Krooninen sairaus

tiivistelmä

molekyylitason mekanismit kordooma synnyssä ei tunneta. Siksi pyrittiin määrittämään uusia mutaatioita ymmärtää paremmin kordooma biologian ja mahdollisesti tunnistaa terapeuttisia kohteita. Ottaen huomioon suhteellisen korkeat kustannukset koko genomin sekvensointi, teimme kohdennettua geneettistä analyysiä käyttäen matrix-laserdesorptio /ionisaatio-lentoaika massaspektrometri (Sequenom iPLEX genotyypin). Testasimme 865 hotspot mutaatioita 111 onkogeenien ja valittujen tuumorisuppressorigeeneille (OncoMap v. 3.0) 45 ihmisen kordooma kasvainnäytteestä. Analysoiduista näytteistä, seitsemän havaittiin ainakin yksi mutaatio. Näistä kuusi oli peräisin Tuorenäytteissä, ja yksi oli peräisin parafiiniin näyte. Nämä havainnot validoitiin käyttäen riippumaton alustan avulla homogeeninen massa pidentää MALDI-TOF (Sequenom HME genotyypin määritys). Nämä geneettiset muutokset ovat: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A), kansallisten sääntelyviranomaisten (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), ja SMARCB1 (R40 *). Tämä tutkimus raportoi suurin kattavan mutaatioanalyysiin chordomas mennessä suoritetusta. Keskittyä mutaatiot, joilla on suurin mahdollisuus kliinistä merkitystä, testasimme vain onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille jotka on aiemmin sekaantuneet kasvainten synnyssä on yleisempää syöpäsairauksia. Havaitsimme harvinainen geneettinen muutoksista, jotka voivat olla toiminnallisia merkitys taustalla biologian ja mahdollisten terapeuttisia chordomas. Mutaatiot CDKN2A ja PTEN ilmennyt aloilla kromosomaalisen kopion menetystä. Kun tämä tieto on yhdistetty tutkimukset osoittavat 18 21 kordooma näytteiden näytetään kopio tappio lokukseen varten CDKN2A, 17 21 kordooma näytteiden näytetään kopio menetykseksi PTEN, ja 3 4 kordooma näytteiden näytetään häviämä SMARCB1 lokuksessa, voimme päätellä että heterotsygotian menetys näiden kolmen loci voi olla merkittävä rooli kordooma synnyssä.

Citation: Choy E, MacConaill LE, Cote GM, Le LP, Shen JK, Nielsen GP, ​​et al. (2014) genotyypin syöpään liittyvien geenien kordooma Tunnistaa Mutaatiot Onkogeenit ja alueet Kromosomi Loss Ottamalla CDKN2A, PTEN, ja SMARCB1. PLoS ONE 9 (7): e101283. doi: 10,1371 /journal.pone.0101283

Editor: Anette Duensing, University of Pittsburgh Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 lokakuu 2013; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2014; Julkaistu: 01 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Choy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tuettiin osittain Jennifer Hunter Yates Foundation, Stephan L. Harris kordooma Fund, Cassandra Moseley Berry sarkooma Endaumentin Fund, Gategno ja Wechsler rahastojen ja KL2 Medical Research tutkija Training (Merit) myönnetty avustus EY kautta Harvard Catalyst /Harvard Clinical and Translational Science Center (National Institutes of Health myöntää 1KL2RR025757-01), sekä rahoitusosuuksia Harvard University ja siihen sidoksissa akateemisen terveyskeskuksissa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: EY on saanut konsulttipalkkiot Amgeniltä, ​​Bayer, NPS, ja Pfizer. LG on konsultti Novartis ja Foundation Lääketiede ja oman pääoman haltija Foundation Medicine. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

