Krooninen sairaus

tiivistelmä

ekspressio tulehduksellisten G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori CysLT

1 R: n on osoitettu olevan yliaktiivista paksusuolen syövän potilaille ja yhteydessä huonoon ennusteeseen. Tässä tutkimuksessa tutkittiin korrelaatio CysLT

1 R ja paksusuolen syövän kehityksen

in vivo

käyttäen CysLT

1 R antagonisteja (ZM198,615 tai Montelukasti) ja paljaan hiiren ksenograftimallissa. Kaksi lääkkeen antamisen hoito perustettiin. Ensimmäinen hoito perustettiin tutkimaan tärkeyttä CysLT

1 R kasvaimen aloittamista. Nude-hiiriin inokuloitiin 50 uM CysLT

1 R-antagonisti-esikäsitellyt HCT-116 paksusuolen syövän soluja, ja sai jatkuvan hoidon (5 mg /kg /päivä, intraperitoneaalisesti). Toinen hoito tarkoituksena oli korjata rooliin CysLT

1 R syövän etenemiseen. Nude-hiiriin istutettiin kuin esikäsitellyn HCT-116-soluissa ja ei saanut CysLT

1 R-antagonisti käsittelyä kunnes tallentavalle kasvain ulkonäkö. Molempia hoitoja johti merkittävästi vähentää kasvaimen koon, johtuvan muutoksia lisääntymistä ja apoptoosia määritettynä vähensi Ki-67 tasoa ja kohonneeseen p21

WAF /CIP1 (

P

0,01), pilkotaan kaspaasi 3, ja kaspaasin halkaistut tuote sytokeratiinin 18. Vähentynyt VEGF (

P

0,01) ja pienentää aluksen koon (

P

0,05) havaittiin myös, jälkimmäinen vain ZM198,615-esikäsittely ryhmä. Lisäksi teimme useita

in vitro

tutkimukset käyttäen koolonisyöpäsolulinja HCT-116 ja CysLT

1 R-antagonisteja. Sen lisäksi, että merkittäviä vähennyksiä solujen lisääntymisen, adheesion ja pesäkkeiden muodostuminen, havaitsimme solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla. Kyky Montelukasti kasvun inhiboimiseksi ihmisen paksusuolen syövän ksenografti- edelleen validoitu käyttämällä kaksi koolonsyöpäsolulinjoissa, SW-480 ja HT-29. Tuloksemme osoittavat, että CysLT

1 R-antagonistit inhiboivat kasvua paksusuolen syövän ksenograftien ensisijaisesti vähentämällä proliferaatiota ja indusoimalla apoptoosin kasvainsoluissa.

Citation: Savari S, Liu M, Zhang Y, Sime W, Sjölander (2013) CysLT

1 R salpaajien estää kasvaimen kasvu ksenograftimallia paksusuolen syöpä. PLoS ONE 8 (9): e73466. doi: 10,1371 /journal.pone.0073466

Editor: Lishan Su, University of North Carolina at Chapel Hill, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 marraskuu 2012; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2013; Julkaistu: 05 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Savari et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustusta AS Ruotsin Syöpäsäätiön (CAN 2009/1185, 10 0478), Ruotsin Medical Research Council (X-10356), Gunnar Nilsson Cancer Foundation (www.cancerstiftelsen.com), The Österlund Foundation, säätiö at Skåne yliopistollisen sairaalan, ja WS Royal physiographic Society Lund (www.fysiografen.se). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eikosanoidit ovat erilaisia ​​bioaktiivisia lipidejä aineenvaihduntatuotteiden johdettu monityydyttymätön 20-hiilen välttämättömiä rasvahappoja. Arakidonihapon kuuluu omega-6 perheen ja on esiaste eikosanoidien, kuten prostanoidit, leukotrieenit, hydroksyyli eicosatetraenoic hapot (HETEs), ja epoksidit. Nämä eikosanoidien pidetään tulehdusta; epidemiologisia, kliiniset ja laboratoriotutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava metabolia arakidonihapon kautta syklo (COX) ja lipoksigenaasin (LOX) reittejä, jotka tuottavat prostanoideja ja leukotrieenien, vastaavasti, voi edistää krooninen tulehdus ja syövän syntymistä [1], [2 ]. Epävakaa leukotrieeninsalpaajien

4 (LTA

4) muodostaa 5-LOX läsnäollessa 5-lipoksigenaasin-aktivoivan proteiinin (FLAP). LTA

4 edelleen metaboloituu joko LTB

4 tai kysteinyylileukotrieenien, LTC

4, LTD

4, ja LTE

4 [3].

