Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä levinnyt muihin elimiin on tärkein kuolinsyy onkologian potilaille. Migration syöpäsolujen ensisijaisesta kasvain on ratkaiseva askel monimutkainen prosessi etäpesäkkeiden, siis estää tämä prosessi on tällä hetkellä tärkein hoito strategiaa. Etäpesäke inhibiittorit, jotka ovat peräisin luonnontuotteista, kuten migrastatin, ovat erittäin lupaavia syövän vastaisia ​​aineita. Siten Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää vaikutusta kuudesta migrastatin vastineita (MGSTA-1-6) maahanmuutosta ja hyökkäys koiran nisärauhassyöpä solulinjoja eristettiin primaarikasvaimista ja niiden metastaasit keuhkoihin. Koirien nisäkasvaimia ovat arvokas väline opiskeluun useita inhimillisen syövän.

Tulokset

Tuloksemme osoittivat, että kaksi kuudesta täyssynteettistä analogit migrastatin: MGSTA-5 ja MGSTA-6 oli voimakas inhibiittorit koiran maitorauhasen syöpäsoluja muuttoliikettä ja invaasiota. Nämä tiedot saatiin käyttämällä haavan paranemista testin, sekä trans-sekä muuttoliike ja invaasion määrityksissä. Lisäksi syövän solujen tehokkain yhdiste (MGSTA-6) häiriintynyt välinen sitoutuminen rihmamaisia ​​F-aktiini ja fascin1. Konfokaalimikroskopia analyysit paljastivat, että hoito MGSTA-6 lisäsi läsnäollessa sitoutumattoman fascin1 ja vähentää kolokalisaation F-aktiini ja fascin1 koiran syöpäsoluja. Todennäköisesti, aktiinisäikeiden ei ristisidottu fascin1 ja ei luoda tyypillinen filopodial arkkitehtuuri aktiinisäikeiden vasteena toiminnan MGSTA-6. Siten anto MGSTA-6 johtaa vähentynyt muodostumiseen filopodia ulokkeita ja stressi kuitujen koiran rintasyövän soluja, aiheuttaen esto syövän muuttoliikettä ja invaasiota.

Johtopäätös

Kaksi synteettistä migrastatin analogit (MGSTA -5 ja MGSTA-6) on osoitettu olevan lupaavia yhdisteitä eston syöpämetastaasia. Ne voivat olla hyödyllisiä terapeuttisia vaikutuksia syövän hoidossa koirilla, erityisesti yhdessä muiden syöpälääkkeiden. Kuitenkin edelleen

vivo

tutkimuksia on tarkistettava tämän hypoteesin.

Citation: Majchrzak K, Lo Re D, Gajewska M, Bulkowska M, Homa A, Pawłowski K, et al. (2013) Migrastatin analogit Estä Koirien rintasyöpä solujen vaeltamiseen ja Invasion. PLoS ONE 8 (10): e76789. doi: 10,1371 /journal.pone.0076789

Editor: Waldemar Dębiński, Wake Forest University, School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 22, 2013; Hyväksytty: 04 syyskuu 2013; Julkaistu: 08 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Majchrzak et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat lupanumeroon N N308 574940 ministeriön Sciences ja Higher Education Puolan ja Science Foundation Ireland (lupanumeroon 07 /IN.1 /B966). Tutkimus Näihin tuloksiin johtanut on saanut rahoitusta Ihmiset-(Marie Curie -toimet) Euroopan unionin seitsemännen puiteohjelman (FP7 /2007-2013) nojalla REA tukisopimuksen määrä PIEF-GA-2011-299042. Tätä työtä tukivat COST Action CM1106. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on syynä useimpiin syöpäkuolemien [1,2]. Vaikka se on tutkittu laajasti, se on edelleen yksi tutkimaton näkökohtia tautia. Huono tuloksia nykyisten hoitomuotojen, erityisesti huonon ennusteen potilaille pitkälle edennyt kiinteiden kasvainten takia etäpesäkkeitä kannustaa tutkijoita ympäri maailmaa löytää uusia lääkkeitä, jotka voivat estää metastaattinen Cascade. Lupaava aine on luonnollinen tuote migrastatin: uusi antimetastaattisia yhdiste mikrobi alkuperää. Se on makrolaktoni luonnontuote alunperin eristetty

