Krooninen sairaus

tiivistelmä

Rauta-rikki-kasauman biogeneesin on suorittaa erillisiä proteiini kokoonpanojärjestelmät. Nisäkkäät ovat kaksi järjestelmää, mitokondrio Fe-S klusterin kokoonpano järjestelmä (ISC) ja sytosolin kokoonpano järjestelmä (CIA), joka on yhdistetty tuntemattoman mekanismin. Ihmisen jäsenet NEET perheen 2Fe-2S-proteiinien, ravinteiden puutteen autophagy factor-1 (NAF-1) ja mitoNEET (mnt), sijaitsevat rajapinnalla mitokondrioita ja sytosoliin. Nämä proteiinit ovat sekaantuneet syöpäsolujen lisääntymistä, ja he voivat siirtää 2Fe-2S klustereita standardin apo-akseptori-proteiinia. Me raportoimme tässä ensimmäisen fysiologisen 2Fe-2S klusterin akseptori sekä NEET proteiineja kuin ihmisen Anamorsin (tunnetaan myös sytokiinien aiheuttaman apoptoosin inhibiittori-1; CIAPIN-1). Anamorsin on elektronin siirto proteiini, joka sisältää kaksi rauta-rikki-kasauman sitovaa kohtaa, joka tarvitaan sytosolin Fe-S-klusterin kokoonpano. Me osoitamme, UV-Vis-spektroskopialla, että molemmat NAF-1 ja mnt voivat siirtää 2Fe-2S klustereita apo-Anamorsin kanssa toisen asteen nopeusvakiot samanlaisia ​​kuin muiden tunnettujen ihmisen 2Fe-2S siirto proteiineja. Suora proteiini-proteiini vuorovaikutus NEET proteiinien apo-Anamorsin havaittiin käyttäen biolayer interferometriaan. Lisäksi sähkösuihkutusmassaspektrometrialla holo-Anamorsin valmistaa klusterin siirto osoittaa, että se vastaanottaa sekä sen 2Fe-2S klusterit NEET-nuoret. Ehdotamme, että mnt ja NAF-1 voi tarjota rinnakkaista reittiä yhdistävät mitokondrioiden ISC järjestelmä ja CIA. 2Fe-2S klusterit koottu mitokondrioissa vastaanotetaan NEET proteiinit ja tarvittaessa siirretään Anamorsin, aktivoimalla CIA.

Citation: Lipper CH, Paddock ML, Onuchic JN, Mittler R, Nechushtai R, Jennings PA ( 2015) syöpään liittyvien NEET proteiinit Transfer 2Fe-2S klustereita Anamorsin, proteiini vaaditaan Sytosoliset Rauta-rikki-kasauman biogeneesin. PLoS ONE 10 (10): e0139699. doi: 10,1371 /journal.pone.0139699

Editor: Yaakov Koby Levy, Weizmann Institute of Science, ISRAEL

vastaanotettu: toukokuu 14, 2015; Hyväksytty: 15 syyskuu 2015; Julkaistu: 08 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Lipper et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH GM101467 myönnetty PAJ, Israel Science Foundation – ISF 865/13 myönnetty RN, ja varoja University of North Texas College of Arts and Sciences myönnetty RM. Work Center for Teoreettinen Biological Physics sponsoroi National Science Foundation (Apurahat PHY-1427654 ja MCB-1214457) ja jota Cancer Prevention and Research Institute of Texas. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rauta-rikki (Fe-S) klusterit ovat ikivanhoja kofaktoreita löytyy proteiineista kuin kaikki muut valtakunnat elämän. Proteiinit, jotka sisältävät rautaa rikkikeskusta suorittavat lukuisia kriittisiä toimintoja, kuten siirto elektronien oksidatiivisen aineenvaihdunnan, fotosynteesi, nukleotidin aineenvaihduntaa, synteesissä proteiini kofaktoreita, ja ovat ratkaisevan tärkeitä DNA: n replikaatio ja DNA korjaukseen [1, 2]. Biosynteesi Fe-S klustereiden tapahtuu monimutkaisia ​​proteiini kokoonpano, jotka sisältävät rakennustelineet proteiinit, saattajia, elektronin siirto proteiinien ja kysteiini desulfurases [3]. Nisäkkäillä on kahdenlaisia ​​ja Fe-S klusterin kokoonpanolaitteita: mitokondrio rauta rikki klusterin kokoonpano (ISC) järjestelmä ja sytosolin rauta rikki klusterin kokoonpano (CIA) järjestelmä. CIA toimittaa Fe-S klustereita sytosolin ja ydinvoima proteiineihin, jotka osallistuvat DNA: n replikaatioon ja korjaukseen [4]. Mitokondrioiden ISC-järjestelmä on raportoitu olevan välttämätön aktivointi sytosolisen järjestelmän [5, 6]. Kuitenkin tarkka luonne linkin näiden kahden järjestelmän välillä on tuntematon. On olemassa useita ihmisen tauteja, joihin liittyy vikoja Fe-S biogeneesin, mukaan lukien Friedreichin ataksia, sideroblastic anemia, useita mitokondrioiden toimintahäiriöitä oireyhtymä ja syöpä [3, 7].