kysteinyylileukotrieenien ovat mukana hengitysteiden prosesseissa, kuten liman eritystä, lisääntynyt verisuonten läpäisevyys, eosinofiilien kemotaksista, ja keuhkoputkien supistuminen [4], [5], [6], [7]. Kysteinyylileukotrieenien myös osallisena kroonisten tulehdustilojen, kuten nivelreuman, astman ja tulehduksellisten suolistosairauksien (IBD) [8], [9], [10]. Tulehduksellinen miljöö on laajalti arvostettu yhdeksi mahdollistaa ominaisuuksien syöpä [11]. Näin ollen on olemassa vahva korrelaatio pitkäaikaiset IBD, kuten haavainen paksusuolen tulehdus ja Crohnin tauti, jossa proinflammatoristen eikosanoidien (ts arakidonihapon johdannaiset) ovat runsaat ja peräsuolen syöpä [12], [13]. Peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä maailmassa ja on neljänneksi korkein kuolleisuus [14]. On arvioitu, että potilailla, jotka kärsivät IBD on noin 30-kertaisesti lisääntynyt riski sairastua paksusuolen syövän [15]. Muut eikosanoidien johdettu arachidonic polku, jotka osallistuvat paksusuolisyövän sisältävät prostanoideiksi. Prostaglandiini E

2 (PGE

2) on johdettu arakidonihappoa kautta COX-reitin ja on yleisin ja laajimmin tutkittu prostanoidi- syövän, erityisesti paksusuolen syövän. PGE

2 on osoitettu lisäävän tuumoritaakka suolistossa sekä APC

Min /+ ja azoxymethane aiheuttama hiirillä [2]. LOX-5: n ja COX-2, entsyymejä tuottamisesta vastuussa kysteinyylileukotrieenien ja PGE

2, vastaavasti, on myös osoitettu olevan osallisena paksusuolen syöpä. Heidän lisääntynyt ilmentyminen on dokumentoitu potilailla, joilla peräsuolen adenokarsinooman [16].

kysteinyylileukotrieenien välittävät niiden vaikutusten kautta G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) ja niitä kutsutaan CysLT

1 R ja CysLT

2R, joka perustuu niiden luonnehdinta ja toiminnallinen profilointi vastauksena sarjan agonistien tai antagonistien eri solu- ja kudoksen järjestelmiä [17]. CysLT

1 R on suurempi affiniteetti LTD

4, voimakkaimpia kysteinyylileukotrieenireseptoreihin, kun taas CysLT

2R on pienempi, mutta yhtä suuri affiniteetti sekä LTD

4 ja LTC

4 [18] , [19]. ZM198,615 ja Montelukasti ovat valikoivia CysLT

1 R antagonisteja tutkimuksessa käytetyt tulehdussairaudet kuten nivelreuma ja astma [20], [21]. Jälkimmäinen CysLT

1 R antagonisti käytetään myös klinikalla hoitoon astmapotilailla [22].

Tasapaino CysLT

1 ja CysLT

2-reseptori näyttää olevan tärkeä sairaus etiologiaa paksusuolen syöpä. Itse asiassa, olemme osoittaneet, että nämä kaksi reseptorit yhteistyötä lokalisoitu ja muodostaa sekä hetero-ja homodimeerien ihmisen suolen epiteelisolujen linja Int 407 ja että LTC

4 stimulaation CysLT

2R säätelee negatiivisesti ilmentymisen solun pinnalla of CysLT

1 R [23]. Aiemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että LTD

4 kautta CysLT

1 R indusoi säätelyä liittyvien proteiinien paksusuolen syövän, kuten COX-2, β-kateniinin, ja Bcl-2 suolen epiteelisolujen [24] . Lisäksi olemme osoittaneet, että CysLT

1 R ylössäädellään paksusuolen syöpäpotilaiden ja liittyy huonoon ennusteeseen [16], kun taas samanaikaisesti alhainen ilmentyminen CysLT

1 R ja korkea ilmentyminen CysLT

2R välittäjänä hyvä ennuste [25]. Lisäksi meidän edellinen työ on osoittanut, että LTD

4 aiheuttama CysLT

1 R signalointi johtaa solun lisääntymistä, eloonjääntiä, ja muuttoliike [26], [27]. Sen sijaan, LTC

4 stimulaatio CysLT

2R on osoitettu indusoivan erilaistumista paksusuolen syövän soluja, ja vähentää ilmentymistä CysLT

2R liittyy huono prognoosi potilaalle. [28]

Tässä tutkimuksessa selvitimme funktio CysLT

1 R paksusuolen syövän kasvun avulla CysLT

1 R-antagonisteja. Vaikutukset CysLT

1 R antagonisteina HCT-116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa tutkittiin sekä

in vitro

ja

in vivo

käyttäen paljaan hiiren ksenograftimallissa.

