Krooninen sairaus

tiivistelmä

paracrine toiminto on merkittävä mekanismi solu-solu viestintä kudoksessa mikroympäristön normaalin kehityksen ja sairaus.

In vitro

soluviljelymalleissa simuloidaan kudokseen tai kasvaimeen mikroympäristölle tarvitaan työkaluja hahmotella epiteelin-strooman vuorovaikutusta ja siihen paracrine toiminto, mutta ihanteellinen kolmiulotteisia (3D) kasvainmuoto tutkittu erityisesti paracrine toiminto puuttuu tällä hetkellä. Jotta tämän aukon olemme kehittäneet uuden 3D yhdessä viljelemisen malli kaksikerroksisen alginaatti hydrogeeli mikropalloja, joissa eturauhassyövän epiteelin ja strooman solujen eri osastoissa mikropallojen. Solut pysyivät rajoittuvat ja elinkelpoisen kuuluvat niiden yli 30 päivää. Osoituksena periaatepäätöshakemuksen parakriinisen funktio mallin, mittasimme valetusta komponentti E-kadheriinin (sE-cad) ilmastoituna media, suuri kalvoon sitoutunut soluadhesiivisen molekyyli, joka on erittäin väärin säädellystä syövät mukaan lukien eturauhassyöpä. Lisäksi osoitetaan, että SE-cad voidaan luotettavasti määrällisesti elatusaine, ajankul- kokeet osoittivat myös, että määrä sE-cad vaikuttavat epiteelin-strooman vuorovaikutus. Johtopäätöksenä on, että tutkimus perustetaan uusi 3D

in vitro

yhdessä viljelemisen malli, jota voidaan käyttää tutkimaan solu-solu-parakriinisella vuorovaikutusta.

Citation: Fang X, Sittadjody S, Gyabaah K, Opara EY, Balaji KC (2013) Novel 3D Co-kulttuurin malli epiteelikasvaimet-stroomassoluihin Vuorovaikutus eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (9): e75187. doi: 10,1371 /journal.pone.0075187

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Iso-Britannia

vastaanotettu: 03 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 11 elokuu 2013; Julkaistu: 20 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Fang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee Wake Forest University yhteisörahastoihin KC Balaji ja NIH avustuksen CA079448 X: Fang. Funder verkkosivuilla on https://www.wakehealth.edu/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useat

in vitro

soluissa yhdessä viljelemisen malleja saatavilla tutkimuksen solu-solu-vuorovaikutuksia käyttää kaksiulotteinen (2D) petrimaljoihin tai levyjä [1,2,3]. Kuitenkin useimmissa elävissä organismeissa solut on upotettu kolmiulotteinen (3D) mikroympäristöä, jota ympäröi muiden solujen ja vaikuttavat liukoisen tekijät erittyy solun ulkopuolelle. Vaihtoehtoisesti sandwich malleja voidaan käyttää monikerroksisia solujen kasvun, mutta rajoitukset ovat ilmeisiä, koska solut muuttaisi niiden morfologisia ominaisuuksia, aineenvaihduntaa ja geeniekspressiomalleja 2D kulttuuriin, varsinkin kun ne ovat korkeammista organismeista [4,5]. Lisäksi tavanomainen 2D soluviljelmissä rajoittavat solujen viestintää ja kuljetus liukoisten tekijöiden, happea ja ravinteita, kuona-aineiden ja solun aineenvaihduntaan kuin läsnä natiivi biologinen ympäristöissä [6,7]. Siksi on tärkeää kehittää

in vitro

mallijärjestelmissä jotka simuloivat kudos mikroympäristöihin tuottaa luotettavaa ja biologisesti merkityksellisiä koetulosten.