Ihmisen NEET Proteiinit äskettäin löydetty uusi luokka ja 2Fe-2S-proteiineja. Ne ovat ainoa tunnettu rauta-rikki-proteiineja paikallista tai lähellä ulomman mitokondriokalvon, jotka ovat rajapinnassa mitokondrioita ja sytosoliin. Paras tunnettu näistä ovat mitoNEET (mnt, CISD1) ja ravinteiden puutteen autophagy tekijä-1 (NAF-1, miner1, ERIS, CISD2) (katsaus [8]). Mnt sijaitsee ulomman mitokondriokalvon (OMM) ja NAF-1 endoplasmakalvostoon (ER), ja mitokondrioiden liittyvä kalvon (MAM) ER [9-11]. NAF-1 in MAM liittyy läheisesti OMM kautta kompleksin IP

3R, joka on suoraan lieassa OMM huokosten proteiini VDAC by grp75 [9, 12]. Nämä NEET proteiinit ovat osallisena useissa ihmisen sairauksia kuten syöpää, diabetesta, kystinen fibroosi, Wolfram oireyhtymä 2, hermoston rappeutumisen ja lihasten surkastumista [8, 13-18]. Kiderakenteet osoittavat, että sekä MNT ja NAF-1 ovat homodimeerejä keskenään protomeerityypin koordinoida 2Fe-2S klusterin epätavallinen 3Cys: 1His koordinointi [19, 20]. Epätavallinen Fe-S klusterin koordinoinnin kolme Cys ligandien ja yksi ei-Cys ligandi on löydetty Fe-S klusterin siirto proteiinien [21]. Olemme osoittaneet kykyä NEET proteiinien siirtämään 2Fe-2S klustereita apo-ferredoksiini, kulta-standardin käytettyyn proteiiniin Fe-S klusterin siirtokokeet [22, 23].

solunosasijaintia on NEET proteiinit rajapinnassa sytosoliin ja mitokondriot, sekä niiden klusteri siirtofunktio, johti meidät tutkimaan, ovatko ne yhdistää mitokondrioiden ISC järjestelmän CIA järjestelmään. Sytosolin 2Fe-2S-proteiinia Anamorsin (tunnetaan myös sytokiinien aiheuttaman apoptoosin inhibiittori-1; CIAPIN-1) on elektronin siirtävän proteiinin, joka vaaditaan varhaisessa vaiheessa Fe-S klusterin kokoonpano CIA järjestelmän [24-26]. Tässä tutkimuksessa tunnistamme Anamorsin kuin ensimmäinen tunnettu suorista fysiologisista 2Fe-2S klusterin akseptori sekä MNT ja NAF-1. Samanlainen kuin meidän aiempien tulosten kanssa ferredoksiini, siirto ilmenee vain, kun klusterin on hapetettu [2Fe-2S]

2+ tila ja estyy mutaatio His ligandin Cys. Määrä klusterin siirto Anamorsin peräisin MNT tai NAF-1 on verrattavissa muiden tunnettujen ihmisen 2Fe-2S klusterin siirto proteiineja. Me osoitamme, käyttäen biolayer interferometry, että molemmat NEET-nuoret muodostavat suoran proteiini-proteiini vuorovaikutus Anamorsin. Lisäksi me raportoimme että NEET proteiineja siirtää suoraan 2Fe-2S klusterit sekä Anamorsin cluster-sitoutumiskohtia mahdollistaa täydellisen ennalleen holo-Anamorsin. Koska holo-Anamorsin tarvitaan biosynteesiä Fe-S klusterit CIA järjestelmä, 2Fe-2S klusterin siirto Apo-Anamorsin viittaa siihen, että NEET proteiineilla on keskeinen rooli sääntelyn /aktivointi klusterin kokoonpano CIA järjestelmän.

Kokeelliset menetelmät

ilmentäminen ja puhdistus proteiinien

liukoinen domeenit NAF-1 (tähteet 57-135) ja mnt (tähteet 33-108), ilmennettiin ja puhdistettiin, kuten on aiemmin on kuvattu [19, 23]. Puhdistettu NEET proteiinit sisältävät ≥ 98% klusterin käyttöaste. Ihmisen Anamorsin koodaava cDNA-plasmidia (Abgent) monistettiin PCR: llä ja subkloonattiin pET28-a (+) -vektoriin (Novagen) välillä Ndel- ja Xhol-restriktiokohdat. Vektori lisää 6x his-tag ja trombiinipilkontapaikan N-päähän-geenin. BL-21 Kodonissa Plus (DE3) RIL-soluja (Stratagene) transformoitiin pET28-a (+) – Anamorsin rakentaa. Viljelmiä kasvatettiin LB-väliaineessa, joka sisältää, kuten aiemmin on kuvattu [27]. 750 uM FeCl

