Krooninen sairaus

tiivistelmä

CD44 on transmembraani- hyaluronihappoa reseptorin geeni, joka koodaa yli 100 erilaista kudosspesifisiä proteiini-isoformit. Eniten läsnä, CD44 standardia, on käytetty syövän kantasoluja merkki munasarjojen ja muiden syöpien. Expression epiteelin CD44 variantti sisältää eksonit v8-10 (CD44v8-10) on liittynyt enemmän solunsalpaajaresistentti ja etäpesäkkeitä ruuansulatuskanavan ja rintasyöpiä, mutta sen rooli munasarjasyövän ei tunneta; siksi tutkittiin sen käyttöä prognostinen markkeri tässä sairaudessa. Geeni-ilmentymisen profiilit 254 kasvaimen näytteiden Cancer Genome Atlas RNAseqV2 analysoitiin läsnäolon CD44-isoformeja. Suuntaus pidempään eloonjäämistä havaittiin potilailla, joiden ilmentymistä CD44-isoformien, jotka sisältävät eksonit v8-10. Immunohistokemiallinen (IHC) analyysi kasvainten esiintymisen CD44v8-10 suoritettiin riippumaton kohortin 210 potilailla, joilla on korkea-asteen serous munasarjasyöpään käyttämällä kasvainkudoksen mikrosirun. Potilas kerrostuminen perustuva ohjelmisto analyysiin värjäys paljasti tilastollisesti merkittävän kasvun eloonjäämisen potilailla, joilla huippunimistä transmembraanisen proteiinin ilmentymisen (top 10 tai 20%) verrattuna niihin, joilla pienin lauseke (pohja 10 ja 20%) (p = 0,0181 , p = 0,0262 vastaavasti). Expression of CD44v8-10 perusterveydenhuollossa munasarjasyövän solulinjoissa korreloi pääasiassa epiteelin fenotyyppi ominaista korkea ilmentyminen epiteelin merkkiaineiden ja heikkoa ilmentymistä mesenkymaalisten merkkiaineiden qPCR, Western blot, ja IHC. Kääntäen, havaitseminen proteolyyttisesti ja liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin CD44v8-10 potilaiden Askites näytteissä korreloi merkittävästi huonompi ennuste (p 0,05). Näin ollen läsnä on transmembraani- CD44v8-10 pinnalla primaarikasvaimen solut voivat olla markkeri erittäin epiteelituumori paremman ennusteen, kun taas entsymaattisesti CD44v8-10, kuten havaitaan läsnä liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin askitesnesteessä, voidaan ilmaisee enemmän etäpesäkkeitä ja huonompi ennuste.

Citation: Sosulski A, Horn H, Zhang L, Coletti C, Vathipadiekal V, Castro CM, et al. (2016) CD44 Splice Variant v8-10 markkerina seroosit munasarjasyöpä Ennuste. PLoS ONE 11 (6): e0156595. doi: 10,1371 /journal.pone.0156595

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

vastaanotettu: 28 syyskuu 2015; Hyväksytty: 17 toukokuu 2016; Julkaistu: 02 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Sosulski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen tiedot tiedostoja tai TCGA verkkosivuilla osoitteessa https://cancergenome.nih.gov/.

rahoitus: kirjoittajat saanut mitään erityistä rahoitusta tähän työhön.

kilpailevat edut: laatijat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yleisin kuolinsyy naisten gynekologinen syöpä maailmassa, jossa on korkea kuolleisuus johtuu pitkälle jossa se on diagnosoitu, tyypillisesti pitkän ajan kuluttua vatsaonteloon metastaaseja on tapahtunut [1]. Jotta etäpesäke esiintyy, munasarjasyöpä soluilla on usein muuttaa proteiinien ilmentymisen mukana soluväliaineen vuorovaikutuksen, kuten CD44, moduloimaan invaasio [2, 3]. Kuten soluadheesiomolekyylille ja suuri solunulkoinen glykoproteiini, hyaluronihappo reseptori CD44 on liitetty kasvaimen invaasion ja metastaasin rinta-, keuhko-, ja maha-suolikanavan syöpien [2].

