Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka ymmärtää paremmin patogeneesin suusyövän, sen hoitotulokseen on edelleen heikko. Näin ollen, on olemassa tarve uusien terapeuttisten strategioiden parantamiseksi ennusteen tämän sairauden. RNA-interferenssi (RNAi), näyttää olevan lupaava terapeuttinen työkalu hoidossa monien sairauksien, mukaan lukien suun syöpä. Kuitenkin este RNAi-välitteinen hoitoja on toimitus, erityisesti säilyttäminen pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) endosomeihin ja niiden myöhempi hajoaminen lysosomeihin, jolloin tehoton geenien. Siten nykyinen Tutkimuksessa tarkasteltiin mahdollisuutta suunnitella ja käyttämällä peptidin, kutsutaan 599, joka koostuu synteettisestä influenssaviruksen johdettuja endosomissa-häiritsevä fusogeeniseen peptidisekvenssin ja venyttää kationisen solu-tunkeutuva Nona (D-arginiini) tähteet, toimittamaan siRNA: t otetaan suun syöpäsoluja ja indusoivat hiljentäminen terapeuttisen kohteen, CIP2A-proteiinia, joka on onkoproteiini yli-ilmentyy erilaisissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien suun kautta syöpä. Lisäämällä 599 peptidi-to-siRNA moolisuhde osoitti korkeampaa sitova kapasiteetti siRNA-molekyylien ja parannettu siRNA toimitus sytoplasmaan suun syöpäsoluja. Itse asiassa, kvantitatiivisia mittauksia siRNA toimitus soluihin osoitti, että 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde voi toimittaa 18-kertaisesti suurempia määriä siRNA: iden verrattuna soluihin, käsiteltiin siRNA yksin ole merkittävää pitkän aikavälin sytotoksisia vaikutuksia. Tärkeintä on, että 599-peptidin välittämä siRNA toimitus edistänyt merkittävästi CIP2A-proteiinia mRNA ja proteiini hiljentäminen jotka alensivat suun syöpäsolun invasiivisuus ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että kimeerinen peptidi, joka koostuu fusogeenisen sekvenssin, yhdessä solussa tunkeutuva tähteitä, voidaan käyttää tuloksellisesti siRNA: t otetaan suun syöpäsoluja ja indusoivat hiljentäminen sen kohdegeenin, mahdollisesti tarjota uusi terapeuttinen strategia torjuminen suusyöpä.

Citation: Cantini L, Attaway CC, Butler B, Andino LM, Sokolosky ML, Jakymiw A (2013) fusogeenisen-Oligoarginine Peptide antolaitteen siRNA: iden kohdistaminen CIP2A-proteiinia Oncogene osaksi Oral Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e73348. doi: 10,1371 /journal.pone.0073348

Editor: Kin-Hang Kok, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: toukokuu 14, 2013; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2013; Julkaistu: 03 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Cantini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIDCR ja NCRR myöntää R00DE018191 (AJ) ja P20RR017696, vastaavasti. Tämä työ oli myös rahoittivat Bankhead-Coley Florida Cancer Research Program apurahan 08BN-02 (AJ). Antama tekninen tuki Clemson Light Imaging Facility mahdollistivat National Science Foundation-palkinto # 1126407 ja Clemson University Core Facility avustuksen Terri F. Bruce. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on arvioitu, että noin 40000 uutta tapausta ja noin 8000 kuolemantapausta liittyvät syöpään suuontelon ja nielun tapahtuu vuosittain Yhdysvalloissa vuonna 2012 [1]. Suuontelon syöpä on tällä hetkellä rankattu kuudes yleisin syöpä maailmassa, jossa levyepiteelikarsinoomien suun limakalvojen on yleisin tyyppi (~90%) [2], [3]. Huolimatta valtavia määriä tutkimusta ja edistysaskeleita onkologian ja leikkaus, 5 vuoden pysyvyys suun syöpä on vain hieman parantunut viimeisten 30 vuoden aikana ja sen ennuste on edelleen huonompi kuin rinta-, paksusuolen tai eturauhassyöpä [1] . Siksi tarvitaan uusia terapeuttisia strategioita tarvitaan parantamaan tuloksista tauti.

RNA-interferenssi (RNAi) on erittäin konservoitunut transkription jälkeinen geeni sääntelymekanismiin laukaisee pieniä, ei-koodaavan kaksijuosteisia RNA-molekyylejä, jotka voivat erityisesti hiljentää geeniekspressiota joko tukahduttaa käännös- ja /tai indusoimaan mRNA: n hajoamisen [4], [5]. Lyhyt kaksijuosteinen RNA-molekyylejä, joita kutsutaan Sirna (siRNA) ovat toiminnallisia molekyylejä, jotka yhdessä RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC) välittävät sekvenssin mRNA kohdistinvalinta ja pilkkominen [6], [7], [8 ], [9]. Havainto, että käyttöönotto kemiallisesti syntetisoitu siRNA: iden nisäkässoluihin voisi tehokkaasti aiheuttaa sekvenssi-spesifinen esto geenin ilmentymisen [6], tuli ilmi terapeuttista potentiaalia valjastaa RNAi keinona kohdistaa ja hiljaisuus tauteja aiheuttavia geenejä. Myöhemmät prekliinisissä kokeissa eläimillä ja uudempien kliiniset kokeet ovat edelleen validoitu siRNA kuin estäjän valikoima sairauksia aiheuttavia geenejä ja lupaava uusi luokka terapeuttisten [8], [10], [11].

