Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset todisteet linkit poikkeava aktivaatio Hedgehog (Hh) signalointia patogeneesin useita syöpiä, kuten medulloblastoma, tyvisolusyöpä, pienisoluisen keuhkosyövän, haima-, eturauhas- ja munasarjojen. Tämä tutkimus suunniteltiin määrittämään, jos esto tämän reitin voi estää vakavien munasarjasyövän kasvua.

Menetelmät

Hyödynsimme

in vivo

pre-kliininen malli vakavien munasarjasyöpä luonnehtia anti-kasvain aktiivisuus Hh-reitin inhibiittorit syklopamiinia ja soveltaa kliinisesti johdannainen, IPI-926. Ensisijainen ihmisen serous munasarjojen kasvainkudoksessa käytettiin tuottamaan tuumoriksenografteja hiirillä, jotka myöhemmin hoidettiin syklopamiinilla tai IPI-926.

Keskeiset havainnot

Molemmat yhdisteet osoittivat merkittävää antituumorivaikutuksen yksittäisinä aineina . Kun IPI-926 käytettiin yhdessä paklitakselin kanssa ja karboplatiinia (T /C), ei synergistinen vaikutus havaittiin, joskin jatkuva hoito IPI-926 lopettamisen jälkeen T /C edelleen tukahduttaa kasvaimen kasvua. Hh-reitin aktiivisuus analysoitiin RT-PCR: llä muutosten arvioimiseksi

Gli1

transkriptin tasolla. Kerta-annos IPI-926 esti hiiri strooman

Gli1

transkriptipitoisuuksissa 24 tuntia ennallaan ihmisen sisäisten kasvainten

Gli1

tasoilla. Krooninen IPI-926 terapiaa 21 päivän kuitenkin esti Hh signalointi sekä hiiren strooman ja ihmisen kasvainsoluissa. Expression tietoja mikro-leikeltiin strooman ihmisen serous munasarjakasvaimia varmisti

Gli1

transkriptio ja merkittävä yhdistyksen välillä koholla

Gli1

transkriptipitoisuuksissa ja huonontunut selviytymistä.

johtopäätökset /merkitys

IPI-926 käsittely estää vakavien kasvaimen kasvua viittaa Hh-signalointireitin myötävaikuttaa patogeneesiin munasarjasyöpä ja voivat olla lupaavia uutena terapeuttisena kohteena, erityisesti huollon ympäristössä.

Citation: McCann CK, Growdon WB, Kulkarni-Datar K, Curley MD, Friel AM, Proctor JL, et al. (2011) esto Hedgehog Signaling antagonisoi seroosit munasarjasyöpä kasvu Primary ksenograftimallissa. PLoS ONE 6 (11): e28077. doi: 10,1371 /journal.pone.0028077

Editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 31 lokakuu 2011; Julkaistu: 29 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 McCann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat avustusta Munasarjojen Cancer Research Fund (BRR), Advanced Medical Research Foundation (BRR), ja Vincent Memorial Research Funds (BRR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Jennifer L. Proctor, Hana Sheikh, Igor Deyneko, Jeanne A. Ferguson, ja John R. MacDougall ovat työntekijöitä Infinity Pharmaceuticals. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kun Yhdysvallat, munasarjasyöpä arvioidaan vaivaamaan noin 22000 naista ja aiheuttavat lähes 14000 kuolemantapausta vuosittain. Elinikä riski sairastua munasarjasyöpään on 1 70, ja se on viidenneksi tappava syöpä naisilla [1]. Useimmat munasarjasyöpä potilailla esiintyy myöhäisvaiheen sairaus, joka on käsitelty kirurgisia debulking ja platinaa kemoterapian. Vaikka 70-80% naisista saavuttaa täydellisen kliinisen vasteen, joka on suurin osa potilaista kehittyy uusiutuva sairaus, joka on usein solunsalpaajaresistentti. Novel hoito lähestymisiä käyttäen tavanomaisia ​​sytotoksisia hoitoja yhdistettynä molecularly kohdennettuja hoitomuotojen kohdistuu erityisiä signalointireitteihin tarvitaan kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen mahdollisesti olla lupaava strategioita kestävä hoito primääristen ja uusiutuvien munasarjasyöpä [2].

