Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on tappava syöpä, jolla on huono ennuste, joka on tyypillistä liiallinen mitogeenisesta reitin aktivointi ja merkitty chemoresistance on laaja kirjo kemoterapeuttisten. Kahteen eri proteiinifosfataasi 1 (DUSP1) on keskeinen negatiivinen säätelijä mitogeenin aktivoitua proteiinikinaasien (MAPK). Silti DUSP1 yliekspressoituu haimasyöpäsoluissa (PCC) in PDAC jossa se paradoksaalisesti parantaa pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa ja edistää

in vivo

kasvainten muodostumiseen. Kuitenkin, se ei ole tiedossa, onko DUSP1 yliekspressio vaikuttaa PDAC chemoresistance. Käyttämällä BxPC3 ja COLO-357 ihmisen PCC, osoitamme, että gemsitabiini aktivoi c-kesäkuu N-terminaalista kinaasin (JNK) ja p38 mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (p38 MAPK), keskeinen kinaasien kaksi suurta stressiä aktivoitu signalointireitteihin. Gemsitabiini-indusoidun JNK ja p38 MAPK aktivointi välittää voimistunutta apoptoosia, mutta myös transkriptionaalisesti säätelee lisäävästi DUSP1, mistä on osoituksena lisääntynyt DUSP1 mRNA-tasoja ja RNA-polymeraasi II lastaus DUSP1 geenin elin. Toisaalta, shRNA estoa DUSP1 parantaa JNK ja p38 MAPK aktivointi ja gemsitabiinin kemosensitiivisyys. Käyttämällä doksisykliini-indusoituvaa knockdovvn DUSP1 vakiintuneissa potilaalle tehdä haimatuumorien, huomasimme, että yhdistämällä gemsitabiinin kanssa DUSP1 esto parantaa eläinten eloonjääminen, vaimentaa angiogeneesiä ja tehostaa apoptoottista solukuolemaa verrattuna gemsitabiinin yksin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että gemsitabiini-välitteistä säätelyä DUSP1 edistää negatiivisen takaisinkytkentäsilmukan, joka vaimentaa sen hyödyllisestä toiminnasta stressiä reittejä ja apoptoosin, nostaa sitä mahdollisuutta, että kohdistaminen DUSP1 on PDAC voi olla se etu, että parannetaan gemsitabiinin kemosensitiivisyys samalla, kun vaimennetaan angiogeneesiä.

Citation: Liu F, Gore AJ, Wilson JL, Korc M (2014) DUSP1 on uusi Target parannustoiminnot Haimasyöpä Cell Herkkyys gemsitabiini. PLoS ONE 9 (1): e84982. doi: 10,1371 /journal.pone.0084982

Editor: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 lokakuu 2013; Hyväksytty: 27 marraskuu 2013; Julkaistu: 07 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute (NCI) avustus CA-R37-075059 MK, myönsi National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Murray Korc on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvän kuoleman USA, joiden vuotuinen kuolleisuus on lähes 38000, keskimääräinen eloonjäämisaika 6-7 kuukautta ja viiden vuoden eloonjäämisaste 6% [1]. Vaikka resektio pidensi elinaikaa ja tarjoaa mahdollisen parannuskeinoa, 80-85% PDAC ovat leikkaushoitoon aikaan diagnoosi johtuu läsnäolo kaukaisten etäpesäkkeitä, vatsakalvon kylvö tai invaasio viereisiin elintärkeä rakenteisiin [2]. Kemoterapeuttinen aine gemsitabiini (2 ’, 2’-difluorodeoxycytidine, dFdC) on ollut tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä [3]. Äskettäin Food and Drug Administration hyväksyi yhdistelmä gemsitabiinin ja napata-paklitakseli, joka perustuu havaintoon, että tämä yhdistelmä parantaa yleistä selviytymisen 8,5 kuukautta vs. 6,7 kuukautta gemsitabiinihoito yksin [4]. On yleisesti hyväksytty, että parantamalla vastata gemsitabiinin PDAC johtaisi lisäkohottaminen elossaololuku.

Vastus PDAC gemsitabiiniannokseen ja monien muiden kemoterapia-aineiden johtuu osittain erilaisia ​​geneettisiä ja epigeneettiset muutokset, jotka johtavat epänormaaliin aktivoitumista solujen eloonjäämistä ja antiapoptooppinen reittejä [5], voimakas desmoplasia joka häiritsee lääkeaineen kasvaimen massan [6], [7], ja muutokset ilmaisun avainmolekyylejä mukana gemsitabiinin ottoa, solunsisäinen aktivointi ja ulosvirtaus [8]. On kiireesti siis lisää tietämystä mekanismeista chemoresistance vuonna PDAC, jotta laatia uusia ja tehokkaampia kemoterapeuttista strategioita.

