Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigeneettiset inaktivaatio kromatiinin tärkeä rooli päätettäessä solun fenotyyppiin sekä normaaleissa ja syöpäsolujen, mutta meidän tieto on vielä kesken suhteessa mahdollisten monoallelic ilmiö. Olemme genotyyppi DNA eristettiin kromatiinin kahden paksusuolen ja peräsuolen syöpää peräisin linjat ja kulttuurin normaalin ihmisen suolen epiteelisolujen (HIEC), joka oli immunosaostettiin vasta-asetyloitua vs. metyloitu histoni H3K9, ja esitetään tiedot on B-alleelin frekvenssi eroja yli useita yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) liikkuvat ikkuna keskiarvoja. [B-alleeli on mielivaltainen termi määritellään yksi kahdesta alleelista milloin tahansa SNP, nimetty A ja B]. Kolme erilaista validointitestejä vahvisti, että huiput esillä erot edustettuina monoallelic verkkotunnuksia. Nämä täydentävät testit vahvistivat seuraavat: 1) geenien alueilla korkean B alleelin taajuus ero ilmaistiin monoallelically; 2) normaaleissa soluissa kaikissa viidessä painamista ohjaus alueita, joilla on heterotsygoottinen SNP leimasi B alleeli ero huippuja; ja 3) haplotyyppien B alleeli ero piikkiä uskollisesti ylläpidetään kromatiinin immunosaostettiin vastaavien vasta-aineita. Molemmissa näytteissä useimmat monoallelic verkkotunnuksia löydettiin alueiden väliset rajat avoimen ja suljetun chromatin. Mitä tulee syövän linja, tämä tukee vakiintunut käsite konformaation levittää, mutta tulokset normaalit solut olivat odottamattomia. Koska nämä solut olivat polyklonaalisia, The monoallelic rakenteet olivat luultavasti ole määritelty satunnainen valinta tapahtuu X-inaktivaation, niin ehdotamme, että epigeneettiset inaktivaatioon joillakin aloilla voi olla perinnöllisiä ja polymorfinen normaaleissa ihmisen soluissa.

Citation: di Paola D, Raelson J, Rampakakis E, Basik M, Zannis-Hadjopoulos M, Bradley WEC (2013) Monoallelic Kromatiini Lihakkuus Flanking pitkän kantaman Silenced Domains in Cancer-Derived ja normaalit solut. PLoS ONE 8 (5): e63190. doi: 10,1371 /journal.pone.0063190

Editor: Brian P. Chadwick, Florida State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 helmikuu 2013; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2013; Julkaistu: toukokuu 16, 2013

Copyright: © 2013 Di Paola et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustusta Cancer Research Society ja sisäinen varat Goodman Cancer Center, McGill University. DDP oli vastaanottaja apurahan päässä Fonds de Recherche en Santén du Québec. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: John Raelson oli aiemmin palveluksessa Genizon Biosciences Inc., joka ei ollut vaikutusvaltaa toimituksellisen sisällön käsikirjoituksen. Mikään muu Kirjoittajat julistaa mitään ristiriitaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Epigeneettiset geenien toiminnan säätelystä on tärkeä lähde fenotyyppisten vaihtelua syöpä. Tällä kromosomitasolla, tämä säätö ilmenee muutoksilla kromatiinin liittyvä konformaatio histonimodifikaation, kuten metylaatio ja /tai asetylaatio lysiinijäämien N-päätteen hännät histonien, ja metylaatio C jäämiä CpG-rikas saaria tai lähellä geenin promoottorit. Nämä muutokset on käytetty laajasti markkereita määrittää epigeneettiset aseman tietyn geenin, ja viimeaikaiset edistysaskeleet genomin teknologia on mahdollistanut arviointi epigenetic inaktivaation yli miljoonan emäksen alueilla; se on nyt sitä mieltä, että nämä muutokset voivat levitä ympäri pitkiä [1]. Tietääksemme tällä alueella on kuitenkin puutteellinen useista syistä: ensinnäkin, CpG-saarekkeen metylaation vain tuottaa yksityiskohtia yksittäisten geenien, jotka liittyvät CpG-saarekkeiden, ja tämä vain silloin, kun geenin toiminnan lopettamisesta aidosti vastaa metylaatiostatuksen. Toiseksi, vaikka nämä viimeaikaiset tutkimukset ovat todellakin osoittaneet, että suuren mittakaavan epigeneettisiä muutoksia voi tapahtua, muutaman tyhjentävä genominlaajuisten analyysejä verrattiin normaalien ja syövän peräisin olevat solut on toteutettu.