The Hedgehog (Hh) signaalinvälitysreitin käsittää perheen hyvin säilyneitä proteiineja, jotka pääasiassa toimivat alkionkehityksen aikana säätelemään kantasolujen kohtalo ja organogeneesiin, ja edistää proliferaatiota, uudistumista ja erilaistumista somaattisten kudosten aikuisten [3]. Patched 1 (Ptch1), kalvoreseptori, yleensä estää membraaniproteiini smoothened (Smo) aktivoimasta Gli1. Sitoutumisen Hh ligandin (Sonic, Indian ja Desert) ja Ptch1 kumoaa sen tukahduttavaa vaikutusta SMO mahdollistaa translokaation Gli1 tumaan, jossa se indusoi kohdegeenien [4], [5]. Poikkeava aktivaatio Hh-reitin aikuisiän on liittynyt kehittämiseen pahanlaatuisen muutoksen eri ihmisen syövissä [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11] , [12]. Lisäksi kasvaimen aloittamista solujen joidenkin syöpien on osoitettu olevan riippuvaisia ​​yllä Hh indusoitu signaali ja sen jälkeen aktivointi Gli1 tuloksena ligandia yli-ilmentyminen tai mutaatiokaavojen aktivaatio Hh-reitin [6], [13]. Hoito-ohjelmat Hh-reitin antagonisteja yhdistelmänä tavanomaisten molekyyli- ja sytotoksisten hoitojen ovat osoittaneet

in vitro

ja

in vivo

tehoavan lisääntymistä medulloblastoma, tyvisolusyöpä, rinta-, pienisoluisen keuhkosyövän, eturauhasen ja haimasyöpä mallit [10], [11], [12], [14], [15], [16], [17]. Nämä antagonistit ovat tällä hetkellä faasin I ja faasin II kliinisissä kokeissa.

Aktivointi Hh-reitin on dokumentoitu munasarjasyövän mahdollisena mekanismi mukana neoplasia. Muunnetun geenin ja proteiinin ilmentymistä Hh-reitin jäsenet Gli1, SMO, Ptch1, Desert hedgehog (Dhh) ja Sonic Hedgehog (Shh) munasarjasyövän on raportoitu, vaikka tarkkaa esiintyvyyttä ja kuvio on vielä selvittämättä [18], [19 ], [20], [21]. Vaikka monet tutkimukset viittaavat siihen, että 50-60% invasiivisista munasarjakasvaimia ilmeinen Hh-reitin aktivaatio, muut tutkijat ovat väittäneet, että mielekäs aktivointi muuttunut ilmentyminen useiden reitin proteiinien tapahtuu alle 20% kliinisistä näytteistä testattiin [19], [20]. Vaikka suoraa korrelaatiota ilmentymisen Dhh ja kliiniseen vaiheeseen, histologiset alatyypin tai eloonjääminen on raportoitu, on tällä hetkellä epäselvää ilmentymisen Dhh ligandi liittyy pienentynyt selviytymisen [20]. Muut analyysit munasarjasyövän näytteistä ovat osoittaneet, että kohonnut Gli1 proteiinin ilmentyminen on itsenäinen tekijä liittyy vähentynyt selviytymisen säädettäessä iän, vaiheen, laatu ja histologinen tyyppi [18].

In vitro

ja rajoitettu

in vivo

tutkimukset antavat viitteitä siitä, että Hh-signalointireitin tärkeä rooli munasarjasyövän solujen lisääntymisen. Shh havaittiin useissa munasarjasyövän solulinjoissa ja lisäksi monoklonaalista vasta-ainetta vastaan, shh johti annosriippuvainen väheneminen solujen lisääntymisen [21]. Vastaavasti hoito viljeltyjen munasarjasyöpäsoluja kanssa Smo inhibiittorin syklopamiinilla on havaittu indusoivan solusyklin pysähtymisen G1: ssä ja edistää apoptoosia [20]. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen Gli1 vuonna munasarjasyöpäsoluja lisännyt solujen lisääntymisen, liikkuvuus ja invasiivisia ominaisuuksia [18]. Munasarjasyöpäsolulin- linja peräisin ksenografteissa ovat myös alttiita Hh-reitin estäminen koska niiden kasvu selvästi heikentynyt hoidon jälkeen syklopamiinilla [21]. Suurin osa käytettävissä olevat tiedot osoittavat, että aktivoitu Hh signalointikaskadissa, voi olla mahdollinen kuljettaja kasvainten merkittävä osa munasarjan epiteelin syövät joten se on houkutteleva kohde terapeuttisten inhibition.

ovat tutkineet tätä mahdollisuutta käyttää Hh estäjää IPI-926, johdannainen syklopamiinin lisääntyneeseen oraalinen hyötyosuus ja pidempi puoliintumisaika [22]. IPI-926 antagonisoi Hh-reitin estämällä Smo. IPI-926 indusoi annoksesta riippuvainen väheneminen