3D-mallinnus järjestelmien simulointiin kudos mikroympäristön kehitettiin vastaamaan liittyvien rajoitusten 2D mallit [8]. Vaikka 3D

in vitro

soluviljelymalleissa voittaa useita rajoituksia 2D malleja, parannus 3D-mallinnus on tarpeen syrjiä tietyntyyppisiin solu-solu vuorovaikutusta, kuten solu-solu suora, autokriinisella tai paracrine toimintoja. Edistysaskeleet biomateriaalien ja biotekniikan tekniikoita voitaisiin käyttää uusien materiaalien kuten kollageenigeelien, laminiinin ja Matrigel ™ soluviljelmässä, kehittää synteettisiä soluväliaineen ja luoda erilaisia ​​3D-malleja [5,9,10,11,12,13,14, 15]. Niistä biomateriaalit käytettävissä, alginaatti hydrogeeli hallussaan edulliset ominaisuudet solusiirteelle, lääkeannostelun ja kudosteknologian. Alginaatti on polysakkaridi ja bioyhteensopiva polymeeri johdettu ruskea merilevästä. Lisäämällä kaksiarvoisten kationien, kuten kalsium- tai barium, alginaatti polymeerit voivat olla ionisesti ristisilloitettu hydrogeelin muodostamiseksi. Hydrofiilinen luonne alginaatin tukirunkoja mahdollistaa korkean solu lastaus jotka pysyvät kestävän ja toimivan kulttuurin [16,17,18]. Lisäksi tuotanto alginaatin hydrogeelin on suhteellisen yksinkertainen ja kapselointi voidaan saavuttaa ei-ankarissa olosuhteissa. Erilaiset solutyypit, kuten hermosoluja, osteoblastien, kondrosyyttien, myoblastit, on kapseloitu, viljeltiin ja laajennettu alginaattihydrogeelit [19,20,21,22,23].

Tässä tutkimuksessa perustimme 3D eturauhassyövän epiteelin-strooman vuorovaikutuksen alginaatti hydrogeeli mikropallojen viljellään yhdessä eturauhassyövän C4-2-soluja (transfektoitu stabiilisti Protein Kinase D1 (PKD1) tai kontrolli-vektori) ja normaalissa eturauhasessa stroomasolut (WPMY-1-soluissa) samassa mikrokapselissa, mutta erillinen osa-kerroksista. Tämä järjestelmä on erinomainen tutkia parakriininen vaikutus kahden solutyyppien, koska suoraa vuorovaikutusta epiteeli- ja stroomasolujen ei ole sallittua. Osoituksena periaatteessa tutkia paracrine toiminto, mittasimme vuodattamalla E-kadheriinin (sE-cad) liukoisessa media. SE-cad on 80 kDa: n pilkottiin fragmentti E-kadheriinin, transmembraaninen soluadhesiivisen proteiini, joka on väärin säädellystä useita syöpiä, kuten eturauhasen [3,24,25,26]. Kohonnut sE-cad on raportoitu nesteiden ja seerumin potilaiden kanssa erilaisia ​​syöpiä ja muita sairauksia [25,27,28,29,30] ja seerumin on osoitettu korreloivan positiivisesti metastasoivaa eturauhassyöpää sairastavilla ja tauti uusiutuu. Näin ollen, sE-cad on ehdotettu olevan uusi biomarkkeri syövän ennustetta. Olemme aikaisemmin kuvattu alas sääntely PKD1 vuonna pitkälle edenneen eturauhassyövän hoitoon [31], ja että PKD1 edistää E-kadheriinin irtoaminen lisäämällä metalloproteinaasien (MMP) -2 ja -9 eritystä [24].

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

C4-2 pysyvästi transfektoitujen solujen pcDNA3.1-vektoriin (vektori-solut) tai PKD1-GFP (PKD1 solut) kehitettiin laboratoriossamme, kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Normaalissa eturauhasessa stroomasolut (WPMY-1) saatiin ATCC: stä. -Soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (korkea glukoosi) (HyClone, Cat # SH30243.01), jossa 10% FBS: ää ja 1% Antibioltic-antimykootteja (HyClone # SV30079.01) 15 cm: n steriiliin levy, ja inkuboitiin 37 ° C 5% CO

2. Kun solut saavuttivat 80% konfluenssin, media poistettiin kunkin levyn ja solut pestiin steriilillä PBS: llä kolme kertaa, käsitellään trypsiinillä (HyClone, Cat # SH30236.01) 20 minuutin ajan ja siirrettiin steriileihin sentrifugin putkiin. Ne pestiin PBS: llä jälleen, ja sitten suspendoitiin uudelleen DMEM väliaineessa kapselointia.

