Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että CXCR2 signalointi on ratkaisevaa syövän etenemisen, ja sen antagonisti SB225002 indusoi apoptoosin Wilmsin kasvainsolujen. Täällä, tutkimme vaikutus SB225002 solusyklin etenemisen ja apoptoosin induktio

in vitro

käyttäen CDDP-herkkä ja kestävä OVCA solulinjoissa erilaisilla p53: (villityyppi, mutantti tai null). Adenovirusinfektion villityyppisen p53 tai transfektoimalla p53 siRNA käytettiin yli-express tai knock-down p53. Solusyklin ja apoptoosin määritettiin virtaussytometrialla tai Hoechst värjäys ja havainnointi ydin- morfologia. Tuloksemme osoittivat, että SB225002 indusoi apoptoosia sekä villityypin että p53-puutteellinen munasarjasyöpä (OVCA) soluihin vaihtoehtoisia mekanismeja. SB225002 edistänyt mitoosi katastrofi, osoituksena kertymistä mitoosi solujen kara poikkeavuuksia, kromosomi mis-erottelu, moninapaista solunjakautumisen useita ytimiä, aneuploidiaa /polyploidiaa ja myöhemmin laaja apoptoosin. SB225002 aiheuttama mitoottisiin katastrofi vaikutti välittyvän alas-säätely tarkistuspiste kinaasin Chk1 ja CDK1-sykliini B aktivointia. Soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä p53: a (OV2008 ja C13 *), SB225002 lisääntynyt koko ja fosfo-Ser p53 tasoilla, ja p53 knock-down laski SB225002: n indusoiman apoptoosin, vaikuttamatta ennenaikaista mitoosin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SB225002 indusoi p53-riippuvaista apoptoosia, ja provosoi mitoottisten katastrofin p53-riippumattomalla tavalla p53 villityypin soluista. Liuottaminen villiin P53 in P53-null SKOV3 cell heikennettyä SB225002 aiheuttama mitoosi katastrofi, mikä viittaa p53 esti mitoosi katastrofin aiheuttama SB225002 p53-puutosta OVCA soluissa. Lopuksi, vaikutus SB225002 ei voida estää esikäsittelemällä CXCR2 ligandin tai sen neutraloiva vasta-aine. Esillä tutkimukset osoittavat ensimmäistä kertaa, että SB225002 on kaksi toimia OVCA soluissa, asiakkuutta klassinen apoptoosin kautta p53 aktivaation ja provosoi mitoottista katastrofin sekä p53 villityypin ja puutteellinen soluissa Chk1 esto ja Cdk aktivointi. Nämä havainnot esiin mahdollisuuden SB225002 uutena ehdokkaana molekyylin OVCA terapiassa riippumattomia p53 tilan.

Citation: Du M, Qiu Q, Gruslin A, Gordon J, hän M, Chan CC, et al. (2013) SB225002 Edistää Mitoottista luonnonkatastrofi Chemo-Sensitive ja kestävä munasarjasyöpäsoluja Riippumaton p53 tila

