Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MicroRNA-34a (miR-34a) on transkription tavoite p53 ja on alassäädetty haimasyövän. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia toiminnallinen merkitys miR-34a haimasyövän etenemisen kautta epigeneettisellä palauttaminen kromatiinin modulaattorit, demetyloimalla agentti 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) ja HDAC estäjä Vorinostat (SAHA).

Menetelmät /Principal havainnot

Re-ilmentyminen miR-34a ihmisen haimasyövän kantasolut (CSCS) ja ihmisen haimasyövän solulinjoissa käsiteltäessä 5-atsa-dC ja SAHA: esti voimakkaasti solulisäkasvumäärityk-, solusyklin etenemistä, itseuudistumisen, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja hyökkäystä. Haiman CSCS, modulaatio miR-34a aiheuttaman apoptoosin aktivoimalla kaspaasi 3/7. Hoito haiman CSCS kanssa kromatiinin-moduloivat aineet johti inhibitio Bcl-2, CDK6 ja SIRT1, jotka ovat oletetun tavoitteita miR-34a. MiR-34a säätelyä näillä aineilla indusoi myös asetyloitua p53, p21

WAF1, p27

KIP1 ja PUMA haiman CSCS. Esto miR-34a mukaan antagomiR kumoaa vaikutukset 5-atsa-dC ja SAHA: viittaa siihen, että 5-atsa-dC ja SAHA: säätelemään kantasolujen ominaisuuksia kautta miR-34a. Vuonna CSCS, SAHA esti Notch polku, mikä viittaa sen tukahduttaminen voi edistää estämällä kyky uusiutua ja apoptoosin induktion. Mielenkiintoista, hoito haiman CSCS kanssa SAHA johti esto EMT kanssa transkription säätely ylöspäin E-kadheriinin ja alas-säätely N-kadheriinin. Expression of EMT induktorien (Zeb-1, Snail ja Slug) estyi CSCS käsittelemällä SAHA. 5-atsa-dC ja SAHA: myös hidastamaan

in vitro

muuttoliike ja hyökkäys CSCS.

Johtopäätökset

Tämä tutkimus osoittaa siten rooli miR-34a kriittiseksi säädin haimasyövän etenemisen mukaan säätelemällä CSC ominaisuudet. Palauttamalla sen ilmentymisen 5-atsa-dC ja SAHA: in CSCS ei ainoastaan ​​tarjota mekanistinen tietoa ja terapeuttisia kohteita haimasyövän mutta myös lupaavia reagenssit lisätä potilaan vastaus nykyisiin kemoterapian avulla tai itsenäisenä syöpälääkkeen poistamalla CSC ominaisuudet.

Citation: Nalls D, Tang SN, Rodova M, Srivastava RK, Shankar S (2011) Targeting Epigeneettiset asetus miR-34a hoito Haimasyöpä mukaan esto Haimasyöpä Stem Cells. PLoS ONE 6 (8): e24099. doi: 10,1371 /journal.pone.0024099

Toimittaja: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2011; Julkaistu: 31 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Nalls et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia National Institutes of Health (R01CA125262, RO1CA114469, 3R01CA114469-05S1, ja 3R01CA125262-03S1), Kansas Bioscience Authority, ja Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa ja on tuhoisa invasiivista sairautta ja yksi aggressiivinen syövät [1]. Huono ennuste haiman adenokarsinooma johtuu sen myöhäinen esittäminen, epätäsmällisistä biomarkkereita varhaisen diagnoosin mahdollisuudesta parantava resektio sekä taipumusta varhaisen etäpesäke. Siksi uusien diagnostisten yksityiskohdista varhaisen diagnoosin ja uusia hoitostrategioita tarvitaan kiireesti.

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä, ei-koodaavaa pieni RNA: t 19-25 nukleotidin pituisia, jotka nyt tunnustetaan ratkaiseva post transkription sääntelyviranomaisten geenien ilmaisu [2], [3], [4]. Kyky miRNA säädellä useita geenejä mukaisia ​​niitä tärkeitä rooleja biologisista prosesseista, jotka vaikutus syövän etenemiseen kuten muuttoliike, invaasio, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja etäpesäkkeiden [5], [6], [7], [8] [9], [10]. MiRNA ovat erittäin lupaavia jo biomarkkereita, prognostisia indikaattoreita ja mekanismi, joka perustuu terapeuttisia kohteita syöpähoitoihin [11], [12], [13], [14], [15], koska niiden poikkeavasta ilmaisuja ovat sidoksissa syövän kantasoluja (CSC) sääntelyn purkaminen ja siten oncogenesis [16].