Vaikka suunnittelu terapeuttisen luokan siRNA on parantunut [8], [10], toimitus on edelleen suurin yksittäinen este kohti levinnyt käyttö siRNA: iden terapeuttista sovelluksiin [8]. Koska terapeuttinen makromolekyylit toimitetaan yleensä endosytoosin [12], joka on yksi tärkeimmistä rajoittaa vaiheet monta toimitusta lähestymistapoja, mukaan lukien siRNA toimitus, on endosomaalinen loukkuun ja myöhemmin hajoaminen terapeuttisen lastin lysosomeihin [11], [12], [13] . Näin ollen parantaa solunsisäisen hyötyosuus siRNA: iden, tehokkaita strategioita endosomaalisen paeta tarvitaan.

kuljettaa virus- genomin sytoplasmaan, eläinten virukset, jotka sisäistetään kautta reseptorivälitteisen endosytoosin, hyödyntää proteiineja endosomissa-häiritsevä fuusiopeptidi domeenisekvenssien välittävän epävakauteen isäntäsolun endosomimembraanin [14]. Menetelmä, jolla nämä virusproteiineja horjuttaa endosomaalista kalvoja esiintyy happamointikäsittelyn riippuvaisella tavalla ja on jäljitellä synteettisiä peptidejä, joita kutsutaan fusogeenistä peptidit [15], [16]. Erityisesti useat synteettiset fusogeenisen perustuvien peptidien N-terminaalinen fuusio domeeni HA2-alayksikön influenssaviruksen hemagglutiniiniproteiinista ovat osoittautuneet tehokkaiksi vaikuttamaan geeninsiirto [15]. Näistä fusogeenistä peptidien, sekä INF-7-peptidin ja sen dimeerimuodoksi diINF-7, ovat osoittaneet endosomissa häiritsevä kykyä parantamalla non-virus- geeninsiirtosysteemeissä ja parantaa sekä sytosolin toimituksen immunoliposomi suljetun makromolekyylien ja lipofektamiini- välittämän siRNA- aiheuttama geenien [15], [16], [17]. Lisäksi koinkubaation kimeerisiä peptidejä, jotka koostuvat HA2 endosomin-häiritsevä fuusioituna soluun tunkeutuva peptidien (CPP, kationinen peptidi-vektorit, jotka voivat nopeasti indusoida oman solun sisäistämisen kautta eri endosytoosin [18]), on myös osoitettu parantaa endosomaaliseen karkaamisen CPP-kompleksoidun lastin siten edistää vahvempaa biologiset vaikutukset [12], [18], [19]. Eräässä tietyssä tutkimuksessa, co-inkubointi HA2-sidottu CPP peptidien kanssa CPP-kompleksoitu siRNA: t havaittiin kohtalaisen parantaa hiljentäminen kohdennettujen reportterigeenin [20].

Vaikka edellä kuvatut strategiat ovat osoittaneet parannuksia siRNA-välitteinen hiljentäminen vaikutuksia, on vielä useita ongelmia, jotka voivat rajoittaa tehoa fusogeenisen peptidin välittämän sytosolinen toimitus siRNA: iden. Ensinnäkin siksi, että fusogeenistä tai HA2-kimeerisen peptidit eivät kompleksoitu että siRNA: t, tämä lähestymistapa ei takaa, että peptidit kolokalisoituvat samassa endosyyttisissä rakkulat kuin siRNA lastin [12]. Co-lokalisointi on tarpeen vapauttaa siRNA molekyylien endosyyttirakkulan [12]. Toiseksi, koska tämä ei ole vuorovaikutusta peptidien ja siRNA: t, on mahdollista, että peptidit voivat paeta endosomeihin ilman vakavia häiriöitä endosomaaliseen kalvot, lopulta jättää siRNA lastin pidättynyt vesikkelin [12]. Niinpä näiden ongelmien kiertämiseksi, tämän tutkimuksen tavoitteena oli suunnitella kimeerisen peptidin, joka koostuu fusogeenisen sekvenssin liittyy CPP jotka mahdollistaisivat stabiili sitova siRNA kautta sähköstaattisten vuorovaikutusten ja edistää niiden solunsisäisen toimituksen ja endosomaalista paeta, jotta aiheuttaa terapeuttisen hiljentäminen kohdennetulla onkogeenin suun syöpäsoluja. Koska INF-7 peptidi on voimakkaampi kalvoon epävakautta peptidin verrattuna kanta- HA2 peptidin ja kationiset Nona (D-arginiini) peptidit ovat erittäin tehokas CPP pystyy tehostetun soluunottoa [12], [21], sekä toimitus siRNA: iden kasvaimiin ja hiirien aivoissa [22], [23], suunnittelimme kimeerinen peptidi, kutsutaan 599, joka valjastaa nämä molemmat ominaisuudet sisällä yksi molekyyli suoraan monimutkainen ja parantaa solunsisäisen hyötyosuutta siRNA: iden. Tässä osoitamme, että 599 peptidi antaa käyttäjälleen siRNA suunniteltu kohde CIP2A-proteiinia, joka on onkoproteiinia yli-ilmennetään ihmisen pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCCs), mukaan lukien suun levyepiteelikarsinoomien (OSCCs) [24], [25], [26] , osaksi suun syöpäsoluja, välittää tehokas CIP2A-proteiinia hiljentämisen, ja näin ollen estää suun syöpäsolun invasiivisuus ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua.