Gli1

mRNA ilmaisun ja kestävä kasvaimen remission hiiren medulloblastoma malli [22]. Vaikka IPI-926 ei ollut vaikutusta ainoana lääkkeenä hiirimallissa pienisoluisen keuhkosyövän ennen kemoterapiaa, käsiteltyjen eläinten IPI-926 kemoterapian jälkeen osoittivat dramaattisen esto kasvaimen uudelleen kasvua [22]. Näiden prekliinisiä tietoja, etsimme onko esto Hh-reitin syklopamiinilla tai IPI-926 vaikuttanut kasvuun ihmisen papillaarisen vakavien munasarjasyöpä ksenograftien johdetut ihmisen kudoksesta saatu aikaan alkuperäisen leikkauksen. Sitten arvioitiin kasvaimen vastainen aktiivisuus IPI-926 meidän ksenograftimallia yhdessä paklitakselin ja karboplatiini ja monoterapiana ylläpitohoito. Lopuksi vaikutus kerta-annoksen ja pitkäaikainen IPI-926 käsittely Hh-reitin aktiivisuus määritettiin sekä strooman ja kasvainsolupopulaatioissa. Meidän tulokset tukevat hypoteesia, että Hh-signalointireitin myötävaikuttaa patogeneesiin vakavien munasarjasyövän ja estävät tämän reitin voi olla terapeuttista hyötyä.

Materiaalit ja menetelmät

immunohistokemiallinen analyysi

munasarjasyöpäsolu kudos microarray (T8235725, BioChain, Hayward, CA), joka sisältää 64 munasarjojen hyvän- ja pahanlaatuisten ihmisen kasvaimissa käytettiin immunohistokemiallista analyysiä Shh proteiinin ilmentymisen. Antigeeni haku toteutettiin sitraatti- tavoite haku puskuriin käyttäen painekattilaa 40 minuuttia ja kohdat käsiteltiin 3% vetyperoksidilla ja inkuboitiin Tausta Sniper (Biocaren, Concord, CA) estämään epäspesifisen sitoutumisen. Inkubointi osioista anti-Shh monoklonaalinen vasta ab53281 (Abcam, Cambridge, MA) laimennettuna 1:2000 in DaVinci Green laimentimessa (Biocare Medical, Concord, CA) suoritettiin huoneenlämpötilassa 90 minuuttia. Sitten leikkeitä inkuboitiin kani jyrsijä laattisysteemiä (Biocare Medical, Concord, CA) 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Objektilasit käsiteltiin sitten 3, 3′-diaminobentsidiiniä kromogeenina (DAB) 5 minuutin visualisointiin. Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Yhteensä kani IgG korvata ensisijaisen vasta toimi negatiivisena kontrollina.

Kasvaimen keräämisen ja eteneminen

in vivo

Liika ihmisen kasvaimen tai askites näytteet saatiin läpi IRB hyväksytty keskitetty pankki infrastruktuuri Massachusetts General Hospital (MGH). Kirjallinen suostumus vastaanotetaan kaikille osallistujille. Ei ollut näytteitä peräisin alaikäisten tässä tutkimuksessa. MGH Gyn kudos arkistoon protokolla (07-049) tarkasteli ja hyväksynyt Dana-Farber Harvard Cancer Center (DFHCC). Lisäksi käytimme arkistoituja näytteitä peräisin MGH patologian alle institutionaalinen hyväksytty protokolla (2008P001695).

Yksisolususpensiot joko entsymaattisesti jalostetut kiinteät kasvainkudoksen tai askites Sitten köyhdytettyä hematologisen komponenttien kuvatulla [23]. Tietty määrä soluja suspendoitiin PBS:Matrigel® (01:01) ja ihon alle (s.c.) osaksi 6-8 viikkoa vanha nainen NOD /SCID-hiiriin (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Eläimiä seurattiin säännöllisesti määrittämään kasvaimen muodostumisen ja lopetettiin, kun ne tulivat kuolemaisillaan tai liiallisesta kasvaintaakkaa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Massachusetts General Hospital Sub-tutkimusta ja Animal Care (protokolla numero 2005N000273). Jokainen pyritty minimoimaan kärsimystä.

edelleen eteneminen hiirissä ksenograftikasvaimissa leikattiin irti ja entsymaattisesti käsitelty yksisolususpension. Suspensio köyhdytettyä hiiren H-2K

d + soluihin käyttämällä MACS-helmiä (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Saksa) ja loput tuumorista peräisin solua uudelleen ihonalaisesti uusi vastaanottaja NOD /SCID-hiiriin. Kaikki keskeiset ihmisen papillaarisen serous munasarjakasvaimia Tässä tutkimuksessa käytettiin oli tehty 4-5 kohtiin

in vivo

ja vakavien histologia kunkin säilyi koko sarjasiirteillä prosessi. Eläimiä pidettiin ja ylläpidetään vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti.

Hiirten käsittely Hh-reitin estäjiä

Syklopamiini.