CD44 koodaa enintään 20 eksonit, joista 10 kutsutaan muunnelma eksonit. Standardi isoformi (CD44s) sisältää vain 10 eksonia, mukaan lukien ensimmäinen 5 eksonia 5′-pään ja viimeisen 5 eksonit 3′-päähän, mikä puuttuu variantti eksonit keskellä, jota kutsutaan v1-v10 tai eksonit 5a -15 standardin nimikkeistön [1, 4, 5]. CD44s on kaikkein läsnä isoformin, laajasti ilmaistuna pinnalla useimmissa kudoksissa ja kaikissa hematopoieitic soluihin, joissa se on vastuussa imusolun itseohjautuva ja muut solu-solu- ja solu-soluväliaine vuorovaikutuksia. Suuri määrä vaihtoehtoisen silmukoinnin isoformien CD44 olemassa, jotka sisältävät yhdistelmän variantin eksonien (V1 kautta V10) työnnetään jukstamembraani- ekstrasellulaarisen alueen valvonnassa epiteelin liitos säätelevien proteiinien (ESRP) 1 ja 2 [6]. Monet CD44 variantin isoformeja on kudosspesifinen ilmaisu; CD44v8-10 ilmentyy epiteelikudoksissa ja epiteelin-tyypin karsinoomien haiman, eturauhasen, rinnan, ja keuhkojen [7], jossa se on tutkittu laajasti, koska spesifinen merkki pahanlaatuisten solujen, joissa lisääntynyt ekspressio havaittu mahalaukun syövän syntymistä hiirimallissa ja adenooma ja karsinooma etenemistä paksu- ja peräsuolisyövän [8-10] ja syöpien [11].

CD44s ja CD44 variantti isomuodot ovat sekaantuneet lääkeresistenssin ja tunnistettu kantasolujen merkkiaineita [ ,,,0],12]. Munasarjasyövän, tutkimukset käyttäen ilmaus CD44s ja sen muunnelma isoformien arvioida ennusteeseen ovat tuottaneet ristiriitaisia ​​tuloksia, joidenkin osoittaa vähentynyt ennuste, ja parannetaan muita ennuste, tai ei lainkaan vaikutusta [13]. Kuitenkin tutkimukset isoformit sisältävät eri yksittäisiä muunnos eksonien munasarjasyöpä ovat yleensä ehdottanut parannettua kokonaiselossaoloaikaa liittyy liitos isoformia CD44 [14]. Epiteelin silmukointivariantti 8-10, jotka ilmentävät V8, V9, ja V10 yhdessä, ei ole tutkittu korkealaatuisesta serous munasarjasyöpä; Siksi on luotettavuus ja toteutettavuus ennustamisessa ennuste oli tässä tutkimuksessa tutkittu.

Materiaalit ja menetelmät

Cancer Genome Atlas (TCGA) data-analyysi

Expression data (Level 3 ) on dokumentoitu CD44s ja CD44 variantti isoformeja kasvainten munasarjan vakavien kystadenokarsinooma analysoitiin kohortin 255 oppiaineiden TCGA (kun sensurointi näytteitä toistuva kasvaimia ja keskittymällä vain korkea-asteen tauti (G2 ja G3)). Käytimme Level 3, jotta vältettäisiin uudelleen analysoimalla raaka aineistot; lisätietoja löytyy alkuperäinen julkaisu [15]. Perustuen merkinnän tiedosto RNAseqV2 analyysi (S1 taulukko), me määritelty CD44 isoformin kuin v8-10 sisältävän eksonit chr11: 35229652-35229753: +, chr11: 35231512-35231601: + ja chr11: 35232793-35232996: +. Survival analyysi ylhäällä ja alhaalla 10% perustuen tarkoittaa ilmaus kolme (v8-10) eksonit, ajettiin käyttäen ”säilyminen” ja ”survMisc” paketin R. Tarkemmin sanottuna käytimme Supremum (Renyi) versio log-rank-testi, joka on suunniteltu analysointiin rajan eloonjäämiskäyrien.

Tuumorikudoksen Micro-array analyysit

toinen kohortti 210 korkealaatuisesta munasarjojen serous kystadenokarsinooma potilasta sairaalaan Massachusetts General Hospital ja Brigham and Women n sairaala Dana Farber Cancer Center välillä 1993-2009 [16] tutkittiin alla sisäisen arvioinnin board (IRB) hyväksyttyjen käytäntöjen (MGH2007P00001918 tai DFCI 02-051). Kasvaimen kairausnäytteitä (3 mm) saatiin alkuperäisen debulking leikkauksen, sijoitettiin mukaan Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique (FIGO) ohjeet, ja oli formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut. Kaikki kasvaimet koepaloja, hävittää de identifioitu Askites näytteitä, ja vastaavat potilastiedot kerättiin alle IRB-hyväksyttyjen käytäntöjen jälkeen kirjallinen suostumus saatiin. Jokainen uusi parafiiniblokkiin sisälsi 24 sattumanvaraisesti jakautunut kasvaimen ydintä, jossa on vähintään 2 ydintä potilasta kohden, ja leikattiin 7 mikronin paksuuteen, kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. Immunohistokemia suoritettiin liukuu kasvaimen mikrosiru (TMA) kohdat, kuten aiemmin on julkaistu [16] ennen estetty käyttäen liuosta, jossa 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja 2%: aasi seerumin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 1 tunnin ajan huoneen lämpötila, inkuboitiin vasta-aineen CD44v8-10 (CD44v9 RV3) [4] 1: 12500 yön kosteutetussa kammiossa 4 ° C, pestiin PBS: llä, ja niitä inkuboitiin käyttäen sekundaarinen vuohen anti-rotta-piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoidun vasta-aineen ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) 1: 200 1,5 tuntia huoneenlämpötilassa. Objektilasit huuhdeltiin ja värjättiin diaminobentsidiini (DAB) liuos, laskuri värjättiin hematoksyliinillä (Dako, Carpinteria CA), kuivattu, ja peitettiin ennen skannataan ja digitoidaan kanssa Scanscope (Leica, Buffalo Grove IL) ja analysoitiin Aperio Imagescope ohjelmisto (Leica, Buffalo Grove IL). Positiivisuus ja intensiteetti (PI) tulokset laskettiin tuote värjättyä alueen murto (positiivisuus) ja sen intensiteetti. Varten värjäyksen analyysissa tarkasteltiin vain ytimiä, joissa on yli 50% kudoksen säilyi ehjänä lasilevyllä. Tämän periaatteen mukaisesti meidän oli 6 potilasta, joille laskimme PI pisteet käyttäen yhden ytimen, ja 203, joissa otimme keskiarvon PI pisteet 2 ydintä, yhteensä 209 potilasta analysoitiin. Elossaololuku laskettiin jona diagnoosista kuolinhetkellä tai saapuessa saattohoidon kun ei ole saatavilla ja muunnetaan päivistä kuukausiin jakamalla päivien mukaan 30. Kokonaiselossaoloaika analysoitiin Kaplan-Meier tonttien ja tilastollisen merkittävyyden päätellä log-rank testejä. Korrelaatiot kliinisiin parametreihin tehtiin käyttäen chi-neliö analyysi. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Prism 6 ohjelmisto (Graphpad, La Jolla CA).