tulokset

599 Peptide sitoo tehokkaasti ja Tarjoaa siRNA osaksi Oral Cancer Cells

jotta testata, onko 599 peptidi kautta kationisen Nona (D-arginiini) jäämiä saattaa tehokkaasti sitoa negatiivisesti varautuneet siRNA perustuu sähköstaattiset vuorovaikutukset, agaroosigeelissä shift määritys suoritettiin (Fig. 1). Käyttäen eri määriä 599-peptidin, joka vaihtelee 1-50-kertainen molaarinen ylimäärä siRNA: iden osoitettiin, että 599-peptidi voidaan todellakin sitoutua siRNA-molekyylejä, joiden tarkoituksena on kohdistaa CIP2A-proteiinia (siCIP2A) hidastamalla siCIP2A alkaen peptidi-to- siRNA molaarinen (P: N) suhde 20:1, joilla ei ole vapaata siRNA havaittavissa geeliä 50:1. P: N suhteilla 10:01, peptidi oli vain kohtalainen vaikutus siRNA sitovia, ja 1:01 se oli täysin tehoton.

etidiumbromidilla värjätty 4% agaroosigeelistä shift määrityksessä tutkitaan kykyä eri määriä 599-peptidin (vaihteluväli 1-50-kertainen molaarinen ylimäärä siRNA: iden) muodostamaan komplekseja siCIP2A. siCIP2A, siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia onkogeeni; MWM, molekyylipainomarkkeri (määrä emäsparin kunkin DNA-fragmentti on esitetty).

Kun osoitetaan, että 599-peptidi voisi sitoutua siRNA tietyille P: N-suhteet, tutkimme seuraavaksi kyky peptidin toimittaa fluoresoivasti leimattua siRNA: t otetaan suun kautta syöpäsolujen fluoresenssimikroskopialla analyysi (Fig. 2A). Käyttäen fluoresoivasti leimattua siRNA, DY547 konjugoituna siCIP2A (D-siCIP2A), on monimutkainen kasvavia määriä 599-peptidin, joka vaihtelee 1-50-kertainen molaarinen ylimäärä siRNA: iden, havaittiin, että lisäämällä P: N-suhde tehostettu toimituksen siRNA molekyylien CAL 27 suun syöpäsolujen kahden tunnin inkuboinnin jälkeen. Tarkemmin 50:1 P: N välinen suhde on osoitettu olevan suurentunut kyky indusoimaan siRNA sisäänottoa soluihin verrattuna 20:1 P: N-suhde, joka oli vain kohtalainen vaikutus. Sitä vastoin solut käsiteltiin D-siCIP2A yksin tai monimutkainen 599 peptidi klo 01:01 P: N suhde kyenneet tehokkaasti siRNA oton. Kvantitatiivisia mittauksia internalized D-siCIP2A osaksi CAL 27 soluihin kuluttua 2,5 tunnin inkubaation tukee myös, että lisäämällä 599 P: N paranivat siRNA ottoa soluihin. Erityisesti 50:1 ja 100:1 P: N suhde toimitetaan noin 18 ja 42 kertaa huomattavasti suurempia määriä D-siCIP2A, vastaavasti, verrattuna soluihin, käsiteltiin D-siCIP2A yksinään (Fig. 2B). Vertailun vuoksi kaupallisen transfektio aineen INTERFERin ™ (IFN) toimitetaan vain noin 2-kertaisesti suurempia määriä D-siCIP2A, verrattuna soluihin, käsiteltiin D-siCIP2A yksin. Huomattavaa on, että vaikka 100:1 P: N-suhde oli kykenee antamaan korkeimman määrän siRNA: iden soluihin, se indusoi merkittäviä pitkän aikavälin sytotoksisia vaikutuksia mitattuna käyttämällä ei-suunnattu siRNA (Sint) kontrolli (Fig. 2C) . Erityisesti 100:1 P: N-suhde vähensi merkittävästi solujen lisääntymistä 48 tunnin hoidon jälkeen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Sitä vastoin 50:1 P: N-suhde ei ollut merkittäviä vaikutuksia pitkän aikavälin sytotoksisuuteen. Tämän seurauksena, joka perustuu näiden havaintojen 50:1 P: N-suhde käytettiin edelleen karakterisointiin ja kokeilua.