Streptomyces

sp. MK929-43F1 by Imoto et al. vuonna 2000 [3-5] ja myöhemmin

Streptomyces platensis

by licari et al. vuonna 2002 [6] estäjänä kasvainsolun muuttoliikettä. Vain muutaman vuoden kuluttua ensimmäisestä yhteensä kemiallinen synteesi migrastatin ilmoitettiin [7,8]. Sittemmin useat tehokkaampi analogeja migrastatin on syntetisoitu ja kuvattu lupaavana antimetastaattisia lääkkeet [8-13]. On ollut pyrkimyksiä luoda uusia analogit rakenteen toiminnan tutkimuksissa [14-17]. Tärkeää on, että yksinkertaisempi analogit migrastatin, kuten makrolidin MGSTA-8 (kuvio 1), ovat osoittaneet aktiivisuutta ~ 1000-kertaisesti aktiivisempi kuin migrastatin itse kasvaimen solujen vaeltamiseen määritykset

in vitro

[9]. Katkaistu analogit kuten MGSTA-4 ja macroketone MGSTA-5 ja MGSTA-8 estävät etäpesäkkeiden erittäin etäpesäkekasvainten soluja hiiren malleissa [10,12]. Kuitenkin esto solun leviämiskyky huomattavasti riippuu yhdisteiden rakenne ja jotkut asykliset analogit osoittavat aktiivisuutta [11,14,15].

molekyylitason mekanismia, jolla migrastatin vaikuttaa syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota ei ole täysin löydetty, vaikka se on ehdotettu kohdentamaan fascin1, aktiini-niputtaminen proteiini [18]. Migrastatin voivat sitoutua yhteen aktiini-sitoutumiskohtien estää aktiini silloittumisen filamenttien ja filopodia muodostumisen [18]. Yli-ilmentyminen

fascin1

syöpäsoluissa on aiemmin yhdistetty kliinisesti aggressiivista luonnetta kasvain, huono ennuste ja lyhentää tautivapaan elinajan ajan [18-20].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet säätely ylöspäin

fascin

erittäin invasiivisia koiran rintasyöpä solulinjoissa [21]. Siten käytimme niitä mallina tutkimus fascin kohdistaminen lääkkeet, kuten migrastatin. Siksi tutkimme rooli kuusi eri analogien migrastatin MGSTA-1-6, mukaan lukien nishefsky macroketone (MGSTA-5) ja makrolaktonia (MGSTA-4), koiran rintarauhasen syöpäsoluinvaasiota, muuttoliike ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyn.

koirien nisäkasvainten ovat houkuttelevia ja hyödyllisiä malli tutkia ihmisen rintasyöpään, koska ne aistii ihmisen rintasyöpiä, toisin kuin useimmat geneettisesti muunnettuja tai vierassiirrettä jyrsijämallia. Ensinnäkin, koirat samaa ympäristöä kuin ihmiset, näin altistuvat monia samoja syöpää aiheuttavia aineita. Toiseksi, niiden kasvainten esiintyy koirilla luonnollisesti ja spontaanisti ja on sama tietenkin, että ihmisillä. Lukuisat kliiniset yhtäläisyyksiä on osoitettu tähän mennessä, jotka koskevat hormonaalisen etiologia kasvainten, puhkeamisikä, riskitekijöiden (esim liikalihavuus), kliinisistä tuloksista, ennuste tekijät (esim kasvaimen kokoa, imusolmuke invasiivisuus ja kliininen vaihe) (selontekoa varten katso: [ ,,,0],22-24]). Lisäksi monet vahvat ja merkittäviä samankaltaisuuksia molekyylitasolla on esitetty genominlaajuisten vertailevia tutkimuksia. Esimerkiksi reitit liittyvät edistämiseen proliferaatiotasoja säädellään ylöspäin sekä lajeja, ja ne liittyvät solujen kehitystä, solumatriisimo- tarttuvuus, ja solujen viestintä, olivat alassäädetty [23]. Lisäksi yliekspressio steroidireseptorit, leviämisen markkereita, epidermaalinen kasvutekijä, p53 vaimennin geenimutaatioita, metalloproteinaasien ja syklo-, havaittiin molemmilla lajeilla, sekä suuri homologia muutokset syöpään liittyviä reittejä, kuten fosfatidyyli-3-kinaasi ( PI3K) /AKT-reitin, KRAS, fosfataasin ja tensin homologi (PTEN), Wnt-β-kateniinin, ja mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) cascade [23,25]. Siksi koiran nisätuumorimallissa on arvokas väline translationaalisen lääketieteen erityisesti arvioinnin ja kehittämään uusia diagnostisia ja prognostisia sovelluksiin sekä hoitostrategioita, joka hyödyttää sekä koirien ja ihmissyöpäpotilaat [22-26].

menetelmät

Soluviljely

solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on kuvattu aiemmin julkaistu tutkimus [21,27]. Kaksi adenokarsinooma solulinjoja eristettiin koiran rintarauhasen kasvaimet (CMT-W1 ja CMT-W2), ja kahdessa solulinjassa eristettiin niiden keuhkometastaasien (CMT-W1M ja CMT-W2M). Solulinjoja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 50 U /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 2,5 pg /ml amfoterisiini B: tä (reagenssit saatiin Sigma Aldrich Chemical Co., USA). Soluja kasvatettiin kudosviljelmäpulloissa (Nunc ™, Tanska) atmosfäärissä 5% CO2 ja 95% kostutetussa ilmassa 37 ° C: ssa, ja niitä käytettiin rutiininomaisesti jatkoviljeltiin joka toinen päivä.

