoottorit (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

) sijaismarkkereina for CIMP korkea. Ei kuitenkaan tutkimuksessa on kattavasti arvioitu laajennettu joukko metylaation markkereita (mukaan lukien nämä 5 markkereita) käyttämällä useita kasvaimia, tai avannut monimutkaisia ​​kliinisen ja molekyylitason yhdistyksille CIMP korkea määräytyy validoitu markkeripaneeli.

Metholodology /Principal havainnot

DNA: n metylaatio klo 16 CpG-saarekkeiden [edellä 5 plus

CDKN2A

(p16),

CHFR

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, P14 (

CDKN2A Twitter /ARF) ja

WRN

] oli määrällisesti 904 kolorektaalisyövissä reaaliaikaisella PCR (MethyLightTM). Vuonna valvomatta hierarkkinen klusterointi analyysi, 5 markkereita (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

)

CDKN2A

,

CRABP1

, MINT31,

MLH1

, P14 ja

WRN

oli yleensä ryhmittyneet keskenään ja MSI ja

BRAF

mutaatio.

KRAS

mutaatio ei ryhmittyneet mitään metyloinnin merkki, mikä viittaa sen yhdistys satunnainen metylaatiokuvion in CIMP-low kasvaimia. Hyödyntämällä validoitu CIMP markkeripaneeli (mukaan lukien 5 markkereita), monimuuttuja logistinen regressio osoittaneet CIMP korkea oli itsenäisesti liittyy korkea ikä, proksimaalinen sijainti, huono erilaistuminen, MSI-korkea,

BRAF

mutaatio, ja kääntäen LINE-1 hypometylaatio ja β-kateniinin (

CTNNB1

) aktivointi. Mucinous ominaisuus, sinettisormus soluja, ja p53-negatiivisuus liittyi CIMP korkea vain yhden muuttujan analyysiin. Vuonna kerrostunut analyysit, suhteita CIMP-korkea huono erilaistumista,

KRAS

mutaatio ja LINE-1 hypometylaatio merkitsevästi erosivat mukaan MSI tilan.

Johtopäätökset

Tutkimus tarjoaa arvokasta tietoa standardoinnin käytön CIMP-high-erityisiä metylaation markkereita. CIMP-high on itsenäisesti liittyy kliinisiä ja keskeisten molekyylien ominaisuuksia peräsuolen syöpä. Tuloksemme osoittavat myös, että

KRAS

mutaatio liittyy satunnainen CpG-saarekkeen metylaatiokuvion mikä voi johtaa CIMP-alhainen kasvaimia.

Citation: Nosho K, Irahara N, Shima K, Kure S , Kirkner GJ, Schernhammer ES, et al. (2008) Kattava biotilastollisen analyysi CpG Island Methylator fenotyypin peräsuolen syövän käyttäen suurta Population-Based Sample. PLoS ONE 3 (11): e3698. doi: 10,1371 /journal.pone.0003698

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2008; Hyväksytty: 24 lokakuu 2008; Julkaistu: 12 marraskuu 2008

Copyright: © 2008 Nosho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Yhdysvaltain National Institute of Health (NIH) myöntää P01 CA87969, P01 CA55075, P50 CA127003 ja K07 CA122826 (SO), ja osittain avustusta Bennett Family Fund ja viihdeteollisuus Foundation (EIR) EIR: n kautta kansallinen peräsuolen syövän Research Alliance (NCCRA). K. N. tukivat apurahan avustusta Japanin Society for Promotion of Science. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä NCI tai NIH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset poikkeavuudet ovat tärkeitä mekanismeja ihmisen syövän synnyn [1], [2]. Useita tuumorisuppressorigeeneille vaiennetaan promoottori CpG-saarekkeen metylaation [3], [4]. Osajoukko ja peräsuolen syöpien esiintyy laajalti promoottorin metylaation, joka kutsutaan CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) [4] – [7]. CIMP korkea Kolorektaalituumorien on liitetty korkea ikä, naispuoliseen proksimaalinen sijainti, mucinous ja huono erilaistumista, mikrosatelliittien epävakaus (MSI),

BRAF

mutaatio, korkea LINE-1 metylaation tason villityypin

TP53

, vakaa ja kromosomit aktiivinen WNT /β-kateniinin [8] – [23]. Kuitenkin monet näistä ominaisuuksista ovat toisiinsa, ja näin ollen on välttämätöntä analysoida suuri määrä kasvainten Monimuuttuja-analyysissä tulkita monimutkaisia ​​suhteita CIMP korkea ja näiden kliinisten /kasvainten muuttujia.