(A) Fluoresenssimikroskopia analyysi CAL 27 suun syöpäsoluja inkuboitiin 2 tuntia DY547-konjugoidun siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia (D-siCIP2A; punainen) yksin tai monimutkainen kasvavia määriä 599-peptidin (vaihteluväli 1-50-kertainen molaarinen ylimäärä siRNA: iden). Ytimet (sininen) vasta- värjättiin DAPI. Mitta-asteikko: 50 um. (B) CAL 27-soluja inkuboitiin 2,5 tuntia D-siCIP2A yksin tai monimutkainen kasvavia määriä 599-peptidin (vaihteluväli 1-100-kertainen mooliylimäärä siRNA: iden). Vertailun solut transfektoitiin myös käyttämällä kaupallista transfektioreagenssia, INTERFERin ™ (IFN). Määrä siRNA toimitetaan soluihin pmol per mg proteiinia raportoidaan kussakin käsittelyssä normalisoida D-siCIP2A yksin. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM neljästä erillisestä kokeesta, joissa *** P 0,001, ** P 0,01 verrattuna D-siCIP2A yksinään käsiteltyjen solujen (ANOVA, Dunnettin monivertailutesti). (C) arviointi pitkäaikainen myrkyllisyys (mitattuna soluproleferaatiomäärityksessä) CAL 27 solujen 48 tunnin kuluttua hoidon joko ei-suunnattu siRNA (sint) yksin, kasvavien pitoisuuksien 599 peptidin yksin tai kasvavia määriä 599-peptidin (vaihteluväli 1-100-kertainen mooliylimäärä siRNA: iden) on monimutkainen SINT. Vertailun solut transfektoitiin myös kaupallisen transfektioreagenssin, IFN. Käsittelemättömät solut määriteltiin 100% elinkelpoisia. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM suoritettiin kolmena rinnakkaisena (n = 3), jossa *** P 0,001, ** P 0,01 käsittelemättömiin soluihin verrattuna (ANOVA, Dunnettin monivertailutesti).

karakterisointi 599 peptidi-siRNA Complex

saadaan käsitys mekanismi solun tuloa 599 /siRNA monimutkainen, solunosasijaintia 599 /D-siCIP2A kompleksi tutkittiin edelleen elävissä soluissa fluoresenssimikroskopialla yhdistettynä vaiheen kontrasti kuvia (Fig. 3A). Lähemmin tarkasteltuna on sisäistetty D-siCIP2As, se ilmestyi perustuu laajoihin pistemäinen oton rakenteessa siRNA: iden, että 599 /D-siCIP2A kompleksi endosytoitumaan. Co-värjäys kiinteiden solujen alussa endosomaaliseen markkeri EEA1, vahvisti rinnakkaispaikantumisen D-siCIP2As kanssa endosomaalisiin rakkulat (Fig. 3B), mikä osoittaa endosyyttisissä sisäistämisen tilassa.

(A) Fluoresenssimikroskopia analyysi ja overlay on faasikontrastikuvassa elävien CAL 27 suun syöpäsoluja inkuboitiin 2 tuntia DY547-konjugoidun siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia (D-siCIP2A; punainen) kompleksoitu 599 peptidi, jonka 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde. Mitta-asteikko: 50 um. (B) Epäsuora immunofluoresenssimikroskoopilla analyysi CAL 27 suun syöpäsoluja inkuboitiin 2 tuntia D-siCIP2A (punainen) kompleksoitu 599 peptidi, jonka 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde. Endosomeista (vihreä) värjättiin käyttäen kanin monoklonaalista anti-EEA1 vasta-aine. Ytimet (sininen) vasta- värjättiin DAPI. Kolokalisaation D-siCIP2A kanssa endosomeista (keltainen) havaitaan sulautuneen paneelissa ja korostetaan nuolilla. Mitta-asteikko: 25 um.

arvioimiseksi 599 peptidin suhteen hiukkaskoon ja pinnan varauksen jälkeen kompleksinmuodostus siCIP2A sekä dynaaminen valonsironta ja zeta-potentiaali mittaukset suoritettiin (Fig. 4A). Mittausten perusteella, 96%: lla hiukkasista on muodostettu keskittyivät 74 nm ja 4% 220 nm: ssä, jonka määrä painotettu kokojakauma, jossa keskimääräinen hiukkaskoko suurten väestöstä on 80 ± 0,5 nm. Zeta-potentiaali on 599 /siCIP2A kompleksi määritettiin olevan positiivinen, joiden arvo on 32,5 ± 0,5 mV. 599 /siCIP2A monimutkainen myös visualisoitiin käyttäen darkfield perustuva optinen valaistus (Fig. 4B). Käyttämällä tätä kuvantamisteknologian 599 /siCIP2A kompleksin havaittiin olevan melko yhtenäinen pallomaisia ​​rakenteita.