In vitro

. PLoS ONE 8 (1): e54572. doi: 10,1371 /journal.pone.0054572

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 15. lokakuuta, 2012 Hyväksytty: 12 joulukuu 2012; Julkaistu: 24 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat suuri kansainvälinen Joint Research Project of National Natural Science Foundation of China (30910103909 DJ Li), National ja Shanghai Johtava Academic Kuri Project (211XK22 ja DJL), Program Erinomainen Medical Academic Leader of Shanghai (ja DJL), ja kansalliset Natural Science Foundation of China (81070537 ja MRD), National Natural Science Foundation of China (31171437 ja MRD), ja Shanghai Pujiang Talent Program (10PJ1401600 ja MRD), ja avustusta Kanadan Institutes of Health Research (MOP-15691 ja BKT) ja World Class University (WCU) ohjelma kautta opetus-, tiede- ja teknologia Korean ja rahoittaa National Research Foundation of Korea (R31-10056 sen BKT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vaikka kahden kirjoittajien (Miao Hän ja Chi Chung Chan) ovat työntekijöitä yhtiö Wuxi AppTech Co., Ltd., tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Yhtiöllä ei ole koskevia ilmoituksia työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteita kuin ne liittyvät tämän hankkeen /käsikirjoitus. Muut kirjoittajat tämän käsikirjoituksen (Meirong Du, Qing Qiu, Andree Gruslin, John Gordon, Dajin Li ja Benjamin K. Tsang) ei ole taloudellisia tai muita etuja yrityksen ja ovat vahvistaneet ilmoitus, että heillä ei ole kilpailevia intressejä määrittelemien Plos ONE.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OVCA) on kaikkein kohtalokas gynekologinen maligniteetti, joka on turhautunut sekä lääkärit ja tutkijat useita vuosikymmeniä. Se on viides johtava syy syövän liittyvät kuolemat naisten, arvioitu 21990 hiljattain diagnosoitujen tapausten ja 15460 kuolemista tapahtuu Yhdysvalloissa vuonna 2011 (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html). Vaikka kemoterapia ja sytoreduktiivisen kirurgia hetkellä vakio menettelyistä OVCA hoitoon, kemiallis-vastus edelleen merkittävä syy kemoterapeuttisen vika. Erilaisia ​​mekanismeja ovat sekaantuneet varten chemoresistance, kuten muuttunut huumeiden kuljetus, parantaa DNA: n korjaukseen ja lisääntynyt sietokyky DNA-vaurioita [1], [2], [3]. Lisäksi nisäkkään soluilla monimutkaisia ​​soluvasteita genotoksinen stressi, mukaan lukien solusyklin tarkastuspiste, DNA: n korjaukseen ja apoptoosin, ja geenien aktivointi on kriittinen ensimmäinen askel aikana solun vasteena DNA-vauriolle. Vaikka adjuvanttihoitoa paklitakselin ja sisplatiinin saavuttaa kliinisen vasteen suuri osa tapauksissa systeeminen toksisuus rajoittaa huomattavasti hoidon mahdollisuus [4]. Siten tehokkaampi ja turvallinen hoitostrategioita tarvitaan pikaisesti kyseisen taudin torjumiseksi.

Apoptosis on ominaista morfologisesti solulimapanos- kutistuminen, kromatiinin kondensaatio ja ydinvoiman pirstoutumisen kanssa chromatinolysis [5], ja biokemiallisesti kaspaasin aktivaatio ja läpäiseväksi että ulomman mitokondriokalvon [6], [7], [8]. Mitoosi katastrofi on erikoistapaus apoptoosin, ja tapahtuu mitoosin yhdistelmä puutteellinen solusyklin tarkastuspisteitä ja soluvaurioita [9]. DNA-vaurioita aktivoi tarkistuspisteitä viivyttää solusyklin etenemisen. P53 säätelee G1 /S siirtymä (G1-tarkistuspisteen), kun taas CHK1 estää pääsyn DNA-vaurioituneet solut M-vaiheen (G2-tarkastuspisteiden). Kun kyseessä on chemoresistance, DNA aiheuttaman vaurion kemoterapia-aineiden ei pidättämään syöpäsoluja G1 vaiheessa ja edistämään apoptoosia johtuu pääasiassa puutteellinen p53 signalointi. Kuitenkin DNA-vaurioita voi aktivoida CHK1 reitissä aiheuttaa S- ja G2-tarkistuspisteitä pidätys [10], [11] ja helpottaa DNA korjaukseen ennen niiden mitoosin (M vaihe). Siksi on mahdollista, että aineet pystyvät indusoimaan tavanomaisen apoptoosin (kautta DNA-vaurioita ja P53 aktivointi), ja edistämällä mitoosi katastrofi (via CHK1 inaktivoinnissa ja kumoamisesta G /M pidätys) voi tarjota mahdollisesti uusia terapeuttisia etuja.

kemokiinit , superperheen pienen sytokiinin kaltaisia ​​proteiineja, ovat tunnettuja niiden keskeinen rooli sääntelyviranomaisten solumigraatiota, solujen välinen viestintä ja syövän etenemistä tarjoamalla sopiva kasvaimen mikroympäristön [12], [13], [14]. CXCR2, toiminnallinen reseptori ELR

+ kemokiinien, ekspressoidaan pääasiallisesti endoteelisoluissa, ja se on voimakas promoottori angiogeneesin kiinteiden syöpien. Todisteet osoittavat, että solutransformaatioon onkogeeninen ras indusoi korkeita ilmentymisen kaikkien CXCR2 ligandien, ja edistää useita kasvainten kehittymiseen. Vuonna OVCA, ELR

+ kemokiinit, kuten IL-8, GRO-1 ja ENA-78, ovat merkittävästi säädelty [15], [16], [17], [18]. Korkea GRO-1 indusoi vanhenemista fibroblastien ja edistää pahanlaatuisiin munasarjojen epiteelisolujen ja OVCA solujen kasvua [19] SB225002 [N- (2-hydroksi-4-nitrofenyyli) -N ’(2-bromifenyyli) urea ] uskotaan olevan tehokas, selektiivinen ei-peptidi-CXCR2-antagonistina inhiboimaan sekä IL-8 ja GRO-1 CXCR2 [20]. Vaikka SB225002 ensin kehitetty tulehdussairauksien [20], [21], viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että retrovirus infektioita, Wilmsin kasvain ja Alzheimerin tauti, saattavat olla mahdollisia terapeuttisia indikaatioita CXCR2-antagonisti [22], [23], [24 ]. SB225002 on raportoitu indusoivan apoptoosia Wilmsin kasvainsolujen, mutta taustalla oleva mekanismi on epäselvä [23].

