Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

lysiiniä demetylaasi 1 (LSD1) on tunnistettu ja biokemiallisesti tunnettu epigenetiikka, mutta patologinen roolit sen toimintahäiriön keuhkosyöpä ovat edelleen selvittämättä. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida ennustetekijöiden merkitystä LSD1 ilmentymisen potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja määritellä sen tarkkaa roolia keuhkosyövän solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion.

Methods

proteiinin tasot LSD1 kirurgisesti resektoitiin näytteissä pienisoluista keuhkosyöpää havaittiin immunohistokemiallisella tai Western-blottauksella. MRNA-tasot LSD1 havaittiin qRT-PCR: llä. Korrelaatio LSD1 ilmaisutapoja kliinisiä piirteitä ja ennusteen määritettiin tilastollinen analyysi. Solujen lisääntyminen korko arvioitiin MTS määrityksen ja immunofluoresenssimenetelmällä. Solujen migraation ja invaasion havaittiin raaputuskokeen, Matrigel määritys ja siirtokuoppaan invaasiomääritys.

Tulokset

LSD1 ilme oli suurempi keuhkosyövän kudosta enemmän kuin normaalissa keuhkokudoksessa. Tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen LSD1 proteiinia liittyy lyhyempi eloonjäämisaste pienisoluista keuhkosyöpää. LSD1 paikallistettiin lähinnä syöpäsolun tuman. Keskeyttäminen LSD1 käyttämällä siRNA tai kemiallisen inhibiittorin, pargyliini, tukahdutetaan jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäys A549, H460 ja 293T-solut. Samaan aikaan yli-ilmentyminen LSD1 parannettu solujen kasvua. Lopuksi, LSD1 osoitettiin säännellä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon keuhkojen syöpäsoluja.

Johtopäätökset

Yli-ilmentyminen LSD1 oli yhteydessä huonoon ennusteeseen NSCLC, ja edistänyt kasvainsoluproliferaation, muuttoliike ja invaasio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LSD1 on kasvain edistävä tekijä lupaavia terapeuttisia mahdollisuuksia NSCLC.

Citation: Lv T, Yuan D, Miao X, Lv Y, Zhan P, Shen X, et al. (2012) yli-ilmentyminen LSD1 Edistää leviämisen, Migration and Invasion in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (4): e35065. doi: 10,1371 /journal.pone.0035065

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu: 22 marraskuu 2011; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2012; Julkaistu: 06 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Lv et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syövän syiden kuoleman maailmanlaajuisesti. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin keuhkosyövän [1]. 5 vuoden eloonjäämisaste keuhkosyöpä on edelleen heikko. Jotta voitaisiin kehittää tehokkaampia hoitoja, on tärkeää saada parempi käsitys molekyylibiologian keuhkosyöpään.

Genetic muutokset ovat tunnusmerkki ihmisen syövän. Viime vuosina syöpä genomiikan alalla on edistynyt merkittävästi tunnistamisessa geneettisten vaurioiden syövässä. Lisäksi tärkeää on epigeneettiset muutokset tapahtuvat aikana keuhkosyövän kehitystä on myös tunnustettu [2]. Epigeneettiset muutokset liittyvät sekä DNA: n metylaation ja histonimodifikaation [3]. Histonimodifikaation, kuten asetylaatio, fosforylaatio ja metylaatio, ovat kytkimiä, jotka muuttavat kromatiinirakenteeseen sallimaan posttranskriptionaalisella aktivointia tai tukahduttamisen loppupään proteiineja [4]. Ymmärtäminen epigeneettiset muutokset tunnistaa uusia syöpään liittyvien geenien, jotka voivat edustaa houkuttelevia kohteita syövän hoitoon ja tarjota uusia oivalluksia biologiaan keuhkosyövässä. Siten integroiva lähestymistapa keuhkosyöpä tutkimukseen, jossa yhdistyvät epidemiologista, geneettiset ja epigeneettiset tietoa, on tullut tärkeä käsite syöpähoitoa varten [5].

metylaatiostatuksen histoni metyylitransferaasit ja histoni demethylases on keskeinen rooli sääntelyn geenien ilmentymisen [6]. Histoni demetylaasin lysiini demetylaasi 1 (LSD1), ensimmäinen histoni demetylaasin joka löydettiin Ydinvoimalaitoksen homologin aminiinioksidaasien, poistaa metyyliryhmät mono- ja dimetyloitu lysiini (Lys) 4 histoni H3 (H3K4me1 /2) ja Lys9 ja histoni H3 (H3K9me1 /2) [7]. LSD1 on välttämätöntä nisäkkäiden kehityksen ja mukana monissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen tyypin erilaistumiseen ja geenien aktivointi ja sorron [8]. Tuore tutkimus osoitti, että LSD1 voisi edistää solujen faasimuutos (puutos LSD1 johti osittaiseen solusyklin pysähtymisen G