materiaalit ja menetelmät

reagenssit

CysLT

1 R-antagonisti ZM198,615 (ICI-198615) oli lahja AstraZeneca ja CysLT

1 R-antagonisti Montelukast hankittiin Cayman Chemicals Co (Ann Arbor, MI). Solujen lisääntymisen reagenssi WST-1 ja hiiren monoklonaalinen M30 CytoDEATH vasta-ainetta (1:10) olivat Roche (Basel, Sveitsi). Anneksiini V-PE Apoptosis Detection Kit oli BD Pharmingen (San Diego, CA). Quick Start ™ Bradford Dye Reagent, Mini-PROTEAN TGX ™ geelit, toissijainen piparjuuri-konjugoiduilla vasta-aineilla, ja kemiluminesenssiosoitusta reagenssi oli Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Kanin monoklonaalista anti-humaani pilkottiin kaspaasi 3-vasta-aine (1:200) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kanin monoklonaalista anti-ihmis-Ki67-vasta-aine (1:500) saatiin Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Vuohen polyklonaalista anti-hiiri-PECAM-1 (CD31) -vasta-ainetta (1:700) ja kanin polyklonaalista anti-humaani-VEGF-vasta-aine (1:200) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-ihmis-p21

WAF1 /CIP1-vasta-aine (1:1200) oli peräisin DakoCytomation (Glostrup, Tanska). Kaniinin polyklonaalista anti-ihmis-CysLT

1 R-vasta-aine (1:250) saatiin Innovagenilta (Lund, Ruotsi). Hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine oli Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kysteinyylirajatulla Leukotriene EIA kit hankittiin Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Kaikki muut kemikaalit olivat analyyttistä laatua ja hankittiin Chemicon International (Temecula, CA) tai Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Cell Culture

HCT-116-solut ( ATCC

® CCL-247), joka on johdettu ihmisen paksusuolen karsinooma, SW-480 (ATCC

® CCL-228) ja HT-29 (ATCC

® HTB-38), johdettu ihmisen paksusuolen adenokarsinooma, saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA).

HCT-116 ja HT-29-soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, kun taas SW-480-soluja viljeltiin RPMI 1640. Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 55 ug /ml streptomysiiniä, 55 IU /ml penisilliiniä, ja 1,5 ug /ml fungitsonia. Soluja kasvatettiin 5 päivää 70

–

80

%

konfluenssiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Kaikki kokeet suoritettiin soluilla kohtia 5-30, ja solut testataan säännöllisesti varmistaa puuttuminen mykoplasmakontaminaation.

-tuumoriksenografti Studies

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin alueellinen eettinen komitea eläinten Research Lundin yliopistossa Ruotsissa (M205-10). Naaras 6-8-viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude-hiiriä (BalbC nu /nu) hankittiin Taconic Europe A /S (Ry, Tanska). Indusoida ihon alle ihmisen paksusuolen syövän ksenograftien, 2,5 x 10

6 low-kanavan HCT-116 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin kahden kylkien per hiiri (n = 7 hiirtä /ryhmä). Kaksi lääkkeen antamisen hoito perustettiin tutkimaan toiminnallinen merkitys CysLT

1 R-antagonistit kasvaimen aloittamista ja etenemistä. Hoidettujen eläinten mukaan ensimmäinen hoito ympättiin HCT-116-soluja esikäsitellään joko DMSO: ssa (DMSO I), 50 uM ZM198,615 (Pre-ZM), tai 50 uM montelukasti (Pre-montelukasti), 30 min. Solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisinivärin syrjäytymisen määritys ja vain elävät solut katsottiin injektiona ihon alle. Sen jälkeen, päivästä, rokotus, hiiret saivat päivittäin i.p. injektiota DMSO: ssa tai CysLT

1 R-antagonisteja (5 mg /kg) liuotettuna DMSO: hon, laimennettiin PBS yhteensä 100 ul: n (kuvio 1A). Mukaan toinen hoito, eläimet rokotettiin kuin esikäsitellyn HCT-116-soluissa. Kun kouraantuntuva kasvaimet perustettiin 6 vuorokauden kuluttua injektion jälkeen hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään ja päätti sitten, mihin ryhmään tulee hoitaa DMSO (DMSO II), ZM198,615 tai montelukasti. Hiiret saivat päivittäin i.p. injektiot DMSO tai CysLT