(A) koko jakelu- ja zeta-potentiaali on 599-peptidin kanssa kompleksoidun siCIP2A klo 50:1 peptidi-to-siRNA molaarinen suhde 20 minuuttia valmistuksen jälkeen vedessä. (B) Darkfield perustuva optinen mikroskopia kuva 599-peptidin kanssa kompleksoidun siCIP2A klo 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde 20 minuuttia valmistuksen jälkeen vedessä. Mitta-asteikko: 10000 nm.

testaamiseksi merkitys kaksi ydinosat (ts endosomissa-häiritsevä ja kationiset solu-tunkeutuva Nona (D-arginiini) jäämien annosta) in annetaan kyky 599 peptidi toimittaa siRNA: t soluihin, kaksi peptidejä syntetisoitiin koostuu joko endosomissa-häiritsevä sekvenssi (616) tai kationinen solu-tunkeutuva Nona (D-arginiini) tähteet yksinään (9R). Kun hoito CAL 27 solujen kanssa joko 599, 616 tai 9R peptidejä kompleksi D-siCIP2A klo 50:1 P: N-suhde, fluoresenssimikroskopiaa analyysit paljastivat, että vain ehjä 599 peptidi sekä endosomissa-häiritsevä ja kationisista solu-tunkeutuva Nona (D-arginiini) jäämien osuudet voisi välittää toimitus siRNA: iden soluihin, kun taas sekä 616 ja 9R peptidejä ei ollut ilmeistä vaikutusta siRNA toimitus 2 tunnin kuluttua altistuksesta (Fig. 5).

fluoresenssimikroskopia-analyysit CAL 27 suun syöpäsoluja inkuboitiin 2 tuntia DY547-konjugoidun siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia (D-siCIP2A; punainen) kompleksoitu peptidejä, 599, 616, ja 9R klo 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde. Ytimet (sininen) vasta- värjättiin DAPI. Mitta-asteikko: 50 um.

Se, että 616 peptidin tuottaa siRNA soluihin johtuu todennäköisesti sen kyvyttömyys sitoutua siRNA jopa P: N suhde peräti 100:1 (data ei näytetty). Kuitenkin tulos kanssa 9R peptidi oli hieman yllättävä, koska se on osoitettu sitovat tehokkaasti siRNA: t, jonka 50:1 P: N-suhde, joka perustuu agaroosigeelillä shift-määritys (Fig. S1A) ja voi muodostaa hiukkasia, joiden keskimääräinen koko 58,2 ± 0,2 nm, ja zeta-potentiaali arvoon 25,8 ± 0,5 mV (Fig. S1B). Koska paraformaldehydi kiinnittymistä solut voivat johtaa keinotekoista uudelleenjakautumista (Arg)

9 peptidit [27], oli mahdollista, että solujen jakautumista 9R /D-siCIP2A kompleksi on saattanut vaikuttaa tämän kemiallisen kiinnitystahnat. Siksi ottoa D-siCIP2A arvioitiin myös käyttäen kiinnitys-itsenäinen kvantitatiivinen lähestymistapa, joka vastaavasti havaittu, että 9R peptidi, joka vaihtelee 0,1-100-kertainen molaarinen ylimäärä siRNA: iden, oli kykenemätön välittämään siRNA toimitus soluihin ja on erotettavissa soluja käsiteltiin D-siCIP2A yksinään (Fig. S1C).