Migrastatin analogit

rakenteet testattiin migrastatin analogit (MGSTA-1-6) on esitetty kuviossa 1.

synteesi analogien migrastatin

yhdiste MGSTA-4 ja MGSTA-5 syntetisoitiin 9 , kuten on raportoitu kirjallisuudessa [9], kun taas yhdisteet, MGSTA-1-3 ja MGSTA-6 valmistettiin 9 [9], kuten kuviossa 2. Näin ollen esteröinnillä 9 5-hekseenihappo Mitsunobu-olosuhteissa, jota seuraa renkaan sulkeminen -metateesillä (RCM), jolloin saatiin 10, ja poistamalla sen jälkeen TBS-ryhmän saatiin MGSTA-1. Hoito 9 hiilitetrabromidin läsnä ollessa polymeeriin sidottua trifenyylifosfiinia dikloorimetaanissa antoi allyylibromidin 11 [9]. Sitten saattamalla β-ketosulfone 12: n läsnä ollessa DBU, jota seuraa pelkistävä poistaminen sulfoniryhmäksi antoi 13. renkaansulkemismetateesi- ja poistaminen TBS-ryhmän antoi MGSTA-2. Tiolaktoniin valmistettiin 14, joka oli ensin muuntaa tio happo 15 käyttäen Lawessonin reagenssia [28]. Muodostumista tiolaktonia Mitsunobu-olosuhteissa, RCM ja TBS poisto antoi MGSTA-3. TBS suojattu macroketone 16 valmistettiin 9 kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Muodostumista TMS enolieetteri saavutettiin regioselektiivisen tavalla ja sen jälkeen hapettamalla Pd (OAc)

2 antoi α, β-tyydyttymättömiä macroketone 17. Lopuksi poistamalla TBS-suojaryhmä antoi tyydyttymättömiä macroketone MGSTA-6.

Reagenssit ja olosuhteet: (a) 5-hekseenihappo, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 3 h, 69%; (B) Grubbs 2

nd, PhCH

3, refluksi, 25 min, 68%; (C) HF. Py, THF, rt, 18 h, 61%; (D) CBr

4, Ph

3P polymeeriin sidottua, CH

2CI

2, rt, 50 min; (E) 12, DBU, PhCH

3 sitten 11, rt, 1,5 h; (F) Na /Hg, MeOH, rt, 3 h, 51% yli kolme vaihetta; (G) Grubbs 2

nd, PhCH

3, refluksi, 15 min, 99%; (H) HF. Py, THF, rt, 38h, 84%; (I) Lawessonin reagenssia, CH

2CI

2, MW, 100 ° C, 10 min; (J) 9, Ph

3P, DIAD, PhCH

3, rt, 15 h, 42%; (K) Grubbs 2

nd, PhCH

3, refluksi, 15 min, 88%; (L) HF. Py, THF, rt, 18 h, 85%; (M) TMSCl: ää, LHMDS, THF, 0 ° C, 2 h; (N) Pd (OAc)

2, CH

3CN, rt, 3 h, 64% kahden vaiheen yli; (O) HF. Py, THF, rt, 18 h, 90%.

solunelinkykyisyysmääritys (MTT-määritys) B

Solujen elävyys (metabolinen aktiivisuus elävien solujen) kvantitoitiin MTT: llä. -Solut ympättiin 96-kuoppalevylle (Nunc Inc., Tanska) pitoisuutena 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Kun solut saavuttivat 60-70% konfluenssin, väliaine korvattiin alustalla, joka sisälsi 10% FBS: ää ja kuusi eri migrastatin analogit (MGSTA-1-6) on pitoisuudet: 1, 10 tai 100 uM. Viljelmiä inkuboitiin 24 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 0,5 mg /ml tetratsoliumsuolan MTT laimennetaan fenolipunaista RPMI 1640-alustassa (Sigma Aldrich), 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Täydellinen liukeneminen formatsaanikiteet, 100 ui DMSO: ta (dimetyylisulfoksidi, Sigma Aldrich), lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solujen elinkelpoisuus määritettiin kvantitatiivisesti mittaamalla fotometriset absorbanssi 570 nm: ssä monikuoppalevyä lukijalle (Infinite 200 PRO Tecan ™, TECAN, Sveitsi). Kaikki näytteet tutkittiin kolmena kappaleena, kukin koe suoritettiin kolme kertaa (n = 9).