1 R antagonisteja (5 mg /kg) (kuvio 1 E).

(A) Kokeellinen protokolla esikäsittely- ryhmiin; BalbC (nu /nu) hiiriin injektoidaan subkutaani- kahteen kupeet HCT-116-solujen esikäsitelty ZM198,615 tai Montelukast (50 uM), ja sai hoitoa vatsaonteloon päivästä, istuttamisen DMSO, ZM 198,615, tai montelukasti (5 mg /kg /päivä). (B) Kasvaimen esiintyvyys hiiriä hoidettiin DMSO (DMSO I ryhmä), ZM198,615 (Pre-ZM ryhmä), tai Montelukast (Pre-Montelukasti ryhmä) ja (C) kasvaimen painoa verrattuna DMSO I ryhmän lopussa kokeen (päivä 21). (D) edustaja kasvain kuvia esikäsittely ryhmästä. (E) Kokeellinen protokolla hoitoon tutkimuksen; ei-esikäsitellyt HCT-116-soluja injektoitiin ihonalaisesti kahteen paljaiden hiirien kylkiin. DMSO (DMSO II ryhmä), ZM198,615 (ZM ryhmä), tai Montelukast (Montelukasti ryhmä) hoito aloitettiin päivänä 6 kasvainsoluinokulaation jälkeen. (F) Tuumoritilavuudet yli 21 päivän kuluessa ja (G) kasvaimen painon kokeen lopussa (päivä 21). (H) edustaja kasvain kuvia hoitoryhmässä. Määrälliset tiedot näytetään ovat keskiarvo ± SEM. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001. Kasvaimen tilavuus analyysi suoritettiin kaksisuuntainen ANOVA ja tuumorin paino analyysi suoritettiin Studentin

t

testiä.

Lisäksi, SW-480 tai HT-29-soluja, 2,5 x 10

6 matala-passage solua 100 ui PBS injektoitiin kahteen kylkiä kohti hiirtä (n = 12 ja n = 18 hiirtä SW-480 ja HT-29, tässä järjestyksessä), joilla ihonalainen ihmisen paksusuolen syövän ksenograftien naisten 6 -to 8 viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude-hiiriä (BalbC nu /nu). Kaikki hiiret olivat perustaneet kouraantuntuva kasvaimia molempiin kylkiin päivänä 7 ja satunnaistettiin kahteen ryhmään kutakin solulinjaa. Ennen aloittamista hoitoja, yksi tutkija mitattuna kasvain koot kaikista kasvaimista varmistaa, ettei koko eroa eri ryhmien välillä. Hiiret sitten Vastaanotetut päivittäin ip injektiot 14 päivän ajan joko DMSO tai montelukasti (5 mg /kg) (= 6 ja n = 9 hiirtä per hoitoryhmän SW-480 ja HT-29, tässä järjestyksessä).

hiiren kehon painoa ja kasvaimen koko mitattiin joka kolmas päivä. Laskentakaava kasvaimen tilavuus oli

V

= π /6 × 1,58 (

pituus x leveys

)

3/2 [29]. Jälkeen 21 päivää, kaikki hiiret tapettiin, ja kasvaimet poistetaan, mitattu, punnittiin, ja valokuvattiin. Kasvaimen kudokset kiinnitettiin 10% puskuroidussa formaliinissa, upotettiin parafiiniin immunohistokemiaan analyysiä ja /tai jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: Western blot -analyysiin.

annos montelukasti (5 mg /kg) valittiin sen perusteella, julkaistut tiedot, jossa annoksina 5-10 mg /kg, on raportoitu erilaisia ​​hiiriä kokeellisissa malleissa [30], [31], [32]. Annostukset 2 mg /kg ja 10 mg /kg tutkittiin myös ja tulokset osoittavat samankaltaisia ​​suuntauksia ksenograftin kasvaimen kasvun inhibitiota (tuloksia ei esitetty).

immunohistokemia

Parafiini upotettujen leikkeiden saatu alkaen ksenosiirrettyjä kasvaimet leikattiin (5 um) immunohistokemiallista värjäystä. Kaikki toimenpiteet suoritettiin käyttäen Dako automaattista dia värjäyslaitteella mukaan valmistajan ohjeiden. Objektilasit valokuvattiin Nikon Eclipse 800 mikroskoopilla ja arvioitiin sokkona kaksi tarkkailijaa itsenäisesti. Koko Ki-67 värjätyt leikkeet skannattiin Aperio ScanScope CS (Aperio Technologies, Inc, Vista, CA) ja alueella, jossa värjäys oli erityisen yleistä (eli hot spot) tunnistettiin kuhunkin kasvaimeen käyttäen pienitehoinen kenttä (× 40). 3 suuritehoisia kentän (x 400) kuvia valittiin analyysiin kussakin hot spot. Käyttämällä NIS-Elements kynnys asetettiin määrittää ja mitata suhde Ki-67 positiivista värjätään alueen koko suuritehoisia kentän alueella. Arvio apoptoottisten solujen suoritettiin havaitseminen kaspaasin lohkaistaan ​​tuote sytokeratiini 18 CytoDEATH (M30). Riippuen kasvaimen kokoa, 5-10 satunnainen kentät valittiin, ja keskimääräinen apoptoottisten solujen määrä per kenttä mitattiin (x 200). Ainetta, joka kohdistetaan CD31 käytettiin määrällisesti mikroverisuonitiheys (MVD). Kuvat (× 100) otettiin kolmella alueella, joilla on korkein mikroverisuonitiheys ulkonäkö (eli hot spots) ja keskiarvon CD31-positiivisten määrä lasketaan. Arvioida alueen CD31-positiivisten rakenteiden (alus alue), kuvat tallennettiin TIFF-tiedostot. Positiivinen värjäytyminen kvantitoitiin käyttäen Adobe Photoshop kynnyksen toiminto ja yhdistettynä histogrammi analyysejä. Keskimääräinen useita myönteisiä pikseleitä per kasvain jakso kolmesta kriisipesäkkeisiin kirjattiin.