kordooma on aggressiivinen ensisijainen pahanlaatuisen aksiaalisesta luuranko, joka on ajateltu olevan peräisin alkaen notochordal kudoksesta [1]. Suurin osa näistä kasvaimista esiintyy joko kallonpohjan (35%) tai ristiluun (50%), ja nämä ovat yleensä hallitaan leikkausta ja /tai säteily [2] – [10]. Niiden kliininen käytös leimaa hidas kasvu ja mieltymys toistua huolimatta kirurginen resektio. Useimmat potilaat, joilla on uusiutuva kordooma ja lähes kaikki potilaat metastasiaa kuolee tähän sairauteen [11], [12]. Valitettavasti ei ole olemassa tehokasta systeemistä agentti valvoa leikkaushoitoon tai metastasoitunut kordooma ja uusien hoitojen rajoittaa meidän huono ymmärrys ja sen biologia [12] – [15].

tunnistaminen kuljettajan mutaatioiden pahanlaatuisen , kuten EGFR-mutatoitunut keuhkosyövässä, c-Kit mutatoitu maha-suolikanavan strooman tuumorit, ja ALK-translokaatio kasvaimia, muun muassa, on dramaattisesti muuttunut hoidon maisema näihin sairauksiin [15] – [20]. Oletamme siis, että tyypillisesti solunsalpaajaresistentti kasvain kuten kordooma, joissa ei ole tehokasta systeemistä terapiaa, tunnistaminen mutaatioiden geenien joille on olemassa terapeuttista strategia voi ilmoittaa kehittämään uusia lääkkeitä. Kuitenkin, koska harvinaisuus potilaiden, joilla on kasvain, kokonaisvaltainen molekyylitason ymmärtäminen kordooma patogeneesi on tällä hetkellä epätäydellinen.

Karyotyyppi tutkimuksissa havaittu chordomas menetys kromosomissa 1p ja 3p ja voitot, joista kromosomien 7q, 20, 5q, ja 12q [21], [22]. Mobley et al. tunnistettu kohortin huonosti eriytetty chordomas että puuttuu SMARCB1 /INI1 ilmaisun [23]. Sytogeneettisellä käyttämällä FISH osoitti, että 3 4 näytettä oli poistetaan tässä lokuksessa. Gene sekvensointi ei paljastanut mitään pistemutaatioita. Äskettäin Le et al. suoritettiin vertaileva genominen hybridisaatio 21 kordooma kasvainnäytteestä näyttää usein menetys kromosomialueita 9p21 ja 10q23.3 [24]. He myös genotyyppi 56 pistemutaatioita esiintyvät 13 geenejä yleisesti liittyvät syöpään, mukaan lukien CDKN2A (sijaitsevat 9p21) ja PTEN (sijaitsee 10q23.3), mutta ei havainnut mitään muutoksia niiden kohortissa. Olemme pyrkineet laajentamaan näitä havaintoja analysoimalla 45 kordooma näytteissä suurikapasiteettisten genotyypitys syöpään liittyvien geenien tiedetään olevan tärkeä rooli syövän.

Methods

Ethics lausunto

Institutional Review board hyväksyntä saatiin takautuvasti tutkia näitä kasvain näytteet Partners Human tutkimuskomitea, 116 Huntington Avenue, Suite 1002, Boston, MA 02116. protokolla määrä on 2007P-002464. Institutionaalinen Review Board luopua tarvetta suostua. Kasvaimen näytteet saatiin kliinisestä arkistoista tohtori Francis Hornicek (Department of Orthopaedic Surgery, Massachusetts General Hospital) ja Massachusetts General Hospital Tissue Repository (https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id = 31).

kordooma kasvainnäytteestä

kasvaimen näytteet saatiin kliinisestä arkistoista tohtori Francis Hornicek (Department of Orthopaedic Surgery, Massachusetts General Hospital) ja Massachusetts General Hospital Tissue Repository ( https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id=31).