Syöpä kantasolut aiheuttaa kasvain irtotavarana jatkuvalla itseuudistumiseen ja erilaistuminen [17]. Haiman CSCS ovat erittäin tuumorigeenisemmiksi ja itsensä uudistamiseen väestöryhmästä jotka ilmentävät solunpintamarkkeria CD133 + /CD44 + /CD24 + /ESA + [17], [18], [19]. Strategioita kehitetään kohti suunnattu tuhoutumisen vuoksi kasvain kantasolujen säästäen fysiologiset kantasoluja, jotka voivat johtaa merkittävästi parantaa potilaiden hoitotuloksiin. Muuttamalla spesifisten miRNA joka voi olla tärkeä rooli haiman CSC uusimiseen ja voi siten edistää haiman karsinooman, auttaisi saavuttamaan selektiivinen ja kohdennettua poistaminen haiman CSCS. Siksi ymmärtäminen mekanismeja, jotka säätelevät itseuudistumisen on mitä tärkein löytö syöpälääkkeiden kohdistaminen CSCS.

TP53 on tärkeä tuumorisuppressorigeeniä joiden biologiset vaikutukset johtuvat suurelta osin sen toimintaa transkription säädin [20 ]. TP53 mutaatiot ovat suhteellisen yleisiä ja esiintyy jopa 70%: ssa tapauksista, joissa haiman adenokarsinooma ja yleisimmin nähty huonosti eriytetty kasvaimissa [21], [22], [23], [24], [25]. Kasvain vaimennin TP53 on tunnistettu transkription säätelijänä miR-34a ja useat viimeaikaiset tutkimukset ovat sekaantuneet MIR-34 perheen miRNA p53 tuumorisuppressorin verkkoon [20], [26]. miR-34a on erittäin ilmentyy normaaleissa kudoksissa, kuten kiveksissä, keuhkoissa, lisämunuaisissa ja perna, vaikka sen fysiologista toimintaa ei tunneta. miR-34a on paikallistettu ihmisen kromosomissa 1p36, joka on alueella liittyy erilaisia ​​syöpiä, ja sen on osoitettu olevan alassäädetty haimasyövän [20]. Vähentynyt ilmentyminen miR-34a haimasyövän voi olla tuloksena joko kopioinnin säätely johtuen p53 mutaatioita koska nämä ovat hyvin yleisiä [22] tai epigenetic hiljentäminen. Siksi ymmärtäminen maksuja näiden mekanismien alas säätely miR-34a haimasyövän, joka voi myötävaikuttaa pahanlaatuisuuden haima, voi olla merkitystä.

MiR-34a toimii vaimennin neuroblastooma tuumorigeneesiin kohdistamalla koodaavan mRNA E2F3 ja vähentää E2F3 proteiinin tasot [27]. On myös osoitettu olevan hyper-metyloitu rinta-, munasarja-, paksusuoli-, keuhko- ja hematologisia syöpäsairauksia ja säätelevät vaimentaen CDK6 kääntämisen mikä osoittaa tuumorisuppressorigeenin rooli miR-34a [28], [29], [30]. MIR-34a reagoiva geenejä hyvin rikastettu niille, jotka säätelevät solusyklin etenemisen, solun jakautumista, apoptoosia, DNA: n korjaukseen, ja angiogeneesin tarjoten siten toimivan pohjan epigeneettisenä inaktivoimiseksi tämän miRNA haimasyövän [31].

on hyvin tunnettua, että monet tuumorisuppressorigeeneille ihmisen syövissä vaiennetaan promoottori metylaation mukana kromatiinin muutoksia johtuen rekrytoinnin histoni deactylases proteiinien sitoutuminen metyloiduksi CpG-tähteitä. Nämä epigeneettisiä merkkiaineita, jotka liittyvät vaiennettaisi tuumorisuppressorigeeneille voivat myötävaikuttaa kasvaimen etenemistä ja voivat olla terapeuttisesti palautuva, palvelevat kohteina haimasyövän hoitoon. Tämän perusteella lähtökohta, me määrällisesti ilmaus miR-34a ihmisen haiman CSCS ja haimasyövän solulinjoissa riippumatta p53-mutaation tila, verrattuna normaaliin haimatiehyen epiteelisolujen käyttäen TaqMan miRNA määrityksiä.