Toinen tämän ilmiön, joka on pysynyt suhteellisen tutkimaton on määrin epigeneettisiä inaktivointi voidaan rajoittaa yhden alleelin. Normaaleihin soluihin, alleelispesifinen geenin toiminnan tiedetään esiintyvän useilla lokusten, mukaan lukien geenien painettu verkkotunnuksia (jossa valinta joka alleeli on inaktivoitu riippuu vanhempi alkuperä), suurin osa geenien yhden X-kromosomin naisten solujen, hajuste reseptorit, ja useita geenejä, jotka osallistuvat tulehduksen ja immuunivasteen (katsaus [2]). Valvontamekanismeja joidenkin näiden inaktivoitumisen tapahtumista näyttävät muuttaa syöpäsoluja, niin että esimerkiksi painettu loci usein biallelically ilmaistaan ​​syöpä (tarkistetaan [3]). Kuitenkin, se, missä määrin de novo monoallelic inaktivointi tapahtuu syöpäsoluissa on tuntematon. Varhainen työ meille [4], [5] ja muut [6] osoitti, että mallissa nisäkässolulinjassa CHO, monoallelic inaktivointi voi levitä yli miljoonan emäksen alueelle, että valinta vastaan ​​ilmaus yhden alleelin yhden lokuksen tuloksena tukahduttaminen yhden alleelin toisen, joka liittyy locus. Tällainen leviäminen on osoitettu tapahtuvan korkealla taajuudella ja ei liity metylaation promoottori-liittyvä-CpG-saarekkeen ainakin yksi geeneistä, jotka liittyvät [7]. Viime aikoina olemme osoittaneet, että noin puolet kasvain- solulinjoissa, jossa RaRb, geeni kasvainta estävä vaikutus, on täysin inaktivoitu, promoottori vain yksi kahdesta alleelista on metyloitu [8], jälleen viittaa metylointi riippumaton inaktivaation mekanismi, joka voi olla monoallelic luonteeltaan.

tässä tutkimuksessa käytimme antiseerumeja histoni H3 asetyloitu K9 /14 (H3Ac) ja histoni H3 tri-metyloitu K9 (H3M) siru kokeita kaksi peräsuolen syövän johdettuja linjoja (HCT116 ja Colo205) sekä kulttuurin ihmisen suolen epiteelisolujen (HIEC), jotka ovat ei-kuolemattomaksi ja polyklonaalisia. Nämä histonimerkkien liittyvät avoimen ja suljetun chromatin rakenne, vastaavasti, ja valittiin useiden tiedetään liittyvän kanssa konformaatio osittain siitä, että muutokset ovat toisensa poissulkevia ja siellä voi olla suurempi mahdollisuus, että tiedot olisivat yksiselitteisiä. Tämä on myös yksinkertaistettu määrittäminen alleeliset bias konformaation kunkin SNP käytetään genotyypin DNA uutetaan immunosaostettiin kromatiinin, koska emme voi laskea eron B alleelifrekvenssien määritetään kunkin SNP HAP550k mikrosiruja. Odotetusti pitkä ”geeni aavikot” todettiin ominaista osuuksilla yleensä suljettujen kromatiinin sekä normaaleissa ja syöpäsoluja. Kiinnostaa, huomasimme, että monoallelic konformaatio on edullisesti lokalisoitu rajoille näiden pitkiä suljettujen kromatiinin konformaation, mikä viittaa leviäminen aktiivinen (tai aktiivinen) konformaation.