Western Blot

lohkaistun kaspaasi 3 ja CysLT

1 R analyysit, viljeltiin soluja 5 päivää 70% konfluenssiin. Vain kiinnittyvä HCT-116, SW-480 ja HT-29-solut kerättiin CysLT

1 R analyysejä. Analysoitaessa pilkotun kaspaasi 3 käytimme sekä pysyvä ja kelluva HCT-116-soluissa. Solulysaatit valmistettiin ja liukoiseksi näytepuskurissa, kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Proteiini uuttamalla ksenosiirrettyjä kasvainkudoksessa suoritettiin sonikoimalla. Lyhyesti, tuumorikudokset 700 ui jääkylmää vähentää latauspuskuria (62,5 mM Tris, pH 6,8, 6 M ureaa, 10% glyserolia, ja 2% SDS: ää), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (2 mM Na

3Vo

4, 4 ug /ml leupeptiiniä ja 60 ug /ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia), tehtiin sonikoimalla jäissä 30 sekuntia. Kokosolulysaateista sentrifugoitiin 3400 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Bromifenolisini (0,003%) ja merkaptoetanolia (5%), lisättiin näytteeseen supernatanteista. Proteiinit erotettiin elektroforeesilla betonielementtien tahansa kD ™ SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin sähkön PVDF-kalvoja. Membraanit blokattiin joko 5% rasvatonta maitoa tai 5% BSA: ta 0,05% Tween /PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineella yön yli 4 ° C: ssa. Lopuksi kalvot inkuboitiin sopivan sekundäärisen vasta-aineen, joka on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja havaitaan kemiluminesenssimittaus reagenssilla. Immunoblottausmääritys tulokset näkyviksi Molecular Imager ChemiDoc XRS Järjestelmä ja Image Lab ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories).

proliferaatiotestillä

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä WST-1 soluproleferaatiomäärityksessä mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena tasapohjaisille 96-kuoppalevyille 1500 solua /kuoppa ja kasvatettiin 24 tunnin ajan elatusaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää. Sen jälkeen soluja käsiteltiin CysLT

1 R-antagonistien eri ajankohtina. Inkubaation jälkeen 10 ui WST-1-reagenssia 90 min, imeytymistä näytteiden mitattiin 440 nm: ssä käyttäen Tecan Infinite M200 levylukijalla.

virtaussytometria

Cell cycle ja solujen kuolema mittaukset arvioitiin virtaussytometrillä. Lyhyesti, HCT-116-solut olivat seerumin puutteessa yön yli ja käsiteltiin CysLT

1 R-antagonistit tuoreessa väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua, joka tarttuu ja kelluvat solut kerättiin ja pestiin PBS: llä. Solusyklin profiilit, solut heti vahvistettu 70% (v /v) etanolia, käsiteltiin 0,1% natriumsitraattia ja 100 ug /ml RNaasi A, ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa 50 ug /ml propidiumjodidia. Apoptoosin induktio määritettiin elinkelpoisten solujen käyttämällä anneksiini V-PE Apoptosis Detection Kit valmistajan ohjeiden mukaisesti protokollaa. Kaikki virtaussytometristen mittaukset suoritettiin käyttäen FACS Calibur virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA), ja analyysit suoritettiin käyttäen FCS Express, versio 4.0 (De Novo Software).

adheesiomäärityksellä

HCT-116 solut suspendoitiin väliaineeseen, joka sisälsi 2% FBS: ää, jonka tiheys on 2,0 x 10

5 solua /ml, ja sitä käsiteltiin tai ilman CysLT

1 R-antagonisteja 30 min ajan 37 ° C: ssa, ennen kuin pinnoitus tasainen -bottomed 12-kuoppalevyille (Corning, 1 ml /kuoppa). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 1 tunti, minkä jälkeen suoritettiin kolme pesua PBS: llä poistamaan irrallista soluihin. Kiinnityksen jälkeen 4% formaldehydiä 15 minuutin ajan, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin kristallivioletilla (5 mg /ml 2% etanolia) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi solut pestiin perusteellisesti, ja värjäys julkaistiin käyttäen 2% SDS PBS: ssä. Värjäytymisintensiteettiä kvantitoitiin spektrofotometrillä 550 nm: ssä käyttäen Tecan Infinite M200 levylukijalla.