Notch signaalit tiedetään vaikuttavan kantasolujen selfrenewal ja erilaistumista, ja on ehdotettu olevan rooli aikana haiman syövän synnyn [32], [33]. Useat jäsenet Notch signalointireitin ilmaistaan ​​haimassa [32]. Lovi reseptorit aktivoituvat Delta ja Serrate /Jagged ligandeilla [34], jotka edistävät proteolyyttisen katkaisun ja vapauttamaan Notch intrasellulaarisen domeenin (ICD). Aktivoitu Notch-ICD translokoituu tumaan ja vuorovaikutuksessa transkriptiotekijä CSL /RBP-JK ja koaktivaattoria Mastermind (MAM) aktivoi kohdegeenien kuten Hes1 ja Hes5 [35], [36], ja Hes ilme voi siksi voidaan käyttää luki varten Notch toimintaa [37].

Nykyinen tutkimukset ovat paljastaneet, että ekspressiotasot miR-34a vähensi merkittävästi haiman CSCS ja haimasyövän kasvainsoluja riippumatta heidän p53 mutaatiostatuksesta riippumatta, verrattuna tavanomaisten haimatiehyen epiteelisolujen. Tämä johtaa meidät oletuksen, että miR-34a, näin voidaan epigeneettiseltä vaientaa haimasyövän. Vähentäminen miR-34a-geenin metylaatio ja muuttunut asetylaatio kuvio käyttämällä kromatiinin modifioivat aineet johti samanaikainen aktivoituminen miR-34a ilme. Expression of miR-34a haiman CSCS ja solulinjoissa oli merkitsevästi indusoidun käsiteltäessä chromatin muuttamiseen demetyloimalla agentti 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) tai histonideasetylaasi estäjä, SAHA (vorionostat). 5-atsa-dC ja SAHA: esti myös kasvua ja aiheutti apoptoosia haiman CSCS. Edelleen ymmärtää toiminnallista roolia miR-34a säätelyssä haimasyövän etenemisen vaikutus 5-atsa-dC ja SAHA: proteiinin ilmentymistä otaksuttu tavoitteista miR-34a haiman CSCS tutkittiin. 5-atsa-dC inhiboi ilmentymistä sykliini D1 ja CDK4: n ja päinvastoin indusoi ilmentymistä p27

/KIP1, ja nämä vaikutukset kumottiin läsnä ollessa miR34a antagonisti. Samoin SAHA alassäädetty ilmaisua SIRT1, sykliini D1 surviviiniperäiset, Bcl-2, VEGF ja CDK6, ja sääteli ilmentymistä p21 ja PUMA annoksesta riippuvaisella tavalla. Edelleen hoito haiman CSCS kanssa kromatiinin määritteet johti eston itseuudistumisen, EMT, muuttoliike ja hyökkäys haiman CSCS

in vitro

. Modulaatio ilmentymisen miR-34a mukaan SAHA: esti mRNA ilmaus eri osien Notch koulutusjakson, mikä viittaa siihen, että miR-34a voi olla osallisena haiman CSC itseuudistumisen. Zeb-1, etana ja Slug transkription ilmentyminen väheni huomattavasti ihmisen haiman CSCS ja haimasyövän solulinjoissa käsittelemällä SAHA. Tuloksemme osoittavat, että miR-34a saattaa olla tärkeä rooli sääntelyn haiman kasvaimien syntyyn. Tämä on tähän asti, ensimmäinen osoitus esto haiman CSC piirteistä epigeneettisellä modulaatio miR-34a terapia intervention käyttäen 5-atsa-dC ja SAHA:. Siksi palauttaminen miR-34a ilmentymisen 5-atsa-dC ja SAHA: haiman CSCS tarjoavat paitsi ainutlaatuisia työkaluja tutkinnan miRNA toiminto, mutta myös lupaavia reagenssia lisätä potilaan vastaus nykyisiin kemoterapian avulla tai itsenäisinä syöpälääke.

tulokset

Expression ja restaurointi miR-34a haiman CSCS ja solulinjoissa

ensin mitataan ilmentymistä miR-34a ihmisen haiman CSCS johdetut kasvaimia ja haimasyöpä solulinjat [ASPC-1 (p53wt) ja MiaPaca-2 (p53mutant)] ja verrattiin normaaliin haimatiehyen epiteelisolujen kvantitatiivisen RT-PCR (RT-PCR-Taqman) ja Taqman Real Time määritykset. Vertaileva Ct (ΔΔCt) menetelmää käytettiin määrittämään ilmaisua kertainen muutos miR-34a haiman syöpäsoluissa verrattuna normaaliin haiman epiteelisolujen. Kokonais-RNA input normalisoitui perustuu Ct saatuja arvoja RNU48 käytettiin endogeeninen kontrolli. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten haimasyövän [20], havaitsimme maailmanlaajuinen lasku ilmaus miR-34a haiman CSCS ja solulinjat riippumattomia p53 mutaatiostatuksesta riippumatta suhteessa ei-neoplastisten haiman epiteelisolujen (Fig. 1A).