On huomattava heterogeenisyys kasvainten osalta CpG-saarekkeen metylaation, eivätkä kaikki CpG saaret metyloituja samalla tavalla kolorektaalisyövässä [15]. Siten valinta CpG-saarekkeiden voi merkittävästi vaikuttaa ominaisuuksiin CIMP. Itse asiassa eri CIMP paneelit käytetään monissa tutkimuksissa ovat aiheuttaneet huomattavaa sekaannusta [7]. WEISENBERGER et ai. [15] ovat seulottu 195 CpG-saarekkeiden, ja valittu 5 lokusten (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

), jotka voivat toimia sijaismarkkereita CIMP korkea. Olemme edelleen validoitu käyttämällä 8 markkereita (edellä 5 plus

CDKN2A

(p16),

CRABP1

ja

MLH1

) kuin CIMP korkea diagnostinen paneelin [24 ]. Ei kuitenkaan tutkimuksessa on kattavasti verrattiin näiden CIMP-high-erityisiä CpG-saarekkeiden ja muut CpG saaret käyttäen useita kasvaimia.

Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet 16 CpG-saarekkeiden lukien uusi 5 CIMP markkereita samoin kuten MINT (metyloitavaa kasvain) markkereita ja muut CpG-saarekkeiden, hyödyntäen hierarkkista klusterointi analyysi useita peräsuolen syöpiä. Olemme myös arvioineet ominaisuudet CIMP-korkea kasvaimet määritettävä validoidulla markkeripaneelin, ja vuorovaikutusta erilaisten kliinisten ja kasvainten tekijöistä monimuuttuja regressioanalyysimme. Tutkimus tarjoaa perustelut standardointia CIMP-high-erityisiä metylaation markkereita.

Methods

Study Group

Hyödynsimme tietokantojen kahden suuren mahdollisille kohorttitutkimukset; Nurses Health Study (NHS, N = 121700 naista seurasi vuodesta 1976) [25], [26], ja Ammattilaisille seurantatutkimuksessa (HPFS- N = 51500 miesten seurasi vuodesta 1986) [26]. Osajoukko kohortin osallistujat kehittyi peräsuolen syövän aikana mahdollisille seurannan. Niinpä nämä peräsuolen syöpien edusti väestöpohjaisen suhteellisen puolueeton näyte (verrattuna yhden tai muutaman-sairaala-pohjainen näyte). Aiemmat tutkimukset ikäluokat ovat kuvanneet perustason ominaispiirteet kohortin osallistujien ja tapauksesta peräsuolen syöpätapausta, ja vahvisti, että paksusuolen ja peräsuolen syöpiä olivat hyvin edustavaa väestöpohjaisen näytteen [25], [26]. Kliiniset tiedot on saatu kaavion tarkastelu lääkärit. Keräsimme parafinoidut kudosblokeista sairaaloista jossa osallistujat oli tehty asemointia ensisijaisen peräsuolen syöpiä. Perustuen käytettävissä riittävästi kudosnäytteiden, yhteensä 904 kolorektaalisyövän tapauksissa (406 miesten kohortti ja 498 päässä naisten kohortti) olivat mukana. Kliiniset ominaisuudet tapauksista kuvataan taulukossa 1 (vasemmalla, sarakkeessa otsikon ”Kaikki tapaukset”). Keskuudessa kohorttitutkimukset, ei ollut merkitsevää eroa väestörakenteeseen toisistaan ​​tapaukset, joissa kudoksen saatavilla ja ilman käytettävissä kudosta [26]. Useimmat kasvaimet ovat aiemmin ominaista statukset MSI, CIMP,

KRAS

,

BRAF

, p53, β-kateniinin, LINE-1 metylointi ja 14 16 metylaation markkereita [19], [21], [24], [27]. Kuitenkaan mikään meidän aiemmat tutkimukset ovat kattavasti analysoitu 16 metylaation markkereita suhteessa toisiinsa, riippumattomien yhteenliittymien CIMP eri kliinisiä, patologisia tai kasvainten molekyyli- ominaisuuksia tai yhteisvaikutuksia eri tekijöiden yhdistykset CIMP korkea kattavilla biotilastollisen menetelmillä . Tämä tutkimus on ainutlaatuinen uusi tutkimus aikavälillä 1) suuren otoksen koon; 2) vahvistetut joukko CIMP-erityisiä metylaation markkereita; 3) useita muita molekyylitason tapahtumia analysoidaan, kuten 8-CpG-saarekkeiden muut kuin CIMP-markkereita, MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53, LINE-1 metylointi ja β-kateniinin ; ja 4) kattavia tilastollisia analyysejä kuten valvomattoman hierarkkinen klusterointi, tasoitus splinien arvioida epälineaarisuus monimuuttujatestaus logistinen regressio, ja ositettu logistinen regressio. Näin ollen tässä tutkimuksessa on saatu uusia tietoja olemassa olevista aineista, ja tietokannan, analoginen uusia tutkimuksia käyttämällä hyvin kuvattuja solulinjoja tai hiiren mallia. Tietoinen suostumus saatiin kaikilta koehenkilöistä. Tissue kerääminen ja analyysit hyväksynyt Harvard School of Public Health ja Brigham and Women n sairaala Institutional Review Boards.