Tulokset ja keskustelu

synnyttää pitkän kantaman kuvia kromatiinin konformaation, fluoresenssin intensiteetti arvot ilmaistuna LogR suhteet olivat keskiarvona liikkuvat ikkunat käsittävät 21 tai enemmän SNP, ja piirrettiin kromosomiasemassa. Kuten odotettua, tietojen perusteella annetaan UCSC epigenome selain, geeni-köyhien genomialuetta leimasi osuuksilla alhainen LogR anti-H3Ac saostaa chromatin ja vastaavasti korkea LogR anti-H3M. Tämä on esitetty kuviossa. 1, joka esittää 15 Mb verkkotunnuksen CHR5 kätkeminen vähemmän kuin 10 geenien, joista viisi on jäseniä kadheriinin perheen. Vuonna normaalit solut (ja harvemmin, syövän solulinjoissa) nämä alueet olivat tyypillisesti keskeytynyt pienten saarten avoimen konformaation merkitty huiput anti-H3Ac juoni, heijastuu kaukalot anti-H3M juoni. Joskus, mutta ei aina, nämä vastasivat promoottorien harvinainen geenien toimialueen (Fig. 1,

CDH18

ja

CDH9

ja karakterisoimattomat geenifragmentti 21,5 Mb, alavirtaan

CDH12

). Huiput näillä aloilla usein litistetty syövän johdettuja linjoja, ja juoni esitetty kuvassa. 1 viittaa siihen, että siirtymisen, oikeanpuoleisen rajan saattanut tapahtua siten, että

CDH6

on suljetuissa chromatin in HCT116-soluissa. On mahdollista, että tämä näennäinen siirtyminen on ainakin joskus osa prosessia syövän etenemisen (katso jäljempänä).

Laskettu arvot edustavat keskiarvoa lukemiin 21-SNP liikkuvat ikkuna. HCT116, peräsuolen syöpä-solulinjaa; HIEC, normaaleja ihmisen suolen epiteelisolujen. Geenit (mistä UCSC Genome Browser, hg18) kuvataan alla LogR tontteja.

kuvioita LogR suhteet koko CHR 9 on esitetty kuvassa. 2, jossa UCSC Genome Browser ”tiheä” näyttö geenien alareunassa kunkin kuvaajan segmentin. Jälleen geeni-huono verkkotunnuksia (esimerkiksi ne keskittyvät 10 Mb, 82 Mb, 105 Mb) on ominaista alhainen LogR arvot anti-H3Ac keskeytynyt lokalisoitu huiput, jotka ovat joskus litistetty syöpälinjojen (H3M tiedot eivät sisälly in pääosa kuviosta yksinkertaisuuden vuoksi). Vuonna upotetun kuvion. 2 näkyy huippuunsa CHR 9 kaikkien kolmen anti-asetyloitu chippinäytteet kanssa samanaikaisesti läpi kaikkien kolmen anti-metyloitu siruja, vastaa meidän odotus peili-kuvia LogR tontteja kahden immunosaostetun näytettä. On vain yksi geeni alueella, C9orf123, jonka 5′-päässä on hyvin lähellä kunkin huippu- ja minimipitoisuudet.

Data käsiteltiin kuvatulla kuvatekstissä kuvioon. 1. Inset, välistä aluetta 7.7 Mb ja 7,9 Mb, osoittaa huiput sirun avulla anti-asetyloitu antiseerumi vs. kourut sirun avulla anti-metyloitu seerumi, jolloin myös promoottorialueen C9orf123. LogR tontteja anti-metyloitua ChIP on jätetty pois tärkein luku selkeyttä.

määritetään sitten kuviot alleeliset puolueellisuudesta chromatin konformaatiossa kahden lähes diploidisolupopu- näytteet (HCT116 ja HIEC), ilmaistuna B alleelin taajuus (BAF) ero kahden palanäytteet keskiarvona 11-markkeri liikkuvat ikkunat (katso menetelmät). Löysimme yli 60 huiput yli konservatiivinen leikkaus, 0,35 (ks teksti File S1), joka pidentää jopa 10 Mb yhtämittaisesti syövän johdettu HCT116. Noin 35 tällaisia ​​piikkejä havaittiin HIEC soluissa, levein kattaa noin 400 kb (leveys piikin puolet korkeutta; ks. 3 katsauksia useiden kromosomien).