Epänormaali aktivointi mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) näyttelee kriittinen rooli säätelyssä solujen eloonjäämistä ja apoptoosin [9], [10]. MAPK voidaan jakaa kolme perhettä: ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK), c-Jun-NH2 kinaasin (JNK), ja p38 MAPK [9], [10]. Kun stimulaatio mitogeeni tai ympäristön stressin, MAPK aktivoituvat fosforylaation kautta niiden tyrosiini- ja treoniiniryhmä by ylävirtaan MAP2K kinaasien [9], [10]. Aktivoitu MAPK fosforyloida kirjon kohdesubstraatteja, mukaan lukien proteiini-kinaasien ja transkriptiotekijät liittyvät säätelyyn solujen lisääntymistä, erilaistumista, selviytyminen, ja apoptoosin [9], [10]. Huolimatta siitä, että ylikuulumisen reittejä eri MAPK, useimmat todisteet tukevat käsitystä, että aktivoitu ERK edistää solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, ja liikkuvuuteen, samalla kun JNK ja p38 MAPK säätelemään negatiivisesti solusyklin etenemisen ja aiheuttaa apoptoottista solukuolemaa vasteena ympäristön stressiin [9] , [10].

dual-spesifisyys fosfataasi (DUSP) proteiinien perhe koostuu 25 jäsentä [11]. DUSPs voi defosforyloivat sekä treoniini /seriini ja tyrosiinitähteillä niiden substraattien ja siten toimivat negatiivisina säätelijöinä MAPK [11]. DUSP1 /MKP-1 on ydin- MAPK fosfataasi, joka on suora transkription kohteena p53, E2F-1, c-Jun, ja ATF2, ja että indusoituu vasteena oksidatiivisen stressin, hypoksia, ja muut rasitukset kuten ravitsemuksellisia puute ja kemoterapeuttisten [12] – [14]. DUSP1 on yli-ilmentynyt eri kasvaimia, mukaan lukien PDAC, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, rintasyöpä, munasarjasyöpä, mahalaukun, ja varhaisvaiheen eturauhassyöpä [15] – [20], ja tämä yli-ilmentyminen korreloi huonoon potilaan eloonjäämisen munasarjasyöpä [18]. Lisääntynyt DUSP1 ilmentyminen rintasyöpä korreloi käänteisesti JNK aktiivisuus ja markkereita apoptoosin, mikä viittaa anti-apoptoottisen roolin DUSP1 kautta aktiivisuus JNK [17]. Tämän tueksi päätelmän, syöpäsolut yli-ilmentävät DUSP1 ovat resistenttejä kemoterapiaa ja Fas-ligandin indusoiman apoptoosin, kun taas vähennys DUSP1 tasojen avulla Sirna lisää herkkyyttä näille aineille [21] – [23]. Sitä vastoin maksasolukarsinoomassa (HCC) lisääntynyt DUSP1 tasot korreloivat paremmin ennusteeseen [24]. Lisäksi DUSP1 säätelee negatiivisesti ERK signaloinnin HCC-soluissa, inhiboiden siten niiden proliferatiivinen potentiaali, mikä viittaa siihen, että DUSP1 on tuumorisuppressorigeenin HCC [24]. Näin ollen haitallisia seurauksia DUSP1 yli-ilmentymisen on todennäköisesti syöpä erityisiä.

raportoitu, että DUSP1 yliekspressoituu PDAC, ja että antisense-välitteisen suppression DUSP1 ilmaisun vähentää kasvaimen kehittymisen nude-hiirissä [15]. Ei tiedetä, kuitenkin, onko DUSP1 voisi olla tavoitteen määrittely vaste gemsitabiinin kemoterapiaan in PDAC. Olemme nyt osoittaa, että gemsitabiini aktivoi JNK ja p38 MAPK, mikä johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin ja DUSP1 transkriptio. Toisaalta, shRNA estoa DUSP1 lisää gemsitabiinin aiheuttaman JNK: n ja p38 MAPK aktivointi ja herkistää PDAC solujen gemsitabiinia. Käyttämällä doksisykliini-indusoituva strategia tukahduttaa DUSP1 vakiintuneilla potilaalle tehdä haimatuumorien, osoitamme, että yhdistämällä gemsitabiinin kanssa DUSP1 esto pidensi elinaikaa, vaimentaa angiogeneesiä ja tehostaa apoptoottista solukuolemaa. Siten DUSP1 voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde parantaa PDAC herkkyyttä gemsitabiinia.

Tulokset

JNK ja p38 MAPK signalointireittejä aktivoidaan vastauksena Gemsitabiini

vaikutukset gemsitabiini PCC kasvuun arvioitiin käyttämällä MTT-määritystä. Kaikissa kolmessa solulinjoissa, gemsitabiini aiheutti annoksesta riippuvan kasvun estävä vaikutus. AsPC-1 oli eniten resistentti gemsitabiinin, joiden IC50 on suurempi kuin 100 ng /ml, kun taas BxPC-3 ja COLO-357-solut olivat herkempiä gemsitabiinin, jossa IC50-arvot 10 ng /ml ja 5 ng /ml, vastaavasti ( kuva 1A).