Hiiret laakeri täsmäsi kokoinen kasvain (300-600 mm

3) ihmisen vakavien munasarjasyöpä näytteen SOC11 satunnaistettiin kahteen ryhmään kuusi hiirtä. Kunkin kohortin saivat joko 25 mg /kg syklopamiini tai vehikkeliä (30% (w /v) 2-hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä (HPBCD) 0,1 M natriumsitraatti, pH 3,0), päivittäin suun kautta letkulla. Hoitojakso kesti 13 päivää. Kasvainmittaukset ja eläinten painot arvioitiin 4 päivän välein. Kasvaimet mitattiin viikoittain jarrusatulat ja kasvaimen tilavuus (mm

3) määritettiin käyttäen kaavaa [pituus (mm) x leveys (mm) x leveys (mm)] /2. Hiiren painot arvioitiin välein 4-7 päivän tarkkailemaan mahdollisia toksisuuden liittyvät kunkin hoidon. Lopussa hoidon aikana eläimet lopetettiin, ja kasvaimet kerättiin tarkempaa analysointia varten.

IPI-926:

Kaksikymmentäneljä hiirillä, SOC12, SOC13 tai SOC14 ksenograftikasvaimissa satunnaistettiin neljään ikäluokat Hyväksytty kasvainten (300-600 mm

3). Paklitakseli /karboplatiini (T /C) yksin kohortin sai viikossa intraperitoneaalisesti (ip) injektion 15 mg /kg paklitakselia ja 50 mg /kg karboplatiinia ja IPI-926 ajoneuvon 5% (w /v) (HPBCD) annettuna joka toinen päivä letkulla suun kautta. IPI-926 yksin kohortti saivat 40 mg /kg IPI-926 joka toinen päivä letkulla suun kautta ja Cremophor:ethanol (01:01, paklitakseli ajoneuvo) ja suolaliuoksella (karboplatiini ajoneuvo) viikoittain i.p. injektio. Hiiret, T /C + IPI-926 kohortti sai viikoittain paklitakselin (15 mg /kg, i.p.) ja karboplatiini (50 mg /kg, i.p.) ja 40 mg /kg IPI-926 (joka toinen päivä, suun kautta letkulla). Ohjaus kohortti saivat paklitakselia, karboplatiini ja IPI-926 ajoneuvojen Annosteluaikataulun sopivat kullekin. Tuumoritilavuudet ja hiiri painot arvioitiin välein 4-7 päivää edellä kuvatulla tavalla.

viimeinen annos T /C kohortti annettiin 14. päivänä 21 päivän kuluttua hiiret kontrolliryhmässä ja IPI-926 yksin kohortteja tapettiin ja niiden kasvaimet kerättiin. Kustakin kasvaimen jäädytettiin nopeasti RNA-analyysiä varten ja parafiiniin histologista analyysiä.

päättymisen jälkeen T /C hoitoa, hiiret T /C yksin ja T /C + IPI-926 ikäryhmät jatkoivat saamaan joko IPI-926 ajoneuvoa (T /C yksin ryhmä) tai 40 mg /kg IPI-926 (T /C + IPI-926 ryhmä) joka toinen päivä letkulla suun kautta. Tämä huolto käsittely suoritettiin 18-30 päivää. Lopussa Pitoajanjakson eläimet tapettiin ja kasvaimet kerättiin ja käsiteltiin RNA ja histologiset analyysit edellä kuvatulla tavalla.

Akuutti IPI-926 käsittely

Hiiret kätkeminen ksenografteja (300-600 m

3) peräisin SOC12, SOC13 tai SOC14 hoidettiin joko 40 mg /kg IPI-926 tai IPI-926 ajoneuvoa letkulla suun kautta. 24 tunnin kuluttua eläimet lopetettiin. Kasvaimet kerättiin ja Kustakin jäädytettiin nopeasti RNA-analyysiä varten ja upotettiin parafiiniin.

RT-PCR-analyysi

RNA eristettiin jäädytetyistä kasvainkudoksen käyttäen GenElute ™ nisäkkään RNA Kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) seuraten valmistajan ohjeita. Kaksi mikrogrammaa eristetyn RNA: ta käytettiin cDNA: n syntetisoimiseksi käyttämällä Invitrogen Superscript ™ Vilo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alukkeita ja koettimia hiiri

Gli1

hankittiin Applied Biosystems Inc. (Carlsbad, CA, luettelonumero Mm00494645_m1). Alukkeiden ja koettimien ihmisen

Gli1

suunniteltiin in-house: eteenpäin: 5′-CTTTCATCAACTCGCGATGC-3 ’; reverse: 5’-GCTCATGGTGCCAATGGAG-3 ’; koetin: 5’FAM-CATCTCCAGGAGGCTCCTACGGTCA TC TAMRA-3 ’. Alukkeet suunniteltiin ulottumaan eksoni-eksoniliitokset estää havaitsemiseen genomista DNA: ta. Ilmentymisen tasot ihmisen ja hiiren

Gli1

geenejä normalisoitiin GAPDH ja kvantitoitiin kuten on kuvattu julkaisussa Applied Biosystems Inc.