valmistustekniikka mikrokapseleiden

strooman, vektori ja PKD1 soluja kapseloitu alginaatti hydrogeeliin käyttäen mikro-fluidic laite joitakin muutoksia kapselointi, kuten on kuvattu Tendulkar et al. ja Khanna et ai. [32,33]. Lyhyesti, ensimmäinen solutyypin (stromal vektori tai PKD1) sekoitettiin 1,5% (w /v) ultrapuhdasta alhaisen viskositeetin korkean mannuronate alginaatti (LVM) (NovaMatrix, Sandvika Norja) ja ekstrudoidaan mikro-fluidisen kapselointi laite. Pisarat tuotettu kerättiin 100 mM kalsiumkloridiliuoksessa. Kun silloittumista alginaatin viideksi minuutiksi CaCl

2, mikrokapselit pestiin 0,9% NaCl, joka sisälsi 20 mM CaCl

2. Mikrokapselit inkuboitiin sitten poly-L-ornitiini (PLO) (0,1% w /v) 20 minuuttia luoda PLO kerros, joka toimii Perm selektiivisen tyvikalvon. PLO-päällystetyt mikrokapseleilla sekoitettiin sitten toisen solutyypin (strooman tai vektorin tai PKD1) suspendoituna 1,5% (w /v) LVM ja kapseloitu uudelleen käyttämällä mikro-fluidisen laitteen saamiseksi monikerroksisen mikrokapseleita. Mikrokapselit pestiin 0,9% NaCl, joka sisälsi 20 mM CaCl

2 ja viljeltiin DMEM: ssa, joka sisälsi naudan sikiön seerumia (10% v /v) 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

elinkelpoisuus Pitoisuus

elinkelpoisuusarviointi kapseloitujen solujen, muutaman kapselit kustakin transfektoiduista ryhmästä otettiin pois ja siirrettiin puhtaisiin 24-kuoppalevyille, media imettiin huolellisesti ja solut värjätään. Yhden solun tyyppi ohjaus värjäys: CFDA SE (Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit, Invitrogen) liuotetaan seerumittomassa DMEM (SFM, HyClone) (1: 400) lisättiin jokaiseen kuoppaan (500 ul /kuoppa) ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 inkubaattorissa. Sitten SFM kanssa CFDA SE korvattiin DMEM 10% FBS ja inkuboitiin jälleen vielä 30 minuuttia 37 ° C: ssa, 5% CO

2 inkubaattorissa. Seerumia sisältävä väliaine korvattiin sitten 50 ug /ml propidiumjodidia (PI) (Life Technologies /Invitrogen, Grand Island, NY) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 minuutin ajan, ja mikrokapselit pestiin 3 kertaa poistamaan ylimäärä PI. Mikrokapselit jälkeen tarkasteltiin fluoresenssikäänteismikroskooppia (Zeiss Axiovert 200M) ja kuvaamisen. Määrä elävien ja kuolleiden solujen määritettiin laadullisesti yhdistelmäkuvaan hankitut Image-Pro plus (versio 6.3.1.542). Double solutyyppi värjäys: osoittamiseksi ero lokerointi eri solutyyppejä monikerroksista mikro-kapselit, sisempi ydin solut esi-värjättiin Cell Tracker green (Invitrogen, cat # C2925) ja ulompi kerros soluja pre- värjättiin Cell-tracker Orange (Invitrogen), ennen synteesiä monikerroksisen mikro-kapseleita. Ennen havainto, mikrokapselit värjättiin SYTOX Blue Nucleic Acid Stain (Invitrogen, kissa # S11348) ja kuolleita soluja. Monikerroksinen mikro-kapselit, sitten kuvataan käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Zeiss Axiovert 200M).