Kuten tekstissä, kunkin heterotsygoottinen SNP absoluuttisten arvojen BAF erot kahden ChIP näytettä laskettiin ja 11-markkeri liikkuvassa ikkunassa keskiarvot jokaisen eri kromosomiin piirrettiin. Sininen, HCT116; koralli, HIEC. Geenit (UCSC Genome Browser) kuvataan alla LogR tontteja.

Validoida näitä tietoja suoritimme sekä rakenteellisia ja toiminnallisia testejä (yksityiskohdat Methods). Ensinnäkin, yli pituus BAF ero huippu suhteellisen suljettu konformaatio tulisi ulottua keskeytyksettä yhdellä homologi ja avoin konformaatio toisella. Tämä osoittautui tapauksessa yli ajojen SNP korkea kytkentäepätasapainossa (LD), koska löysimme täysin yhtäpitäviä välillä haplotyypin vaiheen sekvenssin ja alleelien rikastettu vastaavien palanäytteet (binomiselle p = 1,4 × 10

-45 for HCT116, 5,8 x 10

-11 varten HIEC; tietojen kuvissa. S1 ja S2 File S1). Toiseksi, huomasimme, että seitsemän seitsemän geenien asuvat huiput BAF ero oli monoallelically ilmaistiin (Fig. S3 File S1). Kolmanneksi osoitimme, että viisi huiput BAF ero HIEC, mukaan lukien suuret piikki 22,9 Mb kromosomin 15 (Fig. 3), vastasi nimenomaan painamista säätelyalueita (ICRS), lyhyt monoallelically metyloitua DNA-sekvenssit, jotka ohjaavat painamista (muut dataa ei esitetty). (Muut ICRS meillä tiedustella olivat homotsygoottisia in HIEC). Kaiken kaikkiaan kolme koetta suoritimme puhuvat voimakkaasti sen, että BAF erot heijastavat aito alleeliset erot konformaatiorakenteesta kromatiinin.

Kun LogR suhteet ja BAF erot HCT116-soluja piirretty yhteen kaksi yleistä kuvioita havaittiin (ks. 4, joka esittää kahdeksan huiput kromosomissa 18, jotka on numeroitu I-VIII). Kuten voidaan olettaa, jotkut BAF ero huiput vastasi tiiviisti yksittäisiä huippuja ja /tai pohjien vastaavien palanäytteet. Kyseiset 35 Mb ja 57 Mb (piikit III ja VIII) kuuluvat tähän ryhmään, sekä noin neljäsosa loput näiden huippujen läpi genomin. Peräti kaksi kolmasosaa huiput kuitenkin tapahtui väliset rajat matalan ja korkean LogR arvoja, eli verkkotunnusten välillä avoimen ja suljetun chromatin konformaation. Peaks I, II, V – VII ja kenties IV kuuluvat tähän luokkaan (Fig. 4, viimeksi on epävarmemmat johtuen epäinformatiivisia homotsygoottisiksi hajallaan huippu). Useimmissa tapauksissa LogR ja BAF ero tontit olivat lähes päällekkäisiä välittömiä mielenkiintoisen alueen, mikä osoittaa, että erot, alleelit alkoi samaan kohtaan kuin alun siirtyminen yhdestä konformaatiossa toiselle. Kiehtovan, rajat osuvat BAF ero huiput olivat yleensä niitä, joiden suhteellinen siirtymä nähtiin LogR suhteissa, jollainen on havaittu piikkejä I, VI ja VII (viimeinen on pienempi, mutta todellinen, joiden uppouma on 100 kb). Raja ruuhka II voidaan myös pitää joutuneiden, jonka pidemmän matkan noin 2 Mb.