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta SB225002 solusyklin etenemisen ja apoptoosin

in vitro

käyttäen CDDP-herkkä ja kestävä OVCA solulinjoissa erilaisilla p53: (villityyppi, mutantti tai null). Huomasimme, että SB225002, riippumaton CXCR2, aiheuttama klassinen apoptoosin aktivoitumisen kautta P53 ja provosoi mitoottista katastrofin sekä P53 villityypin ja vajaiden solujen kautta Checkpoint kinaasi 1 (Chk1) eston ja Cdk aktivointi. Sen lisäksi, että estovaikutuksen tuumorin angiogeneesin kautta CXCR2-välitteisen solun signaloinnin (Matsuo

et ai

., 2009), meidän tutkimus osoittaa, että SB225002 voisi olla mahdollisia terapeuttisia aineita solunsalpaajaresistentti OVCA kautta toimintaa solusyklin etenemisen ja apoptoosin riippumaton-reseptorivälitteisen signaloinnin.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) ja Hoechst 33258 hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). SB265610 ostettiin Tocris Bioscience (USA). SB225002 hankittiin Calbiochem (San Diego, CA, USA), pieni estävä RNA (siRNA) ja p53 olivat Cell Signaling Technology (Beverly, CA). Ohjaus siRNA oli peräisin Dharmacon inc. (Lafayette, CO, USA). Ribojuice siRNA transfektioreagenssia oli peräisin Novagen Inc. (San Diego, CA, USA). Ensisijainen vasta-aineita Western blot olivat kanin polyklonaalista anti-PARP, anti-fosfo-CHK1 (S345) ja fosfo-p53 (S15; Cell Signaling Technology), hiiren monoklonaalinen anti-CHK1, anti-kaspaasi 3, anti-fosfo-histoni H3 ( seriini 10), ja anti-p21

WAF1 /CIP1 (Cell Signaling Technology), anti-p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-IL-8 ja GRO-1 (R K-järjestelmä, Minneapolis, MN) ja anti-GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge, UK). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-aineet olivat Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Primaaristen vasta-aineiden immunosytokemiaa oli kanin polyklonaalinen Alexa Fluor® 488-konjugoitua anti-fosfo-histoni H3 (Ser 10; Cell Signaling Technology,) ja FITC-konjugoitua anti-β-tubuliinia (Clone TUB 2,1, Sigma). Monoklonaalinen anti-ihmisen CXCR2 -PE, ihmisen rekombinantti IL8 ja GRO1 olivat R Ambion). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin seuraavilla alukkeilla: GRO-1: F: TGCAGCTGTGTCTCTCTTTCCTCT ja R: AAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCC; IL-8: F: AGCCTTCCTGATTTCTGCAGCTCT ja R: AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG; CXCR2: F: AGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCA ja R: AGTGGAAGTGTGCCCTGAAGAAGA; F: GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT ja R: GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT GAPDH. Monistusreaktio suoritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green PCR kit. Lämpötilasyklit olosuhteet sisälsivät alkuperäisen denaturoinnin vaihe (95 ° C, 15 min) ja sen jälkeen PCR: llä (95 ° C: ssa 15 minuutin ajan, 50 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekuntia, 56 ° C: ssa 20 sekunnin ajan ja 72 ° 30 sekunnin ajan). PCR-tuotteet sulatetaan sen jälkeen 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja mRNA: n runsaus IL-8, GRO-1 ja CXCR2 ilmaistiin suhteessa GAPDH-arvot. Jokainen arvo verrattiin OV2008.

adenovirus Infektio, RNA häiriöt ja SB225002 hoito

SKOV3- solut infektoitiin adenovi- villityyppisen p53: n tai LacZ-ohjaus (MOI = 10) [25] . Kaksikymmentäneljä tuntia infektion jälkeen, solut käsiteltiin SB225002 (750 nM, 24 h tai 48 h). OV2008 ja C13 * solut transfektoitiin p53 siRNA (100 nmol /l; 36 h) tai hajotus- sekvenssin (kontrolli) [26], ja sitten käsiteltiin SB225002.