Soluviljelmä on rekonstruoitu tyvikalvon (Matrigel) B

Cancer soluja käsiteltiin trypsiinillä ja suspendoitiin uudelleen viljelyväliaineessa. Kukin kuoppa Lab-Tek 8 kammion vilje- kalvot (Nunc Inc., USA) päällystettiin 25 pl kasvutekijän vähentää Matrigel (BD Biosciences) ja levyt jätettiin jähmettyä 30 minuuttia. 37 ° C: ssa. Sitten solut maljattiin pitoisuutena 10

4 solua /ml migrastatin analoginen sisältävässä väliaineessa tai väliaineessa, johon on lisätty DMSO: (lääkkeen ajoneuvo). Solujen kasvun Matrigelillä havaittiin jokapäiväistä alle faasikontrastimikroskoopissa (IX 70 Olympus Optical Co., Saksa). Koe suoritettiin kolme kertaa (n = 3).

In vitro

haavojen määritys (naarmuuntumista test) B

tyhjästä -koe sen vaikutuksen arviointiin migrastatin analogit koirien rintasyöpä solun liikkuvuus. Solut siirrostettiin korkealla tiheydellä 600 mm petrimaljoille (Corning-Costar, Cambridge, USA). 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja korvattiin väliaineella, joka sisälsi 10% FBS: ää, ja yksi kuudesta migrastatin analogit (MGSTA-1-6) tai DMSO (kontrolli). Yksikerroksiset haavoittui esimakua: yhdenmukaisesti ja suora kuin mahdollista pipetinkärjen (1000 ui) vähintään kolme kertaa. Kuvat Solujen valtaavat naarmu vangittiin merkityillä ajankohtina (0, 4, 6, 8 ja 24 tuntia) käyttäen faasikontrastimikroskopiaa (IX 70 Olympus Optical Co., Saksa). Kuvat analysoitiin käyttämällä tietokoneavusteisen kuva-analysaattori (Olympus mikrokuva ™ Image Analysis, ohjelmistoversio 4.0 Windows, USA). Siirtymisen nopeus ilmaistiin prosentteina tyhjästä sulkemisesta ja laskettiin seuraavasti:% tyhjästä sulkeminen = ab /a, jossa (a) on etäisyys reunojen haavan, ja (b) on etäisyys, joka jäi solutonta aikana solumigraation sulkea haava [29].

arvot esitetään kolmen riippumattoman haavan kentille kolmen erillisen kokeen (n = 9).

Trans-hyvin migraatiokokeessa

Boyden kammion solujen vaeltamiseen analyysi suoritettiin käyttäen BD Falcon ™ FluoroBlock ™ 24-Multiwell Insert Laatat (8 mikronin huokoskoko) (BD Biosciences, USA). Ensiksi soluja (1 x 10

5) suspendoitiin FBS väliaineessa ja lisätään apikaalisella kammioihin insertin levyjen (500 ui). Sitten 750 ui kemoattraktanttia (10% FBS), lisättiin pohjapinta kammioihin. Migrastatin analogit (MGSTA-5 tai MGSTA-6 100 uM) tai DMSO: ta (kontrollina) lisättiin väliainetta molemmissa kammioissa. Annoksesta riippuva tutkimuksissa MGSTA-6 käytettiin pitoisuusalueella 0,1-100 uM. Migration määritykset suoritettiin 18-20 tunnin ajan vakio viljelyolosuhteissa. Sitten väliaine poistettiin varovasti apikaalisella kammioon ja insertti järjestelmä siirrettiin toiseen 24-kuoppalevylle, joka sisälsi 500 ui 2,5 ug /ml Calcein AM Hanksin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS). Levyjä inkuboitiin yhden tunnin ajan vakio viljelyolosuhteissa. Sitten fluoresenssi siirtynyt solujen mitattiin eksitaatioaallonpituudella 485 nm ja emissio aallonpituudella 530 nm käyttäen florescent levy lukija pohja käsittelyn valmiuksia Infinite 200 PRO Tecan ™ (TECAN, Sveitsi). Kaikki näytteet määritettiin kolmena kappaleena, ja jokainen koe suoritettiin kolme kertaa (n = 9). Kutakin koetta varten kaksi negatiivisia kontrolleja käytettiin: (1), joita oli kasvatettu, kuten edellä on esitetty lisäämättä kemoattraktantti väliaineeseen, ja (2) väliaine lisätään, kuten on kuvattu ilman soluja. Sen määrittämiseksi, fluoresenssin soluja, jotka vaelsivat kalvon läpi, levyt analysoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus BX60, suurennus x4).