599 Peptide sovittelee CIP2A-proteiinia geenien suun Syöpäsolut

599 peptidi voidaan pitää tehokkaana kuljetusvehikkelinä siRNA- terapeuttisten, sen on kyettävä toimittamaan toiminnallisten siRNA: iden soluihin, jotka voivat vaientaa aiottuun geenin tavoite. Arvioida toiminnallisuutta 599 /siRNA monimutkainen, kaksi suun syöpäsolulinjoissa, CAL 27 ja SCC-25, hoidettiin 599 peptidin kompleksoitu joko siCIP2A tai Sint kontrollia, joka 50:1 P: N-suhde, jonka jälkeen sekä CIP2A-proteiinia mRNA ja proteiini tasoilla arvioitiin 48 tunnin kuluttua altistuksesta reaaliaikaisella PCR ja Western blot -analyysit, vastaavasti. Kvantitointiin real-time PCR osoitti merkittävää pudotus on CIP2A-proteiinia mRNA-tasojen sekä suun syöpäsolulinjoissa käsiteltiin 599 /siCIP2A monimutkainen verrattuna kontrolliin 599 /Sint käsiteltyjen solujen (kuvio. 6A). Tarkemmin sanottuna -60% ja -85%: n vähennys CIP2A-proteiinia mRNA-tasojen havaittiin CAL 27 ja SCC-25 suun syöpäsolulinjoja, vastaavasti. Lisäksi Western blot analyysit vahvistivat kykyä 599 peptidin välittävän toimitus toiminnallisten siRNA: iden molemmissa solulinjoissa osoittamalla tukahduttaminen CIP2A-proteiinia proteiinin tasot 48 tunnin kuluttua hoidon kanssa 599 /siCIP2A kompleksin vertailuryhmän 599 /Sint käsiteltyjen solujen ( kuva 6B). Huomattavaa on, että proteiinin tasot onkogeenisten transkriptiotekijän c-Myc arvioitiin myös sillä CIP2A-proteiinia tiedetään säätelevän siten tämän proteiinin stabiiliuden [25]. Western blot analyysit vahvistivat, että hiljentäminen on CIP2A-proteiinia aiheutti epävakautta c-Myc molemmissa solulinjoissa (Fig. 6B).

(A) Reaaliaikainen PCR-analyysi CIP2A-proteiinia mRNA tasojen CAL 27 ja SCC-25 suun syöpäsolut 48 tunnin kuluttua hoidon 599 peptidi kompleksoitu klo 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde 100 nM siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia (siCIP2A) verrattuna vertailuna kohdistamisen siRNA (Sint). CIP2A-proteiinia mRNA-tasot normalisoitiin 18S rRNA. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena, jossa ** P 0,01 verrattuna Sint käsiteltyjen solujen (Studentin t-testi). (B) Western blot analyysit CIP2A-proteiinia ja c-Myc-proteiinin ekspressiotasot CAL 27 ja SCC-25 suun syöpäsolujen 48 tunnin kuluttua hoidon 599 peptidin kompleksoitunut joko 100 nM Sint tai siCIP2A klo 50:1 peptidi-to -siRNA moolisuhde. GAPDH-proteiinin tasot seurattiin tasapuolisen lastaus näytteitä.

karakterisointi 599 /siCIP2A Complex-välitteisen RNAi Response

pyrki edelleen luonnehtia 599 peptidi välittämää hiljentäminen CIP2A-proteiinia suun syöpäsoluissa kesto geenien, annoksesta riippuvaa geenien ja toiminta hiljentäminen seerumissa arvioitiin myös. Onnistunut toteuttaminen RNAi kuin hoitomuoto riippuu näistä kolmesta keskeisiä piirteitä. Siten pyritään määrittämään pysyvyys 599 peptidin välittämän vaiennettu CIP2A-proteiinia suun syöpäsoluissa ajan, Western blot analyysit CIP2A-proteiinia proteiinin ekspressiotasot CAL 27 ja SCC-25 suullinen syöpäsolujen 1, 3, 5, 7 ja 9 päivää käsittelyn jälkeen, jossa 599-peptidin kompleksoitu joko Sint tai siCIP2A yhdellä 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde suoritettiin (Fig. 7A). Yhden hoidon jälkeen, jossa 599 /siCIP2A Äänenvaimennusjärjestelmä vaikutus havaittiin kestää 5 päivää CAL-27-solujen ja jopa 9 päivää SCC-25-solujen mahdollisimman hiljentämiseen esiintyvien 3 ja 7 päivää, vastaavasti. In annos-vaste-kokeita SCC-25-soluja (Fig. 7B), 599 peptidin havaittiin antaa siCIP2A välittämää hiljentäminen annosriippuvaisesti siRNA pitoisuudet ≥ 50 nM annetaan -100% CIP2A-proteiinia proteiinin knockdown ja siRNA alhaisina pitoisuuksina kuin 20 nM on edelleen mitattavissa hiljentäminen vaikutuksia. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin CAL 27-soluissa (tietoja ei esitetty), paitsi, että suurempi siRNA pitoisuudet (≥80 nM) on tarpeen antaa parhaimmillaan ~90% CIP2A-proteiinia proteiinia hiljentäminen. Lopuksi koska vakaus siRNA: iden on tärkeä huolenaihe RNAi-terapiassa, 599 peptidi välittämä CIP2A-proteiinia hiljentäminen arvioitiin poissa ja läsnä seerumin ja verrataan useita kaupallisesti saatavilla standardi kationisen lipidin perustuva transfektioreagensseja (Fig. 7C). Kun hoitoon SCC-25-solujen 599 /siCIP2A, ~95% CIP2A-proteiinia proteiinia, joka pudotettiin puuttuessa ensimmäisen tulon seerumin ja oli verrattavissa CIP2A-proteiinia äänenvaimennusjärjestelmän havainnoitu kaikkien kationisen lipidin perustuva transfektioreagensseilla testattu ( 99%) paitsi HiPerFect® jolla oli vain -30% vähennys proteiinia tasoilla. Merkitystä on kuitenkin se, että vaikka läsnä seerumin, 599 /CIP2A-proteiinia kompleksi voi silti tuottaa erittäin tehokas RNAi vaste -70% CIP2A-proteiinia proteiinia pudotus. Kvantifiointiin Näiden tietojen perustuivat densitometristä analysoi kolmen itsenäisen Western blot kokeissa Image J ohjelmisto [28].