2 /M) ja solujen lisääntymistä, mikä viittaa siihen, että sen yli-ilmentyminen saattaa edistää kasvainten synnyssä [9]. Ilmaisu LSD1 on liittynyt kasvaimen uusiutumisen hoidon aikana erilaisissa syövissä, edelleen syytetään LSD-1 kasvain promoottori [10] – [12]. CDNA mikrosiruanalyysi paljasti myös LSD1 transaktivaatiota keuhkoissa ja peräsuolen karsinoomat [11]. Kaatamalla LSD1 pieniä häiritseviä (si) RNA: iden johti tukahduttamiseen leviämisen eri virtsarakon ja keuhkosyövän solulinjat [11]. Vaikka nämä tutkimukset osoittivat, että LSD1 voi liittyä patogeneesiin keuhkosyöpä, ilmaisun ja merkityksen LSD1: in NSCLC on epäselvä.

Tässä tutkimuksessa yritimme tutkia ilmentymistä ja toimintaa LSD1 vuonna NSCLC, sen suhde kliinis-, ja sen ennusteen arvioinnissa selviytymisen potilaiden NSCLC. Lopuksi tavoitteena oli myös määrittää tarkka rooli LSD1 keuhkosyövän solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Kirurginen yksilöitä 80 NSCLC potilaat saadaan Nanjing Rinta sairaala ja Jinling Hospital tammikuusta 2001 joulukuuhun 2003 saadut takautuvasti kerättiin tutkimusta. Nämä koostuivat 38 squamous karsinoomia ja 42 adenokarsinoomien sekä potilaan sovitettu viereisen ei-kasvain kudosnäytteet. Yksikään potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Kaikki potilaat olivat seurattiin viiden vuoden ajan toiminnan ja täydelliset kliiniset tiedot olivat sähköisesti tallennettu. Kaikki kasvain kudokset luokitellaan Maailman terveysjärjestön luokitus ohjeita. Lavastus kasvainten seurasi 7

th Union International Classification Cancer määriteltyjen perusteiden 2009. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Jinling sairaalassa Nanjing. Kaikki näytteet anonymisoidaan, ja yksikään tutkijoiden suorittaa kokeet oli pääsy kliinis tiedot.

immunohistokemiallinen (IHC) Värjäys

Kaikki näytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla, upotettiin parafiiniin, leikattuna peräkkäin 5 um, ja värjätään hematoksyliinillä ja eosiinilla. Osiot poistettiin parafiini ja rehydratoitiin mukaan rutiinia protokollan. Leikkeitä inkuboitiin yön yli tietyn ensisijaisen LSD1-vasta-aineita (1:100 laimennus; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Levyjä inkuboitiin 30 minuutin ajan vuohen anti-kaniini-immunoglobuliinien (E0432, Cell Signaling) pesun jälkeen Tris-puskuroidulla NaCl-liuoksella. Objektilaseja inkuboitiin sitten 30 minuutin ajan riisuttu AB monimutkainen /AP (K0391, Dako, Peking, Kiina). Counterstaining suoritettiin hematoksyliinillä. Niiden positiivisten solujen määritettiin laskemalla 500 solua viidellä satunnaisesti alueilla per jakso. Nuclear Immunovärjäyksen tulokset LSD1 arvioitiin käyttäen puolikvantitatiivinen Remmele pisteytysjärjestelmä [13], joka lasketaan värjäytymisintensiteettiä ja positiivisten solujen prosenttiosuuden. IHC värjäys pisteytettiin seuraavien kriteerien: – yksikään solut värjätään; +, 1-40% soluista värjättiin; ++; 40-70% soluista värjätään; +++, 70-100% soluista värjättiin. IHC pisteet LSD1 ilmentyminen oli [0 (negatiivinen) ≤ pisteet 2+] ja [2 + ≤ pisteet ≤3 +], joka edustaa matala ja korkea ilmaisun, vastaavasti.