3 lisättiin viljelmään 30 minuuttia ennen IPTG-lisäyksen. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 250 mM NaCl, 5 mM imidatsoli. Uudelleensuspendoitiin solut hajotettiin käyttäen Emulsiflex-C5-homogenisaattorissa (Avestin) ja sentrifugoitiin. Supernatantti, joka sisältää his-merkitty Anamorsin sidottiin Ni-NTA-agaroosia (Qiagen) hartsi, pestiin suspendoimalla uudelleen ja eluoitiin samalla puskurilla, jossa oli 300 mM imidatsolia. Eluoitu Anamorsin laimennettiin 25 mM Tris-HCI, pH 7,1, joka sisälsi 5 mM DTT: tä ja puhdistettiin edelleen käyttämällä HiTrap Q HP 5 ml anioninvaihtopylväällä (GE Healthcare). Proteiini eluoitiin 150-500 mM NaCI-gradientilla 25 mM Tris-HCI, pH 7,1 ja 5 mM DTT: tä. Apo-Anamorsin, The 2Fe-2S klusterin poistettiin kuvatulla menetelmällä Kennedy ja Beinert [28]. Yhden klusterin päällä mutantit Anamorsin (C1 ja C2) suunniteltiin korvaamalla kukin 4Cys klusterin ligandien Ser by mutageneesillä.

UV-Vis-absorptiospektroskopialla siirto kinetiikka

Imeytyminen spektrit rekisteröitiin 300-800 nm: ssä Cary 50 spektrofotometrillä (Varian), jossa on lämpötilan ohjausyksikkö asetetaan 37 ° C: ssa käyttäen 1 cm: n optinen matka kyvetissä. Spektrit saatiin aerobisissa olosuhteissa, ellei toisin mainita. Suhde absorbanssin 423 nm: ssä (ominaisuus 2Fe-2S klusterin (t) Anamorsin) 458 nm (NEET 2Fe-2S cluster allekirjoitus huippu) seurattiin klusteri siirron etenemisen. Laajuus Klusterin siirron reaktio määritetään ja piirrettynä kuvattu aiemmin [23] kaavalla: Siirrä Progress (%) = (R

OBS-R

alustava) /(R

lopullinen-R

alustava) x100%, jossa R

aluksi on 423/458 nm absorbanssisuhde hetkellä 0, R

obs on 423/458 nm suhde tietyllä hetkellä, ja R

viimeinen on IS 423/458 nm suhde täydellistä siirtoa. R

alkukirjainta siirto NAF-1 ja mnt on 0,78. R

alkuarvot siirto NAF-1 H114C mutantti ja mnt H87C mutantti ovat 0,93 ja 0,90 vastaavasti. 423/458 nm absorbanssisuhde puhdistettua holo-Anamorsin, C1-mutantti ja C2-mutantin (1,04, 1,03, 0,99 vastaavasti) käytettiin arvot täydellistä siirtoa (R

lopullinen). Siirron reaktiot, apo-Anamorsin on esi-inkuboida 2,5 mM DTT 60 minuuttia sen varmistamiseksi, että alentaminen kysteiinin tioliryhmiä. Kinetic mittaukset suoritettiin käyttäen ekvimolaariset pitoisuudet NAF-1 tai MNT apo-Anamorsin (yksi NEET kaksi 2Fe-2S cluster per Anamorsin) 50 mM bis-Tris pH 7,0, 100 mM NaCl, 2,5 mM DTT: tä, ellei toisin mainita. Apo-Anamorsin ja DTT esi-inkuboitiin 60 minuuttia ennen lisäämistä NEET proteiinia.

Biolayer interferometria

kinetiikka apo-Anamorsin vuorovaikutus NAF-1 tai mnt mitattiin koskevasta oktetti Red96 instrumentti (ForteBio). Apo-Anamorsin biotinyloitiin 30 minuutin inkuboinnin EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotiinia (Thermo Scientific) on 2: 1 moolisuhde bio- tinylointireagenssia proteiiniin sitten puskuri vaihdettiin käyttäen PD10 suolanpoistopylvääseen (GE Healthcare) osaksi 50 mM bis-tris, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20, 0,5 mg /ml BSA: ta, 5 mM DTT, pH 7,0. 3,5 uM biotinyloitua Anamorsin immobilisoitiin streptavidiinilla biosensorit (ForteBio). Ladatut biosensorit tasapainotettiin samalla puskurilla ilman DTT: tä. Association mitattiin yli 900 sekuntia. Yhdistyksen määräytyy aallonpituuden muutos (nm). Sen jälkeen yhdistys, dissosiaation määritettiin siirtämällä bioanturin kärki puskuroimaan ilman NEET proteiinia ajaksi 1800 sekuntia. Controls ei-spesifisen sitoutumisen kullekin NEET pitoisuus ajettiin ilman lastaus bioanturin ja vähennetään vastaava sidosdata. Data sovitettiin on 1: 1 malli sitoutumista apo-Anamorsin ja 2: 1 heterogeeninen ligandin malli sitoutumista holo-Anamorsin käyttäen Octet ohjelmistoa. Tiedot piirrettiin käyttämällä Kaleidagraph (Synergy Software).