(A) Suhteellinen ilmentyminen miR-34a kvantitoitiin ihmisen haimasyövän solulinjoissa ASPC-1 (p53wt), MiaPaca-2 (p53mutant), ihmisen haimasyövän kantasolut (PanCSC) ja ihmisen haiman normaali duktaaliseen epiteelin solut (HPNE). (B) Palauttaminen miR34a mukaan SAHA ja Aza-5DC. Haimasyövän solulinjoissa ASPC-1 (p53wt), MiaPaca-2 (p53mutant) ja haimasyövän kantasoluja käsiteltiin SAHA (3 uM) tai Aza-5DC (4 uM) 24 tuntia. Ekspression miR-34a kvantifioitiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR (RT-PCR-Taqman) ja Taqman Real Time määritykset, ja normalisoitiin RNU48 ilmentymisen. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (C), Anti-miR34a estää kyky SAHA ja Aza-5DC palauttaa miR34a. Haiman CSCS transfektoitiin lyhytaikaisesti joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotidi, ja käsiteltiin SAHA (3 uM) tai Aza-5DC (4 uM) 24 tuntia. RNA uutettiin mitata ilmentymisen miR34a Q-RT-PCR: llä kuten edellä on kuvattu. NC = negatiivinen kontrolli. (D), miR34a-lusiferaasireporttiterilla aktiivisuutta. Haiman CSCS transfektoitiin joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotideja yhdessä miR34a-Luc rakentaa, ja käsiteltiin joko SAHA (1 uM) tai Aza-5DC (2 uM) 24 tunnin ajan. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05.

Mir-34a on tiiviisti mukana suuri CpG saari viittaa siihen, että se voidaan epigeneettiseltä vaientaa haimasyövän. Todistaa tämän hypoteesin, tutkimme mikäli alennettu ilmentyminen miR-34a haimasyövän voidaan palauttaa käsittelemällä DNA-metylaation inhibiittori, 5-atsa-dc ja /tai histonideasetylaasi-inhibiittori, SAHA. Mielenkiintoista, miR-34a ilmentymistä haiman CSCS ja haimasyövän solulinjoissa [ASPC-1 ja MiaPaca-2] kasvoi merkittävästi hoidon jälkeen nämä kromatiiniin määritteet verrattuna mock käsiteltyihin kontrolleihin, mitattuna qRT-PCR (Kuva. 1 B) käyttäen Taqman Real Time määritykset käyttäen vertailevaa Ct (ΔΔCt) menetelmällä. Kokonais-RNA input normalisoitui perustuu Ct saatuja arvoja RNU48. Nämä tulokset osoittavat, että 5-atsa-dC ja SAHA: indusoi palauttaminen miR-34a haiman syöpäsoluissa. Tiedot viittaavat myös siihen, että epigeneettisellä muuttaminen säätelysekvensseihin CpG-saarekkeiden ja deasetylaatiolla histonien voi myötävaikuttaa miR-34a hiljentäminen haimasyövän. Edelleen esto miR-34a mukaan antgomiR kumoaa vaikutukset 5-atsa-dC ja SAHA: palautumiseen ilmentymisen miR-34a haiman CSCS viittaa siihen, että 5-atsa-dC ja SAHA: säätelemään kantasolujen ominaisuus läpi miR-34a ( kuva 1C).

vieressä tutki transkription säätely miR-34a CSCS by miR-34a-lusiferaasireportteri määritys (kuva 1 D). SAHA ja 5-atsa-dC indusoi miR-34a-lusiferaasivaikutusta, mikä viittaa toiminnallista roolia miR34a haiman CSCS.

lisääntymisen merkkejä miR-34a inhiboi soluproliferaatiota, ja indusoi apoptoosia sekä solukierron pysähtymisen ihmisen haiman CSCS

Tutkimme vaikutus 5-atsa-dC ja SAHA: proliferaatioon haiman CSCS trypaanisini värjäystä. 5-atsa-dC ja SAHA: n vaikutuksesta inhiboitui merkittävästi solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla haiman CSCS (Fig. 2A). Lisäksi tutkimme näiden vaikutukset kromatiinin modulaattoreiden on apoptoosin induktio ja kaspaasi-3/7 aktiivisuutta haiman CSCS anneksiini-V: n ja PI-värjäyksellä, ja kaspaasi-3/7 aktiivisuuden määritys kit, tässä järjestyksessä. 5-atsa-dC ja SAHA: indusoi apoptoosia CSCS annoksesta riippuvalla tavalla, joka oli yhteydessä lisääntyneeseen kaspaasi-3/7 aktiivisuus (Fig. 2B ja C).