Soft Agar Pitoisuus

HCT-116-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 2% FBS: ää kanssa tai ilman CysLT

1 R-antagonisteja. Lyhyesti, 1 ml 0,5% agar /kuoppa (pohjakerroksen), lisättiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin jähmettyä vähintään 1 tunti huoneenlämpötilassa. Sitten 1,0 × 10

4 solut suspendoitiin 1 ml: aan väliainetta, jossa 0,35% agaroosia (ylin kerros). Eri annoksilla CysLT

1 R-antagonistit lisättiin agaroosi (pintakerros) ja agaria (pohjakerros), ennen kuin ne asetettiin kuoppiin. Vielä 2 ml: aan kasvatusliuosta, joka sisältää CysLT

1 R-antagonisteja yläpuolella pintakerros. Elatusaine vaihdettiin joka 3 päivä tai ilman lisäämällä CysLT

1 R-antagonisteja. Sen jälkeen, kun 14 päivää inkuboinnin 37 ° C: ssa, pesäkkeitä visualisoitiin värjäämällä 0,005% kristalliviolettia. Kuvat otettiin käyttäen ChemiDoc ™ XRS + System ja pesäkkeet laskettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

kysteinyylileukotrieenireseptoreihin entsyymi-immunomääritys

Soluja viljeltiin 5 päivän 70-80% konfluenssiin. Päivänä 4 median muutettiin ja kerättiin 5. päivänä for kysteinyylileukotrieenireseptoreihin erottamisen kiinteän faasin uuttaminen Sep-Pak Vac RC (C18-500 mg) patruunoita Water Corporation (Milford, MA). Kysteinyylileukotrieenireseptoreihin tuotanto mitattiin entsyymi-immuno- mukaan valmistajan ohjeiden.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin Prism Software (GraphPad, Inc.), ja tilastollinen merkitys tiedot olivat määritetään

P

0,05. Vertailun kahteen ryhmään, joko pariksi tai parittomat

t

testi (Opiskelijan

t

testi) käytettiin. Yksisuuntainen tai kaksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaamaan useita ryhmiä. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

Tulokset

CysLT

1 R salpaajien Vähennä Vieraslajisiirteen Tumor Growth

paksusuolisyövän ksenografti mallia käytettiin vaikutusten tutkiminen CysLT

1 R antagonisteina syövän kasvua

in vivo

. Tutkia vaikutuksia CysLT

1 R-antagonistien kasvainten aloittamisesta, me ympätty nude-hiiriin, joissa HCT-116-solut esikäsitellään CysLT

1 R-antagonisteja. Hoito aloitettiin välittömästi joko ZM198,615 tai montelukasti (5 mg /kg /vrk) päivänä istuttamisen jälkeen. Hiiret tapettiin 21. päivänä, ennen kasvainten saavuttanut 1 cm

3, mukaan eettinen lupa (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1B, kasvaimen esiintyminen viivästyi merkittävästi Pre-ZM ryhmä (4 kasvaimet) verrattuna DMSO I ryhmä (12 kasvaimia) päivänä 6. Lisäksi montelukasti esikäsittely estivät täysin HCT-116 kasvaimen sukupolvi. Keskimääräinen kasvaimen paino väheni merkittävästi Pre-ZM ryhmässä verrattuna DMSO I ryhmä (0,165 ± 0,048 g

vs.

0,372 ± 0,082 g, kuvio 1 C).

Lisäksi tutkimme vaikutuksia CysLT

1 R antagonisteina taudin etenemiseen siirrostamalla nude-hiirten kanssa kuin esikäsitellyn HCT-116-soluissa. Sen jälkeen tallentava kasvain aloittamisen (6. päivänä), CysLT

1 R antagonisti käsittelyt suoritettiin 2 viikon ajan (kuvio 1 E). Päivänä 21, keskimääräinen kasvaimen koon ZM198,615 ja Montelukast ryhmissä oli huomattavasti pienempi kuin kasvaimia DMSO II ryhmä (490,1 ± 66,21 mm

3 ja 336,9 ± 55,38 mm

3

vs.