Patologiset tutkiminen, DNA Extraction ja sekvensointi

KRAS

ja

BRAF

kaikissa tapauksissa patologista ominaisuuksia, kuten kasvain eriyttäminen, mucinous ominaisuuksia ja sinettisormus solut tutkittiin patologi (SO). Huono erilaistuminen määritettiin läsnäolo 50% glandulaarinen alueella. Genomi-DNA uutettiin parafiini kudoksesta, ja PCR: llä ja pyrosekvensointi suunnattu

KRAS

kodonien 12 ja 13, ja

BRAF

kodonissa 600 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28], [29].

mikrosatelliitti epästabiilisuus (MSI) Analyysi

MSI tila määritettiin MSI paneelin lukien D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26, BAT40, D18S55, D18S56, D18S67 ja D18S487 (eli 10- markkeripaneelin), kuten aiemmin on kuvattu [24]. ”Korkea aste MSI” (MSI-korkea) määriteltiin läsnäolo epävakaus ≥30%: n markkereita.

Reaaliaikainen PCR (MethyLightTM) varten Quantitative DNA metylointianalyysi

natriumbisulfiittia käsittely DNA: n ja myöhemmin reaaliaikainen PCR (MethyLightTM [30]) oli validoitu ja suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Kvantitoimme DNA: n metylaatio 5 CIMP promoottorit (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

) ja 11 muuta CpG-saarekkeiden [

CDKN2A

(p16),

CHFR

,

CRABP1

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31,

MLH1

, P14 (

CDKN2A Twitter /ARF), ja

WRN

].

COL2A1

(kollageenin 2A1-geeni) käytettiin normalisoimaan määrän mallin bisulfiitti-muunnetaan DNA [31]. Alukkeita ja koettimia aiemmin kuvattu [15], [27], lukuun ottamatta

IGFBP3

, P14 ja

WRN

: IGFBP3-F, 5′-G

T

T

T

CG GGC GTG AG

T

ACG A-3 ’(Genbank nro M35878, nukleotidin nro. 1692-1710); IGFBP3-R, G

AA

TCG

CG CA

CA CG

CT

C (nukleotidi nro. 1789-1810) ja IGFBP3-anturi, 6FAM-

T

CG G

T

TG

T

T

T

AG GGC GAA GTA CGG G-BHQ-1 (nukleotidin nro. 1760-1784) (bisulfiitti-muunnettu nukleotidit on korostettu lihavoituina ja kursiivilla); P14 (CDKN2A /ARF) -F, 5′

T

TG GAG GCG GCG AGA

T

A V-3 ’(Genbank nro L41934, nukleotidin nro. 238-256) ; P14-R, 5’- CCC CGT

CCG CG

AT

-3 ’(nukleotidi nro. 332-350); P14-koetin, 6FAM-5’- CGG

TT

C G

T

C GCG AGT GAG GGT T-3 ’-BHQ-1 (nukleotidin nro. 299-320); WRN-F, 5’-G

T

TCG

TT

C GCG GCG

TTT

T

-3 ’(Genbank nro AY442327 , nukleotidin nro. 1827-1846); WRN-R, 5 ’-

CG

AAA

CCG

T

TCC GAA

TC A – 3 ’(nukleotidi nro. 1887-1908) ja WRN-anturi, 6FAM-

TTT

T

t

T

T

TG CGG

T

CG

T

TG CGG G-BHQ- (nukleotidi nro. 1855-1876). PCR edellytys alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 45 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. Standardikäyrä tehdään kunkin PCR levyyn monistaa PCR-monistukset varten

COL2A1

bisulfiitti-muunnetaan ihmisen genomista DNA: 4 eri pitoisuuksina (in 5-kertainen laimennus sarja). Prosenttiosuus metyloitua viite (PMR, eli aste metylaatio) tiettyyn lokukseen laskettiin jakamalla

GENE: COL2A1

templaatin suhde määriä näytteestä

GENE: COL2A1

templaatin suhde määriä

Sss

I-käsitellyn ihmisen genomista DNA: ta (oletettavasti täysin metyloitu) ja kertomalla tämä arvo 100. metylointi positiivisuus oli asetettu PMR≥4 kuten aiemmin validoitu [31].