(A), haiman CSCS käsiteltiin jossa SAHA (3 ja 5 uM) ja 5-atsa-dC (2 ja 4 uM) ja solujen elinkelpoisuus mitattiin 48 tunnin värjäämällä trypaanisinisellä käyttäen Vi-cELL-analysaattori (Beckman laskuri). (B), haiman CSCS olivat käsittelemättömiä (a) tai käsitelty SAHA (b) tai 5Aza-dC (c) 48 tuntia, ja apoptoosi mitattiin värjäämällä anneksiini-PI käyttäen Accuri -virtaussytometrillä. (C), kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin haiman CSCS käsiteltiin SAHA (0,5 ja 2 uM) tai 5-atsa-dC (1 ja 3 uM) 24 tuntia. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05.

Ymmärtääksemme paremmin biologisen merkityksen palauttamisen miR-34a, ASPC-1-soluja käsiteltiin tai ilman SAHA ja sen vaikutuksista solusyklin jakautumisen tutkittiin PI-värjäyksellä käyttämällä virtaussytometrialla (tietoja ei esitetty). SAHA johtuvan kasvun pysähtymisen G2 /M vaiheessa solusyklin 24 h AsPC-1-soluissa. Lisäksi SAHA aiheuttama G2 /M pidätyksestä kumottiin läsnäollessa miR-34a antagonisti verrattuna negatiiviseen kontrollioligonukleotidit viittaa siten osallistumista miR-34a solusyklin pidätti SAHA (tuloksia ei ole esitetty).

vaikutus 5-atsa-dC ja SAHA: on otaksuttu tavoitteisiin miR-34a haiman CSCS

Koska miR-34a on mukana itse uudistaa kapasiteetti ja etäpesäke haiman CSCS, ilmaus otaksuttu tavoitteista miR-34a haiman CSCS käsittelemällä 5-atsa-dC ja SAHA: tutkittiin Western blot-analyysi (Fig. 3A ja B). Tuloksemme osoittavat, että 5-atsa-dC ja SAHA: moduloida proteiinin ekspressiotasot olevan suoraa kohdegeenien miR-34a. Mielenkiintoista, SAHA esti ilmaus sykliini D1 ja CDK6 ja ylös säädellään ilmentymistä p21 /CIP1 haiman CSCS (Fig. 3A). SAHA esti myös ilmentymisen SIRT1, surviviini, Bcl-2, VEGF, ja indusoi ilmentymistä asetyloitu p53 ja puma annoksesta riippuvalla tavalla. Samoin, 5-atsa-dC inhiboi ilmentymisen Notch3, CDK6, surviviini ja Bcl-2, ja indusoi ilmentymistä p21 /CIP1 ja PUMA annoksesta riippuvalla tavalla. Koska SAHA esti ilmentymisen SIRT1 kautta säätely ylöspäin miR34a, tutkimme seuraavaksi vaikutuksia SAHA on SIRT1 3’UTR-lusiferaasireportterilla aktiivisuutta. SAHA esti SIRT1 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3C). Vertailun, SAHA ei ollut vaikutusta SIRT1 mutantti 3’UTR-lusiferaasiaktiivisuutta (joissa ei ole toiminnallista miR34a sitoutumiskohta). Nämä tiedot viittaavat siihen, että MiR-34a inhiboi SIRT1 ilmentymisen kautta miR-34a-sitoutumiskohdan alueella 3 ’UTR: SIRT1.

(A), haiman CSCS käsiteltiin kanssa tai ilman SAHA: ssa 48 tuntia. Ekspression asetyloitu-p53, p21, PUMA, SIRT1, CDK6, CyclinD1, surviviini ja Bcl-2 mitattiin Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B), haiman CSCS käsiteltiin kanssa tai ilman 5Aza-dC: ssa 48 tuntia. Ilmentymistä p21, PUMA, Notch 3, CDK6, surviviini ja Bcl-2 mitattiin Western blot-analyysi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C), SIRT1 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuus. Haiman CSCS transdusoitiin joko SIRT1 3’UTR-Luc rakentaa tai SIRT1 mutantti 3’UTR-Luc rakentaa, ja sitä käsiteltiin SAHA (0-3 uM) 24 tunnin ajan. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Data edustaa keskiarvoa ± SD. *, # Ja% = merkittävästi erilaisia ​​kuin kontrolli, P 0,05.