711,6 ± 82,6 mm

3

P

0,05 tai

P

0,001, vastaavasti) (kuvio 1 F). Vastaavasti keskimääräinen kasvaimen paino ZM198,615 ja Montelukast ryhmissä verrattuna DMSO II ryhmässä oli merkitsevästi pienempi (kuvio 1 G; 0,31 ± 0,037 g ja 0,22 ± 0,036 g

vs.

0,424 ± 0,038 g, tässä järjestyksessä,

P

0,05). Kuvio 1D ja H edustavat kasvain kuvia kustakin ryhmästä. Yhteenvetona nämä tulokset tukevat hypoteesia, että CysLT

1 R on tärkeää paksusuolen syövän kasvua.

CysLT

1 R salpaajien leviämisen vähentämiseksi ja apoptoosin

vieressä tutkineet taustalla olevien mekanismien jolla CysLT

1 R-antagonisteja aiheutti niiden estäviä vaikutuksia kasvaimen kasvuun. HCT-116 tuumorisektioiden värjättiin leviämisen merkki Ki-67 tai apoptoosin merkki M30 CytoDEATH. Yleisin Ki-67 värjättyä alue valittiin kullekin ksenografti kasvain ja kolme suuritehoiset kenttä kuvia tällä alueella analysoitiin edelleen. Ki-67 on näillä valituilla alueilla kohtalaisesti vähentynyt Pre-ZM ryhmä (Pre-ZM

vs.

DMSO I ryhmään, kuvio 2A ja B) ja tilastollisesti merkitsevästi (

P

0,05) vähentynyt hoitoryhmissä (ZM198,615

vs.

DMSO II ryhmä, kuvio 2C ja D). Apoptotic solujen määrä lisääntyi hieman kasvaimissa edeltävään ZM ryhmä (Pre-ZM

vs.

DMSO I ryhmään, kuvio 2E ja F) ja hoitoryhmissä (ZM198,615 tai Montelukast

vs.

DMSO II ryhmä, kuvio 2G ja H).

(A ja C) edustaja Ki-67-värjättyä kuvia parafiinileikkeitä ksenograftikasvaimissa (x 400). (B ja D) Yksi Ki-67-värjättyä hot spot valittiin kustakin kasvain ja 3 erilliset alueet näissä kriisipesäkkeisiin analysoitiin suurella teholla kentän (x 400). Ki-67 positiivinen alue jae määritettiin suhde värjätään alueen kokonaismäärään suuri teho peltoalasta. (E ja G) edustaja M30 CytoDEATH-värjättyä kuvia parafiinileikkeitä ksenograftikasvaimissa (x 200). Musta ja valkoinen nuolet osoittavat positiivisesti värjäytyneiden solujen. Boxed alueiden tärkein paneelit näkyy positiivisesti värjäytyneiden solujen merkitty valkoisella nuolia suuremmalla suurennuksella (x 400). (F ja H) Keskimääräinen apoptoottisten solujen määrä per kenttä määritettiin M30- positiivinen määrä (mustat nuolet) mediaani kokoinen vierassiirrettä tuumorisektioiden otettu keskiosa. Määrälliset tiedot näytetään ovat keskiarvo ± SEM. *

P

0,05 Studentin

t

testiä.

vaikutukset CysLT

1 R-antagonistien kasvaimen verisuonten muodostumista tutkittiin värjäämällä CD31 , endoteelisolujen-antigeenin. Havaitsimme hieman vähentynyt aluksen numero kohdissa edeltävään-ZM ryhmässä verrattuna DMSO I ryhmässä (46,1 ± 6,7

vs.

56,0 ± 7,9; Kuvio 3A ja B). Vascular numero ei ole ainoa parametri osoittaa riittävää kasvain verenkierron; alus alue on myös kriittinen tekijä kasvaimen verenvirtauksen [33]. Tuumorisektioiden edeltävään ZM ryhmä, huomasimme, että astiat ilmestyi pienempi ja ohuempi, ja oli vähemmän aluevaltaus. Kasvain alusten DMSO I ryhmässä esiintyi enemmän kypsä lumenia, paksut seinät, ja voimakas CD31 värjäytyminen pitkin niiden pituuksia. Siksi mittasimme CD31-positiivista värjäytymistä alueilla. Kuten kuviossa 3C, kasvaimia edeltävään ZM198,615 ryhmä oli tilastollisesti merkitsevä (

P

0,05) vähentynyt tarkoittaa, että CD31-positiivinen alue verrattuna kasvaimia DMSO I ryhmä (2596 ± 121,4 pikseliä

vs.

3900 ± 522,3 pikseliä, vastaavasti), mikä vastaa 33%: n vähennys. Ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja keskimääräinen alusten lukumäärä ja verisuonten koko joukossa hiirillä hoitoryhmissä (DMSO II

vs.