Entsyymi immunoabsorbenttimääritys (ELISA) B

arvioimiseksi parakriinisen toimintoja kapseloidut solut, tasot sE-cad mitattiin elatusaineet. Kukin ryhmä mikrokapselin oli viljelty neloset ja käytetty kasvatusliuos kerättiin joka toinen päivä. Samalla kerätä käytetty media, media kussakin kuopassa sekoitettiin perusteellisesti; 1 ml (puolet kokonaismäärästä) otettiin kustakin kuopasta ja korvattiin 1 ml: lla tuoretta täydellistä DMEM 10% FBS ja 1% antibiooteilla. Näyte media säilytettiin puhtaassa Eppendorf-putkessa -20 ° C: ssa. Soluille kasvaa 2D kudosviljelmässä käsitelty petrimaljoja, media kerättiin kun solut saavuttivat 90-100% konfluenssin (kolmen päivän inkubaation). Solujen määrä laskettiin kunkin solulinjan myöhempää normalisointi. Tasot sE-cad kvantitoitiin käyttämällä ELISA Kit R 150 kDa [32]. Kun taas malli esti suoran solu-solu vuorovaikutus, cellular eritteet voivat läpäistä PLO takki mahdollistaa paracrine toimintaan. Koska ensimmäinen askel kohti validoida malli paracrine toiminto, arvioimme solujen elinkelpoisuus.

Left on piirretty malli kaksikerroksisen microsphere. Sisempi ydin ja ulompi kerros erotettiin PLO pinnoite kuten kuvassa. Solut kasvavat erillisissä kerrokset merkitty punaiset nuolet. Oikea on todellinen microsphere tarkasteltiin valomikroskoopilla. Strooman soluja kasvatettiin sisemmän ytimen 7 päivää, ja ulompi kerros on tyhjä.

stroomasolut (WPMY-1), C4-2 vektori-solut (C4-2-solut transfektoitiin stabiilisti pcDNA3 0,1) ja C4-2 PKD1 soluja (C4-2 pysyvästi transfektoitujen solujen ja ilmentävät PKD1) pysyivät kannattavia viimeistään sisä- ytimen tai ulomman kerroksen kaksikerroksiset mikrokapselit 4 viikkoa, ja pysyi rajoittuu niiden kerroksiin ilman siirtolaisuutta PLO ( kuva 2). Seuraavaksi kaksi eri solutyyppejä olivat viljellään yhdessä sisäytimen tai uloin kerros, samalla mikrokapselin, ja molemmat solutyypit pysyi elinkelpoisia yhdessä viljelemisen ainakin 4 viikkoa riippumatta kerrosten tai solutyypin yhdistelmää (kuvio 2). Tulokset osoittavat, että alginaattimikropallojen voidaan kasvattaa epiteeli- tai stroomasoluissa lokeroitu eri kerroksissa

in vitro

vähintään kuukauden.

BS, mikrokapselit tyhjä sisäpiirillä ja strooman solujen uloin kerros. PS, mikrokapselit kanssa C4-2 PKD1 solujen sisäisen ydinosan ja strooman solujen uloin kerros. Green, elävät solut sisempi ydin. Punainen, elävät solut uloin kerros. Sininen, kuolleita soluja. Mittakaava, 100 pm.

kasvaneet solut mikropalloihin osoitti eritystoiminnan

Jotta voidaan osoittaa, että elävien solujen mikropalloihin jäävät myös toiminnallisia, mittasimme pitoisuus liukoisen E-kadheriinin fragmentti (sE-cad, tai valetusta E-kadheriinin) ilmastoituna median merkkiaine eritystoiminnan. E-kadheriinin on tärkeä transmembraaninen solu-solunkiinnitysmolekyyli joka on väärin säädellystä useissa ihmisen syövissä [3,34]. N solunulkoinen domeeni E-kadheriinin lohkaistaan ​​useita solunulkoisia proteaaseja. Pilkkominen johtaa irtoaminen olevan noin 80 kDa: n fragmentti, jonka on osoitettu olevan biomarkkeri aggressiivinen fenotyypin useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhas- [25,27,28,29,30]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että häiriöstä PKD1 vaikuttaa E-kadheriinin irtoaminen eturauhassyöpäsoluissa [24]. Siksi käytimme stabiilisti transfektoitujen C4-2 PKD1 solujen määrällisesti valetusta E-kadheriinin tasolla. Jotta sisältää erilaisia ​​positiiviset ja negatiiviset kontrollit, testasimme sE-cad tasolla väliaine ihmisen erilaisten solulinjojen, mukaan lukien sekä normaalit ja neoplastiset solut. Vaikka jotkut solutyypit eivät osoittaneet paljon näyttöä E-cad irtoaminen heijastuu matalan /jäljitystasoa sE-Cad, toiset erittyy suuria määriä sE-cad on medium (kuva 3). Tulokset osoittivat, että metastaattinen solulinjat (MCF-7, PC3 ja LNCaP) on korkea sE-Cad tasolla, ja hyvänlaatuisia solulinjat (HEK293T- solut, 3T3-solut ja MS1 solut) oli pieni /jäljitystasoa sE-Cad. Oli merkittäviä eroja sE-kadmium- tasoja metastaattisen solujen ja hyvänlaatuisia soluja, jotka oli vahvistettu Studentin t-testillä (kuvio 3). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​julkaistun kirjallisuuden että SE-cad tasolla korreloi solujen invasiivisuus [25].