Solulinjat

sarja ensisijainen munasarjasyövän solulinjoissa oli peräisin potilaasta askites, per IRB-hyväksytty protokolla (# 2007P001918 /MGH) [16]. Lyhyesti, sentrifugoinnin jälkeen askitesneste, solupelletit tuotu kudosviljelmässä kahden eri olosuhteissa (kiinnittynyt ja pallomainen). Vuonna adherenttiviljelmiä, soluja pidettiin täydellisessä konfluenssissa useita viikoista useisiin kuukausiin, kunnes tiukka epiteelisolujen kloonia havaittiin. Kontaminoivat solutyyppejä (valkosoluja, mesothelial ja fibroblastisolut) poistettiin toistettiin osittain trypsiinihajotuksen kunnes ei epäpuhtaat solutyyppejä voitiin havaita. Sen jälkeen solut siirrostettiin vähintään 5 kertaa 1:10 laimennus johtaa stabiilin homogeenisen solulinja. Vaihtoehtoisesti sferoidiviljelmiä (merkitty-sph pääte), solut maljattiin säännöllisesti pulloissa 24 ja tarttumattomat solut kerättiin ja siirrettiin uusiin ultra-low kiinnitys pulloihin, kun taas liitteenä solut heitettiin pois. Sferoidiviljelmiä siirrostettiin dissosiaation ja 1:10 vähintään 5 kohtia johtamiseksi stabiileja homogeenisia solulinjoja. Paneeli ensisijaisen solulinjojen koostuu 16 vakavien epiteelin munasarjojen syöpiä (ptAB, ptAB-sph, ptAF, ptAF-sph, PTW, PTW-sph, ptAO, ptAO-sph, PTD, PTH ptAI, PKD1, PKD2, ptAL- sph, ptAM-sph, ptak-sph), yksi endomet- epiteelisyöpien (ptAP-sph), ja yksi mucinous epiteelin munasarjasyöpä (PTG) kasvatettiin kiinnittynyt ja /tai pallomaista viljelyolosuhteissa.

Ensisijainen solulinjoja ylläpidetään soluviljelmässä yksikerrosviljelmiin DMEM: F12, jossa oli 10% FFBS 1% penisilliini /streptomysiini, 1% L-glutamiinia (Corning, New York NY), tai ei-tarttuva aloilla seerumittomassa kasvaimen alalla media [16] at 37C: ssa kosteutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO2. Lisäksi, munasarjasyöpä vakiintuneet solulinjat OVCAR5 [18] ja OVCAR8 [19], pidettiin DMEM, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 1% penisilliini /streptomysiini, 1% L-glutamiinia (Corning, New York NY).