Western-blottaus

keuhkosyöpä kasvain kudosten ja viereisen ei-tuumorikudoksia homogenoitiin . Yhteensä proteiineja (30 ug) kliinisistä näytteistä tai soluviljelmät erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, minkä jälkeen Sähkösiirtomenetelmiä nitroselluloosamembraanille käyttämällä siirron solu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Western-blottaus suoritettiin peräkkäisillä inkuboimalla 5% rasvatonta maitoa salpauspuskurilla huoneenlämpötilassa 60 min, jonka jälkeen primaarinen vasta-aine joko LSD1 (1:500, Cell Signaling), AcH3K9, Twist1, E-kadheriinin, N- kadheriinin tai β-aktiini 4 ° C: ssa yön yli, ja lopuksi piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1:5000) huoneenlämpötilassa 90 min. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin reaktiolla ECL tunnistusjärjestelmä reagenssit (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) ja altistuminen röntgen- filmi, joka oli kehitetty ja valokuvataan.

mRNA Extraction ja Quantitative käänteistranskriptio ( qRT) -PCR

kudokset homogenisoitiin ja solun kokonais-mRNA eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). CDNA transkriptoidaan käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. qRT-PCR suoritettiin käyttäen Fast Start Universal SYBR Green Master Mix Kit (Roche, San Francisco, CA, USA). Suhteellinen mRNA LSD1 normalisoitiin tasoilla taloudenhoito geeni GAPDH ja laskema 2-ΔΔCt menetelmällä. Seuraavia alukkeita käytettiin: GAPDH, eteenpäin: 5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3 ’ja reverse: 5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTG-3′; LSD1, eteenpäin: 5’-GAAACTGGAATAGCAGAGAC-3 ’ja reverse: 5′-GGTGGACAAAGCACAGTATCA-3’.

Cell Culture, transfektio ja hoito

A549, H460, ja 293T-solut on saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin RPMI-10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia ja 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Plasmidi Flag-LSD1 (3ug); ystävällisesti saatu Dr. Yang Shi, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA), yli-ekspressioplasmidin LSD1 (3 ug) ja LSD1 siRNA (3 ug) transfektoitiin A549 ja H460 solulinjoja in 6-kuoppalevyillä (1 ug /ml) käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pargyliini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), monoamiinioksidaasi-inhibiittori, on käytetty kemiallisesti estää LSD1-välitteisen demetylaatio [14]. Soluja käsiteltiin pargyliinillä 48 tuntia, ja sitten tehtiin MTS-määritystä. Tiedot esitetään taitettavan muutokset valon suhteellista yksikköä /milliAnsonyksikköä pargyliinistä, ja edustavat keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Cell Proliferation, Growth, MTS Määritykset

solukasvumäärityksessä, 50000 solua /kuoppa siirrostettiin kolmena kappaleena 24-kuoppaisen levyn täydellinen kasvualusta. Solut laskettiin kuuden päivän hemosytometrillä. MTS-määritys (Promega), 500 solua /kuoppa siirrostettiin kolmena kappaleena 96-kuoppaisen levyn kunkin solulinjan. 12, 24, ja 48 h, 20 ui MTS-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja tulokset analysoitiin levynlukijalla 490 nm: ssä. Näyte data normalisoitiin tausta lukemat median vain.

Kolmiulotteinen Cell Culture, Kollageeni invaasiomääritys, ja Scratch Pitoisuus

kolmiulotteisen tyvikalvon perustettiin viljelmät kuten aikaisemmin on kuvattu [15 ]. Lyhyesti, 5000 solua /kuoppa kasvatettiin 2% Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), jossa epidermaalisen kasvutekijän (EGF) on 50% Matrigel pohjakerros. Kollageenin invaasiomääritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, 5000 solua /kuoppa siirrostettiin 2% matrigeeliä on kerros 01:01 kollageenin (BD Bioscience) ja matrigeeliä sekoitetaan. Culture kasvu oli päivänä 5. naarmu määritystä soluja kasvatettiin täydellisessä kasvualustassa kunnes 90-100% konfluenssiin saavutettiin. 3 mm: n haavan otettiin halkaisijan poikki kunkin levyn. Solumigraation havaittiin mikroskoopilla klo 24 ja 48 tuntia myöhemmin.