SE-Cad tason mitattiin ELISA ja normalisoitui vastaamaan eritystä 10

7 solua kutakin solulinjassa. sE-Cad tason metastaattisen solulinjojen (MCF-7, LNCaP ja PC3) verrattiin HEK293T- (edustajana normaalin solun riviä) ja P-arvot laskettiin Studentin t-testiä. Kukin pylväs edustaa keskimäärin kolme rinnakkaista kokeita. Virhepalkin edustaa keskivirheen.

Co-kulttuuri epiteelisolujen ja stroomasolujen vaikutteita se levitti E-kadheriinin eritys osoitukseksi paracrine funktion

Voit testata paracrine vuorovaikutus kahden eri solun linjat, stroomasolut, C4-2 vektori solujen ja C4-2 PKD1 soluja kasvatettiin mikrokapseleita erilaisia ​​yhdistelmiä ja sE-cad on kasvatusliuos kvantifioitiin. Kun yhden solun tyyppi kasvatettiin joko sisä- ytimen tai uloin kerros, mikrokapseleiden, strooman solut eivät eritä sE-cad, kun taas sekä C4-2 vektori solujen ja C4-2 PKD1 soluja ei, kun kapseloidaan yhteen erillisiä osastoja (kuvio 4A ). Kvantitointi sE-CAD suoritettiin soluja viljeltiin 2D ympäristössä ja havaittiin samanlaiset tulokset (kuvio 4B). Tulokset vahvistaa luotettavuutta mallin erottamaan epiteelisolujen välillä stroomasolut ”toimintoja.

, soluja viljeltiin 3D-ympäristössä 6 päivää. BS, mikrokapselit tyhjä sisempi ydin ja strooman solujen uloin kerros. BV, mikrokapselit tyhjä sisäpiirillä ja C4-2 vektori solujen uloin kerros. BP, mikrokapselit tyhjä sisäpiirillä ja C4-2 PKD1 solujen uloin kerros. sE-Cad tason mitattiin ELISA. B, soluja viljeltiin 2D ympäristössä (petrimaljassa). sE-Cad tason mitattiin ELISA ja normalisoitu vastaamaan eritystä 10

7 solua kutakin solulinjaa P-arvot laskettiin Studentin t-testiä. Kukin pylväs edustaa keskimäärin kolme (2D kulttuuri) tai neljä (3D kulttuuri) rinnakkaisia ​​kokeita. Virhepalkin edustaa keskivirheen.

C4-2 PKD1 solujen lisääntynyttä erittymistä sE-cad verrattuna C4-2 vektori soluihin (kontrolli) (kuva 4), joka on johdonmukainen ennalta julkaisuja [ ,,,0],24]. Olemme myös aiemmin osoittaneet, että PKD1 up-säänneltyjen E-kadheriinin ilmentymisen [24]. Nykyisessä kokeellinen malli C4-2 PKD1-soluissa, mutta ei C4-2 vektori solujen aggregoitua muodostaen kompaktin pesäkkeitä (sen jälkeen, kun niitä viljeltiin kolmen viikon ajan mikrokapselit) (kuvio 5), joka on vakiintunut fenotyyppi lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen. Kun epiteelin ja strooman soluja viljellään yhdessä riippumaton kerrosten saman mikrokapselin määrä sE-cad erittämä C4-2-solujen (sekä vektori ja PKD1 transfektoitujen solujen) väheni, mikä viittaa siihen, stroomasolut vaikuttamaan epiteeli- sE-cad eritystä (kuvio 6). Koska strooman ja epiteelin soluja ovat lokeroitu ja voi olla vuorovaikutuksessa suoraan, me olettaa, että stromasoluja vaikuttavat epiteelisolujen eritystoiminnan kautta paracrine mekanismi.