Lisäksi, manipuloimalla ilmentyminen miR-34a käyttäen miR-34a antagomiR muuttaa proteiinin ilmentymistä sen kohdegeenien (Fig. 4A ja B). 5-atsa-dC ja SAHA: estää ilmentymistä solusykliä säätelevien proteiinien (sykliini D1 ja CDK2) ja VEGF, ja ylös säätelee ilmentymistä p27 /KIP1 haiman CSCS. Transfektio antagomiR Mir-34a oli yksinään riittävä kumota tätä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että uusia ja merkittäviä mekanismi, jonka 5-atsa-dC ja SAHA: välittävät niiden vaikutukset solujen kasvuun ja apoptoosin haiman CSCS.

(A), haiman CSCS transfektoitiin lyhytaikaisesti joko negatiivisen kontrollin (salattu ) tai anti-miR34a oligonukleotidi ja käsiteltiin Aza-5DC (4 uM) 48 tuntia. Western blot -analyysi suoritettiin mittaamaan ilmentymisen sykliini D1, CDK2, p27: n ja VEGF. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B), haiman CSCS transfektoitiin lyhytaikaisesti joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotidi ja käsiteltiin SAHA (3 uM) 48 tuntia. Western blot -analyysi suoritettiin mittaamaan ilmentymisen sykliini D1, CDK2, p27: n ja VEGF. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C), asetus VEGF-B 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuutta by Aza-5DC. Haiman CSCS transfektoitiin joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotideja yhdessä VEGF-B: n 3’UTR-LUC rakentaa, ja käsiteltiin Aza-5DC (0-3 uM) 24 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Data edustaa keskiarvoa ± SD. *, @ Tai # = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (D), asetus VEGF-B 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuutta. Haiman CSCS transfektoitiin joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotideja yhdessä VEGF-B: n 3’UTR-LUC rakentaa, ja käsiteltiin SAHA (0-3 uM) 24 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Data edustaa keskiarvoa ± SD. *, @, # = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05.

Koska 5-atsa-dC esti VEGF: n ilmentymistä kautta lisäävä säätely miR34a, tutkimme seuraavaksi vaikutuksia 5- atsa-dC VEGF-B 3’UTR-lusiferaasireportteri aktiivisuutta (Fig. 4C). 5-atsa-dC esti VEGF-B: n 3’UTR-lusiferaasireportteri aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Vertailun vuoksi, anti-miR34a esti inhiboivia vaikutuksia 5-atsa-dC lusiferaasiaktiivisuuteen. Koska SAHA esti VEGF: n ilmentymistä kautta lisäävä säätely miR34a, tutkimme myös vaikutuksia SAHA VEGF-B 3’UTR-lusiferaasireportterilla aktiivisuutta. Kuten osoitettu kuvassa. 4D, SAHA esti VEGF-B: n 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Vertailun vuoksi, anti-miR34a esti estäviä vaikutuksia SAHA lusiferaasiaktiivisuuteen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että säätely ylöspäin miR-34a 5-atsa-dC ja SAHA: voi olla toiminnallinen merkitys sääntelystä Notch ja itseuudistumisen.

vaikutus miR-34a palauttaminen ekspressioon kantasolujen uusiminen geenit

Notch signalointi on osoitettu rooli kantasolujen uudistumista ja solujen kohtalon päättäväisyyttä hermo, hematopoieettisten ja alkion kantasolujen [38]. Jagged 1 ilme kantasolujen indusoi itseuudistumiseen kantasolujen vuoksi Notch aktivaatiota [39]. Notch reseptoreita, ligandeja sekä alavirran tavoitteet on tunnistettu voimistuvan esiuudiskasvuisissa vaurioiden invasiivisia haimasyöpä ihmisen ja hiirillä, mikä viittaa siihen, että lovi signalointi voi olla varhainen tapahtuma, joka johtaa kertymiseen erilaistumattomia esiastesolujen haimasyöpä. Osoitamme, että uudelleen täytäntöön ilmentymistä miR-34a haiman CSCS käsiteltäessä SAHA, aiheuttaa eston mRNA ilmaus kaikkien osien Notch koulutusjakson, Notch-reseptori Notch1, Notch 3 ja sen ligandin Jagged1 ja loppupään Notch kohdegeenin Hes1 ilmaisu (Fig. 5A). Down sääntely Notch saattaa siten vaikuttaa eston kantasolujen uudistamista ja invasiivisen kapasiteettia haiman CSCS.