pyrosekvensointi mitata LINE-1 metylointi

jotta tarkasti määrällisesti suhteellisen korkea LINE-1 metylaatiotasoilla, käytimme pyrosekvensointi kuten aikaisemmin on kuvattu [21]. LINE-1 metylointi tason mitattiin pyrosekvensointi on osoitettu korreloivan hyvin yleistä 5-metyylisytosiinin tason (eli genomin laajuinen DNA metylaatio taso) tuumorisoluissa [32], [33].

immunohistokemiaallisesti p53 ja β-kateniinin

Tissue mikrosiruja (TMA) on rakennettu ja immunohistokemiaa p53 ja β-kateniinin suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19], [34]. Asianmukaisten positiivisten ja negatiivisten kontrollia sisällytettiin kuhunkin ajon Immunohistokemian. Soluliman ja ydinvoiman β-kateniinin ilmentymistä kirjattiin erikseen joko ei ilmentymistä (0), heikko ilmentyminen (1+), tai kohtalainen /voimakas ilmaus (2+). Β-kateniinin aktivaatio pisteet laskettiin summana ydin- pisteet (0-2), sytoplasmisen pistemäärä (0-2) ja kalvo pisteet (0, jos kalvo värjäytyminen oli positiivinen, +1 jos kalvo lauseke oli menetetty), kuten alun perin kuvattu by Jass et al. [35]. Kaikki immunohistokemiallisesti värjättyjen objektilasit tutkittiin yksi tutkija (β-kateniinin by K.N .; p53 S.O.) tietämätön muita tietoja. Satunnaisotoksia 402 ja 118 kasvaimet tutkittiin uudelleen varten β-kateniinin ja p53 vastaavasti toinen tarkkailija (β-kateniinin SO, p53 KN) tietämätön muita tietoja, ja konkordansseja kahden tarkkailijaa olivat 0,83 varten β-kateniinin (κ = 0,65, p 0,0001), ja 0,87 p53 (κ = 0,75, p 0,0001), mikä osoittaa merkittävää sopimusta.

tilastollinen analyysi

ryhmäanalyysi biomarkkereiden mukaan lukien 16 metylaatio markkereita, MSI,

KRAS

ja

BRAF

, käytimme keskimäärin sidos hierarkkinen klusterointi, jossa on euklidinen etäisyys metristä toteutettuna MeV (https://www.tm4.org) [36]. Khin neliö testiä käytettiin tutkimaan yhdistyksen välillä CIMP ja muiden kategorinen muuttujien kohteisiin. T-testi olettaen epätasainen varianssien suoritettiin vertaamaan keski-ikä ja keskimääräinen LINE-1 metylointi tasolla. Κ kerroin laskettiin arvioida välisen kullekin 16 markkereita (positiiviset vs. negatiivinen) ja 16-markkeri CIMP paneeli (CIMP-korkea positiivinen vs. negatiivinen).

tarkastella suhteet tietyn muuttuva ja CIMP-korkea, käytimme ehdoton logistisen regression malleja laskea kertoimet suhde (syrjäisimpien alueiden) varten CIMP korkea, mukaan tilan tietyn suureen, korjaamattomissakin ja oikaistu ikä, sukupuoli, kasvaimen sijainti, vaihe, erilaistuminen, LINE- 1 metylointi tasolla, ja asema MSI,

KRAS

,

BRAF

, p53 ja β-kateniinin. Säädä mahdollisia sekoittavia, ikä ja LINE-1 metylointi tason käytettiin jatkuvien muuttujien, ja kaikki muut muuttujat käytettiin kategorisen muuttujia.

ikä ja LINE-1, arvioimme epälineaarisuus by uskottavuussuhde testi, jossa verrattiin regressiomallia lukien toisen asteen (tai kuutio) aikavälillä malli ilman sitä. Uskottavuussuhde testi osoitti, että myös toisen asteen ei vaikuttanut merkitsevästi malli sovi (p = 0,86 iän, p = 0,078 varten LINE-1), ja että myös kolmannen asteen ei merkittävästi muuttanut malli sovi (p = 0,87 iän , p = 0,084 varten LINE-1). Tutkimme myös mahdollisuutta epälineaarinen suhde iän (tai LINE-1 metylointi) ja CIMP-korkea, ei-parametrisesti rajoitetuin kuutio kiilat [37].

kahtia kasvaimen sijainti (proksimaalinen vs. distaalinen), kasvain eriyttäminen (huono vs. no /kohtalainen), sinettisormus soluja (läsnä vs. poissa), MSI (korkea vs. muu MSI-korkea), p53 (positiiviset vs. negatiivinen),