valmistaminen jälkeisen klusterin siirto Anamorsin varten massaspektrometriaa ja biolayer interferometriaan

25 uM apo-Anamorsin 50 mM Bis-Tris pH 7,0 ja 100 mM NaCl oli esi-inkuboida 2,5 mM DTT 60 minuuttia. 27,5 uM NAF-1 lisättiin sitten ja reaktioseosta inkuboitiin tasoravistelijalla 37 ° C: ssa 3,5 tunnin ajan. Kun reaktio holo-Anamorsin puhdistettiin NAF-1 käyttäen HiTrap Q HP 1 ml anioninvaihtopylväällä. Proteiini eluoitiin 150-500 mM NaCI-gradientilla 25 mM Tris-HCI, pH 7,5. Näytteet massaspektrit olivat puskuri vaihdettiin 10 mM ammoniumasetaatti pH 7,5 pika Spin Protein pylväät (Roche).

Sähkösumutusmassaspektrometria ionisaatiomassaspektrofotometrisesti

Anamorsin näytettä 10 mM ammoniumasetaatti pH 7,5 kanssa pitoisuus on noin 1 mg /ml, laimennettiin 100-kertaisesti 50% metanolia, jossa oli 0,5% etikkahappoa, ja injektoidaan Quattro Ultima kolmoiskvadrupoli-järjestelmä (Waters). Spektrit saatiin positiivisionisella tilassa, jossa on m /z välillä 500-2000. Mass dekonvoluutio suoritettiin käyttäen MassEnt1 työkalun MassLynx ohjelmistopaketti.

Tulokset

NAF-1 tai mnt voivat siirtää hapettaa 2Fe-2S klustereita apo-Anamorsin

Anamorsin on kaksi 2Fe-2S sitoutumiskohtia, joissa jokaisessa on ferredoksiini-, kuten 4-Cys klusteri ligaation, joka poikkeaa kuin NEET-nuoret (3Cys: 1His). Tämä ero ligaatio antaa sille UV-Vis absorbanssispektriä, joka eroaa kuin NEET proteiineihin, etupäässä 400-500 nanometrin alueella. Tällä alueella Anamorsin on absorptiopiikkeihin 423 ja 458 nm, kun taas sekä NAF-1 ja mnt on vain piikki 458 nm (kuvio 1). Selvitimme molaarinen ekstinktiokerroin on Anamorsin 2Fe-2S cluster huippu 458 nm olla 5800 M

-1cm

-1 per klusteri, kun taas on NEET-nuoret on 5000 M

-1cm

-1 per cluster [29]. Käytämme suhde 423 nm 458 nm seurata siirtoa 2Fe-2S klusterit MNT tai NAF-1 apo-Anamorsin. Kuten siirto tapahtuu odotamme 423 nm huippu nousta, ja siten kasvuun 423/458 suhteen. Sen sijaan menetys klusterin ratkaisu johtaisi täydelliseen menettämiseen näkyvä absorbanssi 400-800 nm alueella [19]. Valmistella proteiini 2Fe-2S klusterin siirto tutkimuksia, vapaa kysteiiniä apo-Anamorsin vähenevät esi-inkuboimalla DTT 60 minuuttia sen varmistamiseksi, että ne ovat valmiita klusterin ligaatiota. Ensimmäisen skannauksen yhteydessä aloittamisesta siirron osoittaa hapettuneen NEET spektri, joka osoittaa, että suurin osa DTT hapetetaan. Alennettu DTT vähentää NEET klustereita [30], joka estää siirto [23]. Sen jälkeen, NAF-1 tai mnt lisättiin ennalta vähentää apo-Anamorsin ja klusterin siirto reaktiota seurattiin UV-Vis-spektrofotometrillä. Stoikiometria NAF-1 tai MNT apo-Anamorsin valittiin tarjota yksi 2Fe-2S klusterin per Anamorsin, koska se oli aiemmin raportoitu, että sekä klusterin sitoutumiskohtia ei voida samanaikaisesti käyttövalmiiksi [24, 27]. Hapettavissa olosuhteissa siirto etenee sekä NAF-1 ja mnt ilman menetystä klustereita ratkaisun ja tiedot ovat hyvin sovi yhteen eksponentiaalivaiheen (kuvio 2). NAF-1 siirto eteni loppuun taas mnt siirrettiin ~ 80% sen klustereiden osoittaa tehokkaan siirron joko NEET proteiinin Anamorsin. Skannaa valitse ajankohtina voidaan nähdä S1 kuvassa. Alennettu DTT on osoitettu joissain tapauksissa välittäjänä klusterin siirto [31]. Voit testata, onko tämä päti NEET-Anamorsin, DTT poistettiin apo-Anamorsin seuraavan 60 minuutin inkuboinnin tämän edustaja. DTT vapaa apo-Anamorsin on helposti pystyy vastaanottamaan NEET klusterit (S2 Kuva). Tämä osoittaa, että NEET-Anamorsin klusteri siirto on pelkästään proteiini-välitteisen tapahtuma.