uuttaminen Genomisen DNA

uuttaminen DNA kordooma kasvainkudoksissa ja solulinjoja suoritettiin käyttäen QIAamp DNA Micro (Qiagen), kuten aikaisemmin on kuvattu ennen julkaisuissa [25]. Uutto suoritettiin valmistajan ohjeiden. DNA säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

valinta Cancer Gene mutaatioiden ja OncoMap v3 Pitoisuus malli

valinta syövän geenin mutaatioiden määrityksen suunnittelun ja massaspektrometrinen genotyypin suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25] – [27]. Useita tietokantoja, kuten Sanger-instituutin COSMIC tietokanta, PubMed, ja The Cancer Genome Atlas (TCGA), tiedusteltiin tunnettujen somaattisten onkogeeni ja tuumorisuppressorigeeniä mutaatioita. Mutaatiot rankattiin merkitys jonka taajuus syöpien ja eri syövän alatyyppejä, ja geenit olemassa olevien terapeuttisten määritteet olivat ensisijaisesti valittu.

Alukkeet PCR-monistamiseen ja laajennus koetin suunniteltiin käyttäen Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0 ja saatu DNA sekvenssit (1) epäili, että dbSNP tietokantaan välttää sisällyttämisen SNP aikana määrityksen suunnittelun, (2) vahvisti kautta BLAST kaltainen linjaus työkalu (BLAT) ja muutettu tarvittaessa välttää pseudogeenistä vahvistus [28], ja (3) syntetisoitiin muunneltua tavallisilla puhdistus (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA).

massaspektrometrisia genotyypin

Alukkeet ja koettimet yhdistettiin ja sitten validoitu kontrolli-DNA johdettu CEPH paneelista ihmisen HapMap DNA: iden ( Coriell Institute) sekä paneelin ihmisen solulinjoja, joiden tiedetään mutaatiostatuksesta asema, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Perimän DNA kvantifioitiin käyttäen Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia), alistetaan koko genomin vahvistus (WGA) käyttäen Qiagen Repli-g kit, ja post-WGA siivousvaiheen toteutettiin käyttäen Nucleofast Purification Kit (Macherey- Nagel). Massaspektrometrinen genotyypitys käyttämällä iPLEX kemiat suoritettiin aiemmin julkaistu [27].

Candidate mutaatiota edelleen suodatettu käsin lue ja valittu vahvistusta käytetään usean emäksen pidennyksestä homogeeninen massa-Extend (HME) kemiaa plexing on ≤ 6 määrityksissä per allas. Edellytykset HME validointi olivat yhdenmukaisia ​​niiden menetelmien kanssa, ovat kuvanneet MacConaill et al. 2009 [27].

Array Vertaileva Genomic hybridisaatio (CGH) Analysis

Array CGH käyttäen Agilent 4x180k CGH + SNP mikrosiru (Santa Clara, CA) on aiemmin kuvattu [24]. Kopioi numero aberration puhelujen tehtiin vähintään alueellinen absoluuttinen keskimääräinen log pohja 2 suhde 0,25 ja vähintään peräkkäisiä koetin lasken 5. Kaikkien array tietoja manuaalisesti tarkistetaan hienoisia muutoksia.

Tulokset

Ominaisuudet Kliininen kasvaimen näytteet

yhteensä 45 DNA-näytteet, jotka ovat peräisin 40 potilasta, joille oli tehty operatiivinen asemointia niiden kordooma. Potilaan päivämäärä leikkaus (DOS), ikä, sukupuoli, kasvaimen sijainti, toistuminen, ja etäpesäkkeitä on luetteloitu taulukossa 1. 28 yksilöitä saatiin tuore kudoksesta, ja 17 olivat peräisin FFPE lohkoja.

genotyypin ja CGH Analysis

Esimerkkejä massaspektrometrisia lukemat on esitetty kuviossa 1. mutaatio tulokset on luetteloitu rinnalla potilasryhmät taulukossa 1. tunnistetut mutaatiot ovat: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A) myös tiedossa kuten β-kateniinin, kansallisten sääntelyviranomaisten (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), ja SMARCB1 (R40 *).