KRAS

(mutatoitunut vs. villityyppi),

BRAF

(mutatoitunut vs. villityypin) ja β-kateniinin (aktiivinen vs. passiivinen). Oli 3 luokat mucinous ominaisuus (0%, 1-49%, ja ≥50%) alkuperäisessä pääanalyysi (taulukko 2). Me kahtia mucinous ominaisuus (läsnä vs. poissa) toisen kerrostunut analyysit ja analyysit vuorovaikutusta, koska monimuuttuja Syrjäisimpien alueiden CIMP korkea olivat samanlaisia ​​kaikkialla 1-49% mucinous ja ≥50% mucinous luokat (viitaten ei-mucinous kategoria ). Oli 4 luokat vaiheen (I, II, III ja IV) alkuperäisessä pääanalyysi (taulukko 2). Me kahtia kasvain vaiheessa (I vs. II-IV) keskiasteen kerrostunut analyysit ja analyysit vuorovaikutusta, koska monimuuttuja Syrjäisimpien alueiden CIMP korkea olivat samanlaiset kaikkialla vaiheen II-IV (viitaten vaiheeseen I).

Kun puuttui tietoa kasvaimen vaiheessa (12%), LINE-1 (3,9% puuttuu), MSI (3,2% puuttuu), p53 (1,3% puuttuu),

KRAS

(2,3% puuttuu) tai

BRAF

(4,7% puuttuu), me osoitettu erillinen ( ”puuttuva”) indikaattorimuuttujalla ja sisällyttää ne tapaukset monimuuttujamenetelmin malleja. Olemme vahvistaneet, että ilman tapauksissa puuttuu vaihteleva ei merkittävästi muuttanut tuloksia (tuloksia ei ole esitetty). Ei ollut puuttuvia tietoja muita muuttujia.

yhdistys kunkin muuttujan CIMP korkea arvioitiin myös kerrostumien tärkeitä kliinisiä tai molekyylin ominaisuuksia, kuten ikä ( 65 vuotta vanha vs. ≥65 vuotta vanha ), sukupuoli, kasvaimen sijainti (proksimaalinen vs. distaalinen), MSI tila, ja

BRAF

tila. Sillä kerrostunut analyysi, jokainen monimuuttuja logistinen regressiomalli mukana vaihteleva kohteita, joista stratifioitiin tietyn kerrostamiselintä muuttuja (esim ikä) ja oikaistu kaikki loput muuttujat (SAS koodit saatavilla pyynnöstä).

vuorovaikutus arvioitiin myös ristitulo aikavälillä tietyn muuttujan (esim MSI) ja toisen muuttujan kiinnostusta regressiomallia ja uskottavuusosamäärä verrattuna mallin myös ristitulo aikavälillä että ilman sitä. Sen lisäksi yhteisvaikutuksia tahansa muuttujan MSI, sijainti, ikä, sukupuoli ja

BRAF

, tutkimme kaikki mahdolliset jäljellä kaksisuuntaisia ​​yhteisvaikutuksia, eikä löytänyt merkittäviä yhteisvaikutuksia (tuloksia ei ole esitetty).

Kaikki tilastolliset analyysit paitsi klusterointi analyysiä käytettiin SAS versiossa 9,1 (SAS Institute, Cary, NC). Kaikki p-arvot olivat kaksipuolisia, ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin p≤0.05. Kuitenkin useita hypoteeseja testaus pidettiin tulkittaessa tietoja, varsinkin tarkasteltaessa useita kaksisuuntaisia ​​yhteisvaikutuksia.

Tulokset

Evaluation of 16 metylaation merkkiaineiden

Saimme 904 peräsuolen syöpä yksilöitä ja määrällisesti DNA metylaatio 16 loci [

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

MLH1

,

CHFR

,

HIC1

,

IGFBP3

MGMT

, MINT1, MINT31, P14 (

CDKN2A Twitter /ARF), ja

WRN

] reaaliaikaisella PCR (MethyLightTM [30]) määrityksiin. Ensimmäinen 5 loci (jopa

SOCS1

) valittiin hyvä ennustajia CIMP (CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi) seulomalla 195 CpG-saarekkeiden [15]. Käyttö Ensimmäisen 8 loci (jopa

MLH1

) kuin CIMP korkea diagnostinen paneeli on aiemmin validoitu [24].

arvioimiseksi 16 metylaation merkkiaineiden ennakkoluulottomasti tavalla, me suoritti valvomatta hierarkkinen klusterointi analyysi 16 metylaation markkereita ja asema MSI (microsatellite epävakaus), ja