. (Top) Crystal rakenteet mnt (ATE koodi: 2QH7,), NAF-1 (ATE koodi: 3FNV); (Lähi) NEET 2Fe-2S klusterin 3-Cys: 1His koordinointi; (Pohja) Absorptiospektrit 25 uM MNT ja NAF-1. B. (Top) Crystal rakenne N-terminaalinen domeeni Anamorsin (PDB-koodi: 2YUI), joihin on lisätty kaavamaisen rakenteeton 2Fe-2S klusterin sitovan domeenin; (Lähi) edustaja Anamorsin 2Fe-2S klusterin 4-Cys koordinointi (alkaen ferredoksiini, PDB-koodi: 1RFK); (Pohja) absorptiospektri 43 uM Anamorsin eristää

E

.

coli

.

2F-2S klusterin siirto Reaktiota seurattiin UV-VIS-absorptiospektroskopialla. Edistymistä siirto ajan funktiona. Cluster siirto NAF-1 (A) ja mnt (B) apo-Anamorsin tapahtuu vain silloin, kun 2Fe-2S klusterin hapettuu eikä silloin, kun pelkistetään 10 mM natriumditioniitti. Korvaaminen koordinoivan Hänen jäännös Cys (H114C varten NAF-1 ja H87C varten mnt) estää, mutta ei poista siirtoa. Kaikki jäljet ​​on esitetty saatiin 25 uM NAF-1 tai mnt (50 uM 2Fe-2S klusterit) ja 50 uM apo-Anamorsin 50 mM bis-tris, 100 mM NaCl, 2,5 mM DTT, pH 7,0 37 ° C: ssa.

lisäksi testata onko 2Fe-2S klusterin siirto NEET proteiineista apo-Anamorsin riippui hapetustila klusterin löysimme aiemmissa tutkimuksissa klusterin siirto apo-ferredoksiini [22, 23]. Alennetun NEET spektri on kaksi erillistä piikkiä (S3 kuvassa), toisin kuin piirteetön spektri vähennetään Anamorsin [27]. Kun NEET 2Fe-2S klusteri on esipelkistetyt natriumditioniitillä ei siirtoa apo-Anamorsin havaittiin (kuvio 2). Tämä havainto osoittaa, että NEET klusterin siirto Anamorsin edellyttää hapettuneen 2Fe-2S klustereita kuten olemme aiemmin löytynyt siirto NEET proteiineista apo-ferredoksiini sekä havaittiin siirto rauta-rikki kokoonpano proteiini ISCU apo-Fd [32] .

Olemme lisäksi testanneet merkitystä yksittäisen Hänen ligandi mNT ja NAF-1 tehokkaaseen klusterin siirtoon. Korvaaminen koordinoivan His jäämät Cys NAF-1 (H114C) ja mnt (H87C) esti siirto apo-ferredoksiini [22, 23, 33, 34]. Spektrit NAF-1 H114C mutantti ja mnt H87C mutantti voidaan nähdä S4 kuviossa. Samoin havaitaan, että klusterin siirto apo-Anamorsin myös inhiboi yli 10-kertaiseksi näiden mutanttien (kuvio 2).

Siirtonopeus on NEET proteiinit ovat samankaltaisia ​​kuin tunnettujen ihmisen cluster-siirto proteiinien

siirtäminen 2Fe-2S klustereita apo-akseptori proteiinien on kuvattu olevan toisen kertaluvun [32, 35]. Siksi testattiin klusterin siirtyminen MNT tai NAF-1 apo-Anamorsin eri pitoisuuksilla NEET dimeerin luovuttajien (3,13 uM, 6,25 uM, 12,5 uM ja 25 uM). Havaittu taso kunkin pitoisuuden (k

OBS) oli lineaarisesti riippuvainen NEET proteiinipitoisuus (kuvio 3). Näennäinen toisen kertaluvun nopeusvakio (

k

2) kunkin määritettiin lineaarisen sopii k

obs arvoja.

k

2 Laskettuja NAF-1 ja mnt 600 ± 90 M

-1 min

-1 ja 460 ± 60 M

-1 min

-1 vastaavasti, jotka ovat samanlaisia ​​kuin nopeusvakiot mitattiin ihmisen 2Fe-2S klusterin siirto proteiinien ISCA ja ISCU [32, 35] (taulukko 1). Siirtonopeudet noin 2Fe-2S siirto proteiinit lisäävät ATP-riippuvainen saattajia. IscU päässä

Azotobacter vinelandii

läsnä on HscA /HscB cochaperone järjestelmän ja tarpeen kofaktoreita siirtojen raportoitu nopeusvakio, joka on vain hieman suurempi kuin sen NEET proteiinien [36] (taulukko 1). Ylimääräinen samankaltaisuus NEET-nuoret ja ISCU on vaatimus hapettumisen 2Fe-2S klusterin siirtoa [32]. Yhdessä nämä NEET-nuoret siirron yhtä tehokkaasti kuin ISCU ja todennäköisesti toimia samalla tavalla.