Lisäksi

Gli1

mRNA, olemme analysoineet

SHH

,

SMO

,

ja Ptch1

mRNA-tasot on 4 potilaan näytteitä käytetään tuottamaan kasvaimen eksplantaatteja testaamiseksi inhibition Hhog kautta. Alukkeiden ja koettimien ihmisen

SHH

(luettelonumero Hs00179843_m1),

SMO

(luettelonumero Hs00170665_m1), ja

Ptch1

(luettelonumero Hs00970980_m1) hankittiin Applied Biosystems Inc . (Carlsbad, CA).

ekspressiotasot ihmisen

SHH

,

SMO

,

ja Ptch1

geenit normalisoitiin GAPDH ja määrällisesti kuten on kuvannut Applied Biosystems Inc.

Analyysi

Gli1

ilmentymistä ihmisen munasarjakasvain strooman

korkea-asteen myöhäisvaiheen serous primääri munasarjojen kasvaimia näytteet saatiin ennen kemoterapiaa 19 munasarjasyöpä potilasta sairaalahoitoon Brigham ja naisten sairaala vuosien 1990 ja 2000 Luokittelu määritettiin mukaan International Federation of Gynecology and Obstetrics standardeja. Kaikki näytteet ja niiden vastaavat kliiniset tiedot saatiin alle IRB-hyväksyttyjen käytäntöjen. Mikrodissektion ja RNA: n eristys suoritettiin kuten on aiemmin kuvattu [24]. Lyhyesti, fibroblasteista 7 um jääleikkeitä microdissected käyttämällä MD LMD laser microdissecting mikroskooppi (Leica, Wetzlar, Saksa) ja hajotetaan RLT hajotuspuskuria (Qiagen, Valencia, CA). RNA uutettiin ja puhdistettiin käyttäen RNeasy Micro-kittiä (Qiagen, Valencia, CA). Kokonais-RNA näytteet määrällisesti ja laatu tarkastetaan kanssa Bioanalyzer 2100 järjestelmä (Agilent, Palo Alto, CA) ja monistettiin sitten kuten aiemmin on kuvattu [24]. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qRT-PCR) suoritettiin 50 ng kaksinkertaisen monistettu tuote pois 19 yksilöt käyttäen alukesarjoja spesifisiä

Gli1

(eteenpäin ACCCCCTGGACTCTCTTGAT, reverse GACACTCATGTTGCCCACAG). ICycler iQ Reaaliaikainen PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) käytettiin yhdessä SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

tilastollinen analyysi

Ei-parametriset Wilcoxan rank sum testit parittomia näytteitä käytettiin vertaamaan kasvainten kokojen syklopamiinilla ja IPI-926 Hoitokokeissa. Studentin t-testejä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi saatujen tulosten IPI-926 akuutti ja pitkäaikainen hoito kokeilu. Merkitys asetettiin p≤0.05. STATA (College Station, TX) v10 ohjelmistoa käytettiin. Selviytyminen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism versio 5.00 Windowsille (GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA).

Tulokset

Shh ja Gli1 ilmentymistä ihmisen munasarjan kasvaimissa

Viimeaikaiset tutkimukset ovat korostaneet roolia Hh-signalointireitin in kehittymistä ja etenemistä kiinteiden kasvainten [25]. Olemme arvioineet suhteellinen ekspressio Hh-reitin jäsenet Shh ja Gli1 alaryhmässä munasarjojen kasvaimia. Kuten kuviossa 1A on esitetty, immuohistochemical analyysi Shh ekspression kudoksen microarray käsittää hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia kasvaimia määritettiin, että 47%: n arvioidaan pahanlaatuisten munasarjan epiteelin kasvaimissa oli havaittavissa Shh ilmentymisen. Vertailun Shh ekspressiota havaittiin vain 1 5 ei-munasarjan epiteelin kasvaimissa. Osoituksena esimerkit on esitetty kuviossa 1A, tason ja jakelu Shh ilmaisun vaihteli analysoitiin kasvaimia. Sitten tarkasteltiin ilmentymisen

Gli1

mRNA yksittäisten primaaristen ihmisen papillaarinen vakavien munasarjojen kasvaimia SOC1-SOC10 (katso taulukko S1 potilaan tiedot) RT-PCR: llä. Olemme havainneet laajan valikoiman