Trans-ja invaasiomääritys

soluinvaasion Määritys suoritettiin käyttämällä BD BioCoat ™ 24-Multiwell Invasion System esipäällystetty BD matrigeelin ™ Matrix (BD Biosciences, USA). Insertin levyt ensin valmistettiin rehydratoimalla BD Matrigel ™ Matrix kerros lämpimällä PBS: llä kahden tunnin ajan 37 ° C: ssa. Uudelleenkostumisai- Sitten liuos poistettiin varovasti, ja 500 ui solususpensiota lisättiin apikaalisella kammioihin (2,5 x 10

5-solut). Solususpensio valmistettiin trypsinoimalla yksisolukerrokset (80% konfluentit) ja suspendoimalla solut FBS väliaineessa. Sitten 750 ui kemoattraktanttia (10% FBS), lisättiin pohjapinta kammioihin. Koetta varten MGSTA-6 tai DMSO: ta (kontrollina) lisättiin väliainetta molemmissa kammioissa. Invaasiomääritys levyjä inkuboitiin 22-24 tunnin ajan vakio viljelyolosuhteissa. Sitten väliaine poistettiin varovasti apikaalisella kammiosta ja insertti järjestelmä värjättiin Calcein AM HBSS samalla tavalla kuin on kuvattu migraatiokokeessa. Sitten fluoresenssi hyökkäsi solujen mitattiin käyttämällä fluoresoivaan levynlukijaa Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ext.485 nm /Ems. 530 nm) (TECAN, Sveitsi). Kaikki näytteet määritettiin kolmena kappaleena, kukin koe suoritettiin kolme kertaa (n = 9). Kutakin koetta negatiivisen kontrollin muodostivat keskipitkällä jossa kemoatrak- ei lisätty. Sen määrittämiseksi, fluoresenssin soluja, jotka tunkeutuivat kalvon läpi päällystetty Matrigel levyt analysoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus BX60, suurennus x4).

Konfokaalimikroskopia

koiran rintasyöpä soluja kasvatettu Lab-Tek kulttuuri diat päällystetty matrigeelin 24 tunnin sisään migrastatin sisältävässä alustassa (MGSTA-6 konsentraatio 100 uM). Sitten solut pestiin kahdesti lämpimällä PBS: llä ja kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä 20 min ajan huoneenlämpötilassa (RT). Seuraavaksi solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 laimennettiin PBS: ään (10 min huoneenlämpötilassa), pestiin PBS: ssä kolme kertaa ja inkuboitiin ensisijaisen kanin anti-fosfo-FSCN1 (Ser39) vasta-aineen 1: 100 laimennos PBS: ssä ( BIOSs, USA). Yön yli inkuboinnin jälkeen primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin sekundaarisen Alexa Fluor 568 vuohen anti-kani-vasta-aineita, laimennettiin 1: 500 PBS: ään (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) ja co-värjättiin F aktiini-FITC-X phalloidin laimennettiin 1: 100 PBS: ssä (Invitrogen, USA) tunnin pimeässä huoneenlämpötilassa. Peitinlasit sitten asennettu objektilaseille käyttäen SlowFade®Gold kiinnitysväliaine (Life Technologies, Invitrogen). Solut tehtiin näkyviksi käyttäen konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi FV-500-järjestelmä (Olympus Optical Co., Hampuri, Saksa). Yhdistelmä eksitaatio /emissio olivat: Argon 488 nm laser kanssa 505-525 nm suodatin FITC ja HeNe 543 nm laseria 610 nm suodatin Alexa Fluor 568 värjäystä. Kuvat kerättiin erikseen kullekin fluoresenssikanava. Solut tutkittiin käyttäen Fluoview ohjelmaa (Olympus Optical Co, Saksa). Määrällisesti konfokaali tuloksia, olemme analysoineet intensiteetti punaisen fluoresenssin liittyvien fascin1 ilmaisun ja kolorimetriset intensiteetti paikkoja, jotka osoittavat kolokalisaation fascin1 ja F-aktiini at yhdistämisen kuvien avulla tietokoneavusteisen kuva-analysaattori (Olympus mikrokuva ™ Image Analysis , ohjelmistoversio 5.0 for Windows, USA). Viidestä kymmeneen kuvia kunkin dian analysoitiin. Antigeeni spottiväri voimakkuus ilmaistiin keskimääräisinä pixel integroitu optinen tiheys (IOD).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism versio 5.00 ohjelmisto (GraphPad Software, USA). Yksisuuntainen ANOVA ja Tukey HSD (Rehellisesti merkitsevä ero) post-hoc testi, Dunnettin testi ja

t

-testi sovellettiin sekä regressioanalyysillä. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä taas p-arvo 0,01 0,001 kuten erittäin merkittävä. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina +/- S.D. ellei toisin sanota.

in vitro

haavan paranemista määritys analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista RM ANOVA ja Bonferroni post-hoc-testi.