Ylähavas, BAF eroja koko kromosomin 18 HCT116. Lower paneelit, juoni HCT BAF ero (punainen; oikea asteikko) päällekkäin tontit HCT ja HIEC, LogR suhteet (vasen asteikko) yli kromosomi 18 verkkotunnuksia ilmoitettu ylemmässä paneelissa.

me tulkitsevat tämän tarkoittavan, että joko auki tai kiinni verkkotunnuksia levinnyt näitä rajoja ja että ero oli joko monoallelic tai tapahtunut eri tahtiin kahteen homologit, muodostaen näin verkkotunnuksen monoallelic kromatiinin konformaation. Vaihtoehtoisia selityksiä ovat mahdollisia, mutta suosimme leviämisen skenaario osittain koska se vaikuttaa yksinkertaiselta kuvitella tällainen mekanismi, jonka jotkin ennestään ole nisäkässoluissa muodossa X-inaktivaation leviämässä peittyvästi chromatin klo fuusio oleva X-autosomi translokaatio [9].

teki samat analyysit tietojen kanssa HIEC soluista. X-kromosomi ei tuottanut BAF eroja taustamelun yläpuolella (tuloksia ei ole esitetty), vaikka H3K9 asetylointi /metylaatio on osallisena X-inaktivaation [10]. Tämä on odotetusti satunnainen inaktivoitumisen, kun otetaan huomioon, että HIEC solut ovat polyklonaalisia, ja tulos vahvisti, että satunnaisia ​​inaktivointi tapahtumia ei pitäisi sekoittaa tuloksemme. Niistä autosomeiksi, me tuomitaan 13/32 BAF ero huiput vastaavat yksittäisiä LogR suhde huiput /kaukalot H3Ac /H3M chippinäytteet. Kuitenkin loput, joka käsittää suurimman osan BAF ero huiput osui rajat avoimen ja suljetun chromatin konformaation (esimerkit esitetään kromosomin 22 kuvassa. 5 piikin II on entisellä ura ja muut osoittaa monoallelic rajan siirtyminen vaikutuksia). Tämä oli odottamaton tulos, jota me kuitenkin pidämme todellista, koska tarkkuutta meidän validointiprosessiin. Tulkintaamme tämä vaikutus on edellä kuvatulla tavalla, nimittäin että rajat auki /kiinni chromatin rakenne, jonkin verran monoallelic leviämisen konformaation saattaa esiintyä.

Ylähavas, BAF eroja koko kromosomin 22 HIEC . Alempi paneeli, HIEC BAF ero juoni (punainen; oikea asteikko) päälle HCT ja HIEC, LogR suhteet kaavioita (vasen asteikko) yli kromosomin 22 verkkotunnuksia ilmoitettu ylemmässä paneelissa.

Missä voi me ominaisuus tämän näennäisen leviää? Polyklonaalinen luonne HIEC avulla voimme sulkea pois joitakin mahdollisuuksia. Ensinnäkin se on todennäköisesti koska samalla mekanismilla kuin laajalti monoallelic ilmentymisen ovat kuvanneet Gimelbrant et al. [11], koska viimeksi mainittu on osoitettu olevan satunnainen. Voimme samalla sulkea pois mahdollisuutta, että huiput heijastavat syövän vaiheessa, kuten on nähty metyloinnin tuumorisuppressorigeeneille normaalissa kudoksessa syöpäpotilaita, koska tämä olisi myös satunnaisesti suhteessa valintaan alleelin. Joka tapauksessa HIEC solut ovat sikiön alkuperää eikä ikuistettu [12], ja olisi sen vuoksi, ei voida odottaa mitään precancerous ominaisuuksia. Toinen tulkinta, joka ei kuitenkaan tukee voimakkaasti data, on, että nämä huiput BAF eron ovat aiemmin tuntemattomia painettu verkkotunnuksia. Viimeaikaiset todisteet genominlaajuisten hakuja viittaa siihen, että useimmat aito painettu verkkotunnuksia nyt tunnetaan, joten annetaan niiden määrä (noin 20) ja niiden läsnäolo avaamaan ja sulkemaan chromatin rajoja (toisin imprinting- liittyvä huiput että emme tunnista) se näyttää epätodennäköiseltä, vaikka tätä asiaa ei voida yksiselitteisesti osoitettu käyttämällä kokeellista suunnittelua. Yksi tulkinta pidämme sopusoinnussa data on, että alleelinen erot havaitaan kuvastavat perustuslaillisia epigeneettiset muutokset, eli että monoallelic huiput olisivat läsnä kaikissa kudoksissa yksittäisten kyseessä. Tällaisia ​​ilmiöitä on kuvattu rajoitetun määrän tuumorisuppressorigeeneille, mukaan lukien