Western-analyysi

Western blotting suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25], [26]. Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (anti-p53 1: 10000, anti-fosfo-p53 (S15) 1:1,000, anti-CHK1 1: 1000, anti fosfo-CHK1 (S345) 1:1,000; anti-fosfo-CHK1 (S317) 1:1,000, anti-kaspaasi 3 1: 1000, anti-PARP, 1:1,000, anti-fosfo-Histone 3 (S10, 1:1,000), anti-GAPDH, 1:20,000) , jota seurasi inkubointi (RT, 1 h), piparjuuri peroxidase- konjugoidulla anti-kani tai anti-hiiri-vasta-ainetta (1:5,000). Peroksidaasin aktiivisuus visualisoitiin ECL-kitillä (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Tulokset skannattiin ja analysoitiin Scion Image ohjelmisto (Scion, Inc., Frederick, MD).

propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometria

Kelluva ja kiinnittyneet solu kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli. Ne käsiteltiin RNaasi A: lla ja inkuboitiin propidiumjodidilla (50 ug /ml; PI) ja analysoitiin Beckman Coulter FC500. Tunnistamiseksi mitoosi-soluja, soluja inkuboitiin (2 h, RT) ja anti-fosfo-histoni H3 (Alexa 488, 1:10, Cell Signaling) ja pestiin PBS: llä, ennen kuin PI-värjäyksellä. Havaitsemiseksi ilmentymisen CXCR2 ilmaisun OVCAs, solut otettiin talteen ja pestiin PBS: ssä, sitten heti värjättiin standardin immunofluoresenssimäärityksellä fykoerytriiniin (PE) konjugoidulla anti-ihmis-CXCR2 mAb tai PE-konjugoidulla anti-humaani-isotyyppiä-vasta-ainetta (BD Pharmingen). Prosentuaalinen CXCR2-positiivisten solujen määritettiin virtaussytometrialla.

Immunofluoresenssi

Solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin, blokattiin sitten 2% BSA: ta, jota seuraa inkubointi (yli yön, 4 ° C) FITC-konjugoidulla hiiren anti-beeta-tubuliinin (01:50) tai FITC-konjugoidun isotyypin IgG: tä (negatiivinen kontrolli). Pesun jälkeen, Hoechst tumaväriä (33258) lisättiin soluihin, jotka oli asennettu Vectashied (Vector, Burlingame, CA, USA). Florescence Kuvat otettiin vangiksi käyttämällä Leitz DMRX mikroskoopilla ja analysoitiin Adobe Photoshop 7,01 (Adobe, Ottawa, Kanada).

Kromosomi Levitä Pitoisuus

kromosomilevitteisiin valmistettiin käyttämällä vakioyhteyskäytäntöä [32] ; DNA värjättiin 0,1% SYTOX vihreä, ja kuvat saatiin Leitz DMRX mikroskoopilla.

arviointi Apoptosis

Liitteenä ja kelluvat solut suspensoitiin uudelleen neutraaliksi puskuroituun formaliiniin (4%), joka sisälsi Hoechst 33258 väriainetta (3,75 ng /ml, 24 h). Apoptoosiprosentti määritettiin ydin- morfologia. Ainakin 400 solut laskettiin kunkin ryhmän kanssa laskuri ”sokeita” näyte identiteetti välttämiseksi kokeellisen bias [25], [26].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tiedot analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA ja Bonferronin posttest käytettiin määrittämään tilastollinen ero koeryhmien välillä (PRISM-ohjelmiston versio 5.0, GraphPad, San Diego, CA). Tilastollinen merkittävyys päätellä P 0,05.

Tulokset

ilmentäminen CXCR2 ja sen ligandit IL-8 ja GRO-1 in CDDP-herkkä ja kestävä OVCA Cells

ensin tutkittiin mRNA ja proteiinipitoisuus CXCR2 ja sen ligandien IL-8 ja GRO-1 kaksi paria CDDP-herkkä ja kestävä OVCA solulinjoissa. Virtaussytometria osoitti, että CXCR2 oli positiivinen 9,08%, 5,87%, 6,66% ja 7,63% sekä OV2008, C13 *, A2780s ja A2780cp solut, vastaavasti, ja ei havaittu merkittävästi eroa solulinjoja. Samoin, ei ollut merkitsevää eroa CXCR2 mRNA runsaasti (Fig. 1A). Sitä vastoin, IL-8 oli pääasiassa ilmaistu OV2008 ja C13 * solulinjoissa, kun taas GRO-1 oli pääasiassa A2780s ja A2780cp solujen sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. IL-8 eritystä oli 5 kertaa suurempi C13 * kuin OV2008, kun taas GRO-1 eritys oli 5 kertaa suurempi A2780s kuin A2780cp soluissa (Fig. 1 B, 1 C).