Tulokset ja keskustelu

Vaikutus kuusi analogeja migrastatin on syöpäsolu elinkelpoisuus

Ensinnäkin selvitettävä, jos tarkastetun analogien migrastatin vaikuttanut solujen elävyyden. Neljä näistä kemiallisia yhdisteitä (MGSTA-1, MGSTA-3, MGSTA-5, ja MGSTA-6) ei muuttanut elinkelpoisuutta koiran syövän solujen käytettyä pitoisuus (kuvio S1). Kuitenkin elinkelpoisuus CMT-W1 ja CMT-W2 solujen laski merkittävästi (noin 29% ja 32%, tässä järjestyksessä) käsittelyn jälkeen MGSTA-4 pitoisuus 100 uM (p 0,01) (kuvio S1A, B ). Elinkelpoisuus CMT-W1 soluissa myös vähentynyt inkuboinnin jälkeen MGSTA-2 noin 26% (kuvio S1A). Väheneminen solujen elinkelpoisuuden hoidon jälkeen 100 uM MGSTA-4 ja MGSTA-2 on ehkä liittyvät niiden sytotoksisuus, siis seuraavissa kokeissa, näitä yhdisteitä käytettiin pitoisuutena 10 uM sen varmistamiseksi, että havaittu vaikutus näiden yhdisteiden maahanmuutosta ja invaasio ei johtuvat soluproliferaation inhibointi tai induktio solukuoleman.

Käänteisesti myös havaittu, että pienempiä pitoisuuksia muiden analogien migrastatin aiheutti lievää nousua syöpäsolun elinkelpoisuuden (esim MGSTA -5 tai MGSTA-6 CMT-W1 solulinja, MGSTA-1, MGSTA-2 CMT-W2 solulinjaa ja MGSTA-3 CMT-W1M ja CMT-W2M solulinjoja) (Kuva S1). Näin vältetään mahdolliset syöpäsolun kasvua edistäneet käsitelty yhdisteillä, seuraavissa kokeissa käytettiin mahdollisimman pitoisuus (100 uM), joka ei vaikuttanut solujen elävyyden (eikä laskeva ei lisää sen elinkelpoisuus). Lisäksi aikaisemmat tutkimukset ihmisen A549 keuhkosyövän solulinjaa osoittivat, että alhaisemmat pitoisuudet migrastatin vastineita (ME – migrastatin core eetteri) ei vaikuttanut solujen vaeltamiseen [13]. Lisäksi tutkimus Shen ja työtoverit [11], jossa kahdeksantoista eri puoliksi synteettisesti valmistettu migrastatin yhdisteiden tutkittiin, kävi ilmi, että vain kaksi yhdistettä näytetään solun kulkeutumistestis- IC

50-arvot alle 100 uM haavan paranemista määritys .

esto koiran maitorauhasen syöpäsoluja maahanmuuttoa analogeja migrastatin arvioitiin haavan paranemista määrityksen

in vitro

Haavanparantamislaite määritys suoritettiin, jotta luonnehtia vaikutus analogeja migrastatin siirtyvien koiran syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa 3 kahdella kuudesta tutki yhdisteiden (MGSTA-5 ja MGSTA-6) aiheuttama voimakas estävä vaikutus syövän solujen vaeltamiseen in CMT-W1, CMT-W1M ja CMT-W2 solulinjat. Lisäksi, myös MGSTA-2 oli hyvin tehokas CMT-W2 solulinja ajanhetkellä 4, 6 ja 8 tunnin jälkeen naarmuuntumista. Vaikka valvonta kunnossa soluissa suljettu 39,2 ± 6,8%, 57 ± 7,5% ja 84 ± 9,4% haavan (jälkeen 4, 6 ja 8 tuntia, vastaavasti), kun MGSTA-2 annon solujen kiinni vain 19,9 ± 2,1%, 29,6 ± 9,9% ja 38,9 ± 8,8%: n haavan, vastaavasti. Kuitenkin 24 tunnin jälkeen haava oli täysin suljettu, kuten valvonta kunnossa (kuvio 3B). Solujen migraation ei vaikuttanut mitään tutkittujen migrastatin analogeja CMT-W2M solulinja (tietoja ei esitetty).

kvantifiointi migraation CMT-W1 (A), CMT-W2 (B) CMT- W1M (C) solulinjat esitetään prosentteina tyhjästä sulkemisen ja laskettiin seuraavasti:% tyhjästä sulkemisen = ab /a, jossa (a) on etäisyys reunojen haavan, ja (b) on etäisyys, joka pysyi solu-ilmaiseksi solumigraation sulkea tyhjästä. Valokuvia solujen valtaavat naarmu otettiin lähtökohta ja sen jälkeen 4, 6, 8, ja 24 tuntia käyttäen faasikontrastimikroskopiaa (IX 70 Olympus Optical Co., Saksa). Anto MGSTA-5 ja MGSTA-6 (100 uM) väheni solujen potevilla CMT-W1, CMT-W2 ja CMT-W1M solulinjoissa. MGSTA-2 hoito vähensi solujen liikkuvuuden vain CMT-W2 solulinjassa. Muut migrastatin analogit eivät vaikuta maahanmuuttoa kykyyn tutki solulinjoissa. (D) edustaja kuvia tyhjästä sulkemisesta ohjausehtojen ja jälkeen MGSTA-5 ja MGSTA-6 hoitoa (100 uM) klo 8

th tunnin kuluttua raapiminen CMT-W1, CMT-W2 ja CMT-W1M solulinjoissa; Kuvat on otettu käyttäen objektiivi, 4x suurennus ja analysoitiin käyttämällä tietokoneavusteisen kuva-analysaattori (Olympus mikrokuva ™ Image Analysis, ohjelmistoversio 5.0 for Windows, USA). Koe suoritettiin kolme kertaa. Kaksisuuntainen ANOVA ja Bonferroni post-hoc testit sovellettiin. p 0,05 merkitty * ja p 0,001 oli merkitty ***.