MGMT

[13], että nämä geenit on havaittu vaiennetaan normaaleissa somaattisten solujen, ja uskotaan, että tuloksena on syöpää altistavia fenotyyppi. On ehdotuksia kirjallisuudessa, että nämä ”perustuslaillinen epimutations” voi olla geneettinen alkuperä [14], [15]. Muut ryhmät ovat tehneet genomin laajuinen yhdistys tutkimukset alleeliset ilmaisun [16] ja ovat löytäneet monia SNP liittyvän ekspressiotasoja. Kaikissa näissä tapauksissa monoallelic vaikutus rajoittuu yhteen geneettinen komponentti, kuten SNP tai promoottorin yhden geenin. Ei ollut mitään erityistä yhdistys näissä tutkimuksissa monoallelic ilmaisun kromatiinin konformaatiota tai läheisen geenin aavikoita, joten se ei vielä tiedetä, onko monoallelic ilmentymiskuviot nämä kirjoittajat kuvaavat voi olla päällekkäinen niiden kanssa, jotka me kuvaamme.

Tutkimuksemme uusia uria kahdessa suhteessa. Ensinnäkin se paikantuu merkittävä lähde monoallelic kromatiinirakenteeseen alueille välittömässä läheisyydessä verkkotunnuksia suljettujen kromatiinin konformaation. Sellaisena se ehdottaa mekanismia epigeneettiset polymorfismia, jotka voivat muistuttaa kontrolloitu versio leviämisen, että me ja muut ehdottavat olevan merkittävä lähde fenotyyppisten vaihtelua syöpä. Toiseksi, jos meidän tulkinta on tarkka, se nostaa mahdollisuus geneettinen komponentti tähän lähde epigeneettiset vaihtelua. Tiedetään, että kuvaan on

IGF2R

sivuston chr6q on polymorfinen, ja ehkä jotkin periytyvä epigeneettiset valvonnan kromatiinin konformaation voi olla olemassa, mikä ilmenee itse kuin domeenit monoallelic konformaatio olemme dokumentoitu. Selittämätön ilmiö, joka voi liittyä on sukupolvien välisen perintö [17], jossa geneettiset tekijät vaikuttavat fenotyypin sukupolvet ilman geenit suoraan määritetään, että fenotyypin peritty. Joka tapauksessa uuden puolia tulokset voivat johtaa syvempää ymmärrystä perinnöllisyys, ja me tutkivat parhaillaan näitä vaikutuksia edelleen.

Methods

Solut

HIEC- 6 ovat polyklonaalisia ei kuolemattomaksi suolen epiteelisolujen viljeltiin naisen 20-viikon alkio. Ne ystävällisesti toimittaa jo kulun 17 Jean-François Beaulieu, ja kasvatettiin julkaistujen menetelmien mukaisesti [12]. Kokeet suoritettiin kuluessa 6 kohtia vastaanotto laboratoriossamme. HCT116 ja Colo205 ovat peräsuolen syövän solulinjat alun perin saatu ATCC: stä, ja kasvatettiin RPMI kuten aiemmin on kuvattu.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) B

menettely on, että kuvattu [18] . Soluja viljeltiin täydellisessä media pestiin esilämmitetyllä PBS: llä ja käsiteltiin 1% formaldehydiä 10 minuutin rajat linkin proteiinien ja DNA