(A) AsPC-1, BxPC-3, ja COLO-357-soluja inkuboitiin 48 h puuttuessa tai läsnä vaihtelevia pitoisuuksia gemsitabiinin, ja MTT-määritykset suoritettiin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 kokeen. * P 0,05; ** P 0,01 verrattuna kontrolli. (B) AsPC-1, BxPC-3, ja COLO-357-soluja inkuboitiin osoitetut ajat 100 ng /ml, 10 ng /ml, ja 5 ng /ml gemsitabiini, vastaavasti, ja analysoitiin immunoblottauksella. (C) BxPC-3-soluja inkuboitiin 48 h 10 ng /ml gemsitabiini (G), poissa tai läsnä ollessa 10 uM SB203580 (SB) tai 10 uM SP600125 (SP), ja analysoitiin immunoblottauksella.

vaikutusten arvioimiseksi gemsitabiinin aktivoinnista MAPK, soluja inkuboitiin gemsitabiinin pitoisuutena lähellä niiden IC 50-arvot. In BxPC-3 ja COLO-357, gemsitabiini indusoitu fosforylaatio p38 MAPK ja JNK, avain-kinaasien kaksi merkittävää stressiä aktivoitu signalointireitteihin (Fig. 1 B). Gemsitabiini myös nostivat fosfo-c-Jun näissä soluissa (Kuva. 1 B). Koska fosfo-c-Jun on yhteinen alavirtaan tavoite p38 MAPK ja JNK polkuja, tämä havainto vahvisti aktivoinnin p38 MAPK ja JNK signalointi. Lisäksi tasot katkaistun kaspaasi 3 ja pilkottiin PARP korreloi p38 MAPK, JNK, ja c-Jun aktivaation, mikä viittaa siihen, että p38 MAPK ja JNK reittejä välittää apoptoottisen solukuoleman vastauksena gemsitabiinia (Fig. 1 B). Sitä vastoin, AsPC-1-solut olivat resistenttejä gemsitabiinin, mistä on osoituksena puuttuminen p38 MAPK ja JNK aktivointia ja alemmilla tasoilla pilkottiin kaspaasi 3 ja pilkottiin PARP, jopa pitoisuutena jopa 100 ng /ml (kuvio. 1B). Sen määrittämiseksi, onko gemsitabiini indusoi apoptoosia p38: n MAPK ja JNK aktivointi, BxPC-3-soluja inkuboitiin gemsitabiinin puuttuessa tai läsnä ollessa p38 MAPK (SB203580) tai JNK (SP600125) estäjät. Tasot pilkkoa PARP ja pilkottiin kaspaasi 3 pieneni SB203580 ja SP600125, kun se lisätään gemsitabiinia (Fig. 1 C). Niinpä herkillä solulinjoissa, gemsitabiini aktivoi p38 MAPK ja JNK signalointia, joka indusoi apoptoottista solukuolemaa, kun taas gemsitabiini-vastus liittyy alhaisempi apoptoosin ja selvästi heikennettyjä p38 MAPK /JNK aktivointi.

Gemsitabiini Aktivoi DUSP1 transkriptio kautta JNK ja p38 MAPK signalointi

Koska DUSP1 on keskeinen säätelijä MAPK toimintaa [11], tutkimme seuraavaksi ilmentymistä DUSP1 vastauksena gemsitabiinin ja taustalla olevan mekanismin säätämällä sen ilmentymistä. Molemmissa BxPC-3 ja COLO-357-solut, DUSP1 mRNA ja proteiini-tasot indusoitiin 24 tunnin ja 48 tunnin seuraava gemsitabiini Lisäksi samaan aikaan aktivointi p38 MAPK ja JNK (Fig. 2A). Sitä vastoin merkittäviä muutoksia DUSP1 tasot havaittiin gemsitabiinin kestävä AsPC-1-soluissa, sopusoinnussa alhainen apoptoosin ja puuttuminen p38 MAPK ja JNK aktivointi käsittelyllä (Fig. 2A).

(A) AsPC-1, BxPC-3, ja COLO-357-soluja inkuboitiin osoitetun kertaa 100 ng /ml, 10 ng /ml, ja 5 ng /ml gemsitabiini, vastaavasti, ja DUSP1 tasot arvioitiin Q- PCR ja immunoblottauksella. (B, C) BxPC-3 ja COLO-357-soluja inkuboitiin 24 h 10 ng /ml ja 5 ng /ml gemsitabiini, vastaavasti, poissa tai läsnä ollessa 10 umol /l U0126, 10 umol /l SP600125, 10 umol /l SB203580, tai molemmat SP600125 ja SB203580, ja Q-PCR: llä (B), ja RNA-polymeraasi II ChIP seurasi Q-PCR: DUSP1 geenin rungon (C) suoritettiin. Kaikki tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 kokeen. * P 0,05; ** P 0,01, verrattuna kontrolli.

Vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin, transkriptiotekijä AP-1 (c-Jun, c-Fos, ATF2: n), joka on merkittävä alavirran kohde p38 MAPK ja JNK signalointi, on osoitettu liittyvän kanssa DUSP1 promoottori ja säätelevät sen transkription [14], [25]. Voit selvittää p38 MAPK ja JNK signalointi välittävät induktion DUSP1 ilmentymisen gemsitabiini, BxPC-3 ja COLO-357-soluja käsiteltiin gemsitabiinin puuttuessa tai läsnä SB203580, SP600125 tai niiden yhdistelmä. SB203580 ja SP600125 laski induktio DUSP1-mRNA-tasojen gemsitabiini, kun taas niiden yhdistelmä täysin tukossa tämä induktio. Sen sijaan ERK inhibitioastetta U0126 jättänyt muuttaa gemsitabiinin välittämää induktion DUSP1, joiden perusteella voidaan päätellä, että p38 MAPK ja JNK sijaan ERK signalointi välittäjänä DUSP1 induktion gemsitabiinia (Fig. 2B).

lisäys DUSP1 mRNA-tasot voivat johtua tehostetun transkriptionaalista aktiivisuutta tai posttranskriptionaalisella mRNA vakautta. Näin ollen, kromatiinin immunosaostus vastaan ​​RNA-polymeraasi II, joka on keskeinen osa transkription koneiden, on seuraava suorittaa, jonka jälkeen Q-PCR: llä määrän kvantitoimiseksi RNA-polymeraasin II sitoutuu geenin kehon alueella DUSP1. Tämä määritys mahdollistaa suoran mittauksen aktiivisen elongaatiovaihe ja heijastaa transkriptionaalisen aktiivisuuden DUSP1 geenin. Inkubointi BxPC-3 ja COLO-357-solut gemsitabiinin kanssa 24 h lisääntynyt määrä RNA-polymeraasi II lastaus geenin kehon alueen DUSP1 6-kertaiseksi ja 12-kertaiseksi (kuvio. 2C), joka osoittaa transkriptionaalista aktivointia DUSP1 mukaan gemsitabiinin . SB203580 ja SP600125, mutta ei U0126, esti gemsitabiinin indusoimaa määrää RNA-polymeraasi II liittyy DUSP1 geenin rungon (Fig. 2C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että p38 MAPK ja JNK signalointi sovittelee DUSP1 transkription aktivaation gemsitabiinia.

keskeyttäminen DUSP1 negatiivinen kierre Parantaa Kemosensitiivisyys gemsitabiiniannokseen ja sisplatiinia

vaikutuksen tutkimiseksi hiljentäminen DUSP1 on MAPK toimintaa ja gemsitabiinin kemosensitiivisyys, AsPC-1, BxPC-3, ja COLO-357-solut stabiilisti transdusoitiin lentiviruksen ilmentävien shRNA vastaan ​​DUSP1 tai ei-kohdistuksen sekoituskoodin ohjaus ja inkuboitiin sitten eri gemsitabiinin konsentraatioita. Kaikissa kolmessa solulinjoissa, DUSP1 pudotus käyttämällä kahta shRNAs lisäsi kasvua estäviä vaikutuksia gemsitabiinin. Siten hiljentäminen DUSP1 siirtänyt IC50-arvot gemsitabiinin AsPC-1, BxPC-3 ja COLO-357-solut 500-10 ng /ml, 10-5 ng /ml, ja sen 5-2,5 ng /ml, vastaavasti (Fig. 3A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DUSP1 Knockdown tehostettu gemsitabiini kemosensitiivisyys, ja että herkistäviä vaikutuksia olivat merkittävämpiä solujen korkea chemoresistance.

AsPC-1, BxPC-3, ja COLO-357-solut stabiilisti transdusoitiin lentivirukselle ilmentävien shRNA vastaan ​​ryntäily valvontaa tai DUSP1. (A) Soluja inkuboitiin 48 h puuttuessa tai läsnä vaihtelevia pitoisuuksia gemsitabiinin, ja MTT-määritykset suoritettiin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 kokeen. * P 0,05; ** P 0,01 verrattuna kontrolli. (B) AsPC-1, BxPC-3, ja COLO-357-soluja inkuboitiin osoitetun kertaa 100 ng /ml, 10 ng /ml, ja 5 ng /ml gemsitabiini, vastaavasti, ja analysoitiin immunoblottauksella.