A, B) LSD1 ilmentyminen säädellään ylöspäin keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä kudosta. Nuolet osoittavat LSD1-positiivisten syöpäsolujen, jotka sijaitsevat solutumien. Suurennus: A × 20; B, × 60. (C, D) LSD1 ilmentyminen säädellään ylöspäin keuhkoadenokarsinooma syöpäkudoksessa. Suurennos: C, × 20; D, × 60. (E, F) IHC paljasti, että LSD1 ilmentyminen oli heikko normaaleissa keuhkojen kudoksia. Suurennus: E, × 20; F, × 60. IHC tulokset LSD1 ilmaisun olivat: alhainen, [0 (negatiivinen) ≤ pisteet 2+]; korkea, [2 + ≤ pisteet ≤3 +].

P

0,05 osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien.

(A) proteiini taso LSD1 keuhkosyövässä kudoksessa oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa kudoksessa (

P

0,01), kuten havaittiin Western blot. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina. (B) näyte 122, 206 ja 207 on esitetty edustajia kolmeen ryhmään: N, normaali keuhkojen kudoksia: C, NSCLC kudoksia; P, paracarcinoma kudoksiin. (C) mRNA-taso LSD1 havaittiin qRT-PCR: llä, ja mRNA: n ilmentymisen LSD1 oli merkittävästi suurempi kasvainkudoksessa kuin normaalissa kudoksessa (

P

0,05).

Blue linjat kuvaavat korkeita LSD1 ilmaisun, ja punaiset viivat kuvaavat alhaisia ​​LSD1 ilmaisun NSCLC näytteissä. (A) pienisoluista keuhkosyöpää pienemmillä LSD1 proteiinin tasot olivat parempia ennustetta. (Oikaisematon

P

-arvo = 0,0003; alhainen ilmaisun tapauksissa n = 52 ja korkea ilmaisun tapauksissa n = 28). (B) Potilaat, joilla pienempi mRNA LSD1 oli myös pidempi eloonjäämisen (

P

0,05).

Tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

-testin ja ANOVA käytettiin tutkimaan assosiaatioita LSD1 ilmaisun ja kliiniset tekijät (ikä, sukupuoli, tupakointi, kasvain vaiheessa histologia, kasvaimen koon, imusolmukestatuksesta, ja kokonaiselossaolo). Pearsonin korrelaatio analyysiä käytettiin arvioimaan asteen lineaarinen korrelaatio kahden muuttujan. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin määrittämiseksi ennusteen arvioinnissa LSD1, ja log-rank testiä käytettiin vertaamaan tasa kahden eloonjäämiskäyrien.

P

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja

P

0,01 pidettiin erittäin merkittävä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmaa v17.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).

Tulokset

LSD1 Ekspressio Up-säännelty NSCLC Kasvain Kudokset

ensimmäinen tutkittiin ekspressiotasoja LSD1 80 NSCLC kasvain kudosten ja 20 normaali keuhkojen kudoksiin IHC värjäystä. Korkea LSD1 ekspressiota havaittiin tumien pahanlaatuisten solujen, kun taas heikkoa värjäytymistä havaittiin koko ei-neoplastisten kudosten (Fig. 1). Tarkemmin sanottuna ilmentyminen LSD1 havaittiin 90,0% ja keuhkosyövän (72/80) ja 10,0% hyvänlaatuisen keuhkojen yksilöt (2/20). Korkea LSD1 ilmaisun (pisteet: ++ – +++) havaittiin 37 (46,3%) kasvaimen kudokset pienisoluista keuhkosyöpää.

Seuraava tutkittu LSD1 ilmentymistä 40 satunnaisesti valittua NSCLC tuumorikudoksia, paracarcinoma keuhko kudoksia, ja normaali keuhkojen kudoksia Western-blottauksella. Tulokset osoittivat tilastollisesti merkitsevää nousua LSD1 ilmentyminen kasvaimissa, verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksia käyttäen β-tubuliinia ohjearvon (kaksisuuntainen pariksi

t

-testi, n = 40,

P

0,01) (Fig. 2A). Proteiini taso LSD1 näytteissä 122, 206, ja 207 on esitetty kuviossa 2B.

edelleen vahvistaa edellä olevan proteiinin tuloksia, tutkimme myös mRNA tasot LSD1 näissä 40 valittujen NSCLC kasvain kudosten ja normaali keuhkojen kudoksiin qRT-PCR: llä käyttämällä GAPDH referenssinä. Huomasimme, että mRNA-tasolla LSD1 syövän kudoksissa (Ct = 19,9 ± 1,01) oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa keuhkojen kudoksissa (Ct = 22,1 ± 0,9) (kaksisuuntainen pariksi

t

-testi, n = 40,

P

0,05) (Fig. 2C).