MGSTA-5 annetaan pitoisuus 100 uM esti migraation CMT-W1, CMT-W1M ja CMT-W2 solujen vastauksena tyhjästä haava. CMT-W1 soluja käsiteltiin MGSTA-5 suljettu vain 29 ± 6,5% ja 56 ± 5,2% haavan (jälkeen 6 ja 8 tuntia, vastaavasti), kun taas kontrolli olosuhteissa, 50 ± 7,2% ja 78 ± 7,8%: n haava suljettiin 6 ja 8 tuntia sen jälkeen, kun raapiminen, vastaavasti (kuvio 3A). Samoin CMT-W2 soluja inkuboitiin MGSTA-5 (100 uM) suljettu vain 30 ± 3,8% ja 43 ± 3% haavan 6 ja 8 tunnin kuluttua raapiminen (vastaavasti), kun taas kontrolli olosuhteissa ne suljettiin 57 ± 7,5% ja 84 ± 9,4%: n haavan tuolloin (6 ja 8 tuntia vastaavasti) (kuvio 3B). Samoin myös CMT-W1M soluja inkuboidaan tämän yhdisteen suljettu 21 ± 7,7% ja 30 ± 7,4% haavan 6 ja 8 tunnin kuluttua raapiminen, vastaavasti, kun taas kontrolli solut suljettu 59 ± 6,3% ja 80 ± 8,7%: n haava samalla pisteitä (kuvio 3C). Lisäksi CMT-W2 ja CMT-W1M solulinjoja käsiteltiin MGSTA-5 ei sulje haavan jälkeenkin 24 tunnin raapimista (74 ± 7,3% ja 52 ± 7,8% sulkeminen, tässä järjestyksessä). Vuonna ohjaus olosuhteissa, haava oli täysin suljettu (kuvio 3B, C).

MGSTA-6 osoittautunut myös erittäin tehokas estäjä muuttoliikkeen. CMT-W1 solulinja käsiteltiin tämän aineen suljettuna vain 25 ± 5,1% ja 37 ± 2,8% haavan 6 ja 8 tunnin jälkeinen raapiminen (kuvio 3C). Hoito CMT-W2 solujen MGSTA-6 laski myös muuton kyky. Se oli erittäin merkittävä 8 ja 24 tunnin jälkeen naarmuuntumista. Vuonna ohjaus olosuhteissa haava oli lähes täysin suljettu tuolloin (86-100%), kun taas solut käsiteltiin MGSTA-6 suljettu vain 52 ± 8,1% ja 78 ± 5,2% haavan, vastaavasti (kuvio 3B). MGSTA-6 aiheutti samanlainen vaikutus CMT-W1M solulinjaa, joka ilmenee lähes täydellinen lohko siirtolaisuuden (9 ± 6,8% ja 21 ± 3,7% haavan 6 ja 8 tunnin kuluttua raapiminen, vastaavasti). 24 tunnin kuluttua vain 41 ± 4,2% haavan suljettiin (kuvio 3C).

nishefsky ja työtoverit saatiin samanlaisia ​​tuloksia [13]. Kirjoittajat tutkittu antimetastaattisia ominaisuuksia migrastatin ytimen eetteriä (ME) ja karboksimetyyli- migrastatin eetteri (CME). Molemmat yhdisteet annetaan pitoisuus 100 uM lähes täysin tukossa migraatio ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä 12 tunnin kuluttua alusta. Kirjoittajat perustuvat haavan paranemista määrityksessä määritetään puolet maksimaalisesta estävä siirtolaisuuden pitoisuus (IC

50-arvo), joka oli alhaisempi kuin saatu tutkimuksemme kanssa käyttäen trans-hyvin migraatiokokeessa (keskustelu alla). Tehokkain inhibitio maahanmuuton kolmen koiran syöpäsolulinjoissa, arvioitiin haavan paranemista määritys saatiin aikaan MGSTA-5 ja MGSTA-6 pitoisuus on 100 uM, ja nämä kaksi käytettiin edelleen karakterisointiin. Vaikka MGSTA-2 esti muuttoliike kykyä CMT-W2 soluissa oli tehotonta muissa solulinjoissa. Puolestaan ​​MGSTA-4 (Danishefsky ”makrolaktoni) korkeana pitoisuutena 100 uM inhiboi merkittävästi solujen proliferaatiota kahden solulinjan (CMT-W1 ja CMT-W2) (kuvio S1A, B), mutta alhaisempi pitoisuus (10 uM ) ei ollut vaikutusta solujen vaeltamiseen (kuvio 3). Nämä eroavuudet voivat johtua eri ominaisuus koiran solulinjoissa.