Gli1

mRNA: n ekspressio kaikkialla analysoitiin kasvaimia (kuvio 1 B). Lisäksi olemme analysoineet

SHH

,

SMO

,

Ptch1

,

ja Gli1

mRNA tasoilla 4 yksittäisen potilaan näytteitä käytimme tuottamaan kasvain ksenografteissa analysoimiseksi vaikutuksen Hh-reitin estoa munasarjakasvain kasvuun

in vivo

(kuva 2). Kussakin kasvainten,

Gli1

ja

SMO

oli runsaammin ilmaistu suhteessa

Ptch1

. Ei ollut juurikaan ole

SHH

mRNA: näistä näytteistä. Yhdessä nämä ilmentymisen analyysit viittaavat siihen, että Hh-signalointireitin aktivoidaan osajoukko ihmisen munasarjan kasvaimissa, kuten aiemmin on raportoitu.

. Immunohistokemiallinen analyysi Shh ilmaisun suoritettiin kudoksen microarray kuljettaa 64 yksittäisten primääri munasarjojen kasvaimia arvioida sekä taajuuden ja tason Shh ilmentymistä ihmisen munasarjasyöpä. SHH värjäytyminen huonosti eriytetty vakavien kystadenokarsinooma (ylempi vasen paneeli), huonosti eriytetty mucinous kystadenokarsinooma (ylempi oikea paneeli), joka on hyvin erilaistunut kystadenokarsinooma (alempi vasen paneeli), ja huonosti eriytetty adenokarsinooma (alempi oikea paneeli) näytetään. Taulukossa on yhteenveto taajuus Shh värjäytymistä hyvänlaatuiset kasvaimet ja ei-epiteelin ja epiteelin pahanlaatuisia kasvaimia läsnä munasarjakasvain mikrosirulla. B. Reaaliaikainen Q-PCR suoritettiin analyysi

Gli1

mRNA tasot 10 ensisijainen ihmisen papillaarisen serous munasarjasyöpä kasvaimia. Spesifisiä alukkeita ihmisen

Gli1

ja

GAPDH

käytettiin. Kunkin näytteen taso

Gli1

mRNA suhteessa tasoon

GAPDH

mRNA on esitetty.

ilmentyminen

Gli1

Ptch1

,

SHH

ja

SMO

analysoitiin RT-qPCR 4 ensisijainen ihmisen vakavien munasarjakasvaimia (SOC11-SOC14) perustettiin vierassiirrännäiset NOD /SCID-hiiriin . Spesifisiä alukkeita kunkin ihmisen geeniä ja ihmisen

GADPH

käytettiin. Kunkin kasvaimen tasot kunkin geenin suhteen

GADPH

mRNA on esitetty.

inhibitio Hh signaloinnin estää kasvua ihmisen vakavien munasarjojen tuumoriksenografteja

arvioida toiminnallista merkitystä Hh-reitin etenemisen munasarjasyöpä, käsittelimme hiiret kätkeminen ihmisen serous munasarjojen tuumoriksenografteja syntyvät platinaa herkkä kasvain SOC11 kanssa joko Hh estäjää syklopamiinia tai ajoneuvon ja arvioidaan säännöllisesti vaikutus jokaisen hoidon kasvaimen tilavuus. Syklopamiinilla hoidetuissa hiirissä, kasvaimen kasvu oli poissuljettu yli kolmetoista vuorokauden ajan tuloksena huomattavasti (p 0,004) väheni tuumorin tilavuus päivänä 13 verrattuna, että havaittu vehikkelillä käsiteltyihin eläimiin (kuvio 3). Vähäinen myrkyllisyys havaittiin syklopamiinilla hoidettujen eläinten kanssa ei havaittu tilastollisesti erilaisia ​​muutoksia hiiren painoa (kuva S1).

Hiiret, joilla on ihmisen papillaarisen serous munasarjojen tuumoriksenografteja näytteestä SOC11 satunnaistettiin 2 ikäluokat Hyväksytty kasvainten ja käsitellyn joko ajoneuvon tai syklopamiinihoidon. Kasvaintilavuudet arvioidaan säännöllisesti. Muutos kasvaimen tilavuuden on esitetty suhteessa kasvaimen tilavuus alussa kokeen. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM). Merkitys määritettiin käyttäen Wilcoxonin summa testi.