LSD1 Expression liittyi Kokonaiselossaoloaika

arvioimiseksi kliinistä merkitystä LSD1 yli-ilmentyminen keuhkosyöpä, analysoimme onko ekspressiotasoja LSD1 liittyivät yleisen eloonjäämisen NSCLC. Kuten on esitetty taulukossa 1, proteiinipitoista tasot LSD1 liittyivät merkittävästi eloonjäämisen (χ

2 = 12,87,

P

= 0,0003), mutta ei korreloi johonkin ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia (kuten ikä, tupakointi , sukupuoli, kasvaimen halkaisija, histologinen tyyppi, sisäelinten keuhkopussin invaasio, pathologic vaiheessa tai lentotoiminnan laji; kaikki,

P

0,05). Aikana 5 vuoden seuranta-aikana, 52 ulos 80 (65%) NSCLC potilasta kuoli seurauksena taudin etenemistä. Kaplan-Meier käyrät osoittivat, että potilailla, joilla on lisääntynyt LSD1 ilme (28 tapausta) oli huomattavasti lyhyempi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla on vähentynyt LSD1 ilme (52 tapausta) (

P

= 0,0003) (Fig. 3A).

ilmentymistä LSD1 on A549- ja H460 keuhkosyövän soluja oli suurempi kuin 293T-soluihin. Proteiini tasolla H460 solulinjassa oli korkeampi kuin A549-solulinja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Sarjan käyrät edustavat soluproliferaation 0 h 48 h altistumisen jälkeen eri pitoisuuksia pargyliinin hoidon ja transfektio eri plasmideja. (EN) LSD1 estäjä, pargyliini (ylhäältä alas: 1 mM, 2 mM, 3 mM ja 4 mM), ja LSD1 siRNA esti lisääntymisen A549 solulinjan. A549-solujen lisääntymisen pieneni merkitsevästi eri ryhmissä, verrattuna kontrolleihin (*

P

0,05). (B) pargyliini esti H460 solulinjan selviytymistä. Lisäksi voimakkaampi inhiboiva vaikutus havaittiin H460 solulinjassa, mutta ei ollut merkittäviä eroja kahdessa solulinjassa. H460 soluproliferaatiota pieneni merkitsevästi eri pitoisuuden ryhmissä, verrattuna kontrolleihin (*

P

0,05). (C) pargyliini esti selviytymisen 293T solulinjan. (D) lisääntyminen käyrä transfektion jälkeen Flag-LSD1 plasmidin A549 ja transfektio LSD1 siRNA plasmidin H460 soluun. A549-soluja, lisääntymisen oli huomattavasti suurempi transfektion jälkeen Flag-LSD1 plasmidi, verrattuna pCMV5-transfektoitiin kontrolli (*

P

0,05). H460-solujen proliferaatio oli merkitsevästi pienempi transfektion jälkeen LSD1 siRNA plasmidi, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu siRNA ohjaus plasmidi (*

P

0,05).

kuvat näkyvät × ​​20 suurennus. Vihreä, punainen ja sininen fluoresenssi edustavat LSD1, BrdU ja Topro-3, vastaavasti. Lisääntyminen merkittävästi lisääntynyt A549 transfektion jälkeen Flag-LSD1 plasmidiin. Kuitenkin leviämisen vähentynyt H460-soluissa transfektion jälkeen LSD1 siRNA plasmidi. Pargyliini hoito vähensi lisääntymistä molemmissa solulinjoissa. Topro-3-värjäys osoittaa ydinvoiman lokalisointi ja BrdU-värjäys osoittaa lisääntyvien solujen.

vaellusnopeus laski asteittain 6 h 48 h transfektion jälkeen LSD1 siRNA plasmidi H460-soluissa, jotka oli poikkeaa merkittävästi nopeus 24 tunnin ja 48 tunnin (*

P

0,05). Siirtymisen nopeus vähitellen kasvanut transfektion jälkeen Flag-LSD1 plasmidin A549, joka oli merkittävästi erilainen kuin nopeus 24 tunnin ja 48 tunnin (*

P

0,05). Kaikki transfektion ryhmät olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin verrokkiryhmässä (*

P

0,05).

suostumuksella Tässä olemme myös päättäneet, että korkeammat mRNA ilmentymistä LSD1 liittyi pieneni eloonjäämiseen pienisoluista keuhkosyöpää (

P

0,05) (Fig. 3B.).