Q-PCR ja pääkomponenttianalyysi

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin ensisijaisesti johdetut solulinjat potilaiden askites (ptAB, ptAB-sph, ptAF, ptAF-sph, PTW, PTW-sph , ptAO-sph, PTG, PTD, PTH PKD1, PKD2, ptAL-sph, ptAP-sph, ptAM-sph) sekä vakiintuneiden epiteelin munasarjasyövän solulinjoissa OVCAR-5 ja OVCAR-8. Solupelletit jälkeen saatiin sentrifugoimalla, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja pakastettiin -80 ° C, kunnes RNA uuttamalla käyttäen Qiagen RNeasy Mini Kit (Germantown, MD) ja kvantitoitiin Nanodrop. cDNA käänteiskopioitiin käyttäen 500 ng RNA per näyte Superscript III First Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen, Carlsbad CA), ja qPCR suoritettiin perustettu päättäjät epiteelin ja mesenkymaaliset muunnos (EMT), ja pluripotenttisuus lukien CD44s, CD44v8-10 [ ,,,0],20], vimentiinin, E-kadheriinin, ESRP1, Zeb1, Lin-28, Sox-2, Oct-4, N-kadheriinin, ja EpCAM, jossa GAPDH sisäisenä standardina. Suhteellinen ilmentyminen päätellyt määrittämisen syklin kynnys (Ct) ja lasketaan käyttäen 2 ^ -ΔCt muutos normalisoitiin GAPDH Ct. Pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritettiin käyttäen näitä geeniekspressiota arvoista, log transformaatio käyttäen ”FactoMineR” paketti R. PCA mesenkymaalisten sekä epiteelin markkereita selkeästi erillisinä ensimmäisen komponentin, kun taas EMT ja pluripotentteihin merkkiaineet olivat kohtisuorassa toisessa komponentti, mutta erottaa toisistaan.

Western Analysis

Solusakat korjattu paneeli ensisijainen potilaan askites solulinjoissa (ptAB, ptAB-sph, ptAF, ptAF-sph, PTW, PTW Sphl, ptAO, ptAO-sph, PTD, PTH ptAI, PKD1, PKD2, ptAL-sph, ptAP-sph, ptAM-sph, ptak-sph) ja 2 perustettu syöpäsolulinjoissa (OVCAR-5 ja OVCAR-8) pestiin kahdesti 10 ml jääkylmää PBS ja kokosoluekstraktien laadittu 1x lyysipuskuria (Cell Signaling Technology, Danvers MA) steriiliin veteen, joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Roche Indianapolis, iN) ja fosfataasin estäjä tabletteina (Roche, Indianapolis iN). Yhteensä proteiinia per lysaattia saatiin käyttämällä Pierce bikinkoniini- hapon määritys (BCA) proteiini kvantifiointiin Kit (Thermoscientific, Rockford IL), ja yhtä suuret määrät proteiineja (15ug) alennetaan, ladataan kuhunkin kaistaan, ja erotettu NuPage 4-12% geelejä ( Life Technologies, Carlsbad CA). Proteiinit siirrettiin Immobilon polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, Billerica MA), estetty 5% rasvatonta maitoa liuotetaan tris-puskuroitua suolaliuosta ja Tween 20 (TBST) -liuosta, ja sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: havaita koko pituus transmembraani- tai solunsisäisen proteiinin primaarista vasta-rotan anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) [8], tai hiiren anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500), jäniksen anti vimentiinistä (Abcam, Cambridge MA) (1: 1000) tai kaniinin anti E-kadheriinin (Abcam, Cambridge MA) (1: 10,000) vasta-aineet, kukin laimennettu 5% rasvatonta maitoa TBST. PVDF kalvoja pestiin sitten TBSTillä ja inkuboitiin sopivan sekundäärisen vasta-aineen, joko anti kani (Cell Signaling tekniikka, Danvers MA), anti-hiiri (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA), tai anti rotta (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin ilmaisin, kukin 1: 10000 5% maito TBST-liuoksella 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kalvot pestiin jälleen TBST ja käsiteltiin Pico ECL ™ kemiluminesenssin alustan proteiinin visualisointi (Thermoscientific, Rockford IL). Suhteellinen proteiinin runsauden mitattiin densitometrisesti Western blot bändejä ja normalisoitu yhdenvertaista proteiinin lastaamista B-aktiini tiheyden Image J ohjelmisto analyysi.

Patient askites saatiin tuoreista terapeuttinen paracenteses, per IRB-hyväksytty protokolla (# 2007P001918 /MGH). 1 ml askites-nesteessä näytteitä sonikoitiin, sentrifugoitiin maksiminopeudella 10 min tyhjentää, ja laimennettiin 1:50 hajotuspuskuriin ennen käynnissä western blot kuten edellä on kuvattu. Kalvoja inkuboitiin rotan anti CD44v8-10 (RV3) (1: 1000) tai hiiren anti CD44s (R + D, Minneapolis MN) (1: 500) yön yli 4 ° C ja kehitetään kuten edellä käyttäen femto ECL ™ kemiluminesenssin alustan (Thermoscientific, Rockford IL) läsnäolon määrittämiseksi liukoisen pilkotun ja erittää solunulkoisen domeenin CD44v8-10 ja CD44s irtoa osaksi potilaan askites-nesteestä. Latauskontrollina käytimme anti-ihmisen IgG: n raskaan ja kevyen ketjun piparjuuriperoksidaasiin konjugaatin 1: 20000 (Life Technologies, Carlsbad CA). Kuvat otettiin BioRad XR Gel Doc kuva lab ohjelmisto (BioRad, Hercules CA) ja analysoitiin Image-J prosentteina IgG kevytketjun runsautta. Shed proteiini taso sitten korreloi potilaan selviytymisen, jossa päätepisteet ovat kuolinpäivästä tai saapuessa saattohoidon kun ei ole käytettävissä.