mikrokapseleita inkuboitiin 23 päivää näkyvät. PB, mikrokapselit kanssa C4-2 PKD1 solujen sisäisen ydinosan ja tyhjä ulkoisen kerroksen. VB, mikrokapselit kanssa C4-2 vektori solujen sisäisen ydinosan ja tyhjä ulkoisen kerroksen. Green, CFDA värjäys elävien solujen. Punainen, Propidiumjodidia (PI) värjäys kuolleita soluja. Nuolet osoittavat solujen pesäkkeitä. Mittakaava, 100 pm.

SE-cad tason mitattiin ELISA seuraavat yhdessä viljelemisen 30 päivää. SB, mikrokapselit kanssa strooman solujen sisäisen ydinosan ja tyhjä ulkoisen kerroksen. BV, mikrokapselit tyhjä sisäpiirillä ja C4-2 vektori solujen uloin kerros. BP, mikrokapselit tyhjä sisäpiirillä ja C4-2 PKD1 solujen uloin kerros. SV, mikrokapselit kanssa strooman solujen sisäisen ydinosan ja C4-2 vektori solujen uloin kerros. SP, mikrokapselit kanssa strooman solujen sisäisen ydinosan ja C4-2 PKD1 transfektoitujen solujen uloin kerros. P-arvot laskettiin Studentin t-testiä. Kukin pylväs edustaa keskimäärin neljä rinnakkaista kokeiluja. Virhepalkin edustaa keskivirheen.

Keskustelu

kaksikerroksiset mikropallokoostumukset malli kuvattu tässä tutkimuksessa on 3D-ympäristössä, joka simuloi

in vivo

mikroympäristössä, myöntyväinen helppo ja skaalautuva aineiden tuotanto, puhdistus ja käsittely, ilman havaittavaa sytotoksisuus, ja on kemiallisesti yhteensopiva vesiliuosten ja fysiologisia olosuhteita. Toisin kuin muut tällä hetkellä saatavilla 3D

in vitro

mallissa mikropallokerroksen mallia tässä tutkimuksessa mahdollistaa nimenomaan analysoida paracrine vuorovaikutusta eri tyyppisiä soluja. Kuitenkin tämä malli myös on tiettyjä rajoituksia. Määrä määrällisesti eritystä sE-cad kasvavien solujen sisäinen ydin on pienempi kuin sama määrä ja tyyppi kasvatettujen solujen uloin kerros mikrokapselin (tuloksia ei ole esitetty). Tämä vähentynyt eritys voi johtua siitä, että sE-cad erittyy solujen sisäisen ydinosan on diffundoitua kaksi kerrosta hydrogeelin ennen vakioitu väliaine. On myös mahdollista, että permselektiivisyys PLO takki vähentynyt eritys sE-kadmium-. Optimoida mallina havaitsemiseksi muiden erityisten proteiinien kemiallisen ominaisuudet silloitettu PLO takki voidaan joutua optimoitu erityisiä tutkimuksen tarpeisiin. Vaikutus eksosomi olisi myös otettava huomioon, kuten E-kadheriinin tunnistettu mikrovesikkeleille puhdistettiin normaaleista hiiren dendriittisolujen ja ihmisen syöpäsoluja [35,36]. On edelleen mahdollista, että SE-Cad voitaisiin loukkuun eksosomeiksi, mutta vähän tiedetään miten mikrovesikkeleille säätelevät solu-solu vuorovaikutusta parakriinisella järjestelmässä.

Toinen huolenaihe on jatkuva mekaaninen ominaisuus alginaattia hydrogeeliä, kun ionisesti ristisilloitettu alginaatteja osoitti väheni geelin lujuus 90 päivän kuluttua

in vitro

[37]. Tämän ongelman ratkaisemiseksi, stabiili kovalenttinen ristisidosten voidaan syöttää alginaattihydrogeelit käyttäen bifunktionaalisia silloittajia. Lisäksi on mahdollista, että pitkän ajanjakson

in vitro

inkubaatioissa voi johtaa epätasapainoon vallitsevassa ionikonsentraatioissa (joka on tarpeellista säilyttää mikrokapseli vakaus), mutta ei alle

in vivo

olosuhteissa, koska ei heikkene näiden alginaattimikropallojen havaittiin vähintään kolme kuukautta viimeaikaiset

in vivo

tutkimuksissa (julkaisematon data). Huolimatta näistä rajoituksista, malli kuvatulla voidaan käyttää tehokkaasti tutkia paracrine epiteelin-strooman vuorovaikutus.