esto muuttoliikkeen ja hyökkäys koiran maitorauhasen syöpäsoluja kaksi tehokkainta analogeja migrastatin (MGSTA-5 ja MGSTA-6) arvioitiin Boyden kammiot määritys

vahvista antimetastaattisia aktiivisuus kaksi yhdisteitä, jotka olivat tehokkaita haavan paranemista määrityksessä, suoritimme muuttoliike ja invaasion määrityksissä Boyden kammioissa.

Syöpä solujen vaeltamiseen oli laskenut huomattavasti 24 tunnin inkubaation 100 uM MGSTA-5 ja MGSTA-6 CMT-W1 ja CMT-W1M solulinjoissa. Fluoresenssin intensiteetti liittyy vaeltavien solujen valvontaolosuhteet oli 10,3 ± 2,5 ja 19,7 ± 3,1 in CMT-W1 ja CMT-W1M solulinja, vastaavasti, kun taas hoito macroketone MGSTA-5 laskivat suhteellista loisteputki (RFU) ja 5.6 ± 1.2 ja 14.2 ± 2,1 CMT-W1 ja CMT-W1M solulinja, vastaavasti (kuvio 3A). Samanlainen vaikutus saatiin soluissa, joita käsiteltiin MGSTA-6. RFU laski 4,2 ± 1,2 ja 3,8 ± 1 CMT-W1 ja CMT-W1M solulinja, vastaavasti (kuvio 4A). Muuttoliike CMT-W2 soluissa oli lähes täysin inhiboida näitä yhdisteitä. Ei kuitenkaan vaikuta migraatio CMT-W2M solujen todettiin, vaikka pientä laskua havaittiin (kuvio 4A).

(A) kvantifiointi kulkeutumista tutkittiin solulinjojen (CMT-W1, CMT-W1M CMT-W2, CMT-W2M) esitetään Suhteellinen loisteputki (RFU) saatiin käyttämällä florescent levynlukijaa Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em. 530). Syövän solujen MGSTA-5 ja MGSTA-6 20 tunnin ajan pitoisuudella 100 uM laski läpi kulkeutumista kalvon CMT-W1, ja CMT-W1M solujen ja lähes kokonaan poistetaan migraation CMT-W2-soluja. CMT-W2M solulinja ne yhdisteet olivat tehottomia. Koe suoritettiin kolme kertaa. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen Prism versio 5.00 ohjelmisto (GraphPad Software, USA). Yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukey HSD post-hoc testi ja parittomia t-testiä sovellettiin. p 0,05 merkitty *, p 0,001 oli merkitty ***. (B) micrographs siirrettyjä CMT-W1, CMT-W1M ja CMT-W2 solujen otettu Olympus mikroskoopilla BX60 x4 suurennuksella.

syöpäsoluinvaasiota koe suoritettiin vain voimakkain analoginen of migrastatin (MGSTA-6). Invasiivisuus CMT-W1, CMT-W1M ja CMT-W2 koiran syöpäsolulinjoissa väheni merkittävästi tämän yhdisteen annetaan konsentraatio 100 uM 24 tunnin ajan. Fluoresenssin intensiteetti liittyvät tunkeutuneet CMT-W1, CMT-W1M ja CMT-W2 solujen valvonnan olosuhteissa oli 11 ± 1,7, 9,7 ± 0,6, ja 11,4 ± 1,5, tässä järjestyksessä (kuvio 5A). Anto MGSTA-6 vähensi invasiivisuus syöpäsoluja. Florescence intensiteetti liittyvät tunkeutuneet CMT-W1, CMT-W1M ja CMT-W2-soluissa oli 6,7 ± 0,6, 6,6 ± 0,6, 7,3 ± 0,7, vastaavasti (p 0,005). Hyökkäys CMT-W2M solu ei vaikuttanut MGSTA-6. Mikroskooppinen analyysi suoritettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa vahvisti saadut tulokset (kuviot 4B ja 5B).

(A) kvantifiointi invasiivisuus tutkittujen solulinjojen (CMT-W1, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W2M ) esitetään Suhteellinen loisteputki (RFU) saadaan käyttämällä -fluoresenssinlukijaa Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em.530). Syövän solujen MGSTA-6 24 tunnin ajan pitoisuuden 100 uM laski invasiivisuus kautta kalvon valmiiksi pinnoitettu matrigeeliä ™ Matrix, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W1M soluja. CMT-W2M solulinja MGSTA-6 oli tehoton. Koe suoritettiin kolme kertaa. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen Prism versio 5.00 ohjelmisto (GraphPad Software, USA).