in vivo

; ne pestiin sitten ja raaputettiin jääkylmään PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), jota oli täydennetty täydellinen proteaasi-inhibiittori tabletti (Roche Molecular Biochemicals). Seuraavat läpi 21-G: n neulalla kolme kertaa, tumat kerättiin, suspendoitiin uudelleen yhteen pakattu ydin- tilavuuteen lyysipuskuria, ja sonikoitiin, kunnes DNA-fragmentit 1 kb saatiin. Chromatin koko seurattiin elektroforeesilla. Immunosaostuksella (IP) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu, seuraavin muutoksin: Lyhyesti, leikattua kromatiinin lysaatit (500 ug) esi-selvitetty inkuboimalla 50 ui proteiini A /G-agaroosin (Roche Molecular Biochemicals) vähentää taustan aiheuttamia ei-spesifinen adsorptio helmiä, inkuboitiin 6 h joko 20 ug: lla anti-asetyloitu H3K9 /14 (Upstate), anti-trimetyloidaan H3K9 (Upstate) tai normaali kanin seerumi (NRS) 4 ° C: ssa jatkuvasti pyörimisen. Proteiini A /G-agaroosin (50 ui) lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Pelletoidut helmet pestiin peräkkäin kaksi kertaa 1 ml: aan lysis-puskuria 15 minuuttia kukin 4 ° C: ssa, mitä seurasi 1 ml WB1 (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% NP40, 0,05% natriumdeoksikolaatti, täydellinen proteaasi-inhibiittori tabletti), 1 ml WB2 (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,1% NP40, 0,05% natriumdeoksikolaatti, täydellinen proteaasi-inhibiittori tabletti) ja 1 ml steriiliä TE. Helmet suspendoitiin uudelleen 200 ui TE /1% SDS: ää, inkuboitiin huoneenlämpötilassa (rt) 15 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 3000 rpm 1 min huoneenlämpötilassa. Puolet supernatanttia inkuboitiin sitten yön yli 65 ° C: ssa kääntää ristisidosten, jota seurasi 100 ug proteinaasi K 55 ° C: ssa 2 tuntia. DNA puhdistettiin käyttäen QIAquick PCR-puhdistuskittiä (Qiagen, Valencia, CA, USA) ja eluoitiin 100 ul: aan TE: tä.

Genotyypin

DNA HIEC ja HCT116 oli genotyyppi on Illumina HAP550 mikrosiruja jonka genotyypin palvelun Genizon biotieteiden Inc., mukaan valmistajan ohjeiden ja kuten on kuvattu [19]. DNA Colo205 oli genotyyppi on 1 M duo array, mukaan valmistajan ohjeiden. Selittämään eron microarray valmistuksessa, me moninkertaistanut LogR suhdeluvut alkaen 1 M array 2,0 esitys näiden tonttien syntyvät HAP550 array. Tämä mahdollisti esitys palstojen vastaavia amplitudi. Microarray tiedot talletetaan Dryadi (doi: 10,5061 /dryad.43h8c).

laskeminen B alleelifrekvensseiltään Erot

piirrettynä B-alleelin taajuus (BAF) erot vastaan ​​kromosomiasemassa, jossa tiedot kahdella tavalla. Ensin lasketaan poikkeama BAF valvonnan kromatiinin valmiste saostetaan normaalia kanin seerumia kunkin kahden immunosaostetun näytettä. Ero näiden arvojen laskettiin kunkin SNP, absoluuttinen arvo on peräisin, ja 11-markkeri liikkuvassa ikkunassa keskiarvot piirrettiin vs. kromosomiasemassa. Toiseksi kunkin SNP yksinkertaisesti vähennetään BAF varten H3Ac näytteen, että sen H3M näyte (normalisoitu), ja absoluuttiset arvot näiden erojen keskiarvo laskettiin yli 11-markkeri liikkuu ikkunat kuin edellä ja piirrettiin vs. asentoon. Mitään olennaista eroa kahden laskentamenetelmän, ja esittelemme ainoastaan ​​johdettujen toinen kahden menetelmän. Kolme suoritettiin tulosten validointiin kuvatulla seuraavassa jaksossa.