(A) Western blot analyysit CIP2A-proteiinia proteiinin ekspressiotasot CAL 27 ja SCC-25 suun syöpäsolut 1, 3, 5, 7, ja 9 päivää käsittelyn jälkeen, jossa 599-peptidin kompleksoitu joko 100 nM: n ohjaus ei-suunnattu siRNA (Sint) tai siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia (siCIP2A) kanssa 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde. GAPDH-proteiinin tasot seurattiin tasapuolisen lastaus näytteitä. (B) Western blot-analyysi CIP2A-proteiinia proteiinin knockdown SCC-25 suun syöpäsolujen 48 tunnin kuluttua hoidon 599 peptidillä yksinään (5 uM) tai kompleksoitu klo 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde joko Sint (100 nM ) tai pitoisuuksien alentamista siCIP2A. CIP2A-proteiinia proteiinin tasot käsittelemättömillä soluilla analysoitiin myös vertailun vuoksi. GAPDH-proteiinin tasot seurattiin tasapuolisen lastaus näytteitä. (C) Western blot analyysit CIP2A-proteiinia proteiinin pudotus SCC-25 suun syöpäsolujen 48 tunnin kuluttua hoidon 599 peptidin kompleksoitunut joko 100 nM Sint tai siCIP2A klo 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde, läsnäollessa (+) tai puuttumista (-) seerumin, verrattuna käsittelemättömiin soluihin tai solut, joita käsiteltiin kaupallisen transfektioreagensseja Lipofectamine® RNAiMAX (RNAiMAX), Lipofectamine® 2000 (LF2000), INTERFERin ™ (IFN), ja HiPerFect®. GAPDH-proteiinin tasot seurattiin tasapuolisen lastaus näytteitä.

599 Peptide-välitteisen vaiennettu CIP2A-proteiinia Vähentää Oral Cancer Cell invasiivisuus ja Anchorage riippumattoman kasvun

Aiemmin julkaistussa kirjallisuudessa on osoittanut että CIP2A-proteiinia hiljentäminen syöpäsoluissa eri kudoksista peräisin, kuten HNSCCs, munuaiskarsinoomia, ja rintasyöpä voi olla vaikutuksia syöpäsolujen invaasiota ja ankkurista riippumaton kasvu [25], [29], [30]. Näin ollen edelleen on osoitus mahdollisista hyödyllisyyttä 599 peptidin siRNA terapeuttisten suun kautta syöpä, testasimme onko 599-peptidi-välitteisen hiljentäminen CIP2A-proteiinia voivat vaikuttaa invasiivisuus ja kiinnittämisestä riippumaton kasvu ominaisuudet suun syöpäsoluja. Johtuen siitä, että CAL 27 solut osoittivat vain lyhyt äänenvaimennusvaikutus eivätkä kasva hyvin puolikiinteässä väliaineessa [31], 599 peptidi välittämää CIP2A-proteiinia hiljentäminen vaikutukset solujen invaasiota ja ankkurista riippumaton kasvu oli testattu vain SCC- 25-soluja. Kun hoito SCC-25-solujen 599-peptidin kompleksoitu siCIP2A, havaitsimme merkittävää ~ 33%: n esto solu- invasiivisuus, verrattuna kontrolliin 599 /Sint käsiteltyjen solujen (kuvio. 8A). Lisäksi 599-peptidi-välitteisen hiljentäminen CIP2A-proteiinia SCC-25-solujen vähensi merkittävästi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ~39% verrattuna kontrolliin 599 /Sint käsiteltyjen solujen (kuvio. 8B). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että käytettäessä 599-peptidin toimia tehokkaana kuljetusvehikkelinä siRNA-pohjainen suun syöpähoitojen.

(A) kvantitointi prosenttiosuus hyökkääviä SCC-25 suun syöpäsolujen käsittelyn jälkeen 599 peptidi kompleksoitu yhdellä 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde 100 nM siRNA kohdistaminen CIP2A-proteiinia (siCIP2A) verrattuna kontrolli ei-suunnattu siRNA (Sint). Tiedot ovat keskiarvo ± SEM neljästä erillisestä kokeesta, joissa * P 0,05 verrattuna Sint käsiteltyjen solujen (Studentin t-testi). (B) ankkurointi-riippumaton kasvu SCC-25 suun syöpäsolujen käsittelyn jälkeen 599-peptidin kompleksoitu yhdellä 50:1 peptidi-to-siRNA moolisuhde 100 nM siCIP2A verrattuna ohjaus sint. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM neljästä erillisestä kokeesta, joissa * P 0,05 verrattuna Sint käsiteltyjen solujen (Studentin t-testi).