KRAS

ja

BRAF

onkogeenien, käyttäen 860 kasvaimet kaikkien näiden tulosten saatavilla (kuvio 1 ). 8 CIMP-korkea markkereita (

CACNA1G

,

CDKN2A

(p16),

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

) olivat yleensä ryhmitelty yhteen, mikä osoittaa hyvää konkordanssin metylaatiovyöhykkeiden näiden markkereiden ja tukemaan näitä 8 markkereita niin hyvä CIMP korkea markkereita. Lisäksi p14, MINT31 ja

WRN

myös ryhmittyneet kanssa 8 markkereita. Toinen 5 metylointi markkereita (

MGMT

,

HIC1

,

CHFR

, MINT1 ja

IGFBP3

), eivät olleet ryhmänä läheisesti toisiinsa tai 8 markkereita.

BRAF

ja MSI muuttujia, jotka on tiedetty liittyvän CIMP-korkea [15], [18], [24], myös ryhmittyneet yhdessä näiden 8 markkereita, osoittaa tiukka yhdistysten kanssa CIMP- korkea. Erityisesti

KRAS

mutaatio ei ryhmittyneet minkä tahansa metylaation markkereita, mikä viittaa sen yhdistys satunnainen metylaatiokuvion (erityisesti CIMP-low kasvaimia, jotka on liitetty

KRAS

mutaatio [29 ]; katso myös Supplemental kuva S1). Käytimme kokosi analyysi vain tutkimiseksi Merkittyjen klusterointia, mutta ei kasvaimen luokitusta. Tämä johtui siitä, klusterointi merkkiaineiden oli erittäin vakaa kanssa suuren määrän kasvaimia (eli ilman muutama kasvaimia eivät vaikuttaneet huomattavasti tulokset) kun kasvain luokittelu ryhmittelemällä analyysi perustuu 16 markkereita ei ollut vakaa.

Vaaka ja pystyakseleita edustavat merkkiaineita ja tapauksissa, vastaavasti. Laajentunut näkymä klustereiden puu markkereita näkyy oikealla. 8 markkereita meidän CIMP-korkea diagnostinen paneeli (

CACNA1G

,

IGF2

,

RUNX3

,

MLH1

,

SOCS1

CDKN2A

(p16),

CRABP1

ja

NEUROG1

) ovat keskittyneet tiiviisti, tukemalla että nämä merkit ovat hyviä CIMP-korkea markkereita. Huomaa myös läheiset suhteet MSI,

BRAF

ja 8 CIMP korkea markkereita.

KRAS

mutaatiota ei ole ryhmitelty minkä tahansa metylaation markkereita analysoidaan, mikä viittaa siihen, että

KRAS

mutaatio (joka liittyy CIMP-alhainen [24], [29]; katso Supplemental kuva) on luultavasti liittyy satunnainen metylaatiokuvion.

kuvata suorituskykyä jokaiselle 16 merkkiaineiden puolueettomasti, laskimme κ-kerroin (sopimukseen tilastot), herkkyys ja spesifisyys kunkin ehtiä CIMP- korkea diagnoosi määritetään 16 markkereita (Supplemental taulukko S1). Cutoff varten CIMP korkea asetettiin ≥11 /16 tai ≥10 /16 denaturoidulla markkereita perustuu jakeluun

KRAS

ja

BRAF

mutaatioita (Supplemental kuva), ja edellisestä havainnot että CIMP korkea liittyy

BRAF

mutaatio ja CIMP-low liittyy

KRAS

mutaatio [24], [29]. Herkkyys ja spesifisyys kunkin merkin heijastuu yleinen konkordanssin on metylaatiokuvion kanssa loput 15 markkereita. Oli selvää, että suorituskyky 8 CIMP-paneeli markkereita (

CACNA1G

,

CDKN2A

,

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

) oli yleisesti ottaen hyvä. Κ kerroin oli suurempi kuin 0,5 kaikki nämä 8 markkereita.

RUNX3

oli yksi paras merkkiaine CIMP korkea diagnoosi. Muista 8 markkereita (

CHFR

,

HIC1

,

IGFBP3

,

MGMT

, MINT1, MINT31, P14 ja

WRN

), vain MINT31 ja p14 johdonmukaisesti osoitti κ-kerroin on suurempi kuin 0,5, ja hyvä herkkyys /spesifisyys. Tämä oli kanssa klusterointi analyysi, joka osoitti, että MINT31 ja p14 ryhmittyneet kanssa 8 CIMP-paneeli markkereita.