ZM198,615 tai montelukasti; kuvio 3D, E ja F). Pelkistetty verisuonten koon kasvainleikkeissä edeltävään-ZM ryhmä osoitti, että CysLT

1 R-antagonisti hoitoa 21 päivän voisi estää kasvaimen verisuonten muodostumista ja ovat voimakkaampia vaikutusta kasvaimen etenemiseen.

(A ja D) edustaja CD31 värjättyä kuvaa (x 100). (B ja E) Aluksen tiheys määritettiin CD31-positiivisten määrä kolmessa eri alojen (hot spots). (C ja F) kvantitatiivinen analyysi CD31-positiivisten alueilla käyttäen Adobe Photoshop. Määrälliset tiedot näytetään ovat keskiarvo ± SEM. *

P

0,05 Studentin

t

testiä.

Seuraavaksi ekspressiotasot valittujen proteiinien mukana solusyklin, apoptoosin, ja angiogeneesi oli tutkittu. p21

WAF /CIP1, potentiaalinen solusyklin estäjä, osoitettiin olevan merkitsevästi yliaktiivista kasvain näytteet Pre-ZM ryhmässä verrattuna DMSO I ryhmän (

P

0,01; kuvio 4A) . Havaitsimme myös kohtalaisesti kohonnut katkaistun kaspaasi 3-fragmentit (kuvio 4B) ja laski merkittävästi ekspressiotasot VEGF (

P

0,05; kuvio 4C), tuumoreiden Pre-ZM ryhmässä verrattuna DMSO I ryhmä. Samanlainen analyysi tehtiin hoitoryhmissä (ZM198,615 tai Montelukast

vs.

DMSO II). Merkittävästi lisääntynyt ekspressiotasot p21

WAF /CIP1 (

P

0,01; kuva 3D) ja vähenivät ekspressiotasot VEGF (

P

0,05; kuvio 4D) voisi olla havaittu, että montelukasti-hoidetussa ryhmässä, mutta ei ZM198,615 käsitellyssä ryhmässä verrattuna DMSO II ryhmä. Kohonnut katkaistun kaspaasi 3-fragmentit havaittiin myös hoitoryhmissä (ZM198,615 tai montelukasti

vs.

DMSO II) (kuvio 4E).

Kasvaimen näytteitä (kolme tai neljä kasvaimia kussakin ryhmässä) tehtiin Western blot-analyysi. Kalvot tutkittiin koettimella varten (A ja D) p21

WAF /CIP1; (B ja E) lohkaistaan ​​kaspaasi 3; ja (C ja D) VEGF: ää. Data normalisoitiin perusteella β-aktiini tasot. Densitometrinen analyysi proteiinin ilmentymisen on keskiarvo ± SEM. *

P

0,05, **

P

0,01 Studentin

t

testiä.

CysLT

1 R antagonistit leviämisen vähentämiseksi ja Pakotettava G

1 pidätys HCT-116 solut

Koska havaitsimme, että CysLT

1 R-antagonisti hoito voisi estää kasvaimen kasvua

in vivo

osittain indusoimalla solukierron pysähtymisen olimme vieressä kiinnostuneita vahvistamaan tämän toteamuksen

in vitro

. Sen tutkimiseksi, CysLT

1 R-antagonistit ollut suoraa vaikutusta paksusuolensyöpä soluproliferaatioon, WST-1 soluproleferaatiomäärityksessä suoritettiin. Hoidon kasvavien pitoisuuksien kanssa ZM198,615 aiheutti eston HCT-116-solujen lisääntymisen annoksesta riippuvalla tavalla. Päivänä 4, solujen kasvua käsiteltiin 12,5, 25 ja 50 uM ZM198,615 väheni 11%, 31%, ja 88% vastaavasti, verrattuna DMSO-käsiteltyjen kontrollisolujen (kuvio 5A). Kun sama pitoisuuksia Montelukasti kuin ZM198,615 käytettiin, havaitsimme vielä vahvempi vaikutus solujen kasvun esto; 35%, 88% ja 100% oli 12,5, 25, ja 50 uM montelukasti, vastaavasti, verrattuna DMSO-käsiteltyjen kontrollisolujen (kuvio 5B). Olemme ensi tutkinut, CysLT

1 R-antagonisti-välitteistä kasvun eston HCT-116-solujen johtui solusyklin intervention. Huomasimme, että montelukasti indusoi solusyklin pidätyksen HCT-116-solut 24 tuntia G

1 vaihe. Kuten kuviossa 5C, oikea paneeli, 81% ja 87% käsiteltyjen solujen 12,5 ja 25 uM Montelukast vastaavasti olivat G

1 vaihe verrattuna 64% käsiteltyjen solujen DMSO.