LSD1 mainosvideosuositukset leviämisen Lung Cancer Cell Lines

ilmentymistä LSD1 oli pienempi A549 kuin H460 solulinjassa, kuten on esitetty kuviossa 4. Näin ollen, Flag-LSD1: n plasmidi transfektoitiin A549-soluihin ja LSD1 siRNA plasmidi transfektoitiin H460-soluissa. 293T normaalit epiteelin soluja käytettiin negatiivisena kontrollina.

Olemme havainneet, OD-arvo A549, H460 ja 293T-soluissa MTS tuottamaan solun kasvukäyrät. Kaikissa kolmessa solulinjoissa, soluproliferaatiota väheni yhdessä pargyliinillä hoidon konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Se oli huomattavasti pienempi 4 mM-hoidetussa ryhmässä kuin 1 mm- tai 2 mM hoidetuissa ryhmissä. Lisäksi se oli myös pienempi 1 mM: lla hoidetussa ryhmässä kuin 3 mM-käsitelty ryhmä; kuitenkin, ei ollut eroa 1 mm- ja 2 mM hoidetuissa ryhmissä tai 3 mm- ja 4 mM hoidetuissa ryhmissä (

P

0,05), kuten on esitetty kuviossa 5A-C.

transversed solujen määrä oli merkitsevästi suurempi A549-soluja, jotka on transfektoitu Flag-LSD1 plasmidiin; kuitenkin transfektio LSD1 siRNA plasmidin H460-solujen vähensivät määriä invasiivisia soluja. Numerot invasiiviset solut molemmista transfektiosta ryhmät olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin kontrolliryhmän (*

P

0,05).

ilmentyminen yhteensä H3K9 ei muuttunut merkittävästi. Kun LSD1 aktiivisuus oli säädelty, Twist1 ja N-kadheriiniekspressiota lisääntynyt ja AcH3K9 ja E-kadheriinin ilmentymisen pienentynyt. Kun LSD1 aktiivisuus alassäädetty, Twist1 ja N-kadheriiniekspressiota väheni ja AcH3K9 ja E-kadheriinin ilmentymisen lisääntynyt. Flag-LSD1: n plasmidi transfektoitiin A549-solulinja, ja LSD1 siRNA plasmidi transfektoitiin H460 solulinja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Lisääntyminen merkittävästi lisääntynyt A549 ryhmässä transfektion jälkeen Flag-LSD1 plasmidi (

P

0,05); kuitenkin merkittävästi vähentynyt H460 ryhmässä transfektion jälkeen LSD1 siRNA plasmidi (

P

0,05). PCMV plasmidia käytettiin säädin A549 transfektion ryhmä, ja LSD1 siRNA ohjaus plasmidia käytettiin H460 solutransfektiolle ryhmä (Fig. 5D).

edelleen osoitettu roolia LSD1 A549 ja H460 soluproliferaatiota immunofluoresenssivärjäyksen. Muutos määrä lisääntyvien solujen havaittiin BrdU värjäystä. Tulokset osoittivat, että solujen lisääntyminen oli merkittävästi lisääntynyt transfektion jälkeen yli-ilmentävät LSD1 plasmidin A549-solulinja. Samaan aikaan, solujen lisääntyminen väheni H460-soluissa, jotka oli transfektoitu LSD1 siRNA plasmidi. Se laski sekä solulinjoissa jälkeen pargyliinillä hoidon, kuten on esitetty immunofluoresenssivärjäyksen (Fig. 6), mikä vahvisti myös, että LSD1 on osallisena kasvainsoluproliferaation.

LSD1 edisti Migration of Lung Cancer Cells

solun muuttoliikettä tutkittiin solun tyhjästä määrityksessä. Verrattuna verrokkiryhmään, määrä ja nopeus siirtynyt solujen asteittain vähentää, kun transfektion LSD1 siRNA plasmidista H460 solulinjoissa. Vaeltavat solut saavuttivat huippunsa 48 h, kuten on esitetty kuviossa 7A. Sen sijaan, useita siirtynyt soluja kasvoi merkittävästi A549-solulinjan transfektion jälkeen Flag-LSD1: n plasmidi, verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,05). Suhteellinen nopeus muuttoliikkeen esitetään kuviossa 7B.

rooli LSD1 Lung Cancer Invasion

solujen kyky ylittää matrigeeliä osoitti invasiivisuus A549 ja H460 solulinjoissa. H460-soluja, jotka on transfektoitu LSD1 siRNA plasmidi oli vähemmän invasiivisia kuin kontrolliryhmä (

P

0,05). A549-soluja oli transfektoitu Flag-LSD1 plasmidi olivat invasiivisia kuin vertailuryhmän soluihin ja soluja käsiteltiin pargyliinillä (molemmat,

P

0,05). Määrä hyökkäävän solujen rajan läpi matrigeelin tyvikalvon on esitetty kuviossa 8.