NAF-1 (A) ja mnt (B) siirto apo-Anamorsin seurattiin UV-Vis-absorptiospektroskopialla sarjalle NEET pitoisuuksia. Kunkin NEET pitoisuus suhteessa 1 NEET dimeeri per 2 apo-anamorisn säilyi. Nopeusvakio, k

obs, määritetään sovitus datan räjähdysmäisesti ja on funktiona pitoisuuden NAF-1 (C) tai mnt (D). Kulmakerroin parhaiten linjan istuvuuden määrittämiseen käytettiin ilmeistä toisen kertaluvun nopeudella vakiot (

k

2) ja NAF-1 ja mnt, jotka ovat 600 ± 90 M

-1 min

-1 ja 460 ± 60 M

-1 min

-1 vastaavasti.

Tässä osoitamme, että 2Fe-2S klusterit siirretään Anamorsin pois NEET proteiineista. Voit käsitellä mahdollisuutta, että NEET-nuoret ovat yksinkertaisesti toimittajia raudan ja rikkivetyä kautta vapautumista ja kaapata mekanismi, suoritimme siirto läsnäollessa EDTA (rautaa kelatoiva sequesters vapaan raudan ja estää näin klusterin kokoonpano). Vaikka vapaan raudan ja rikkivetyä voi spontaanisti muodostaa ryppäitä Anamorsin [24, 27], EDTA poistetaan kokoonpano. Kuitenkin siirtää kustakin NEET-nuoret apo-Anamorsin etenee tehokkaasti EDTA: n läsnäollessa (S5 kuvio). Siksi NEET-nuoret ”rooli tässä prosessissa on enemmän kuin yksinkertaisesti tarjoamalla rauta- ja rikkivetyä ja suora vuorovaikutus on välttämätön tehokkaan siirron.

NAF-1 tai mnt sitoutuvat suoraan apo-Anamorsin

tutkimiseksi potentiaalia proteiini-proteiini vuorovaikutusta NEET proteiinien ja Anamorsin käytimme biolayer interferometria (BLI). Sekä NAF-1 ja mnt sitoutunut suoraan immobilisoituun apo-Anamorsin. Yhdistyksen ja dissosiaation käyrät on esitetty kuvassa 4. On- (

k

päälle) ja off-hinnat (

k

off) mitattiin kullekin vuorovaikutuksen näkyvät Taulukko 2. paikan hinnat NAF-1 ja mnt eroavat kertoimella kaksi, kun taas off-rate of NAF-1 on ~ 18 kertaiseksi nopeammin kuin mnt. Olemme myös analysoineet sitoutumista holo-NEET-nuoret holo-Anamorsin (S6 kuviossa).

sensorigrammit sitomisesta holo-NAF-1 (A) ja holo-mnt (B) ja biotinyloitua apo-Anamorsin immobilisoida streptavidiinilla päällystettyjä biosensoreita on esitetty. Yhdistys seurattiin 900 sekuntia (nouseva signaali) ja sen jälkeen 1800 sekuntia dissosiaation (lahoavaa signaali). Aineisto mahdu one-to-one malli (musta käyrät). Ja off-hinnat määritettiin sopii kunkin NEET-Anamorsin pitoisuus (esitetty taulukossa 2).

NEET proteiinit voivat siirtää kuhunkin Anamorsin klusterin sitovat kohdat

Anamorsin on kaksi 2Fe-2S klusterin sitoutumiskohtiin ja

in vitro

kemiallinen käyttövalmiiksi osoitti, että kukin klusteri sivusto voidaan käyttövalmiiksi mutta klusterin sitoutuminen oli toisensa poissulkevia [27]. Viittaamme ensin sivuston C1 ja toinen C2 (kuvio 5A). Anamorsin mutantit, jotka sisältävät vain yhden klusterin sitova kohta tuotettiin joihin kaikki neljä kysteiinitähdettä muista sivuston korvattiin seriineihin testata mahdollisia etuoikeutetut siirto MNT tai NAF-1 apo-Anamorsin. Absorbanssispektriä Kunkin mutantin voidaan nähdä S7 kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa 5, kukin Anamorsin mutantti vastaanotetun klusterit kunkin NEET luovuttajalta proteiinia, joka esittää hieman parempana siirtää joko C1 tai C2 akseptorikohdat.

Anamorsin mutantteja, jotka sisältävät yhden klusterin-sitoutumiskohta on esitetty; toinen klusteri sivusto oli häirinnyt korvaamalla kaikki Cys-tähteiden Ser. (A) Kaavio on Anamorsin-C1 (vihreä) ja Anamorsin-C2 (magenta) on esitetty. 2Fe-2S klusterin siirtyminen NAF-1 (B) tai mnt (C) kullekin yksittäiselle klusterin sitovat apo-Anamorsin mutantti seurattiin UV-Vis-absorptiospektroskopialla. Traces saatiin 25 uM NAF-1 tai mnt (50 uM 2Fe-2S klusterit) ja 50pM apo-Anamorsin.