Validation BAF Difference Peaks edustavan Alleelisia Bias

Validoida näitä tietoja suoritimme sekä rakenteellisia että toiminnallisia testejä. Ensinnäkin, jos huiput BAF ero vastaa todellisia konformationaalisten alleeliset bias, sitten avoin konformaatio yltää pituuden BAF eron toisella homologin ja suljetun konformaation välillä. Näin ollen, kuviot BAF eroja vastaavien ChIP näytteiden pitäisi näkyä haplotyyppien tai toisella homologi. Löysimme kuviot ovat täysin yhdenmukaisia ​​(binomiselle p = 1,4 × 10

-45 varten HCT116, 5,8 x 10

-11 varten HIEC, data usean LD lohkoja kaksi piikkiä annetaan File S1, kuva 2 , Fig. 3). Toinen validointitestiä perustui odotukseen, että huippu BAF eron, vain yksi alleeleista kuljettaa geenin avoimessa konformaatiossa, joten ekspressiokuviota tämän geenin tulisi yleensä monoallelic. Näytteitä cDNA seitsemästä geenien näillä alueilla kuljettaneen heterotsygoottista cSNPs analysoitiin ja havaittiin olevan merkittävä tai täydellinen rikastamiseen yhden alleelin (File S1, Fig. S3). Kolmas koe, joka perustuu oletukseen, että ainakin osa BAF eron huippujen HIEC soluissa tulisi vastata tunnettujen domeeneja monoallelic ilmentymisen normaaleissa soluissa. Koska HIEC ovat polyklonaalisia, meidän ei pitäisi havaita mitään alleeliset bias X-kromosomissa tai muihin loci tulee satunnaisia ​​alleelinen inaktivaatiota (File S1); kuitenkin painettu verkkotunnuksia, alleelinen inaktivointi ei ole satunnainen, vaan vanhempi-erityinen, joten kaikki solut polyklonaalinen populaatio tulisi kantaa kuvaan merkki samalla alleeli. Niinpä löysimme viisi HIEC BAF ero huiput, kuten suuret piikki 22,9 Mb kromosomin 15 (Fig. 3), vastasi nimenomaan ICRS (File S1). Kaikki muut ICRS me kysellä, mukaan lukien valvontaan H19 klusterin, ovat homotsygoottisia vuonna HIEC ja siksi huomaamaton.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

tukeminen Teksti ja kuviot S1, S2 ja S3. Kuva S1. Validation että BAF ero huiput heijastavat vierekkäisiä verkkotunnuksia HCT116. Päättelimme, että jos BAF erot edustaa aito eroja kahden homologit, materiaali immunoprecitated anti-Me on pääasiassa peräisin yhdestä homologin, ja että anti-Ac pääosin muista koko pituudelta korkean LD. Kaksi -alueilla pitkä huippu BAF ero chr1 (ylempi kuva) havaittiin, joille HapMap tiedot osoittivat erittäin korkeita LD (r

2 yli 0,9 kaikkialla). Pääalleelille taajuus piirrettiin anti-Ac (sininen) ja anti-Me (koralli) kunkin SNP sisällä tunnistettu ajaa korkea LD. Jokaista SNP, anti-Ac ChIP tuotti suuremman BAF kuin anti-Me siru, joka osoittaa täysin yhtäpitäviä välillä haplotyypin ja immunosaostettiin materiaalia. Kuva S2. Validation että BAF ero huiput heijastavat vierekkäisiä verkkotunnuksia HIEC. Katso legenda kuvioon S1. Kolme alueiden korkean LD on CHR 7 on esitetty. Jälleen täysin yhtäpitäviä välillä havaittiin haplotyypin ja Immunopresipitoidun materiaalia. Kuva S3. Validation että BAF ero huiput edustavat domeeneja monoallelic ilmentymisen SPRY2 (at 80,1 Mb, CHR 13). Genomi-DNA- ja cDNA noin rs504122 (C /T heterotsygoottinen sekä HCT116 ja HIEC) monistettiin molemmat linjat ja sekvensoitiin. Upper paneelit, molemmat alleelit ilmaistaan ​​HIEC ainoastaan ​​C HCT116. Alempi paneeli, BAF erot piirretty molempien solulinjojen, osoittaa HCT116, mutta ei HIEC, jossa BAF eroja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0063190.s001

(DOC) B

Kiitokset

kirjoittajat kiittää tohtori Jean-François Beaulieu tarjoamiseksi HIEC kulttuureissa ja Dr. Patrick Dion varten editointiavun.