V: CXCR2 mRNA ja proteiinin ilmentymistä chemosensitive OVCA soluissa (OV2008 A2780s) ja niiden kestävä vastine (C13 * A2780cp, vastaavasti) määritettiin qPCR (vasemmalla) ja virtaussytometria (oikealla, tummempi viiva isotyyppikontrollia, kevyempi linja edustaa CXCR2-värjäämällä solut). B C: mRNA runsaus ja proteiinin eritystä IL-8 (B) ja GRO-1 (C) [Western blot (ylempi) ja qPCR (alempi)]. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM kolmesta kokeesta. Edustavia kuvia FCM ja Western blot on esitetty.

SB225002 aiheuttaman apoptoosin ja Mitosis sekä CDDP-herkkä ja kestävä OVCA Cells

Voit selvittää, CXCR2 antagonisti SB225002 aiheuttaisi solu kuoleman sisplatiini-herkkä ja kestävä OVCA soluja, arvioimme apoptoosin morfologisesti in OV2008 /C13 * (sekä p53-villityypin) ja A2780s /A2780cp (p53-villityypin ja p53 mutantti, vastaavasti) solujen seuraavat SB225002 tai CDDP hoitoa 24 h. Kuten odotettua, CDDP aiheuttaman apoptoosin (ilmeistä sytoplasman kutistuminen, kromatiinin kondensaatio ja ydinvoiman pirstoutuminen) in kemiallis-herkkien solujen (OV2008 ja A2780s) mutta ei resistenttien solujen (C13 * ja A2780cp). Sen sijaan, SB225002 indusoitua apoptoosia kaikissa solulinjoissa pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 2A), Tätä havaintoa tukee kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen (Fig. 2B). Mielenkiintoista, ”kukka-like” solut, joissa on suurempia ja kondensoitumattomat kromosomit olivat ilmeisiä altistettaessa SB225002 (≥500 nM; Fig. 2C), joka liittyy lisääntynyt solun kerääntyminen G2 /M ja osa-G1 vaiheiden (Fig. 2D – ylempi). Useimmat kasvoi G2 /M vaiheessa väestö oli fosfo-histoni H3-positiivisia soluja (Kuva. 2D-low), mikä viittaa siihen, että SB225002 määrä nousee mitoosi solujen mahdollisesti joko edistämällä ennenaikainen mitoosin merkintä tai viivästyttää mitoosia poistua.

V: CDDP (0-10 uM, 24 h) indusoi apoptoosin kemiallis-herkkien OV2008 ja A2780s muttei niiden kestävä kollegansa C13 * ja A2780cp, kun taas SB225002 (0-1000 nM, 24 h) aiheuttaman apoptoosin kaikissa solussa linjat. OVCAs käsiteltiin eri pitoisuus SB225002 tai CDDP: ssa 24 tuntia. Liitteenä (elinkelpoinen) ja kelluva (apoptoottisten) solut yhdistettiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen neutraaliksi puskuroituun formaliiniin (4%), joka sisälsi Hoechst 33258 väriainetta (3,75 ng /ml, 24 h). Apoptoosiprosentti määritettiin perustuen ydin- morfologiaa. Ainakin 400 solut laskettiin kunkin ryhmän ja laskuri ”sokeita” näyte identiteetti välttämiseksi kokeellisen bias. B: SB225002 aiheuttama kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen (Western blot) kaikissa OVCA soluissa tutkittiin. C: SB225002 aiheuttama morfologisia ominaisuuksia apoptoosin OV2008, joka oli mukana mitoosin kaltaisia ​​soluja. D: Virtaussytometrinen analyysi solusyklin jakautumisen OV2008 jälkeen SB225002 hoidon eri pitoisuuksina (0, 250, 500, 750 ja 1000 nM) 24 tuntia. Solut M vaiheessa tunnistettiin anti-fosfo-histoni H3 (P-H3), kuten on esitetty piste tontit (alempi). Kuvat edustavat vähintään kolmen kokeen.

SB225002 aiheuttama apoptoosi Wild Type-P53 OVCA Solut kautta p53 Activation

P53 on välttämätöntä apoptoosin induktio OVCA soluissa, ja on tekijä CDDP herkkyys [25]. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, SB225002 (≥500 nM) merkitsevästi ajan säänneltyä yhteensä p53 ja fosfo-p53 (Ser15) kaikissa solulinjoissa tutkittu. Hiljentäminen p53 siRNA alassäädetty SB225002 aiheuttaman apoptoosin sekä OV2008 ja C13 * solut (Fig. 3B), mikä viittaa siihen, että SB225002 indusoi apoptoosin kautta aktivoimalla p53. Sen sijaan, määrä fosfo-histoni H3-positiivisia soluja ei vaikuttanut p53 siRNA (Fig. 3C), mikä viittaa siihen, rooli p53 on SB225002: n indusoiman apoptoosin ei ole riippuvainen mitoosissa kertymistä.