anti-DUSP1-vasta rutiininomaisesti paljasti 2 tiiviisti-muuttolintuja bändejä western blotissa (Kuva. 2-3). Kuitenkin DUSP1 pudotus on kaksi erittäin spesifisiä shRNAs kohdistaminen DUSP1 erityisesti vaimennettu ilmentymisen alempi kaista (Fig. 3B), mikä osoittaa, että ylempi vyöhyke oli ei-spesifinen. DUSP1 Knockdown samalla hyvin spesifisiä shRNAs myös voimistaa gemsitabiini-indusoitua apoptoosia, ovat osoituksena kohonneet katkaistun PARP ja pilkottiin kaspaasi 3 (Fig. 3B). Korkeammalla gemsitabiinin aiheuttaman fosfo-p38 MAPK ja fosfo-JNK havaittiin myös DUSP1 pudotus soluissa, verrattuna ryntäily ohjaus, mikä viittaa siihen, että hiljentäminen DUSP1 de-tukahdutettu p38 MAPK ja JNK signalointi, mikä johtaa tehostetun apoptoottisen solukuoleman vastauksena gemsitabiinia (Fig. 3B).

Kun otetaan huomioon, että gemsitabiinia voidaan käyttää yhdessä sisplatiinin tai 5-fluorourasiilin hoitoon paikallisesti levinnyt tai metastaattinen PDAC [26], [27], seuraavan kerran pyrittiin määrittämään, onko kohdistaminen DUSP1 olisi samanlainen herkistäviä vaikutuksia muiden kemoterapia-aineiden lisäksi gemsitabiinia. Tätä varten, BxPC-3 ja COLO-357-solut, jotka ilmentävät stabiilisti shRNA vastaan ​​DUSP1 tai sekoituskoodin ohjaus käsiteltiin eri pitoisuuksilla sisplatiinia. Sekä BxPC-3 ja COLO-357-solut, DUSP1 pudotus laski IC50 2-0,5 ug /ml, ja myös voimistaa sisplatiinin indusoiman apoptoottisen solukuoleman, kuten ilmenee kohonneeseen pilkotun PARP ja pilkottiin kaspaasi 3 (Fig. 4A, 4B). Korkeampi sisplatiinin aiheuttaman fosfo-p38 MAPK ja fosfo-JNK havaittiin myös soluissa, joissa DUSP1 pudotus (Fig. 4B), ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin ASPC-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että keskeyttävä negatiivista palautetta p38 MAPK ja JNK-signaloinnin estävä DUSP1 voisi lisätä apoptoosia ja parantaa kemosensitiivisyys haimasyövän useita kemoterapeuttisia aineita.

BxPC-3 ja COLO-357-solut olivat vakaasti transdusoitiin lentiviruksen ilmentävien shRNA vastaan ​​scramble valvontaa tai DUSP1. (A) Soluja inkuboitiin 48 h puuttuessa tai läsnä vaihtelevia pitoisuuksia gemsitabiinin, ja MTT-määritykset suoritettiin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 kokeen. * P 0,05; ** P 0,01 verrattuna kontrolli. (B) BxPC-3 ja COLO-357-soluja inkuboitiin 2 ug /ml sisplatiinia ilmoitettu ajat, ja immunoblottaus suoritettiin.

knockdovvn DUSP4, toinen Nuclear DUSP, epäonnistuu Paranna Kemosensitiivisyys

vieressä pyrittiin määrittämään, onko tehostettu kemosensitiivisyys on ainutlaatuinen DUSP1 hiljentäminen tai yhteinen piirre kohdisteta DUSP perheenjäseniä. Niinpä päätimme pudotus DUSP4 /MKP-2, koska sen samankaltaisuus DUSP1 kannalta solunosasijaintia ja alustan etusija [11]. AsPC-1 ja BxPC-3-solut stabiilisti transdusoitiin lentiviruksen koodauksen shRNA vastaan ​​DUSP4 tai ei-kohdistaminen scramble ohjaus. Onnistunut vaiennettu DUSP4 varmistettiin immunoblottauksella (kuvio. 5B). Kuitenkin DUSP4 pudotus ei vaikuta MAPK aktivointia tai vaste gemsitabiinin joko solulinja (Fig. 5A, 5B). Näin ollen, DUSP1 on potentiaalinen terapeuttinen kohde tehostavien stressi-aktivoidun MAPK merkinanto- ja parantaa gemsitabiinin kemosensitiivisyys, joka ei välttämättä ole yhteinen piirre kaikille DUSP perheenjäsenet.