Vertasimme myös kaikki-16-merkki paneeli 8-merkki CIMP paneeli. Käyttämällä 8-maker paneeli, tai 16-maker paneeli, CIMP-korkea määriteltiin ≥6 /8 tai ≥11 /16 metyloitu markkereita, vastaavasti. Niistä 904 tapauksessa 879 tapausta (97,2%) osoitti yhtäpitävät diagnoosi CIMP aseman välillä 16-merkki paneeli ja 8-markkeripaneeli (κ = 0,89, p 0,0001). Kun 16-markkeri CIMP paneeli käytettiin, yhdistysten CIMP korkea kliinisiä ja molekyylitason ominaisuudet olivat hyvin samanlaisia ​​kuin CIMP korkea yhdistysten jonka 8-merkki CIMP paneeli (tuloksia ei ole esitetty). Olemme myös vahvistaneet korkea sopimuksen (98,6% yhtäpitävät; κ = 0,94) välillä 8-merkki paneeli sekä 5-markkeripaneeli kuvanneet WEISENBERGER et al. [15]. Niinpä myöhemmissä analyyseissä, käytimme 8-markkeri CIMP paneeli josta olimme validoitu laajasti [24].

CIMP-korkea kolorektaalisyövässä

arvioitiin kliininen, patologinen ja molekyylitason ominaisuudet CIMP-korkea kolorektaalisyöpä (taulukko 1). Vuoteen univariate analyysi, CIMP korkea liittyi naispuoliseen ikä, proksimaalinen sijainti, huono erilaistuminen, musiini, sinettisormus soluja, MSI-korkea ja

BRAF

mutaatio, ja kääntäen vaiheen I

KRAS

mutaatio, LINE-1 hypometylaatio, positiivinen p53, ja aktiivinen β-kateniinin (kaikki p 0,004).

Age oli lineaarisesti liittyy CIMP-korkea regressioanalyysimme (p for suuntaus 0,0001). Emme eivät osoittaneet merkittäviä epälineaarisuus jonka uskottavuusosamäärä että verrattuna mallin mukaan lukien toisen asteen (tai kuutio) aikavälillä malli ilman sitä (p 0,85). Samoin LINE-1 hypometylaatio käänteisesti lineaarisesti liittyy CIMP-korkea (p muutossuunnat 0,0001), ja ei ollut merkittävää epälineaarisuus jonka uskottavuusosamäärä käyttäen toisen asteen (tai kuutio) termi (p≥0.078) . Ei-parametriset rajoitettu kuutio kiilat tukee myös lineaarinen suhde ikä ja CIMP-korkea (kuvio 2) ja käänteinen lineaarinen suhde LINE-1 hypometylaatio ja CIMP-korkea (kuva 3).

Log

e (OR varten CIMP-korkea) (y-akseli) iän (x-akseli) on esitetty (ja nuorena kuin merkityksiä). Katkoviivat osoittavat 95%: n luottamusväli. Huomaa lineaarinen suhde ikä ja CIMP korkea. CIMP, CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi; OR, riskisuhde.

Log

e (OR varten CIMP-korkea) (y-akseli) mukaan LINE-1 metylointi (x-akseli) on esitetty (korkean tason LINE-1 metylaatio kuin merkityksiä). Katkoviivat osoittavat 95%: n luottamusväli. Huomaa käänteinen lineaarinen suhde LINE-1 hypometylaatio ja CIMP korkea. CIMP, CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi; LINE-1, pitkä välissä nukleotidin elementti-1; OR, riskisuhde.

monimuuttuja logistinen regressioanalyysi, CIMP korkea oli merkitsevästi yhteydessä ikä, proksimaalinen sijainti, huono erilaistuminen, MSI-korkea ja

BRAF

mutaatio, ja käänteisesti aktiivinen β-kateniinin ja LINE-1 hypometylaatio (taulukko 2). Kuitenkin kaikki muut ominaisuudet (naaras, vaihe, musiini, sinettisormus soluja,

KRAS

ja p53) eivät enää olleet merkitsevästi yhteydessä CIMP-korkea monimuuttujamenetelmin. Olemme lisäksi tutkittiin mahdollisten sekoittavien tekijöiden yhdistyksen kunkin muuttujan CIMP korkea. Paitsi sukupuoli, kaikkien muiden muuttujien osoitti merkittäviä muutoksia kerroinsuhde (OR) varten yhdessä CIMP korkea säätämisen jälkeen MSI,

BRAF

ja /tai kasvaimen sijainti (tai muiden muuttujien) (taulukko 2 ). Nämä tulokset osoittivat, että on olemassa monimutkaisista suhteista kliinisen ja molekyylitason ominaisuuksia (kuten CIMP) kolorektaalisyövässä, jotka on esitetty yhteenvetona kuviossa 4.

Katkoviiva ilmaisee suhteellisen heikko yhdistys.