V: SB225002 (0-1000 nM, 24 h) kasvoi päätyen ja fosfo-p53 (S15) tasolla OV2008, C13 *, A2780s solut ja lisääntynyt fosfo-p53 A2780cp soluissa. SB225002 lisäsi fosfo-p53 /yhteensä-p53 suhteen kaikissa solulinjoissa (Western blot). B: vaimentaminen p53 [p53 siRNA (100 nM, 36 h, tai scramble siRNA (kontrolli)] laski SB225002 (750 nM, 24 h) aiheuttaman apoptoosin, mutta ei mitoosia OV2008 ja C13 * soluja. C: vaimentaminen p53 ei ollut vaikutusta solun numerot tekemästä mitoosia OV2008 ja C13 * solut käsiteltiin SD225002 750 nM. Cell mitoosissa tunnistettiin FCM, käyttäen anti-fosfo-histoni H3 (P-H3).

SB225005 aiheuttama kertyminen Pre-kypsä Mitosis ja jälkeen apoptoosi p53 villityypin ja puutteellinen OVCA Cells

Koska SB225002 aiheuttama mitoosia kertymistä sekä p53-villityypin ja puutteellinen OVCA soluja, me edelleen määrätietoisesti onko SB225002 indusoimaan mitoosissa kertyminen osaltaan apoptoosin. SB225002 hoito aiheutti ajasta riippuvan osuuden kasvu mitoosi-solujen (fosfo-histoni H3 positiivinen), joka alkoi 6 tuntia, lisäämällä ja kestää 24 tuntia, sitten laskee sen jälkeen. SB225002 aiheuttama myöhäinen lisäys solupopulaatiossa Saharan G1 vaihe (apoptoosin), joka alkaa klo 12 h ja korkeimmillaan 48 tuntia. Aikariippuvaisella tappio mitoosi soluissa 24 tunnin kuluttua altistuksen SB225002 liittyi huomattavasti enemmän apoptoottisia soluja, mikä viittaa siihen, että SB225002 aiheutti OV2008 solujen pidättämään mitoosissa ennen etenee kiinni apoptoosin (Fig. 4A).

V: Aika riippuva induktio mitoosin (täytetyt ympyrät) ja sen jälkeen apoptoosin (umpinaiset neliöt) in OV2008 soluissa SB225002. B: 24 h kuluttua SB225002 hoidon, mitoosi karan visualisoitiin Alexa Fluor® konjugoitu anti-α-tubuliinin (vihreä) ja vastavärjättiin Hoechst (sininen). Vuonna ohjaus soluissa, normaali kaksisuuntainen kara oli hyvin järjestetty erittäin kondensoidaan kromosomien linjassa päiväntasaajan levyt aikana meta-vaiheen ja sisko kromatidien erillisiä alkaessa Anaphase (B-1). SB225002-käsitellyt solut näytetään mitoottisen poikkeavuuksia. Taajuudet jäljessä kromosomaalisen materiaalin, moninapainen mitoottisen karat ja useita tumat olivat kaikki lisääntynyt SB225002-käsitellyissä soluissa (B-2, B-3). C: Kromosomi leviää osoittaa SB225002-aiheutti aneuploidiaa /polyploidiaa.

morfologia läpikäyvien solujen SB225002 aiheuttama mitoosin vahvistettiin lisäksi karan muodostumista, kromatiinin kondensaatio ja β-tubuliinia ja DNA erottaminen. Vuonna ohjaus soluissa, normaali kaksisuuntainen kara oli hyvin järjestetty soikean muotoinen, erittäin kondensoidaan kromosomien linjassa päiväntasaajan levyt aikana meta-vaiheen ja sisko kromatidien erillisiä alkaessa Anaphase. SB225002 lisääntynyt muodostuminen tietyntyyppisten moninapaista karat, kuten pseudobipolar, kolminapainen ja moninapainen soluja. Joko ei ollut kromosomin kondensaation aikana profaasissa, tai kondensoitu kromosomit eivät kohdista oikein pitkin päiväntasaajan levyjen aikana metafaasissa vaan levisi koko soluja. Cell syöttämällä Anaphase osoitti selvää kromosomi jäljessä, osoittaa epänormaali kromosomi eriytyminen SB-225002-pidätettiin mitoottisiin soluissa. SB225002 indusoi myös ulkonäkö useita ytimiä, mikä oli yleisempää pidentämällä valotusaikaa (Fig. 4B). Poikkeava mitoosin liittyi aneuploidiaa /polyploidiaa soluja, varmennettuna kromosomi levittämällä määrityksellä (Fig. 4C). Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että SB225002 aiheuttama epänormaali mitoosi karat, muuttunut kromosomi eriytymistä pidätettiin mitoosi soluissa, ja johti epänormaali solujen jakautumista ja muodostumista useita ytimiä, jotka kaikki olivat osoitus ennenaikainen mitoosia, tapahtuma lopulta johti mitoottisiin katastrofin.