AsPC-1 ja BxPC-3-solut olivat pysyvästi transdusoitujen jossa lentiviruksen ilmentävät shRNA vastaan ​​scramble valvontaa tai MKP2. (A) Soluja inkuboitiin 48 h puuttuessa tai läsnä vaihtelevia pitoisuuksia gemsitabiinin, ja MTT-määritykset suoritettiin. (B) AsPC-1 ja BxPC-3-soluja inkuboitiin osoitetun kertaa 100 ng /ml ja 10 ng /ml gemsitabiini, vastaavasti, ja immunoblottaus suoritettiin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 kokeen.

gemsitabiini ja DUSP1 knockdown Yhdistä pidentää Survival heikentävät tuumoriangiogeneesi ja leviämisen, ja apoptoosin tehostamiseksi

vieressä pyrkineet arvioida vaikutuksia estämään DUSP1 gemsitabiinin kemosensitiivisyys käytettäessä potilaalle tehdä hiirimallissa. Tutkia terapeuttista potentiaalia kohdistaminen DUSP1 täysin vakiintunut haimatuumorien, me vakaasti transdusoitu COLO-357 ihmisen haimasyövän soluja lentivirusta ilmentävät doksisykliini-indusoituva shRNA vastaan ​​DUSP1 tai ei-kohdistaminen scramble ohjaus, ennen solujen injektointia haimaan immunopuutoksesta hiiret TET-OFF-tilassa. Kaksi viikkoa myöhemmin, solut, jotka ilmentävät doksisykliini-indusoituva shRNA vastaan ​​DUSP1 tai sekoituskoodin ohjaus muodostettu kasvaimia samankokoisia, joka voitaisiin helposti tunnustelemalla. Kaikki hiiret kuvattiin päivänä 15 leikkauksen jälkeen, käyttämällä korkean resoluution ultraääni, ja kasvainten tilavuudet laskettiin saatuun 3-D kuvaa, jossa vahvistetaan, että molemmat ryhmät muodostivat kasvaimia yhtä suureen määrään (Fig. 6). Alkaen päivä 18 leikkauksen jälkeen, doksisykliini jatkuvasti annettiin juomavedessä, ja hiiret satunnaistettiin 2 ryhmään saamaan ajoneuvo tai gemsitabiinia (50 mg /kg, vatsaonteloon, kahdesti viikossa). Gemsitabiini yksin tai DUSP1 äänenvaimennusjärjestelmien yksinään ole pidentää eläinten eloonjäämisen (Fig. 7A). Kuitenkin vertailu shRNA-scramble /gemsitabiini ryhmä ja shRNA-DUSP1 /gemsitabiini ryhmä paljasti, että DUSP1 knockdown tuotti merkittävän selviytymisen etu läsnä gemsitabiinin (p = 0,037) (Kuva. 7A). Kasvu elinaika oli vielä suurempi verrattaessa shRNA-DUSP1 /gemsitabiini ryhmä kanssa shRNA-scramble /ajoneuvo (p = 0,009), mikä viittaa siihen, että DUSP1 Silencing tehostettu gemsitabiini herkkyys

in vivo

(Fig. 7A ).

COLO-357-solut stabiilisti transdusoitiin lentivirusta ilmentävien Tet-indusoituva ohjaus shRNA (shScramble) tai DUSP1 kohdistamisen shRNA (shDUSP1). Solut injektoitiin haimasta immunopuutoksesta hiirillä, ja 15 päivää myöhemmin, tuumorit kuvattiin käyttäen Vevo2100 korkean resoluution ultraääni. (A-B) edustaja korkean resoluution ultraääni kuvia (A) ja kvantitointi kasvainten 3D vatsan skannaa (B) osoittavat, että ennen Dox tai gemsitabiinin hoitoja, shScramble ja shDUSP1 kasvainten (T, osoitettu nuolilla) olivat samanlaisia ​​kooltaan . Data in (B) ovat keinoja ± SEM.

immuunivajaisiin hiirissä, joissa potilaalle tehdä kasvaimia peräisin COLO-357 soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti doksisykliini-indusoituva shRNA vastaan ​​scramble ohjaus tai DUSP1 annettiin doksisykliini juomavedessä ja käsiteltiin ajoneuvon hallinnan (suolaliuos) tai gemsitabiinia (50 mg /kg, ip, kahdesti viikossa). (A) Kaplan-Meier selviytymisen. * P 0,05 verrattuna scramble gemsitabiiniryhmässä;

## p 0,01 verrattuna scramble käsiteltiin suolaliuoksella. (B) Q-PCR mittaus DUSP1 mRNA-tasojen. (C) TUNEL värjäys ja immunohistokemiallinen CD34, Ki67, ja pilkotaan kaspaasi 3. Scale, 20 um. (D) kvantifiointi. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 kokeen. * P 0,05; ** P 0,01 verrattuna scramble hoidettiin suolaliuoksella.

suostumuksella

in vitro

havaintojen gemsitabiinihoidon lisääntynyt DUSP1 mRNA tasot shRNA-scramble kasvaimia. Useimmat shRNA-DUSP1 kasvaimia oli suhteellisen alhainen DUSP1, kun taas yksi kasvain oli suuria DUSP1 tasoja, johtuen mahdollisesti lyhyempiä doksisykliini altistuminen tai saastumisen viereisen ei-kasvainkudoksen kun korjuu näytettä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että doksisykliini onnistuneesti aiheuttama shRNA ilme. Kuitenkin, koska suuri vaihtelu keskenään hiiri, ero DUSP1 tasoilla eri ryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 7B).