NAF-1 homodimeerit voi toimittaa sekä 2Fe-2S klustereita Anamorsin

Koska edellä esitetyt tulokset, päätimme testata, onko joko yhden NEET homodimeeri voisi toimittaa 2Fe-2S klusterit sekä C1 ja C2 akseptorikohdat yhden apo-Anamorsin. Cluster siirto mitattiin NAF-1 stökiometrisen luovuttaja klusterin akseptorikohdat (50 uM NAF-1-dimeerin ja 50pM apo-Anamorsin) (kuvio 6A). Keskityimme NAF-1, koska vain NAF-1 ilmeni täydellinen siirto ylimäärällä apo-Anamorsin (kuvio 2). Siirto ~ 1,5 2Fe-2S klustereita per Anamorsin havaittiin yllättäen osoittavat, että vähintään puolet Anamorsin proteiinien hyväksytty kaksi klustereiden inkuboinnin jälkeen NAF-1. Havaitsimme ei heikkene klusterin ratkaisu (spektriamplitudia). Koska tiedot ovat hyvin sovi yhteen eksponentiaaliseen vaiheeseen, molemmat klusterit siirretään kineettisesti erottaa vaiheet. Yksinkertaisin selitys on, että molemmat klusterit siirretään yhdellä sitova tapahtuma, vaikka ne voivat olla hieman eri tahtiin, koska eri aminohappokoostumus noin kahden Anamorsin klusterin sitovaa kohtaa. Epätäydellisen siirto voi johtua muodostumista molekyylin sisäinen disulfidisidosten apo-Anamorsin tai mahdollisesti johtuu modifioitu kysteiini sivuketjujen apo-Anamorsin. Entinen ehdotettiin aiemmin epätäydellisiä siirto ISCU apo-ferredoksiini [32]. Vahvista muodostumisen täysin miehitetty holo-Anamorsin seuraava siirto NAF-1 käytimme sähkösumutus ionisaatiomassaspektrofotometrisesti (ESI-MS). Holo-Anamorsin muodostuu siirto reaktiolla NAF-1 puhdistettiin NAF-1 käyttäen anioninvaihtokromatografiaa. Saatu holo-Anamorsin analysoitiin ESI-MS: llä. Lisäksi ostimme ESI-MS-spektrit apo-Anamorsin ja Anamorsin koska se puhdistettiin

E

.

coli

. Saatu spektri on esitetty kuviossa 6B. Odotettu massan apo-Anamorsin rakentaa on 35614 Da ja odotettu massa 2Fe-2S klusteri on 176 Da. Huomaamme, että Anamorsin puhdistettu

E

.

coli

on pääasiassa sisältää yhden klusterin, kun taas suuret osa siirron jälkeisten Anamorsin sisältää kaksi 2Fe-2S klusterien Aiemmin kemiallinen saattamisen raportoitu klusteri käyttöaste olevan toisensa poissulkevia [27]. Tämä tulos osoittaa, että on välttämätöntä suoran siirron aktivoimiseksi Anamorsin.

(A) 2Fe-2S siirto 50pM dimeeristä NAF-1- 50 uM apo-Anamorsin (kaksi 2Fe-2S klusterit per Anamorsin) (näkyy punainen) verrataan 25 uM NAF-1- 50 uM apo-Anamorsin (yksi 2Fe-2S cluster per Anamorsin) (näkyy sinisenä). Siirto on lähellä täydellistä, että yhden 2Fe-2S cluster kohti Anamorsin näyte ja noin 75% valmis kahden 2Fe-2S cluster per Anamorsin näytettä. Jälkimmäinen tulos osoittaa, että vähintään puolet Anamorsin kykenee vastaanottamaan kaksi 2Fe-2S klusterit yhdestä NAF-1 homodimeeri. (B) Anamorsin luovutuksen jälkeen reaktio NAF-1 puhdistettiin ja analysoitiin ESI-MS (esitetty punaisella). Massaspektrit Apo-Anamorsin (kiinteä musta viiva) verrataan tärkeimpien huippu siirron jälkeisten Anamorsin (kiinteä punainen viiva), joka osoittaa lisääntymistä vastaavan massan sisällyttämistä kaksi 2Fe-2S klustereita. On myös pieni piikki 35856 Da, joka todennäköisesti vastaa Anamorsin yhdellä 2Fe-2S klusteri ja rautaionin sidottu joka voi olla jäänne klusterin joka heikkene näytteen valmistus prosessi.