SB225002 aiheuttama Mitoottista katastrofi on kautta Chk1 alassäätöä ja CDK1 Activation

DNA-vaurioita aiheuttaa Chk1 aktivaation, joka johtaa CDC25 hajoaminen laski CDK1 aktiivisuus ja G2 pidätys [10]. Olemme osoittaneet, että OVCA solut käsitelty SB225002 poistui G2 vaihe ja tuli M vaiheeseen, ja tehtiin ennenaikainen mitoosia, mikä viittaa siihen, G2 /M vaiheessa tarkastuspiste purkamista. Siksi me tutkimme, Chk1 inaktivoitumistehon CDK1 aktivaatio oli mukana SB225002 toimintaa. SB225002 vähentynyt koko ja fosfo-Chk1 (S345) tasot pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5A), mikä viittaa siihen, että edistäminen ennenaikaisen mitoosin tulon SB225002 liittyy Chk1 esto ja ennenaikaista CDK1 aktivointi. Tätä käsitystä tukee se havainto, että esikäsittely kanssa CDK1 estäjän roscovotine esti SB225002 aiheuttamaa mitoosissa keskittymisen ja apoptoosin (kuvio. 5B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että SB225002 kykenee edistämään apoptoosia mitoosi katastrofin todennäköisimmin kautta CDK1 aktivoitumisen.

V: SB225002 (0-1000 nM, 24 h) väheni koko ja fosfo-Chk1 (S317 ja S345 ) tasot OV2008 soluissa. B: esikäsittely OV2008 solujen roscovotine (12 h) heikennettyä SB225002 (750 nM, 24 h) aiheuttaman M vaihe kertymistä ja vähentää myöhempien apoptoosin. * P 0,05 (verrattuna SB225002 yksin).

ennastus Wild Type P53 in P53-null OVCA Cell vaimennettu SB225002 aiheuttama Mitoottista Katastrofi

Voit määrittää, onko p53 on osallisena SB225002-indusoidun mitoosi katastrofin, p53-null munasarjasyövän solulinja SKOV3 käsiteltiin SB225002. SB225002 aiheuttama pitoisuudesta riippuvaa mitoosissa keskittymisen ja apoptoosin SKOV3- soluissa (Kuva. 6A 6B). Kasvu apoptoosin oli ajasta riippuva ja ajallisesti liittyvät SB225002 aiheuttama mitoosin (Fig. 6 C), mikä viittaa siihen, että p53 on tarpeetonta SB225002 aiheuttama mitoottisiin katastrofi. Arvioitava edelleen toiminta p53 SB225002 aiheuttama mitoosi katastrofi, tutkimme jos käyttökuntoon villityyppisen p53 p53-vajaiden solujen voisi muuttua SB225002 aiheuttama mitoottisia keskittymisen ja apoptoosin. SKOV3- solut infektoitiin adenovi- villityyppisen p53: n (vahvistettiin Western blot, Fig. 6D). Kuten odotettua, altistuminen SB225002 yksin indusoi erityisesti mitoosia 24 h, ja ne on merkitty apoptoosin 48 tuntia. Liuottaminen villityyppisen p53 merkittävästi esti SB225002 aiheuttama mitoosin 24 h, ja heikennetty myöhemmin indusoiman apoptoosin SB225002 48 h (Fig. 6D, 6E). Apoptoosi vahvistettiin lisäksi PARP pilkkomalla 24 h Western blot (kuvio. 6D). Tuloksemme osoittavat, että p53 vaimentaa SB225002 aiheuttamaa myöhään apoptoosia estämällä ennenaikaisen kertyminen solujen mitoosin. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että p53: lla päinvastainen merkitys SB225002 aiheuttamaa apoptoosia OVCA solujen asiakkuutta klassinen apoptoosin kautta p53 aktivaation ja estää apoptoosin kautta mitoottisiin katastrofin.