Epithelial-strooman vuorovaikutusten on tärkeä rooli normaalin kehityksen ja neoplastisen transformaation. Normaaleissa ihmisen eturauhasen strooman solut koostuvat pääasiassa sileän lihaksen solujen ja fibroblastien, kun taas loput ovat endoteelisolujen, perisyytit, lymfosyytit ja makrofagit [38]. On raportoitu, että syöpä liittyvät strooman (CAS) voi muuttaa solun morfologia /kasvu /aggressiivisuus neoplastisten ihmisen eturauhasen epiteelisolujen, mutta ei normaaleissa eturauhasen epiteelisolujen [39]. Samanlaisia ​​vaikutuksia on raportoitu käyttäen eturauhaskarsinoomasolulinjaa yhteistyössä kulttuuria pleuripotent luun stroomasoluja [40]. Normaalit fibroblastit eivät osoita tällaista muokkaava vaikutus epiteelisolujen mieleen ominaisuuden epiteelin-strooman vuorovaikutuksen aikana neoplastisia prosessi soluihin [39]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että yksi mahdollinen mekanismi strooman vaikutus epiteelisyöpäsolujen kautta paracrine mekanismi. Osoituksena periaate osoitimme väheneminen sE-cad eritystä eturauhassyövän solut stroomasolujen läsnä ollessa ja malli voisi oletettavasti voidaan tutkia muita solutoiminnoille vaikutteita paracrine mekanismilla.

stroomakasvaimet vuorovaikutus vaikutteita leviämisen, apoptoosin ja etäpesäkkeiden epiteelisolujen. Haimasyövän, antagonisti Hedgehog (Hh) esti tuumorin kasvua vain silloin, kun syöpään liittyvän strooman olemassa, mikä osoittaa, signalointireitin riippuvainen strooman [41]. Eturauhasen, todettiin, että strooman tekijät, kuten caveolin-1 ja tymidiinifosforylaasia olivat liittyy kasvaimen aggressiivisuus [42]. Muita uusia proteiineja, joilla on tärkeä rooli epiteelin-strooman vuorovaikutus on todettu transkription profiloinnin eturauhasen [43]. Yksi heistä, Decorin, säädeltiin vähentävästi eturauhassyövässä [43]. Vähentynyt Decorin johti merkittävään vähentämiseen E-kadheriinin sekä

in vivo

ja

in vitro

, ja fyysinen vuorovaikutus Decorin ja E-kadheriinin varmistettiin samanaikainen immunosaostus [34]. Dekoriini ilmentyminen on tiukasti rajoitettu mesenkymaalisten /stroomasolujen, mutta ei epiteelisolujen eturauhasen [43], ja sen ilme on huomattavasti vähentynyt carcinoma liittyviä strooman [43]. Olipa Decorin myös tärkeä rooli irtoaminen E-kadheriinin edelleen tuntematon.

Toinen tärkeä ryhmä soluväliaineen proteiinien, MMP, voisi olla mahdollisia peruskudoksen säätimiä, jotka vaikuttivat E-cad irtoaminen. Olemme aiemmin osoittaneet, että PKD1 aiheuttama eritystä MMP-2 ja -9 kasvaa E-kadheriinin irtoaminen ja tukahduttaa soluproliferaatiota [24].

Yhteenvetona tutkimus osoittaa toteutettavuus ja hyödyllisyys 3D alginaattia microsphere malli tutkia parakriinisen solujen toimintaa. Erityisesti olemme käyttäneet mallia tutkia epiteelin-strooman vuorovaikutus ja osoittivat, että normaalissa eturauhasessa stromasoluja vaikuttamaan eritystä sE-Cad eturauhassyövän epiteelisoluihin paracrine vuorovaikutusta. Mallia voitaisiin käyttää vahvistamaan lisää solulinjojen ja parakriininen vuorovaikutus eri soluja.