analyysi syklopamiinin vaikutuksen -tuumoriksenografti kasvua ehdotti, että esto Hh-signaloinnin voi olla tehokas tapa valvoa munasarjojen syövän etenemiseen. Seuraavaksi me suorittaa samanlaisia ​​kokeita käyttäen useamman kemiallisesti voimakas ja soveltaa kliinisesti Hh-reitin estäjä IPI-926 Faasi I /II kliinisiä kokeita kuin munasarjojen kiinteitä kasvaimia. IPI-926 on peräisin syklopamiinilla ja on parantunut lääkinnällisiä ominaisuuksia kuten korkeampi teho, pitempi puoliintumisaika ja kasvanut biosaatavuus. Olimme erityisen kiinnostuneita Tarkastellaan mahdollista hyödyllisyyttä IPI-926 yhdistettynä standardin ensimmäinen rivi kemoterapiaa. Suoritimme kolme erillistä koetta käyttäen riippumaton ihmisen primaaristen vakavien munasarjojen ksenograftikasvaimissa (SOC12, SOC13, ja SOC14) analysoida kasvaimen vastainen aktiivisuus IPI-926 yksinään tai yhdistelmänä paklitakselin ja karboplatiini (T /C). Kasvaimen ksenografteja olivat peräisin 2 potilailla, joilla on platina resistenttejä (SOC12, SOC13) ja 1 potilas, jolla platinaa herkkä sairaus (SOC14), ja tulokset näiden analyysien on esitetty kuviossa 4. Hiiret, primäärisistä ihmisen vakavien munasarjojen tuumoriksenografteja satunnaistettiin neljään hoitoryhmään, jotka saivat joko ajoneuvon hallinnan, IPI-926 yksin, T /C yksin tai IPI-926 ja T /C. Yli hoitojakson alussa (päivät 0-21), kasvaimen tilavuus käsitellyillä hiirillä ajoneuvon ohjaus lisääntynyt dramaattisesti (kuviot 4A, 4B, 4C). Hoito SOC12, SOC13 ja SOC14 ksenografteissa T /C pelkällä vähentynyt merkittävästi kasvaimen tilavuus (p 0,05; p 0,007; p 0,001 vastaavasti) suhteessa kontrolliin hoitoon. Kuten syklopamiini, IPI-926 monoterapiana oli tilastollisesti merkitsevä estävä vaikutus kasvaimen kasvuun suhteessa ajoneuvon ohjaus sekä SOC13 (kuvio 4B, p 0,007) ja SOC14 (kuvio 4C, p 0,01). Yhdistelmä IPI-926 ja T /C, ei osoittanut suurempaa kasvaimen vastainen vaikutus kuin T /C yksin kaikissa testatuissa kasvaimissa. Näissä analyyseissä, havaitsimme merkittävää laihtuminen hoidettuihin eläimiin IPI-926 monoterapiana verrattuna vehikkelillä hoidettuihin eläimiin (kuva S2).

Hiiret kasvaimia peräisin potilaiden diagnosoitu vakavien munasarjasyöpä satunnaistettiin osaksi 4 kohortteja (n = 4-6 eläintä per hoito kohortti) Hyväksytty kasvainten ja sille osoitettuun hoito-ohjelmille. Kolme riippumatonta papillaarinen vakavien munasarjasyöpä näytteitä, SOC12 (A), SOC13 (B) ja SOC14 (C) käytettiin biologisen rinnakkaista. Kohortteja saivat ensin pelkällä vehikkelillä (kontrolli), paklitakseli ja karboplatiini (T /C) yksin, IPI-926 yksinään tai T /C + IPI-926, kuten on ilmoitettu. Viimeinen T /C-annos on annettu päivänä 14 (merkitty katkoviivalla). Prosentuaalinen muutos tuumorin tilavuuden edustaa muutosta tuumorin tilavuuden suhteessa kasvaimen tilavuus alussa kokeen. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM). Merkitsevyys määritettiin käyttäen Wilcoxonin Rank Sum testi.

vieressä tutkittiin anti-kasvain aktiivisuus IPI-926 lopettamisen jälkeen T /C hoitoon. Näissä analyyseissä, ne hiiret, jotka saivat joko T /C yksinään tai yhdessä IPI-926 annettiin heidän kolmas ja viimeinen viikoittainen annos T /C päivänä 14 hoito-ohjelman (pisteviiva, kuvio 4). Sitten eläimiä pidettiin joko ajoneuvoon (T /C yksinään käsitelty kohortti) tai IPI-926 (T /C + IPI-926 käsitelty kohortti) ja kasvainten tilavuudet arvioitiin säännöllisin väliajoin. Kuten kuvioissa 4A, 4B ja 4C, jatkoi anto IPI-926 suorittamisen jälkeen T /C hoito säilyy kasvaimen regressio, ja yhdessä tapauksessa (SOC13, kuva 4B), johti edelleen pieneneminen kasvaimen tilavuuden tasoille, jotka olivat lähes huomaamaton. Sen sijaan havaitsimme kasvaa tasaisesti kasvaimen kasvua hiirissä, joita käsiteltiin vehikkelillä lakkaamisen jälkeen T /C antoa. Siten edelleen IPI-926-hoito johti merkittävään (p 0,02) ero kasvaimen tilavuuden havaittuun verrattuna ajoneuvojen hoidetut hiiret kaikissa kolmessa yksittäisten primäärikasvaimissa.