Yhdistykset kanssa CIMP-korkea kerrostumien MSI

Molecular luokittelua MSI tila on yhä tärkeämpää kolorektaalisyövässä [38] – [40]. Siten tutkimme suhteita kliinisten ja kasvaimen muuttujien CIMP-korkea MSI-korkea kasvaimet ja ei-MSI-korkea kasvaimet (taulukko 3). Korkea ikä, proksimaalinen sijainti ja

BRAF

mutaatio liittyi merkittävästi CIMP-korkea sekä MSI-korkea ja ei-MSI-korkea kasvaimet. Sen sijaan suhteet CIMP-korkea huono erilaistumista,

KRAS

mutaatio ja LINE-1 hypometylaatio näyttää poikkeavan mukaan MSI tila (p vuorovaikutukselle 0,005). CIMP korkea liittyi huono erilaistumista ja käänteisesti

KRAS

mutaatio MSI-korkea kasvaimet, mutta ei ei-MSI-korkea kasvaimet. LINE-1 hypometylaatio oli käänteisesti yhteydessä CIMP-korkea kuin MSI-korkea kasvaimet, mutta ei MSI-korkea kasvaimet.

Yhdistykset kanssa CIMP korkea kerrostumissa kasvaimen sijainti

on kertynyt todisteita molekyyli- ero proksimaalisen ja distaalisen kolorektaalisyövissä [38], [41]. Siksi tutkimme suhteita kliinisten ja kasvaimen muuttujien CIMP korkea proksimaalisilta kasvaimet ja distaalisen kasvaimet (taulukko 4). Suhteita CIMP-korkea muuttujat eivät näyttäneet vaihtelevat kasvaimen sijainti (kaikki p vuorovaikutukselle 0,23).

Yhdistykset kanssa CIMP korkea muissa kerrostunut analyysit

Tutkimme suhteita kliinisten ja kasvaimen muuttujien CIMP korkea kerrostumissa sukupuolen, iän ( 65 vuotta vanha vs. ≥65 vuotta vanha) ja

BRAF

tila. Ottaen huomioon useita hypoteeseja testaus (12-hypoteesien testaus kutakin), vaikutus muuttujia ei näyttänyt poikkeavan merkittävästi iän (kaikki p vuorovaikutukselle 0,03) ja sukupuoli (kaikki p vuorovaikutukselle 0,02). Erityisesti vaikutus LINE-1 hypometylaatio ollut ilmeisesti vaihtelevat

BRAF

tila (p vuorovaikutukselle = 0,001) (taulukko 5). Merkittävä käänteinen yhdistys LINE-1 hypometylaatio kanssa CIMP korkea esiintyi

BRAF

-mutated kasvaimissa [säätää OR = 0.022; 95%: n luottamusväli (CI), ,003-+0,17], mutta ei

BRAF

-wild-tyypin kasvaimet (oikaistu OR = 0,87; 95% CI, 0,25-3,06).

Meillä on myös tutkinut kaikki jäljellä mahdollisten kaksisuuntaisia ​​yhteisvaikutuksia käytettävissä olevan kliinisen ja kasvainten muuttujia, ja ei havaittu huomattavia yhteisvaikutuksia osalta assosiaatioita CIMP-korkea (tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

tässä tutkimuksessa hyödyntämällä suuri otoskoko, arvioimme 16 metylaation päättäjät puolueeton tavalla. 16 metylaatio markkereita sisältyi 5 markkereita (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

) että valittiin seulomalla 195 CpG-saarekkeiden [15] ja edelleen validoitu sisällytetään CIMP-korkea diagnostinen paneeli (edellä 5 plus

CDKN2A

,

CRABP1

ja

MLH1

) [24]. By valvomatta hierarkkinen klusterointi analyysi, 5 metylointi markkereita ryhmittyivät keskenään sekä MSI (mikrosatelliittien epävakaus) ja

BRAF

mutaatio. Analyysi κ kertoimen, herkkyys ja osoittivat myös hyvä suorituskyky 5 metylaation markkereita yleisesti yhtäpitävä metylaatiokuvion. Hyödyntämällä validoitu CIMP paneeli, olemme avannut monimutkaisia ​​suhteita CIMP korkea eri kliininen, patologinen ja molekyylitason ominaisuuksia peräsuolen syöpä. Tuloksemme antavat perustelut on validoitu CIMP erityisiä metylaation markkeripaneelin.

Tämä tutkimus on ensimmäinen laaja tutkimus verrata 5 uutta CIMP-high merkkiaineita [15] kanssa MINT1, MINT31 ja muut CpG-saarekkeiden käyttäen suuri otoskoko.