(A), Haiman CSCS käsiteltiin SAHA (1 ja 3 uM) 24 tunnin ja ilmentymä Notch1, JAGGED1, NOTCH3 ja HES1 mitattiin qRT-PCR. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Tai $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), RBP-JK-reportterin aktiivisuuden. Haiman CSCS transfektoitiin joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotideja yhdessä RBP-JK-LUC rakentaa, ja käsiteltiin SAHA (0-3 uM) 24 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Data edustaa keskiarvoa ± SD. *, # Tai @ = merkittävästi erilaisia ​​kuin kontrolli, P 0,05.

Koska SAHA esti ilmentyminen useiden komponenttien Notch reitin, seuraavan kerran mitattu RBP-JK-reportterin aktiivisuuden lusiferaasianalyysissä ( kuva 5B). SAHA esti RBP-JK-Lusiferaasiaktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Vertailun vuoksi, anti-miR34a esti estäviä vaikutuksia SAHA on RBP-JK-lusiferaasiaktiivisuus. Nämä tiedot viittaavat siihen, että säätely ylöspäin miR-34a by SAHA: voi olla toiminnallinen merkitys sääntelystä VEGF.

vaikutus miR-34a palautettiin epiteelin-mesenkymaalitransitioon haiman CSCS

EMT induktio syöpäsoluissa tulosten hankinnassa invasiivisen ja metastaattisen ominaisuudet [40]. Siksi tutkittiin miten miR-34a ennallistamisen EMT asetuksessa haiman CSCS. Zeb-1 on tärkeä EMT aktivaattorin ja estää ilmentymisen tyvikalvon komponenttien ja solun polariteetti tekijät mikä edistää etäpesäkkeiden syöpäsoluja. Zeb-1 transkription estyi merkittävästi haiman CSCS ja syöpäsolulinjoissa käsittelemällä SAHA (Fig. 6A ja B). Me tutkimme seuraavaksi vaikutus SAHA ilmenemistä muiden EMT transkriptiofaktoreiden Snail ja Slug haiman CSCS. Yhdessä SAHA johti estoon Etana, etana ja Zeb1 transkriptio (Fig. 6B), mikä viittaa rooli miR-34a on käänteinen EMT siirtymisen haiman CSCS. Kiinnostavaa kyllä, 5-atsa-dC esti myös transkription Slug (tietoja ei ole esitetty), joka voi mahdollisesti olla rooli inhibitio hyökkäystä.

(A), haimasyöpä solulinjat [ASPC-1 (p53wt ) ja MiaPaca-2 (p53mutant)] ja haiman CSCS käsiteltiin SAHA (1 uM) 24 tunnin ajan, ja ilmentyminen Zeb1 mitattiin qRT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), haiman CSCS käsiteltiin SAHA (1 uM) 24 tunnin ajan ja ilmentymistä Snail, Slug ja Zeb1 mitattiin qRT-PCR: llä. HK-GAPD käytettiin endogeenisen normalisointia ohjaus. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (C), asetus Zeb-1 3’UTR reportteriaktiivisuutta. Haiman CSCS transfektoitiin joko negatiivinen kontrolli (salattu) tai anti-miR34a oligonukleotideja yhdessä Zeb1 3’UTR-Luciferase konstrukti, ja käsiteltiin SAHA (0-3 uM) 24 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega). Data edustaa keskiarvoa ± SD. *, #,% = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (D), haiman CSCS käsiteltiin SAHA (1 uM) tai 5-atsa-dC (2 uM) 24 tunnin ajan ja ilmaisu E-kadheriinin ja N-kadheriinin mitattiin qRT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * = Merkitsevä ero ohjaus, P 0,05.