immunohistokemia epiteelin ja mesenkymaalisten merkkiaineiden PDXa irrotetut kasvaimissa

potilas- johdettu ksenografteja vesivatsanesteestä (PDXa) missä perustettu istuttamalla 5 miljoonaa solua varhainen ensisijainen linjat (ptAP-sph, PTW, ptAM-sph, PTH ptAB-sph, PTD) uudelleensuspendoitiin 1: 1 Matrigel (Corning, New York NY ) ja istutettiin ihonalaisesti kylkiin NOD /SCID /IL2RGamma Jax ™ hiiriä (Jackson Laboratory, Bar Harbor ME) alle IACUC-hyväksytty tutkimussuunnitelma (# 2009N000033) [16]. OVCAR5 kasvaimia johdettiin käyttämällä identtistä ksenografti protokollaa käyttäen 1 miljoonaa solua. Tuloksena kasvaimet kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 7 mikrometriä paksuus päälle Fisher Scientific

Probe Käytössä plus

mikroskoopin (Fisher Scientific, New York NY). Objektilasit poistettiin parafiini ksyleenillä, niihin lisätään alkoholia ja microwaved puskuroidussa natriumsitraatti (0,01 M) antigeenin hakuun 5 minuuttia suurella teholla, 10 minuuttia 10% teholla, ja 10 minuuttia 20% teholla, sitten huuhdeltiin tislatussa vedessä . Objektilasit käsiteltiin 3% vetyperoksidilla, pestiin ja blokattiin käyttämällä liuosta, jossa oli 1% BSA: ta ja 2% vasikan sikiön seerumia (FCS) PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, sitten inkuboitiin CD44v8-10 vasta-aineella (RV3 rotan monoklonaalinen) (1: 12500), ja verrattuna inkuboitiin CD44s (R + D, Minneapolis MN, hiiren monoklonaalisella 16ug /ml), anti E-kadheriinin-vasta-ainetta (Abcam, Cambridge MA, kani) (1: 500), tai anti vimentiinistä vasta-aine (Abcam, Cambridge MA, kani) (1: 500) yön yli kostutetussa kammiossa 4 ° C. Kun oli inkuboitu vuohen anti-rotta-HRP-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX), aasin anti-hiiri-HRP: tä, tai aasin anti-kaniini-HRP-vasta-ainetta (1: 200) (Jackson Laboratories, Bar Harbor MA) 1,5 tunnin ajan huoneen lämpötila, leikkeet huuhdeltiin ja värjättiin DAB-liuoksella (Sigma Aldrich, St. Louis MO), ja laskuri värjättiin hematoksyliinillä (Dako, Carpinteria CA), kuivattu, ja peitettiin. Edustavia micrographs saatiin paikkatietojen vertailua proteiinien aikaisemmin havaitaan western analyysi ensisijainen solulinjojen josta kasvaimia kasvatettiin.

Tulokset

Expression of CD44 variantin isoformeja sisältävä eksonin 8.-10 ( V8-10) mRNA The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNAseqV2 munasarjasyöpä aineisto

määrittämiseksi mRNA ilmentymistasojen CD44s ja sen muunnelma V8-10 sisältävän isoformit (kuvio 1A) in vakavien munasarjakasvainten, analysoimme RNAseqV2 resurssi TCGA, joka sisältää kohortin 255 asteen 2 ja 3 kasvaimen näytteitä. Ilmaisu Yksittäisten eksonien V8, V9, ja V10 korreloi voimakkaasti kaikkia näytteitä, jotka voidaan havaita myös, että ”standardi” eksonit 1-5 ja 15-18 (S1 kuvio), mikä viittaa siihen, ne pääasiassa ilmaistaan ​​lohkon V8 -10. Lisäksi eksonit V8-10 näyttävät olevan runsain kaikkien muuttuvien eksonit, mikä viittaa siihen, cd44v8-10 sisälsi isoformit ovat vallitsevia vaihtoehtoisesti silmukoituneet selostukset CD44 (kuva 1B). Potilaat stratifioitiin perustuu keskimääräisen mRNA ekspressiotasot eksonien V8-10 niiden kasvain ja jakaa korkean ja matalan ilmentävät ryhmien (ylhäällä ja alhaalla 10%), josta alkaen, ja Kaplan-Meier selviytymisen dikäyrät osoittaa merkittävästi parempi ennusteen korkealla ekspressoivat (p = 0,035) (kuvio 1C). Määrittämään suhteellinen osuus kussakin erillisessä isoformin sisältää eksonit v8-10 vertasimme yleistä ilmaisua ja arvioitu vaikutus eloonjäämiseen. Suuntaus kohti elonjäämisetua havaittiin kaikkien paitsi yhden CD44 isoformeja sisältävä V8-10, vaikka yksikään ei ollut merkittäviä yksinään (S2 Kuva). Monimuuttujamenetelmin käyttämällä Coxin suhteellista riskisuhde malli todettiin, että vain ikä oli merkittävä vaikutus eloonjäämiseen (taulukko 1).