IPI-926 estää Hh-reitin aktiivisuutta molemmissa strooman ja kasvaimen

Viimeaikaiset tiedot ovat viitanneet siihen, että Hh-signaloinnin strooman vaaditaan kasvaimen kehittymisen hiiren ksenograftimalleissa haiman ja paksusuolen syövän (25). Arvioida työkohteen IPI-926 järjestelmäämme, analysoimme

Gli1

mRNA: n ilmentymisen sekä hiiren strooman ja ihmisen kasvainsoluissa seuraavat joko akuuttia tai pitkäaikaista hoitoa IPI-926. Akuuttiin tutkimuksissa hiirillä kätkeminen ksenografteissa syntyvät SOC12, SOC13 ja SOC14 hoidettiin joko ajoneuvon tai IPI-926 24 tuntia. Kasvaimen sato, suhteellinen ilmentyminen hiiren ja ihmisen

Gli1

määritettiin RT-PCR: llä käyttäen lajispesifisiä alukkeita. Akuuttia IPI-926 käsittely johti nopeaan merkittävän laskun hiiri

Gli1

ilman estoa ihmisen

Gli1

ilmaisu (kuvio 5, yläpaneeli). Analysoimme myös tukikudosten ja kasvainspesifisen

Gli1

ilmentymistä SOC12, SOC13 ja SOC14 ksenografteissa korjattu hiirillä, joita hoidettiin joko ajoneuvon tai IPI-926 ja 21 päivää tutkimuksissa on esitetty kuviossa 4. Kuten akuutissa asetus, pitkittynyt IPI-926 käsittely johti merkitsevän eston

Gli1

mRNA ilmaisun strooman (p 0,05) osaston (kuvio 5, alempi paneeli). Toisin kuin havaittiin myös akuutin ympäristössä, kohtalainen inhibitio

Gli1

mRNA: n ekspressio havaittiin kasvaimen (p 0,03), kun hoito on pitkäaikaista.

Gli1

mRNA: n ekspression tasojen ksenograftikasvaimissa peräisin SOC12, SOC13, ja SOC14 analysoitiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä käsittelyn jälkeen hiirten IPI-926: ssa 24 tuntia (ylempi paneeli) tai 21 päivää (alempi paneeli). Suhteelliset tasot ihmisen (vasen paneeli) ja hiiren (oikea paneeli)

Gli1

mRNA ilmaisu analysoitiin lajispesifisiä alukkeita. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM). Merkitys (# p≤0.03, * p = 0,05, ** p≤0.001) määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä.

Korkea

Gli1

ilmaisun stroomaan ihmisen papillaarisen serous munasarjakasvaimia korreloi huonon säilymisen

voidakseen vahvistaa, että

Gli1

mRNA ilmentyy stroomaan ihmisen vakavien munasarjakasvainten, tutkimme suhteellista ilmentymistä

Gli1

in strooman microdissected toisesta kohortin 19 ihmisen primääri munasarjojen vakavien kasvaimia (taulukko S2). Mikro-leikellään strooman näiden kasvainten osoitti täyden valikoiman

Gli1

mRNA: n ilmentymisen (tuloksia ei ole esitetty). Univariate selviytyminen analyysi paljasti, että suuri

Gli1

mRNA: n ekspression strooman korreloi merkittävästi huonontunut eloonjäämisen (kuvio 6).

Survival analyysin tulokset, jotka saatiin

Gli1

mRNA: n ekspression on mikropaloitelluista strooman näytteitä 19 potilaista käyttäen qRT-PCR validointi. Korkeampi

Gli1

mRNA ilmaisu korreloi vähentynyt selviytymisen (log-rank testi, p 0,015) ja mediaanielossaolosta +26,50kuukausi potilaille, joilla on alhainen

Gli1

mRNA ilmaisu vs. 16 kuukautta potilaiden joka oli kasvaimia, joilla on korkeampi

Gli1

mRNA ilmaisun strooman.

keskustelu

Useat tutkijat ovat dokumentoineet roolia Hh-signalointireitin kehittämiseen ja ylläpitoon kiinteitä kasvaimia [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että aktivaatio tämä reitti on mukana synnyssä munasarjasyöpä (18, 20, 21). Tutkimuksessamme terapeuttinen kohdistaminen tämän reitin johti inhibition ihmisen papillaarisesta vakavien kasvaimen kasvua.