Keskustelu

RNAi-perustuvat tekniikat olisivat tehokkaita hoitomuodot, ne vaativat tehokasta solunsisäiseen antoon terapeuttisen siRNA: iden sytoplasmaan soluja. Kuitenkin, koska useimmat toimitus lähestyy liikennettä siRNA rahdin soluihin kautta endosytoosin, loukkuun näiden molekyylien sisällä endosyyttisissä vesikkelien on tullut merkittävä rajoittava vaihe [11], [12] ja näin esteen kohti tehokasta käyttöä RNAi-pohjainen hoitoja. Tämän ongelman kiertämiseksi, me suunniteltu ja testattu peptidi, kutsutaan 599, joka koostui osittain sarjoissa sekä erittäin tehokas CPP ja endosomissa-epävakautta INF-7 peptidi että kun yhdistetään mahdollistaisi tehokkaan toimittamisen kompleksoidun siRNA lastin soluihin. Tulokset Tutkimuksemme osoitti, että 599 peptidi voisi lisätä solunsisäistä hyötyosuutta siRNA: iden suun syöpäsoluissa ja tehokkaasti välittävät hiljentäminen kohdennettujen CIP2A-proteiinia onkoproteiinia on seurauksena esto suun syöpäsolun invasiivisuus ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua.

koska kovalenttisen konjugaation siRNA: iden ja CPP voi johtaa tehottomaan toimitukseen toiminnallisten siRNA: iden soluihin [18], [32], [33], 599 peptidi suunniteltiin ovat kationiset nona (D-arginiini) jäännökset, jotka toimisivat ei ainoastaan kuten CPP komponentti, mutta myös mahdollistaa ei-kovalenttinen sitoutuminen negatiivisesti varautuneiden siRNA molekyylien peptidin kautta ladattu vuorovaikutuksia. Agaroosigeelillä shift määrityksiä vahvistivat, että 599-peptidi voisi monimutkainen siRNA-molekyylejä, ja että sitoutuminen välillä 599 peptidin ja siRNA: t, näytti olevan riippuvainen nona (D-arginiini) tähteitä. Tämä oli erityisen selvää, joka perustuu siihen, että 616-peptidi, joka käsitti vain hyvin anionisten INF-7 peptidisekvenssi, ei voi sitoa siRNA: t.

tutkinta onko 599-peptidi-siRNA kompleksin muodostuminen oli riittävä indusoimaan internalisaatioon siRNA: iden soluihin, paljasti, että lisäämällä P: N suhteet lisäisi siRNA sisäänottoa soluihin kahden tunnin hoidon verrattuna soluihin käsitelty INTERFERin ™ tai alasti siRNA. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​useita muita tutkimuksia, jotka samalla tavalla havaittu, että lisäämällä pitoisuudet erityisten CPP lisäsivät siRNA hapenottokyvyn [20], [23]. Lisääntynyt käyttöönottoa siRNA: iden soluihin todennäköisimmin tapahtui korkeammilla P: N suhde perustuu useisiin tekijöihin. Ensinnäkin, koska korkeampi P: N tunnusluvut olivat tehokkaampia sitova vapaa siRNA: t liuoksessa, koska oli ilmeistä läpi agaroosigeelissä muutos määrityksissä, tämä in-osassa olisi myötävaikuttanut suurempia määriä siRNA: iden on sisäistetty soluihin. Toiseksi, koska solujen käsittely korkea solunulkoinen pitoisuuksia CPP on raportoitu indusoivan niiden internalisaatiota soluihin aktivoimalla endosytoosin [34], lisääntynyt sisäänotto siRNA: iden soluihin korkeammilla P: N suhteet voivat myös katsottu johtuvan läsnä korkeampien määriä 599-peptidin, joka tehokkaammin laukaista endosytoosin monimutkainen.

CPP välittämää sisäistämisen soluihin ohjaa kationisia tähteitä tavataan niiden järjestys ja tämä prosessi on ilmoitettu esiintyvän erilaisilla endosytoosin [18]. Tutkimuksessamme 599 peptidin havaittiin välittävän sisäistämisen siRNA: iden kahden ensimmäisen tunnin endosyyttisiin rakkuloiden ja poistamisen nona (D-arginiinista) päässä 599-peptidin, kuten on esitetty 616-peptidin, vahvistanut, että kationisten tähteet toimittamisesta siRNA lastin. Yllättäen 9R peptidi, joka koostui ainoastaan ​​kationista Nona (D-arginiini) tähteet oli vastaavasti kykenemätön tuottamaan siRNA: iden soluihin, vaikka se voisi muodostaa komplekseja siRNA.