A) Kaavamainen esitys vaihtoehtoisten jatkos isomuotojen ilmentävät muuttuja eksonit V8-v10. B) jakauma RNAseq2 ilmaisun dataa 254 näytteet kaikista CD44 eksonien TCGA munasarjasyöpä aineisto. Näytteet, joissa ei ilme jätettiin pois tästä luvusta. C) Kaplan-Meier käyrä selviytymisen käyrän verrataan korkean ja matalan CD44v8-10 ilmaisemalla näytteiden ja vastaava taulukko, jossa potilaiden määrä kullakin tiettynä ajankohtana. Olemme määritelleet korkea ilmentävien setti (punainen) ja alhaisen ilmentävät setti (musta) kuin näytteet, joilla on korkein ja alin ilmentymisellä käyttämällä ylä- /alaosassa 10% ekspressoivat, jossa juoni ulottuu 5 vuotta. Pylväät edustavat sensuroitiin datapistettä.

CD44v8-10 värjäämällä primaarikasvainten liittyy pidempi eloonjäämisen itsenäinen kohortin 210 korkealaatuisesta serous munasarjasyöpä potilaat analysoitiin kasvain mikrosirujen immunohistokemiallisesti

vahvista suuntaukset havaittu analyysin TCGA data viittaa parempaan ennusteeseen liittyi CD44v8-10 ilme, päätimme tutkia proteiinin tasot CD44v8-10 in kasvainbiopsioissa. Pintailmentymistä transmembraanisen CD44v8-10 proteiini analysoitiin korkealaatuista vakavien munasarjasyövän immunohistokemiallisesti käyttämällä erityistä CD44v8-10 vasta-aineen kasvaimen microarray, joka sisältää primaarisen kasvaimen näytteitä kohortin 210 potilailla. Kaikki kasvaimet olivat korkealaatuisesta serous logian valtaosa (71%) sai ainakin FIGO Stage III, ja asteen 3 (89%) diagnoosi (taulukko 2). Kaikki primaarikasvaimen mikrosirujen tutkitut näytteet otettiin aikaan alkuperäisen debulking leikkausta. Diffuusi ja polttoväli värjäytyminen havaittiin lieriöepiteeliin on pötsinystyt, usein Tyvisolukerroksessa (nuolet) (kuvio 2A, 2B ja 2C), epiteelin, mutta ei tuumorin strooman tahansa ytimien (kuvio 2D), ja aina solun pinnalla sen sijaan, että solunsisäistä tai sytoplasmisen sijainnin (kuvio 2B, insertti). Yhteensä intensiteetti positiivisten pikseliä ja kokonaismäärä positiivisten pikseliä, määritettynä Imagescope ohjelmisto, yhdistettiin positiivinen intensiteetti pistemäärä (PI), joka oli keskimäärin yli kaksi edustavaa ydintä potilasta kohden, ja käyttää potilaan kerrostumista. Valitsimme ylä- ja alaosan 10 ja 20 prosenttia potilaista verrata selviytymisen eroja matalan ja korkean ekspressoivat sekä CD44v8-10 transmembraanisen pinnan proteiinia, ja löysi merkittävä kasvu selviytymisen sekä top 10% ja 20% potilaista jotka ilmentävät korkeita CD44v8-10, jossa on mediaanielossaolosta 30 ja 29 kuukautta verrattuna potilaisiin, jotka ilmentävät alin 10% (p = 0,0181) ja 20% (p = 0,0262), ja keskimääräinen eloonjäämisaika 49 ja 52 kuukautta vastaavasti (kuvio 2E) . Koostumus ylä- ja alaosan 10% ja 20%: lla potilaista oli samankaltainen tarkasteltaessa kliinisen parametrin FIGO luokka, vaihe, ja ikä (S2 taulukko), lukuun ottamatta eroa pieni määrä luokka 2 potilasta. Kun tämä väestö luokka 2 jätettiin pois analyysistä poissulkemiseksi vaikutuksen Näiden harvinaisten alemman asteen kasvaimet, selviytymisen ero säilyi merkitsevänä välillä suurimman ja pienimmän ekspressoivat of CD44v8-10 proteiinin (S3 kuvassa).

parafiiniin upotettu kudokseen microarray ytimien värjättiin immunohistokemiallisesti käyttämällä vasta-ainetta CD44v9, skannataan käyttäen Aperio Scanscope, ja analysoitiin käyttäen Aperio Imagescope ohjelmiston positiivinen pikselimäärä algoritmia. Kuvat ovat otettu suurella (40x) teho näyttää pohjapinta epiteelin värjäytymisen a ja c, hajanaisempi pintaepiteelisolujen värjäytymistä b, ja negatiivinen strooman yksittäisiä positiivisia epiteelisolujen d. e.) Kokonaiselinaika potilailla, joilla on korkea-asteen serous munasarjasyöpäpotilailla by CD44 variantti ilme. Vasemman- Korkein ja alin 10% ilmaisun variantti ja oikea- Korkein ja alin 20% ilmentymisen variantti, osoittaa merkittävää eloonjäämiseen korkeuksissa ekspressoivat p = 0,0181 ja p = 0,0262, vastaavasti.