LSD1 säädelty epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) Lung Cancer Cells

Sen tutkimiseksi, LSD1 säätelee EMT siirtyminen keuhkojen syöpäsoluja, selvitimme ilmaus keskeisten EMT transkription repressori TWIST1 ja EMT markkereita E-kadheriinin ja N-kadheriinin in LSD1-over-ilmentäviä A549-soluja (transfektoitu Flag-LSD1 LSD1 yliekspressoivissa plasmidi) ja LSD1 pudotti H460 soluja (transfektoitu LSD1 siRNA plasmidin, tai käsiteltiin 4 mM pargyliini). Vaikutukset H3K9, AcH3K9, Twist1, E-kadheriinin ja N-kadheriiniekspressiota aiheuttama muuttuminen LSD1 toiminnan tutkittiin. Vaikka ilmaus yhteensä H3K9 ollut vaikutusta, LSD1 yli-ilmentyminen johti laskee H3K9 asetylointi ja E-kadheriinin ilmentymisen ja lisäykset Twist1 ja N-kadheriiniekspressiota. Samaan aikaan, H3K9 asetylointi tasoja ja E-kadheriinin ilmentymisen nostettiin LSD1 kaataa soluja, mikä viittaa siihen, että LSD1 ilmentyminen voidaan korreloida AcH3K9, Twist1, E-kadheriinin ja N-kadheriinin ilmentymisen, kuten on esitetty kuviossa 9.

keskustelu

viime vuosina epigenetiikan on tullut kuuma aihe syöpätutkimukseen. Tasapaino metylaation ja demetylaatio in epigeneettiset muutos vaikuttaa geenien ilmentyminen ja solujen toimintaa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava histoni lysiiniä metylaatio syövän liittyy paitsi tukahduttamisesta kromatiinin liittyvät tiettyihin geeneihin, mutta myös tukahduttaminen suurten kromosomialueita. Epigeneettiset muutokset LSD1 on osoitettu olevan keskeisessä asemassa karsinogeneesissä [17]. LSD1 voi estää kertyminen Dimetyyliadduktin ryhmien p53, tukahduttamiseen p53-välitteisen transkription ylössäätöä, estää apoptoosin, ja edistää ihmisen syövän synnyn kautta chromatin muutos mekanismi.

Toistaiseksi vain harvat tutkimukset ovat sekaantuneet LSD1 in NSCLC. Hayami

et al.

Osoittivat, että LSD1-erityisiä siRNA merkittävästi pudotettiin LSD1 ilmaisun ja johti tukahdutti leviämisen eri keuhkosyövän soluihin [11]. Kuitenkin yhdistyksen välillä LSD1 ja selviytymisen NSCLC potilaiden ei ollut hyvin määritelty, ja rooli LSD1 proliferaatiossa, muuttoliike ja hyökkäyksen NSCLC oli epäselvä. Tutkimuksemme selvitettiin yhdistysten LSD1 ilmaisun ja kliinisiä piirteitä NSCLC potilaiden diagnosoitu vaiheen I /II. Osoittaakseen, että epigeneettiset muutokset liittyivät geneettisiä muutoksia keuhkosyöpä, ensin tutkineet ilmaus LSD1 NSCLC kliinisissä näytteissä.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että LSD1 proteiini ja mRNA-tasot voivat toimia biomarkkereita potilaille aggressiivisempaa kasvaimia rintasyöpä, eturauhassyöpä, ja neuroblastooma [18] – [20]. Tutkimuksessamme havaitsimme LSD1 IHC analyysi, Western blotting ja qRT-PCR. Vahva kohta tämän tutkimuksen havainto, että ilmaus LSD1 korreloi merkitsevästi eloonjäämisaste NSCLC potilaiden. Nykyinen tutkimus tutkittiin miten LSD1 in NSCLC. Lisätutkimukset LSD1 in muissa elimissä voi paljastaa, että potilailla, joilla on korkeampi LSD1 (riippumatta mRNA tai proteiini ja /tai riippumatta primaarituumorin tyyppi) huonompi selviytyminen kuin potilailla, joilla on alhaisempi LSD1.