vaikutusten arvioimiseksi DUSP1 hiljentämisen ja gemsitabiinihoidon kasvaimen angiogeneesi, leviämisen, ja apoptoosin, kasvaimen kudokset seuraavan analysoitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä CD34 (angiogeneesi) ja Ki67 (proliferaatiota), sekä päätelaitteen deoksinukleotidyylitransferaasi dUTP nick end merkintöjä (TUNEL) ja pilkottiin kaspaasi 3 immunoreaktiivisuus, jotka molemmat ovat markkereita apoptoosin. Gemsitabiini hieman vaimennettu CD34 ja Ki67 signaaleja, kun taas DUSP1 knockdown oli selvästi estävä vaikutus CD34 värjäystä ja maltillisempaa mutta erittäin merkittävä estävä vaikutus Ki67 värjäytymistä (kuvio. 7C, 7D). DUSP1 hiljentäminen johti myös parannettu lohkaista kaspaasi 3 immunoreaktiivisuus ja TUNEL signaaleja verrattuna ryntäily ohjaus kasvaimia, mikä osoittaa, että lisääntyi apoptoottisen solukuoleman seuraavat DUSP1 knockdown. Kasvu kaspaasi 3 pilkkominen ja DNA: n fragmentoituminen oli vielä suurempi, kun yhdistetään DUSP1 hiljentäminen gemsitabiinin (Fig. 7C, 7D). Näin ollen, DUSP1

in vivo

johti tukahdutetaan angiogeneesiä ja syöpäsolujen lisääntymistä, ja parannettu gemsitabiinin: n indusoiman apoptoosin.

Keskustelu

JNK1, -2, ja -3 ovat koodaama

MAPK8

,

MAPK9

ja

MAPK10

vastaavasti ja vaihtoehtoisen silmukoinnin aiheuttaa ainakin kymmenen isoformit [9]. Sitä vastoin p38 MAPK-α, -β, -γ ja -δ koodaavat

MAPK14

,

MAPK11

,

MAPK12

, ja

MAPK13

, vastaavasti, ja on olemassa kaksi vaihtoehtoisesti silmukoituneet isoformia

MAPK14

[9]. Maailmanlaajuisesti JNK ja p38 MAPK stressi aktivoituvien reittien apoptoosin joissakin tapauksissa, mutta parantaa selviytymistä toisissa riippuen solutyyppispesifiselle eroja, intensiteetti ja kesto signaloinnin, ja läsnäolo tai puuttuminen ylikuulumisen muiden signaalinvälitysreittien [9].

nykyisessä tutkimuksessa määritettiin, että gemsitabiini aktivoitu JNK ja p38 MAPK siten aiheuttamaan apoptoosin PCC. Vaikka rooli tiettyjen isoformien ei ole arvioitu, gemsitabiini-aktivoitua JNK: n ja p38 MAPK signaloinnin indusoi myös DUSP1 transkriptio, ovat osoituksena lisääntynyt DUSP1 mRNA-tasoja ja lisää RNA-polymeraasi II lastaus DUSP1 geenin elin. Lisäksi shRNA estoa DUSP1 parannettu gemsitabiinin aiheuttaman JNK: n ja p38 MAPK aktivointi ja herkistyneet PDAC solujen gemsitabiini ja sisplatiini, mikä alentaa solujen proliferaatio ja lisääntynyt PARP ja kaspaasi 3 pilkkominen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että gemsitabiini aktivaatio JNK ja p38 MAPK johtaa säätelyä DUSP1, mikä puolestaan ​​edistää negatiivista palautetta silmukka, joka vaimentaa JNK ja p38 MAPK toimintaa, siten häiritsevän hyödyllisestä toiminnasta gemsitabiinin stressiä polkuja ja apoptoosin (Fig. 8). Nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että DUSP1 voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde parantaa PDAC herkkiä useille kemoterapia-aineiden. Lisäksi DUSP1 kohdistaminen johtaa kohonneeseen p-ERK1 ja p-ERK2: n [15], ja ERK-aktivaation haimasyöpäsoluissa lisää gemsitabiinin chemoresistance [28]. Siten gemsitabiinin aiheuttama nousu JNK ja p38 MAPK toimet ovat ratkaisevia sen proapoptoottisten toimia.