Monimuuttuja-analyysi tallenteiden kliinisten parametrien kuten ikä, luokka, vaihe, rajaamisvai- tila, ja CD44v8-10 värjäytymisen intensiteetti analysoitiin niiden vaikutus ennusteeseen (taulukko 3).

ikä oli vahvin vaikutus ennusteeseen seurasi CD44v9 värjäytymisintensiteettiä kasvain samalla FIGO lavastus tai lajitteluun ja rajaamisvai- tila eivät olleet merkittäviä. Koska cox verrannollinen riskisuhde (taulukko 3) osoittivat riippuvuutta iän ja CD44v8-10 pintamerkkiaine ilme, halusimme tutkia muuttuvien korrelaation käyttämällä puolueeton potilas kerrostumista tuottaa päätöspuuta joka maksimoi ennustetekijöitä eroja (kuvio 3). Me kerrostunut potilasryhmät iän, FIGO vaiheessa Arvostelu, rajaamisvai- tila, ja CD44v8-10 ilme. Tuloksena luokitus osoitti, että potilaiden 59,2 vuotta iässä eivät merkittävästi soveltaa korkeampia CD44 ilme. Nuoremmilla potilailla osoittavat vahvan korrelaation parempi eloonjäämisen kun ottaa suuren CD44 pintamarkkerin. Nämä havainnot tarkentaa havaintojen COX riskisuhde malli ja määritellä päätös puu, joka voitaisiin käyttää kliinisesti maksimoida ennustetekijöiden voima CD44v8-10 kasvaimen värjäytymistä (kuvio 3).

potilaita kasvain array sampleset stratifioitiin käyttämällä Age, CD44v9 värjäyksen intensiteetti (σ of CD44v9 ilmaisun), laatu, rajaamisvai- tila, ja FIGO pisteet. Monimuuttuja-analyysi suoritettiin ja vaikutus kokoinen sijoittui tuottaa binary päätös puun maksimoida ennustetekijöiden tehon puolueettomasti ja antaa tilastollista merkittävyyttä. Vain tilastollisesti merkitsevä (ikä ja CD44v9 värjäytyminen) esitetään sekä niiden vaikutusta kokonaisuuteen potilaiden eloonjäämisen Kaplan-Meier tontteja. Pylväät edustavat sensuroitiin datapistettä.

ilmentäminen CD44v8-10 korreloi epiteelin fenotyyppi

Me tehdään pääkomponenttianalyysi (PCA) (FactoMiner) on mRNA: n ilmentymisen, jotka on määritelty qPCR arvot 2

-ΔCt normalisoitiin GAPDH, sarjassa eri epiteelin (EPCAM, ESPR1, E-kadheriinin) ja mesenkymaaliset (ZEB1, vimentiinin, N-kadheriinin) markkerien paneelin 15 ensisijaisen (ptAB, ptAB- sph, ptAF, ptAF-sph, PTW, PTW-sph, ptAO-sph, PTG, PTD, PTH PKD1, PKD2, ptAL-sph, ptAP-sph, ptAM-sph) ja 2 perustettu munasarjasyövän solulinjoissa (OVCAR5, OVCAR8). PCA vahvisti, että CD44v8-10 mRNA ilmaisu kumppaniaan muiden epiteelin markkereita, kun taas CD44s ilmaisu korreloi mesenkymaalisten merkkiaineiden munasarjasyöpä (kuvio 4A). Expression pluripotenttisuuden markkereita (LIN28, Sox2, Oct4) liittyi kumpikaan epiteelin eikä mesenkymaaliset markkereita, mikä viittaa stemness on riippumaton epiteelin tai mesenkymaaliset tila (kuvio 4A).

A) Pääkomponenttianalyysi käyttäen qPCR suhteellista kvantifiointia ilmaus epiteelin, mesenkymaalisten ja pluripotenttisuus merkkiaineiden ensisijainen munasarjasyövän solulinjoissa. Värilliset nuolet osoittavat suuntia kunkin ryhmän markkereita. B) Western-analyysi ensisijainen solulinjan proteiinilysaattien ilmentämiseen CD44v8-10 proteiinin käyttäen rotan monoklonaalinen vasta-aine ihmisen CD44v8-10.