PCR-tuotteet eroavat massa riippuen siitä, onko koetin laajennus havaitsee sytosiini (C) tai tymiini (T). Luku oikeaan näyttää massasp juoni alleelin vuonna SMARCB1 näytetään huipussaan sekä C ja T. vasemman paneelin mukaan useimmat testatuista näytteistä olivat homotsygoottisia C, ja 2 näytteet olivat heterotsygoottinen.

Niistä 28 juuri jäädytetty testatussa, 6 mutaatioita tunnistettiin. Niistä 17 FFPE testatussa, vain 1 mutaatio (in ALK) tunnistettiin. Samanlainen kuin meidän aiemmin raportoitu hinnat havaitsemaan samalla taajuudella mutaatioita kuin juuri jäädytetty ja parafiiniin osteosarkooma kasvainnäytteestä [25], ei näyttänyt olevan mitään eroa määrä mutaatioita näytteistä, jotka oli juuri jäädytetty verrattuna näytteitä FFPE valmistettu (Fisherin tarkka testi, p = 0,22 kaksi häntää). Kaksi näytettä (näytteet # 7 ja 8 taulukossa 1), joka on otettu samasta potilaasta eri anatomisia paikoissa ja kirurgiset päivämäärät, kaikilla oli samat mutaatiot molemmissa SMARCB1 ja CDKN2A. Kun teimme CGH analyysi näytteistä CDKN2A ja PTEN mutaatioita, havaitsimme kopioluvun tappiot vastaavat loci (kuvio 2), jotka osoittavat, että nämä mutaatiot tapahtunut alueilla kromosomaalisen menetys.

X-akseli mittaa sijainti pitkin kromosomi 9 (paneeli A) tai 10 (paneeli B). Y-akseli mittaa suhteellista koetin count. V: aCGH osoittaa heterozyogous kopio tappio CDKN2A; B: aCGH osoittaa heterozyogous kopio tappio PTEN.

Keskustelu

Chordomas on aiemmin kuvattu olevan kromosomimuutosten ja niille on ominaista kromosomi voitot ja tappiot eri alueiden läpi genomin [ ,,,0],21], [22], [24], [29]. Kattava genominlaajuisten kysely korkean tuoton mutaatioita ei ole vielä tehty kaikkialla suuri kokoelma chordomas. Array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) käytettiin analysoimaan 21 kordooma kasvainnäytteet [14], ja havaittiin suuri kopioluku tappiot, joista kromosomien 1p, 3, 4, 9, 10, 13, 14, ja 18 [24]. Tässä tutkimuksessa, joka on rajattu analyysi 11 syöpään liittyvien geenien ei havaittu uusia mutaatioita DNA-sekvenssin. Diaz et ai. suoritetaan koko genomin yhden emäksen monimuotoisuus mikrosiruanalyysi 21 clival kordooma näytteitä vahvistaa CGH havaintoja toisten että kromosomi 3 aneuploidian ja kromosomi 9p poisto tapahtuu (vaikkakin harvemmin kuin sacral chordomas) [29].

nykytekniikalla, koko genomin sekvensointi suuria kokoelmia chordomas on kallista ja työlästä. Niinpä pyrimme laajentamaan mutaatiostatuksesta näytöllä, kun keskitytään vain niitä geneettisiä muutoksia, jotka on aiemmin liitetty kuten tumorigenisis kuljettajat muissa elimissä yleisen tavoitteena on tunnistaa uusia mutaatioita, jotka voivat ohjata lisätutkimuksia kordooma terapeuttista löytö. Osa mutaatioista tunnistettu tässä tutkimuksessa ovat geenien tunnettuja roolinsa tuumorisuppressorien, kuten PTEN ja CDKN2A. Mielenkiintoista, molemmat näistä geeneistä sijaitsevat kromosomialueita, jotka todettiin usein olevan kopioluvun tappioita viime CGH erilaisia ​​analyysi (9p21 varten CDKN2A ja 10q23.3 varten PTEN) nopeudella 80% jokaista. Siksi teimme CGH näytteissä, jotka sisältävät mutaatioita PTEN ja CDKN2A ja löysi kromosomaalisen tappio kunkin lokuksen vastaavissa näytteissä. Mielenkiintoista, 33% näytteistä testattiin Le et al. kokoelma löytyy täydellinen menetys molempien kopioiden CDKN2A – sillä, että joko pistemutaation CDKN2A tai täydellisen kopion menetystä CDKN2A voi johtaa LOH tässä lokuksessa [24]. Siksi päätellä, että heterotsygoottisuuden menetys (LOH) näissä loci voi mahdollisesti olla kasvaimia tapahtuma kehittämiseen kordooma.