Koska SAHA esti ilmentymistä Zeb-1 kautta lisäävä säätely miR34a, tutkimme myös vaikutuksia SAHA on Zeb1 3’UTR-lusiferaasia reportteriaktiivisuutta. Kuten osoitettu kuvassa. 6C, SAHA esti Zeb-1: n 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Vertailun vuoksi, anti-miR34a esti estäviä vaikutuksia SAHA on Zeb-1: n 3’UTR-Lusiferaasiaktiivisuus. Nämä tiedot viittaavat siihen, että säätely ylöspäin miR-34a by SAHA: voi olla toiminnallinen merkitys on EMT sääntelyä estämällä Zeb-1.

kadheriinin kytkin on osoitettu tapahtua EMT sääntelyä. Hoito haiman CSCS kanssa SAHA ja 5-atsa-dC yksin indusoi ilmentymisen E-kadheriini ja inhiboi ilmentymistä N-kadheriinin, mikä osoittaa, että miR-34a on voimakas indusoija epiteelin fenotyypin (Fig. 6D).

5-atsa-dC ja SAHA: estävät muuttoliike, pesäkkeiden muodostumista, invaasio ja pallojakaantuminen muodostumista

edelleen ymmärtää vaikutusta säätely ylöspäin miR-34a ilme invasiivisen potentiaalia haiman CSCS, tutkimme seuraavaksi vaikutus 5-atsa-dC ja SAHA: haiman CSCS käyttäen naarmu muuttoliike, pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista, ja siirtokuoppaan Boyden kammion hyökkäystä määrityksiä. Edustavia mikrovaloku- solujen valtaavat kautta tyhjästä luotu torjunta- ja 5-atsa-dC ja SAHA: käsitellään haiman CSCS verrokkeja vähemmän muuttoliikettä hoidetussa ryhmässä paneeli verrattuna hallita ryhmään (Fig. 7A).

(A ), mikrovalokuvat osoittavat tulokset in vitro kulkeutumista haiman CSCS käyttämällä yksinkertaista scratch-tekniikkaa. Haiman CSCS kasvatettiin yksikerroksisessa, naarmuuntunut ja käsiteltiin SAHA ja 5-atsa-dC: ssa 24 tuntia. (B), SAHA ja 5-atsa-dC estävät pesäkemuodostusta CSCS. Haiman CSCS ympättiin pehmeällä agarilla ja käsiteltiin SAHA (1 ja 3 uM) tai 5-atsa-dC (2 ja 4 uM) ja 21 päivää. Lopussa itämisaika, pesäkkeet laskettiin. Data edustaa keskiarvoa ± SD. * Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (C), CSCS maljattiin Matrigel-päällystetty kalvo yläosassa kammioon transwell ja käsiteltiin SAHA (1 ja 3 uM) tai 5-atsa-dC (2 ja 4 uM) 48 tunnin ajan. Solut tunkeutuneet alempaan chambered kiinnitettiin metanolilla, värjätään ja valokuvataan. (D), haiman CSCS ympättiin suspensiona ja käsiteltiin SAHA (1 ja 3 uM) tai Aza-5DC (2 ja 4 uM) ja 7 päivää. Kuvat sferoidien muodostettu suspensiossa vietiin mikroskoopilla.

5-atsa-dC ja SAHA: vähensi kykyä haiman CSCS muodostaa pehmeän agarin pesäkkeitä verrattuna kontrolliin (Fig. 7B) ja transfektio anti-miR-34a mitätöidä vaikutuksia 5-atsa-dC ja SAHA: kolonioiden muodostumista (tietoa ei esitetty). Invasion of haiman CSCS läpi Matrigel päällystetty kalvo osoitti, että määrä tunkeutumaan solujen estyi merkittävästi 5-atsa-dC ja SAHA: käsiteltyjä soluja, ja oli noin 75% pienempi kuin solujen määrä valtaavat kontrolliryhmässä (Fig. 7C) . Edelleen, 5-atsa-dC ja SAHA: inhiboivat sferoidi muodostumista haiman CSCS kuten kuviossa. 7D. Nämä tulokset osoittavat, että miR-34a saattaa olla tärkeä rooli sääntelyn Haiman kasvaimen kehittymisen estämällä kyky uusiutua haiman CSCS, etäpesäkkeitä ja invaasiota.

Keskustelu

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät ilmentymistä muiden geenien transkription inhibitio tai translaation tukahduttaminen. Kertyvät todisteet viittaavat rooli MikroRNA ihmisen syövän synnyn uusina tyyppisiä tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [41], [42]. Äskettäin miR-34a perheenjäsenten todettiin suoraan säädellä TP53, ja funktionaalisen aktiivisuuden miR-34a osoitti mahdollisen aseman tuumorisuppressorina. Osoitamme tässä tutkimuksessa, että miR-34a ilmentymistä säädeltiin ihmisen haiman CSCS ja haiman kasvain solulinjojen riippumatta p53 mutaatiostatuksesta riippumatta.