lisäksi osoittanut, että LSD1 oli tärkeää syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota. LSD1 aiheuttama aktivointi lisääntymisen, migraation ja invaasion kasvainsolun estyi pargyliini. Down-regulation LSD1 ilmentymisen siRNA kasvainsolulinjoissa lisännyt solujen kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että LSD1 voi vaikuttaa muutosta kasvainsolujen, ja se voi myös edistää EMT keuhkojen epiteelin. Lisätutkimuksia on suoritettava sen määrittämiseksi, yli-ilmentyminen LSD1 on aikaisin tai myöhään tapahtuma keuhko- kasvainten synnyssä ja mikä mekanismi yli-ilmentymisen on. Olemme esittäneet tietoja viittaa siihen, että LSD1 on säädelty keuhkoissa syöpäkasvain edistäminen polku ja että se toimii lisätä solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio, ja palauttamaan transformoidun epiteelin fenotyypin. Farmakologinen suppressio LSD1 voi edustaa lupaavaa lähestymistapaa NSCLC hoitoon.

Lisäksi toiminnallinen analyysi on määritettävä sääntelyn verkosto LSD1. Transkription analyysi paljasti, että LSD1 /Nurd kompleksit säätelevät useat solusignalointi reittejä [21], mukaan lukien TGFp 1-signalointireitin, joka on kriittisesti osallisena solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon. Olemme osoittaneet, että LSD1 edisti hyökkäyksen ja metastaattisen potentiaalin keuhkosyöpään solujen

in vitro

. Olemme myös havainneet, että LSD1 on säädellään ylöspäin keuhkokarsinoomia ja että sen ilmentymistaso korreloi negatiivisesti kuin AcH3K9, Twist1 ja N-kadheriinin, ja korreloi positiivisesti että E-kadheriinin. Tuloksemme antavat molekyylitason perustan vuorovaikutus histonien deasetylointi kromatiinin remodeling, mikä osoittaa, että LSD1 voivat vaikuttaa EMT ja asetylointi H3K9.

poikkeava yli-ilmentyminen LSD1 keuhkosyövässä voivat tehdä hyvä ehdokas terapeuttisena molekyyli- kohde [11]. Tällainen tieto osoittaa myös, että meidän pitäisi jatkaa kehittää uusia syöpähoidolla perustuu epigenetic asemasta. Koska se on vaikutuksia löytämisen epigeneettiset markkereita, tärkeä kysymys ratkaista on, miten määritellään potentiaalisia epigenetic hoitoa. Ensimmäisen sukupolven lääkkeet kohdistuvat suhteellisen siveetön DNA: n metylaation ja histoni asetylaatio määritteet ovat menestyneet hoidossa hematologisen syöpien [22]. Jos LSD1 esto johtaa merkittäviin de-tukahduttaminen joidenkin geenien, LSD1 saattaa olla tärkeä vaihtoehto kohde hoitoa. Epigeneettiset valvonta geenisäätelystä on nopeasti kehittyvä ala, jossa merkittäviä mahdollisuuksia, ja onkologian on todennäköisesti terapeuttista käyttöä, jossa nopein edistystä. Tähän mennessä, synteettiset estäjät klassisen histonideasetylaasi on laajalti käytetty biologisten välineitä epigeneettisiä tutkimuksia, ja jotkut ovat edenneet kliinisiin tutkimuksiin. Lisäksi kehittäminen histoni metyylitransferaasiestäjiä ja demetylaasientsyymin estäjien on viime aikoina raportoitu [21], [23]. Vuonna keuhkosyöpä, yli-ilmentyminen LSD1 pitäisi edistää geeni tukahduttaminen estää solujen kasvua ja pahanlaatuisten etenemisen, mutta missä on todellinen tarkoitus LSD1 edelleen tuntematon. Aiomme tutkia tätä tulevissa tutkimuksissa.

Yhteenvetona huomasimme, että LSD1 oli yli-ilmentynyt NSCLC potilaiden kautta aikaista loppuvaiheen syövän synnyn. LSD1 on läsnä tumassa ja edistää proliferaatiota, mahdollisesti sääntelyn monenlaisia ​​kromatiinin toimintoja. Samaan aikaan yli-ilmentyminen LSD1 edistetään kasvainsoluproliferaation, muuttoliike ja hyökkäystä. Lisävalidointia kanssa toiminta-analyysejä tämän proteiinin yhteydessä ihmisen syövän synnyn voi auttaa kehittää uusia terapeuttisia strategioita keuhkosyöpään.