E

.

coli

-purified Anamorsin on esitetty vertailun (pisteviiva), joka osoittaa Anamorsin sisältää yhden 2Fe-2S klusteri.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tunnistettu Anamorsin ensimmäisenä ihmisen 2Fe-2S klusterin akseptori proteiinia sekä OMM syöpään liittyvät mNT ja NAF-1-proteiineja. Äskettäin Ferecatu

et al

. [37] todennut, että mnt hankkii 2Fe-2S klusterit mitokondrioiden ISC järjestelmään. Tuloksemme osoittavat, että kun on saatu, MNT (ja NAF-1) voidaan siirtää sen 2Fe-2S klustereita Anamorsin tarjoten siten hyvin määritelty väylä ISC CIA kautta ulkokalvon kytkettynä mnt (Kuva 7).

mnt on OMM ja NAF-1 on MAM saavat 2Fe-2S klusterit tuottaa kyseisen mitokondrion jonka ISC järjestelmän. Sekä MNT ja NAF-1 siirtää nämä 2Fe-2S klustereita Anamorsin. Anamorsin vastaanottaa elektroneja diflavin reduktaasin NDOR1 ja syöttää ne CIA järjestelmän varhaisessa vaiheessa tarpeen tuotantoa varten 4Fe-4S klustereita. Tämä vaihe edellyttää holo muodossa Anamorsin. Sekä MNT ja NAF-1 voi tarjota rinnakkaista reittiä yhdistävät CIA ISC. CIA tuotettu klustereita kohdistetaan proteiineja sytosoliin ja tumassa ja ovat tärkeitä solujen aineenvaihduntaa, huolto ja leviämisen.

Anamorsin, joka on olennainen osa CIA, satamat kaksi Fe-S klusteri aa sitova sivustoja ja huomasimme, että mnt tai NAF-1 voi siirtää 2Fe-2S klusterit sekä klusterin sitovaa kohtaa. NEET proteiinit voidaan toimittaa kaikki tarvittavat klustereita aktivoimiseksi Anamorsin sen elektronin siirtofunktio. Tämä nyt yhdistää välttämättömyys mitokondrioiden Fe-S klusterin kokoonpano funktio sytosolin CIA [37, 38].

NEET n paikalla OMM /MAM ja niiden klusterin siirtofunktio samankaltaisuuksia ISCU ehdottaa, että he voivat olla osa koulutusjakson yhdistää mitokondriaalisen 2Fe-2S kiinnittyy CIA järjestelmään. Vaikka Ferecatu

et al

. osoittivat, että knockdovvn mnt ei ollut merkittävää vaikutusta kypsymistä CIA-riippuvaisen Fe-S-proteiineja [37], osoitamme, että NAF-1 on tehokkaampi siirtämään apo-Anamorsin ja se voi olla rinnakkainen reitti CIA .

ominaisuudet NEET proteiinien mukaan lisäksi mitokondrioiden 2Fe-2S kuljetuksen, ne toimivat altaiden mahdollistaa 2Fe-2S klustereita koottavaksi edullisin ehdoin sisällä mitokondrioiden ja varastoidaan nopeamman saatavuuden kun sytosolin 2Fe -2S klustereita tarvitaan. Tämä mahdollistaisi nopeampi reagointi välittömiä tarpeita kuin olisi mahdollista, jos mitokondrion kokoonpano ja liikenne kahden kalvojen sytosolisia proteiineja. Tämän tueksi toiminnon, MNT hiljattain todettu koota /korjata 4Fe-4S klusterin sytosolin rauta säätelijäproteiinia 1 (IRP1; sytosolinen aconitase) seuraavat hapettumista [37]. Siten NEET-nuoret voivat toimia kuljetusta 2Fe-2S klustereita ulos mitokondrioita sekä säiliö helposti saatavilla 2Fe-2S klustereita.

NAF-1, mnt ja Anamorsin ovat kukin sekaantuneet syöpää [15 , 39-41]. Molemmat NEET proteiinit ovat yli-ilmentynyt epiteelin rintasyöpäsoluissa, ja vähentää niiden ekspressiota kautta shRNA knockdowns tuloksia laski syöpäsolujen lisääntymistä ja laski kasvaimen kasvua. Fe-S-proteiinit ovat välttämättömiä DNA: n replikaatiota ja solujen kasvua, tarvitaan nopeaa toimittamista Fe-S klusterit kätevästi yhdistää NEET proteiinit syövän solujen proliferaatiota. Lisäksi hiivan homologi Anamorsin (Dre2) tarvitaan kokoonpanoa diferric-tyrosyyli radikaali kofaktori ribonukleotidireduktaasin [42], joka on tarpeen, jotta saadaan deoksinukleotideista. Rajallinen saatavuus deoksinukleotidien myös estää DNA: n replikaatiota ja siten syöpäsolujen lisääntymistä. Kohdistaminen NEET proteiinit saattavat olla kätevä keino hallita monet prosessit, joita tarvitaan nopeutetun syöpäsolujen lisääntymistä ja mahdollisuus moduloida käyttäen pieni molekyyli kohdentamista NEET proteiinien [43].

Tässä tutkimuksessa, tarjoamme hyvin määritelty yhteys ISC ja CIA järjestelmien kautta mNT ja NAF-1, joka on ainoa tunnettu 2Fe-2S proteiinit liittyvät OMM. Osoitamme, että NEET proteiinit voivat siirtää sekä niiden 2Fe-2S klusterit suoralla proteiini-proteiini vuorovaikutus aktivoi olennaisia ​​CIA proteiinia, Anamorsin.

tukeminen Information

S1 Kuva.