Samalla ilmentymisen CD44v8-10 proteiinin potilaan peräisin oleva solu rivi lysaatit western blot näkyvissä suuntaus koekspressoimalla CD44v8-10 E-kadheriinin tai CD44s kanssa vimentiinista, poissulkevalla tavalla (kuvio 4B), mikä vahvistaa qPCR tietojen mukaan CD44v8-10 on epiteelin merkki ja CD44s mesenkymaaliset markkeri korkealaatuista vakavasta munasarjasyöpä.

Voit selvittää paikkatietojen ilmaus CD44v8-10, ja sen suhteen epiteelin tai mesenkymaaliset kasvain histologialtaan, potilaasta peräisin ksenografteissa vatsaontelones- (PDXa n) [16] analysoitiin immunohistokemiallinen (IHC). Kaiken kasvaimia kasvatettiin

in vivo

kertasi epiteelin tai mesenkymaaliset heterogeenisuus havaittiin ensisijaisen solulinjassa

in vitro

(kuvio 4). Kasvaimet, jotka ovat erittäin epiteelin fenotyyppi ilmaistuna alhainen vimentiinin, joka rajoittui stroomasolut (PTW, OVCAR5) ja korkea CD44v8-10 ilmaisun, joka oli spesifinen solun pinnan syöpäsolujen kasvaimen (kuvio 5A, aseta). Toisaalta, enemmän mesenkymaaliset kasvaimet (PTH, PtAM aloilla, ja PtAB aloilla) ilmaistuna vimentiinista sekä epiteelisyöpäsolujen sekä strooman solujen kasvain, ja sillä oli hyvin alhainen ilmentyminen CD44v8-10 (kuvio 5B). Kasvaimet välituotetta fenotyypin sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten ominaisuudet oli ilmentymisen CD44v8-10 ja vimentiinin epiteelisoluissa sekä strooman (kuvio 5C).

Vasta-aineen värjäys kudosleikkeiden kasvaimia kehittyi in vivo injektion jälkeen of 1-5 miljoonaa ensisijainen potilaasta johdettujen munasarjasyöpäsoluja. Edustavia osastoja kasvaimista peräisin OVCAR5, ptAP-sph, Pt W (A), ptAM-sph, PTH ptAB-sph (B) ja Ptd (C) on esitetty. CD44v8-10, ja vimentiinistä immunohistokemiallinen tahra näkyy hematoksyliinillä vastavärinä 100x suurennuksella. CD44v8-10 etiketit pinta epiteelisyöpäsolujen (insert), kun taas vimentiinistä tarrat stroomasolut enemmän epiteelikasvaimissa, ja useimmat solut useammalla mesenkymaaliset kasvaimet (insertti). Kasvaimet ryhmiteltiin epiteelin (A), mesenkymaaliset (B) tai seka fenotyyppi (C), joka perustuu värjäystä.

Liukoinen CD44v8-10 on havaittavissa supernatantissa askites näytteitä ja korreloivat huonompi ennuste

Arvioimme mahdollisuudet havaita liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin CD44v8-10 kuin pilkotun fragmentin askiittinesteessä supernatantissa käyttäen Western blot of 28 eri potilaan askites näytteitä. Liukoinen lohkaista CD44S on homogeenisesti ilmentyy kaikissa askites näytteissä, kuten hyvänlaatuinen valvonta, mikä viittaa se on läsnä veren proteiini. Mielenkiintoista, halkaistut irtoa liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin CD44v8-10 oli havaittavissa 27 ulos 28 näytettä potilaan munasarjojen askites, erittäin vaihtelevia määriä, mutta ei ollut havaittavissa hyvänlaatuisia askites, mikä viittaa se voi olla syöpää erityinen. Edustava Western blot 6 potilaan askitesta osoitetaan kuvassa 6A. Proteiini runsaus liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin CD44v8-10 mitattiin densitometrisesti Western blot bändejä ja normalisoitu yhdenvertaista proteiinin lastaamista IgG kevyen ketjun tiheyttä Image J ohjelmisto analyysi. Sen jälkeen kun kerrostuminen potilaista perustuu CD44v8-10 tasoilla, olemme huomanneet merkittävästi vähentynyt selviytymisen potilailla, joilla on korkea liukoisen CD44v8-10 (top 50%) ja mediaanielossaolosta 39 kuukautta vs. +59,27kuukausi pohjaa 50% (p = 0,0481) (kuvio 6B).

A) Askites näytteitä (n = 28; 6 näytettä esitetty edustaja) saatiin potilailta, joille suoritetaan terapeuttisen paracentesis, ja tutkittiin western-blottauksella ja CD44v8-10, CD44s, ja anti-ihmis-IgG-kevytketjun latauskontrollina. Proteiini densitometria tehtiin ja analysoitiin ekspressiotasot liukoisen CD44v8-10 ja jaettu kahteen yhtä suureen ryhmään korkean ja matalan CD44v8-10 tasolla.