V: SB225002 (0-1000 nM, 24 h) aiheuttama apoptoosin SKOV3- soluissa (ylempi). B: SB225002 lisääntynyt SKOV3 solujen Saharan G1 vaihe (apoptoottinen solu) ja mitoosin (fosfo-histoni H3-positiivisia; piste alat). C: Aika-aikana SB225002 aiheuttaman mitoosi (täytetyt ympyrät) ja apoptoottinen (umpinaiset neliöt) [virtaussytometria]. D E: Adenviral villityypin p53-infektion (MOI = 10, adenoviruksen LacZ tasaamiseksi yhteensä MOI kussakin koeryhmässä), joihin on SKOV3 heikennettyä SB225002 (750 nM; DMSO kontrollina) aiheuttama mitoosin ja sen jälkeen apoptoosin. p53 sisältö ja PARP pilkkominen arvioitiin 24 h (Western blot). Solusyklin etenemistä arvioitiin virtaussytometrialla. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM. * P≤0.05 (verrattuna DMSO-ohjaus).

# P≤0.05 (verrattuna SB225002 käsiteltyjä soluja).

SB225002 aiheuttamaa apoptoosia ja tuhoisa Mitosis ollut kautta Esto CXCR2 reseptorisignalointi

Koska SB225002 on erityinen ei-peptidi antagonistina CXCR2, me olivatko toiminnan SB225002 välittyy CXCR2. Ensin esikäsitelty OV2008 ja C13 solua, joilla on eri pitoisuudet IL-8: ssa 2 tuntia, ennen kuin viljelemällä niitä SB225002 (750 nM) vielä 24 tuntia. Yllättäen esikäsittely IL-8 tai GRO-1 epäonnistui estämään SB225002-indusoitua mitoosin tai apoptoosin (Fig. S1A), mikä osoittaa, että SB225002 aiheuttama mitoosia ja apoptoosia ei voi välittyä läpi CXCR2. Lisäksi esikäsittely solut CXCR2 neutraloivan vasta-aineen ja toisen antagonisti CXCR1 /CXCR2-G31P [33] ei ollut vaikutusta perustason tai SB225002: n indusoiman apoptoosin ja mitoosia OV2008 ja C13 * (Fig. S1B ja S1C). Lisäksi toinen spesifinen inhibiittori CXCR2, SB265610 ei ollut vaikutusta perustason ja SB225002: n indusoiman apoptoosin ja mitoottisen pidätys (Fig. S2A B & C) ja p53: n aktivointi ja Chk1 inhibition (Fig. S2D) in OV2008. Yhdessä nämä tulokset tukevat käsitystä, että SB225002 indusoi apoptoosia ja mitoottista katastrofin OVCA soluissa riippumattomia CXCR2.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että SB225002, ei-peptidi CXCR2-antagonisti, on tehokas indusoimaan apoptoosin tarkistuspiste interphases ja mitoosin sekä CDDP-herkkä ja kestävä OVCA solulinjoissa erilaisilla, p53 status. Hoito syöpäsolujen kanssa SB225002 johti p53-välitteisen klassisen apoptoosin mutta myös laukaisi mitoosi katastrofin p53 villin tyypin ja puutteellinen OVCA soluja. SB225002 aiheuttama mitoosi katastrofin edistämällä epänormaali mitoosi karat, muuttamalla kromosomi eriytymistä pidätettiin mitoosi soluissa, ja aiheutti epänormaali solujen jakautumista ja muodostumista useiden ytimien. Näiden muutosten kumottu roscovotine, mikä viittaa siihen, että sykliini B /CDK1 oli aktivoitu kautta alas-säätely tarkistuspiste kinaasin Chk1. Vaikutukset SB225002 ei moduloida esikäsittelemällä CXCR2 ligandeja tai sen neutraloivan vasta, eikä matkia muita CXCR2 antagonisti SB265610 tai G31P. Tutkimuksemme tarjoaa ensimmäinen osoitus siitä, SB225002 solukuolema ei vain tavanomaisia ​​apoptoosin, mutta myös mitoosi katastrofin kautta CXCR2-riippumattomalla tavalla.

tutkimus osoitti, että sekä p53 villityypin ja puutteellinen OVCA solut reagoivat SB225002 että apoptoosin induktion, vaikka erilaisten mekanismien kautta. P53 voi joko laukaista apoptoosin kautta aktivoinnin luontainen (mitokondrion) ja ulkoisen (kuolema-reseptori) apoptoottista reitin kautta genomista [33], [34] ja ei-genomista [27], [28] mekanismien.