Gemsitabiini aktivoi JNK ja p38 MAPK (p38) signalointia, joka välittää apoptoottisen solukuoleman. Aktivoitu JNK ja p38 MAPK sitten upregulate DUSP1 transkription, joka negatiivisesti moduloi JNK ja p38 MAPK signalointi aktiivisuutta ja vaimentavat gemsitabiinin solukuolema. Inhiboiva DUSP1 yhdessä gemsitabiinihoidon lisää merkittävästi kemosensitiivisyys haimasyövän soluja.

alassäätely DUSP1 estää angiogeenisten tekijöiden ilmentymistä, kuten SH2D2A ja VEGF-C: n ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ( NSCLC) soluihin, ja toiminnalliset analyysit ovat vahvistaneet roolin DUSP1 edistämisessä kasvainangiogeneesissä [29]. Lisäksi ihmisen NSCLC yksilöitä, DUSP1 lokalisoituu CD31-positiivisten verisuonten rakenteet, ja läheinen korrelaatio lisääntyi VEGF-C ja DUSP1 ilme on osoitettu [29]. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että DUSP1 voi olla tärkeä rooli kasvainangiogeneesissä. Vaikka PDAC on ominaista merkittävä desmoplasia ja hypoperfuusioon, se myös osoittaa suureen taipumukseen etäispesäkkeitä kautta hematogenous tai imusuonten reittejä, vaikka ensisijainen kasvain on pieni [30]. Lisäksi PDAC näyttelyitä pesäkkeitä mikro-angiogeneesin ja ilmentää monia pro-angiogeenisten tekijöiden ja parannettu angiogeneesi, korkea seerumin VEGF-A tasoilla ja lisätään VEGFR-2: n ilmentymisen ovat korreloineet huonompi ennusteen PDAC potilailla [30]. Yhdessä nämä raportit korostavat mahdollista merkitystä poikkeavan angiogeneesin PDAC ja sotkea DUSP1 edistävän tätä prosessia.

Käyttämällä doksisykliini-indusoituvaa knockdovvn DUSP1 vakiintuneissa potilaalle tehdä haiman kasvaimia, esillä olevassa tutkimuksessa määritettiin, että yhdistämällä gemsitabiini jossa DUSP1 esto pitkittynyt eläinten eloonjäämisen ja parannettu apoptoottista solukuolemaa verrattuna gemsitabiinin yksin. Lisäksi DUSP1 knockdown vaimensi merkittävästi PCC lisääntymistä ja kasvaimen angiogeneesiä. Meidän käyttö immuunijärjestelmän hiirissä esteenä arvio seuraus DUSP1 estoa immuunijärjestelmään tai makrofagien määrä ja aktivointia haiman kasvain massa. Koska DUSP1 tiedetään moduloivan makrofagien lisääntymistä ja aktivoitumista [31], tutkimukset syngeenisellä tai geneettisesti hiiri malleja PDAC vaaditaan käsittelemään tätä puolta DUSP1 toiminnon PDAC.

mekanismeja, jotka johtavat lisääntyneeseen DUSP1 ilmentyminen PDAC ei tunneta. On osoitettu, kuitenkin, että hypoksia voi sää- dellä DUSP1 transkription [14], ja PDAC on erittäin desmoplastic kasvain huomattavan hypoksinen mikroympäristön [5] – [7]. Lisäksi, kun läsnä on oksidatiivisen stressin, E2F1 indusoi DUSP1 ilmaisun [13], ja E2F1 on yliaktiivista PDAC seurauksena RB toimintahäiriö ja liiallinen PI3K aktivointi [32], [33]. Yhdessä esillä olevan havaintojen nämä havainnot viittaavat siihen, että PDAC voi olla ”pohjustettu” näytteille lisääntynyt DUSP1 aktivoinnin vastauksena gemsitabiinin, ja viittaavat siihen, että kohdistaminen DUSP1 vuonna PDAC voisi parantaa hyödyllisestä toiminnasta gemsitabiinin edistämällä apoptoosin ja tukahduttamalla haimasyöpä soluproliferaatiota ja kasvaimen angiogeneesiä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Institutional animal Care ja käyttö komitea Indiana University (Luvan numero: 10108). Kaikki eläinkokeet kuvatut tehtiin sopusoinnussa hyväksyttyjen standardien inhimillinen eläinten hoitoon ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Cell Culture

AsPC-1 ja BxPC-3 ihmisen haimasyövän soluja saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357-solut olivat lahja tri R. Metzger Duke University, ja alun perin asetettiin kulttuuriin Morgan,

et al

., [34] potilaalta metastasoitunutta PDAC. Niitä on käytetty laajalti [15], [35], [36], ja ne todistaa oikeaksi kromosomianalyysi. AsPC-1 ja BxPC-3-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, ja COLO-357-soluja kasvatettiin DMEM: ssä. Ellei toisin mainita, media oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä (täydellinen alusta).

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2 yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) Pitoisuus

MTT-määritys suoritettiin, kuten on kuvattu [35].

immunoblottauksella

Immunoblottaus tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],35] käyttäen vasta-aineita seuraavia antigeenejä: PARP, Caspase-3, katkotun kaspaasi-3 (Asp175), fosfori-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfo-JNK (G9), ja fosfo-c-Jun ( Ser63) Cell Signaling Technology, Danvers, MA; DUSP1 (C-19), MKP2 (S-18), JNK (FL) ja ERK2 (C-14), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.