SMARCB1 on alayksikkö ATP-riippuvaiset chromatin remodeling kompleksin SWI /SNF, tehokas epigeneettiset kasvain vaimennin, joka suoraan antagonisoi histoni metyylitransferaasi EZH2. Mutaatiot SWI /SNF jäsenet katsotaan yhä useammin pahalaatuisuuksis- missä ne ovat nyt ajatellut joidenkin ryhmien olevan yleisempää kuin inaktivoivat mutaatiot p53 [30], [31]. SMARCB1 myös säätelee solusyklin aktivoimalla CDKN2A, ja sen menetys johtaa säätelyä EZH2 molekyyli, joka on suunnattu useita estäjiä, jotka ovat tällä hetkellä kliinisissä testeissä [32] – [34]. SMARCB1 tiedetään hajotettiin pahanlaatuisten rhabdoid kasvaimia, pyöreä solu pehmytkudoksen sarkoomat (useimmat olivat osajoukko kasvaimia muistuttavat extraskeletal myxoid kondrosarkooma kanssa rhabdoid ominaisuuksia, epithelioid sarkoomat, ja schwannomatosis [34] – [38].

Nämä kasvaimet, kuten chordomas, ovat ryhmiä harvinaisia ​​kasvainten, joille ei ole tehokasta hoitoa on tiedossa. Mobley et al. havaittiin, että huonosti eriytetty chordomas, ilmaus SMARCB1 puuttuu myös. He käyttivät FISH arvioimaan SMARCB1 lokuksen kromosomissa 22q ja löydetty poisto 3 4 näytteen [38]. siksi myös päätellä, että kun SMARCB1 mutaatiot samanaikaisesti alueilla kromosomi menetykset, heterotsygotian voi myös olla kasvaimia tapahtuma.

Useat mutaatioiden havaittu tutkimuksessamme , kuten ALK, PIK3CA, ja CTNNB1, kullakin inhibiittoreita, jotka ovat joko kaupallisesti saatavilla, kuten ALK estäjä XALKORI (crizotinib), tai on useita inhibiittorit parhaillaan aktiivinen kliinisen kehityksen [39] – [44]. Havainnot, kuten meidän ehdottaa kliininen hyöty suorittamaan genotyypin suunnattu kliinisessä tutkimuksessa kokeilla uusia estäjät tässä tautikantaa.

Yhteenvetona havaitsimme chordomas kanssa pistemutaatioiden tuumorisuppressorigeeneille alueilla usein kromosomi menetyksen ja oncogenes kanssa kaupallisesti saatavilla inhibiittorit. Entinen ehdottaa mahdollisia mekanismeja kordooma kasvaimien synnyn, jälkimmäinen viittaa mahdollisuuksia Uusien hoitomuotojen. Lisätutkimuksia on tehtävä, jotta voidaan luoda näiden geenien tärkeinä biomarkkereita tai maalien kordooma. Ihanteellinen tutkimus olisi täydellinen Genomikartoituksen ponnisteluilla paljon enemmän kordooma näytteitä. Toivomme, että tämä ensimmäinen merkki onnistuneesta genotyypitykseen suurin kokoelma ihmisen kordooma kasvainnäytteestä tasalla voivat sytyttää innostus jatkotutkinnan molekyyli patologian tämän sairauden, joka ei ole tällä hetkellä tehokasta lääkehoitoa.